Summary
Vi præsenterer teknikker til isolering, dyrkning, karakterisering og differentiering af humane primære muskel stamceller (Hmpc'er) opnået fra skeletmuskulatur biopsi væv. hmpcs opnået og karakteriseret gennem disse metoder kan bruges til efterfølgende at behandle forskningsspørgsmål relateret til human myogenesis og skeletmuskulatur regenerering.
Abstract
Brugen af primære humane væv og celler er ideel til undersøgelse af biologiske og fysiologiske processer såsom skeletmuskulaturen regenerativ proces. Der er anerkendte udfordringer for at arbejde med humane primære voksne stamceller, især humane muskelprogenitorceller (Hmpc'er) afledt af skeletmuskulatur biopsier, herunder lavt celle udbytte fra indsamlet væv og en stor grad af donor heterogenitet af vækst og død parametre blandt kulturer. Mens indarbejdelse af heterogenitet i eksperimentel design kræver en større stikprøvestørrelse til at opdage betydelige virkninger, det giver os også mulighed for at identificere mekanismer, der ligger til grund for variabilitet i hMPC udvidelseskapacitet, og dermed giver os mulighed for bedre at forstå heterogenitet i skeletmuskulatur regenerering. Nye mekanismer, der skelner ekspansions evne af kulturer har potentiale til at føre til udvikling af terapier til at forbedre skeletmuskulatur regenerering.
Introduction
Skeletmuskulatur er det største organsystem i den menneskelige krop, der tegner sig for 30 − 40% af hele kroppen masse1. Ud over sin anerkendte rolle i bevægelse, skeletmuskulatur bevarer kropstemperatur og kropsholdning, og spiller en central rolle i hele kroppen næringsstof homøostase. Forskning, der involverer menneskelige deltagere, dyr, og cellekultur modeller er alle værdifulde til at løse spørgsmål vedrørende skeletmuskulatur biologi og regenerering. Isolation og kultur af humane primære muskel stamceller (Hmpc'er) giver en robust model, der giver mulighed for cellekultur teknikker og manipulationer, der skal anvendes til humane prøver. En fordel ved at bruge hmpcs er, at de bevarer den genetiske og metaboliske fænotype fra hver donor2,3. Vedligeholdelse af donor fænotype giver forskerne mulighed for at undersøge den interindividuelle variation i den myogene proces. Vi har for eksempel anvendt vores hMPC-karakteriserings metode til at identificere alders-og kønsrelaterede forskelle i hMPC-befolkningens udvidelseskapacitet4.
Formålet med denne protokol er at detaljeret teknikker til at isolere, kultur, karakterisere, og differentiere hMPCs fra skeletmuskulatur biopsi væv. På grundlag af tidligere arbejde, der beskrev hmpcs og identificerede potentielle celle overflade beslutningstagere for HMPC isolation5,6, denne protokol fylder en kritisk kløft i viden ved at forbinde isolation til karakterisering af hmpcs. Desuden gør de detaljerede trin-for-trin instruktioner inkluderet i denne protokol hMPC isolation og karakterisering tilgængelig for en bred videnskabelig publikum, herunder dem med begrænset erfaring med hMPCs. Vores protokol er blandt de første til at beskrive brugen af et billedbehandlings-flowcytometer til at spore cellepopulationer. Nydesignede billedbehandlings cytometre er state-of-the-art, High-gennemløb, og Micro Plate-baseret, der muliggør Live Cell Imaging, celletælling, og multikanal fluorescens analyse af alle celler i hver brønd af et kultur fartøj inden for minutter. Dette system giver mulighed for hurtig kvantificering af dynamiske ændringer i spredningen og levedygtigheden af en hel cellepopulation med kun minimal forstyrrelse af kulturen. For eksempel er vi i stand til at udføre objektive foranstaltninger for sammenløbet på hinanden følgende dage in vitro til at bestemme vækst kinetik af hver kultur, der stammer fra forskellige donorer. Mange protokoller i litteraturen, især dem, der involverer differentiering af MPCs, kræver celler til at nå et defineret niveau af sammenløbet før påbegyndelse af differentiering eller behandling7. Vores metode giver mulighed for objektiv bestemmelse af sammenløbet af hver brønd i en kultur fartøj giver forskerne mulighed for at indlede behandling på en upartisk, ikke-subjektiv måde.
Tidligere var en væsentlig begrænsning af brugen af primære Hmpc'er lave udbytter, der begrænser antallet af celler, der er tilgængelige til eksperimenter. Vi og andre har vist udbyttet af MPCs fra skeletmuskulatur biopsi væv er 1 − 15 MPCs per milligram af væv (figur 1)8. Da vores protokol tillader fire passager i cellerne før rensning med fluorescens aktiverede celle sortering (FACS), er vores kryopræserverede HMPC-udbytter, der er afledt af små mængder biopsi-væv (50 − 100 mg), tilstrækkelige til at løse forskningsformål, hvor der kræves flere eksperimenter. Vores FACS-protokol producerer en ~ 80% ren (Pax7 positiv) MPC-population, således at vores protokol er optimeret til både udbytte og renhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol blev godkendt af institutions revisionsrådet ved Cornell University. Alle deltagere blev screenet for underliggende helbredsforhold og gav informeret samtykke.
1. opnåelse af humant muskelvæv via skeletmuskulaturen biopsi
- Identificer vastus lateralis musklen via palpation, anatomiske landemærker, og aktiv sammentrækning af musklen.
- Palpere vastus lateralis ved at have deltageren stramme deres quadriceps muskel og finde maven af musklen, omkring 1/3 af vejen fra patella til hoften, og bare ventrolaterale til femur.
- Brug en papir måle tape til at markere et område med en kirurgisk markør omkring 4 − 6 inches fra toppen af patella repræsenterer maven af musklen.
- Barberer ethvert hår i nærheden af det markerede område og derefter rense med en kirurgisk kvalitet antiseptisk, der anvendes før medicinske procedurer (for eksempel: 2% chlorhexidin gluconat (CHG)/70% isopropylalkohol (IPA)).
- Anesthetize biopsi stedet med 1% lidocain.
Bemærk: Undgå at injicere lidocain i skeletmuskulaturen. - Lav en 4 − 5 mm incisionsvej på det markerede sted.
- Efter at området er bedøvet, skubbe en Bergstrom nål med trokar gennem fascia ind i maven af musklen (ca. 2 − 3 cm).
- Tegn muskelvæv i Bergstrom nålen ved at trække skære trobilen 2 − 3 cm, mens en assistent anvender suge ved at trække et påsat 60 mL sprøjte stempel.
- Luk skære kammeret.
- Drej bunden af biopsi nålen en fjerdedel Drej og Gentag sekvensen af at åbne nålen, anvende suge, og lukke nålen.
Bemærk: Hver gang nålen lukkes, skal der opnås en udskæring af muskelvæv inde i Bergstrom nålen. Under prøveopsamling vil nålen forblive i låret i samme lodrette position, mens den drejes længderetningen gennem 360 ° for at opnå hver prøve. Denne sekvens kan gentages 3 − 4 gange. - Udsæt det indsamlede biopsi-væv fra nålen til en steril nonvedent dressing pad.
- Undersøg vævet og fjern alle synlige fedtvæv-og fibrotiske væv ved hjælp af sterile skalpel klinger eller pincet.
- Anbring en portion (50 − 100 mg) væv i et sterilt rør, der indeholder CO2-uafhængigt næringsmedium (f. eks. dvale a).
Bemærk: Vægten af vævet bestemmes som følger. Først placeres det udjævnede rør, der indeholder næringsmediet på en skala og Tara. Næste sted vævet ind i røret, Resumé røret, og derefter afveje røret indeholder vævet i næringsstof medium. - Røret, der indeholder vævet og næringsmediet, opbevares ved 4 °C indtil forarbejdningen.
Bemærk: Biopsi væv bør behandles inden for 48 h af indsamlingen.
2. isolering af humane muskel progenitorceller fra biopsi væv
- Mince biopsi væv.
- Muskelvæv overføres fra næringsmediet til en steril Petri skål i et biologisk sikkerhedskabinet eller en lignende steril arbejdsplads.
- Brug sterile skalpel klinger til at hakle vævet i ~ 1 mm3 stykker.
- Vask hakket biopsi væv for at fjerne resterende snavs.
- Muskelvæv overføres til et 15 mL konisk rør, der indeholder 10 mL fosfat-bufferet saltvand (PBS) og lader vævet bosætte sig via tyngdekraften.
- Aspirere supernatanten at passe på ikke at forstyrre muskelvæv.
- Tilsæt 10 ml PBS til det vaskede væv og lad muskelvæv genbosætte via tyngdekraften.
- Aspirere supernatanten at passe på ikke at forstyrre muskelvæv.
- Tilsæt 10 mL lavglucose Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) og lad vævet genbrænde sig via tyngdekraften.
- Aspirere supernatanten at passe på ikke at forstyrre muskelvæv.
- Inkuber vævet i Digest medier.
- Resuspension af muskelvæv i 3 ml fordøje medier (2 mg/ml kollagenase D i lav glukose DMEM).
Bemærk: collagenase D stamopløsninger kan tilberedes ved 20 mg/mL i lavt glucosedmem og opbevares ved-80 °C, derefter fortyndes 1:10 i lav glukose DMEM på tidspunktet for brug. - Inkuber røret, der indeholder muskelvæv, i et vandbad ved 37 °C i 30 minutter.
- Muskelvæv suspensionen triturate hver 10 min ved hjælp af en 10 mL serologisk pipette eller en bred bore pipette.
- Tilsæt 83 μL yderligere fordøje medier og 24 μL dispase opløsning (0,76 mM calciumacetat, 1,39 mM natriumacetat, 13,91 mg/mL dispase II i lavt glucosedmem). Returner suspensionen til 37 °C-vandbad.
- Triturate muskelvævet suspension hver 5 − 10 min med en bred bore pipet spids.
- Fortsæt formalings indtil en ensartet gylle er opnået, og for ikke længere end 1,5 h at forhindre over fordøjelsen.
Bemærk: Tilstrækkelig hakning af vævet og enzymatisk aktivitet af kollagenase og dispase kan påvirke prøve fordøjelsen. En ensartet gylle skal kunne passere gennem en normal pipettespids med minimal okklusion efter 1,5 h. Hvis en ensartet gylle ikke er opnået efter 1,5 h, dobbelttjekke, at vævs hakning er tilstrækkelig, og væv er hakket til den passende størrelse (trin 2.1.2). Desuden bør aktiviteten af enzymer testes som lot til parti variation i enzymatisk aktivitet forekommer.
- Resuspension af muskelvæv i 3 ml fordøje medier (2 mg/ml kollagenase D i lav glukose DMEM).
- Pellet celler og fryse i Recovery Media.
- Tilsæt 6 mL vækstmedier (GM; 79% skinke F12, 20% føtal kvægserum, 1% penicillin/streptomycin, 5 ng/mL grundlæggende fibroblast vækstfaktor [bFGF], pH 7,4, passeret gennem et 0,22 μm filter) til muskel gylle.
- Afpipettér suspensionen gennem en 70 μm-cellefilter i et 50 mL konisk rør. Skyl straineren med yderligere 4 mL GM.
Bemærk: Prøven kan overføres tilbage til et 15 mL konisk rør for at gøre det lettere at visualisere pellet. En større vaske volumen kan anvendes, hvis efterfølgende celle udbytter er lave. - Centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Aspirere supernatanten er sikker på ikke at forstyrre pellet. Svip røret for at resuspendere pellet i de resterende medier. Hvis cellerne ikke vil blive dyrket straks gå videre til trin 2.4.5 for instruktioner om langtidsopbevaring, ellers gå videre til trin 3.1.6.
Bemærk: Hvis der ønskes umiddelbar kultur, skal GM i cellekultur pladerne præinkuberet (trin 3.1.1 og 3.1.2), inden behandlingen med biopsi påbegyndes. - Tilsæt 1,5 mL af genvinding cellekultur frysning medier (tabel over materialer) til den gendannede pellet.
- Overfør gyllen til en cryovial. Kryovial placeres i en isopropanol-kontrolleret hastighed chiller natten over ved-80 °C. Opbevar cryovial ved-80 °C, indtil den er klar til kultur.
Bemærk: Cryovials, der indeholder gylle, kan opbevares i flydende nitrogen til langtidsopbevaring (mere end 1 måned). Ved hjælp af en isopropanol-kontrolleret sats chiller tillader celler at være reproducerbart frosset med en hastighed på 1 °C/min resulterer i optimale celle opsving satser som dokumenteret ved levedygtighed efter frysning og øget sandsynlighed for fastgørelse til cellekultur fartøjer9. Alternativt kan der anvendes et bægerglas, der indeholder RT isopropanol, som er anbragt i en-80 °C-fryser.
3. dyrkning af humane muskel progenitorceller
- Tø muskel opslæmningen.
- Forud for optøning og såning hmpc'er, præ-equilibrate cellekultur plader i GM. Tilsæt 250 μl GM til 4 brønde af en kollagen-belagt (kollagen I), 24-brønd cellekultur plade. Fyld de resterende brønde med 500 μL sterile base medier (dvs. F12) for at forhindre fordampning under langvarig kultur.
Bemærk: For biopsier mellem 50 g og 100 g, fire brønde af en 24-brønd plade er passende. Hvis biopsi vævet er mindre end 50 g, to brønde kan være mere passende. Restaffald og lavt celle nummer forhindrer brugen af en celle optællings teknik på dette trin; Derfor er den nøjagtige såning tæthed ikke bestemmes og varierer lidt fra biopsi til biopsi. - Inkuber cellekultur beholdere med GM ved 37 °C i 5% CO2 i 1 time før såning.
- Fjern cryovials fra-80 °C fryser og Placer i et 37 °C vandbad; væsken i røret skal være helt nedsænket i vand.
- Når optøning er næsten komplet (~ 5 min), overføres cryovial til en steril laminar flow hætte. Muskel opslæmningen overføres fra cryovial-røret, og der tilsættes et 15 mL konisk rør indeholdende 6 mL forvarmet GM med en hastighed på 1 mL/min.
- Centrifuger muskel opslæmningen ved 300 x g i 5 minutter ved rt.
Bemærk: En svingende spand centrifuge kan gøre det lettere at visualisere små pellets på dette trin, men er ikke afgørende. - Aspirere supernatanten er sikker på ikke at forstyrre pellet. Svip røret for at resuspendere pellet i de resterende medier og resuspendere i 1 mL GM.
- Overfør 250 μL af den opslæmmede pellet (nu betragtes som en hMPC suspension) til hver af de 4 brønde i den præ-inkuberet 24-brønden cellekultur plade.
- Forud for optøning og såning hmpc'er, præ-equilibrate cellekultur plader i GM. Tilsæt 250 μl GM til 4 brønde af en kollagen-belagt (kollagen I), 24-brønd cellekultur plade. Fyld de resterende brønde med 500 μL sterile base medier (dvs. F12) for at forhindre fordampning under langvarig kultur.
- Kultur og passage hMPCs.
- Opretholde hMPC-kulturer i GM ved 37 °C i 5% CO2.
Bemærk: Lagre af GM uden bFGF (dvs. F12, antibiotika, FBS) tilberedes i partier og opbevares ved 4 °C i op til 2 uger. bFGF tilsættes til GM på dagen for brug. Medier, der indeholder bFGF, kan opbevares i 48 h ved 4 °C. - Fireogtyve timer efter isolation, Aspirér GM, forsigtigt vaske kultur fartøj 2x med præ-varmet GM, og tilsæt frisk GM.
Bemærk: 24 timer skal give hMPCs tilstrækkelig tid til at vedhæfte; ingen Hmpc'er skal fjernes efter vask. Dette trin vil også fjerne resterende snavs, der blev genereret under celle høsten, hvilket gør fartøjet mere modtagelig for nøjagtig konfluence scanning ved hjælp af et billedbehandlings-flowcytometer (afsnit 5 nedenfor). Efter denne første medie ændring ændres GM hver 48 h. - Passage hMPCs når 70% sammenløbet er opnået, eller når de er forblevet på samme kultur skål i 10 dage, afhængigt af hvad der indtræffer først.
Bemærk: 70% Confluence er ca. 55.000 celler/cm2. - Til passage tilsættes 250 μL præ-varmet trypsin til hver brønd af en 24-brønd cellekultur plade og Inkuber i ~ 5 min.
- Tryk på cellekultur beholderen på en fast overflade for at frigøre hMPCs. Et let mikroskop kan bruges til at kontrollere, at Hmpc'erne er løsrevet.
- Trypsin/hMPC-suspensionerne overføres til 5 mL GM i et 15 mL konisk rør.
- Centrifuger hMPC-suspensionen ved 300 x g i 5 minutter ved rt.
- Fjern hMPC-suspensioner fra centrifugen og anbring den på isen i den sterile laminar flow hætte.
Bemærk: Holde hMPCs på isen under forbifarten resulterer i mindre celle aggregering. - Aspirér supernatanten fra hMPCs og resuspender forsigtigt pellet i 1 mL GM.
- Tæl celler ved hjælp af en hemocytometer eller en automatiseret celle tæller.
Bemærk: En 1:5 fortynding af cellesuspension til celle optællings buffer er generelt hensigtsmæssig. - Frø hMPCs på kollagen-coated kultur retter, der indeholder præ-varmet GM ved en tæthed på 3.500 celler pr cm2. En kombination af 10 cm plader og 24-brønd plader er ideel. 24-brøndens plader kan scannes dagligt på et billedbehandlings flowcytometer for at overvåge væksten.
- Følg samme procedure (begyndende ved trin 3.2.4.) for efterfølgende passager.
Bemærk: Cellernes sundhed og renhed kan overvåges på tværs af passager ved hjælp af en markør for cellulær senescens (f. eks. β-galactosidase) og immun farvning for Pax7.
- Opretholde hMPC-kulturer i GM ved 37 °C i 5% CO2.
- Cryopreserve Hmpc'erne.
- Cryopreserve overskydende celler til senere brug for at gøre kultur volumen mere håndterbar.
- For Kryopreservation, Følg trypsinserings proceduren beskrevet i trin 3.2.4.-3.2.9.
- Mens cellesuspensionen centrifugeres, skal der fremstilles en blanding af 20% (f. eks. 200 μL) dimethylsulfoxid (DMSO) og 80% (f. eks. 800 μL) GM. pipette op og ned 20x for at sikre tilstrækkelig blanding. Lad blandingen hvile på is.
- Baseret på celletal fortyndes hMPC-suspensionen til 2 x 106/ml i GM.
- Kombiner hMPC-suspensionen og den 20% sterile DMSO/80% GM-blanding 50/50. Det endelige cryopreservations medie er en kombination af DMSO (10%) og GM (90%) indeholdende 1 x 106 hmpcs/ml.
- 1 mL af hMPC-suspensionen, som er forberedt i trin 3.3.5, placeres i så mange kryovialer, som det oprindelige celletælling tillader. Placer derefter aliciterede Hmpc'er i en isopropanol-kontrolleret sats chiller i a-80 °C fryser natten over.
Bemærk: På dette trin, typisk mellem 5 og 15.000.000 celler opnås, 30 − 60% hvoraf er identificeret som hMPCs af FACS.
4. isolering af Pax7+ humane muskel progenitorceller via strømnings cytometri
- For at forberede Hmpc'er fra levende kulturer (trin 3.2.11), trypsinize nok kultur beholdere til 1 x 106− 2 x 106 samlede celler. Forbered celle suspensioner som beskrevet i trin 3.2.4 − 3.2.9.
- Forbered Hmpc'er fra kryopreserverede kulturer (trin 2.4.6 eller 3.3.6).
- Vælg 1 − 2 rør, der indeholder ~ 1 x 106 passage fire Hmpc'er for hver donor.
Bemærk: Brug passage fire Hmpc'er giver mulighed for passende celle udbytte, mens stadig opretholde proliferativ potentiale indtil passage seks (figur 2). - Hurtigt tø celler ved at fjerne dem fra-80 °C fryser og placere dem i en 37 °C vandbad med væsken i røret helt nedsænket.
- Når optøning er næsten komplet (~ 5 min), Overfør Hmpc'er til en steril laminar flow hætte og Overfør indholdet af cellesuspensionen til 6 mL forvarmet GM i et 15 mL konisk rør med en hastighed på 1 mL/min.
- Forbered celle suspensioner som beskrevet i trin 3.2.7 − 3.2.9.
- Resuspension hver pellet i 3 mL FACS buffer (500 mL PBS, 12,5 mL normal ged serum, 2 mL 0,5 M EDTA, pH 7,4, passeret gennem et 0,22 μm filter).
- Centrifuger cellesuspensionen ved 300 x g i 5 minutter ved rt.
- Aspirér supernatanten fra hMPCs og resuspender forsigtigt pellet i 250 μL FACS buffer; sted på is.
- Placer 100 μL af cellerne i et 1,7 mL mikrocentrifuge glas, og lad på isen anvendes som levende/døde kontroller (trin 4.5.1).
Bemærk: 100 UL af celler, der skal bruges til levende/døde kontroller kan komme fra at tage en lille volumen (~ 20 UL) af resuspenderede celler fra hver donor, der skal sorteres eller fra bankede celler.
Bemærk: det er vigtigt ikke at tage mere end 20 UL resuspenderede celler fra en enkelt donor. Bring volumen op til 100 UL med FACS buffer, hvis < 100 UL af celler er tilgængelig.
- Vælg 1 − 2 rør, der indeholder ~ 1 x 106 passage fire Hmpc'er for hver donor.
- Bejdsning af Hmpc'er til celleoverflade markører.
- Forbered følgende antistof cocktail (de viste beløb er for hver kultur, opskalering passende): 5 μL CD56 (Neural celle adhæsions molekyle [NCAM]; PE-Cy7-konjugeret) og 5 μL CD29 (β1-integrin; AlexFluor488-konjugeret). Den endelige antistof fortynding er 1:50.
- Tilsæt 10 μL antistof cocktail til hver hMPC suspension og Inkuber på is i 30 minutter i mørket.
- Tilsæt 10 mL FACS buffer til hver suspension/antistof cocktail blanding.
- Centrifuger hvert rør ved 300 x g i 5 minutter ved RT.
- Resuspension af pellet i 300 μL FACS buffer og overførsel til en 5 mL rund bund polystyren tube.
- Hold suspensionen på is og beskyttet mod lys.
- Forbered kompensation perler.
Bemærk: positive kontroller for hvert antistof og en negativ kontrol (unstained perler) bør forberedes ved hjælp af kompensation perler. Kontrol af kompensations perler skal udføres på flowcytometer, inden prøverne sorteres. Disse kontroller gør det muligt at fastslå, hvor meget vha fra hvert antistof kan påvises i den anden kanal, så der kan anvendes kompensation.- Vortex kompensation perler.
- I tre 1,7 mL mikrocentrifuge glas tilsættes en dråbe (50 μL) af kompensations perler.
- Tilsæt 1 μL af hvert antistof til det relevante rør, eller ingen til den negative kontrol.
- Inkuber i mørket i 15 min.
- Tilsæt 1,5 mL FACS buffer til hvert rør og vortex.
- Centrifuger hvert rør ved 300 x g i en bordplade centrifuge i 5 minutter ved rt.
- Aspirér supernatanten og resuspension af pellet i 200 μL FACS buffer.
Bemærk: Pellet kan være meget vanskeligt at visualisere; der skal udvises forsigtighed ved aspirering af supernatanten. - Placer suspensionen i en 5 mL rund bund polystyren tube og derefter holde røret på is og beskyttet mod lys.
- Forbered levende og døde kontroller.
- Del 100 μL af Hmpc'erne fra trin 4.2.8 til to 1,7 mL mikrocentrifuge glas (én til livekontrol og én til dødens kontrol).
- Anbring det døde kontrolrør i en varmeblok, der er forvarmet til 70 °C i > 10 min. I løbet af denne tid, holde livekontrol på isen.
- Centrifuger hvert rør ved 300 x g i en bordplade centrifuge i 5 minutter ved rt.
- Aspirér supernatanten og resuspension af pellet i 150 μL FACS buffer.
- Kombiner de levende/døde Kontroller i en enkelt 5 mL rund bund polystyren tube.
- Udfør levedygtighed farvning.
- Tilsæt 1 μL 7-aminoactinomycin D (7-AAD) til alle rør, der indeholder celler, som skal sorteres, og den levende/døde kontrol.
- Tilsæt GM til kollagen belagt 24-brønd (250 μL/brønd) og 10 cm (8 mL/brønd) plader og gør det muligt at ækvibrere i en cellekultur inkubator ved 37 °C i 5% CO2.
- Sortér hMPCs via flowcytometri.
- Sorter Hmpc'er på et flow flowcytometer med 100 μm dyse ved et tryk på 20 psi. Bestem Live hMPCS baseret på side-og Forward scatter samt 7-AAD negativitet (sorteringsparametre og en repræsentativ sortering kan ses i figur 3).
- Celler, der er positive for PE-Cy7 (780/60 nm) og AlexFluor488 (530/30 nm), repræsenterer CD56+/Cd29+ celler og er således Pax7 positive celler (hmpc'er). Sorter dobbelte positive celler i opsamlings slanger, der indeholder en 300 μL pude af FACS buffer.
Bemærk: Renheden af sorterede kulturer kan bestemmes ved immunofarvning for Pax7 efterfulgt af en downstream-flow cytometri-analyse (figur 4). - Kassér alle andre celler.
- Overfør de sorteres celler til et 15 mL konisk rør.
- Drej hMPC-affjedringen ved 300 x g i 5 minutter ved rt.
- Aspirér forsigtigt supernatanten og resuspension i 1 mL GM.
- Tæl celler ved hjælp af en hemocytometer eller en automatiseret celle tæller.
Bemærk: Mens antallet af celler kan udledes som antallet af hændelser, der er positivt sorteret, er denne optælling blevet fundet for at overvurdere antallet af celler med 10 − 40% sammenlignet med traditionelle celle optællingsmetoder. - Seed Hmpc'erne som beskrevet i trin 3.2.11.
Bemærk: Verifikation af hMPC-befolkningens renhed kan bestemmes ved immunofarvning for Pax7 og analyse via flowcytometri.
5. karakterisering af humane muskel progenitorceller (hMPC) kulturer ved hjælp af en billeddannelse cytometer
-
Brug billedbehandlings flowcytometer (tabel over materialer) til at udføre konfluence scanninger.
- Vælg Opret ny scanning , og Indtast/Vælg derefter plade kategorien, plade profilen og plade-id'et. Billedbehandlings flowcytometer kan rumme 96, 24 og 6 brønd plader.
- Under applikationskal du vælge sammen løbet ≫ konfluence 1.
- Vælg en brønd for at se ved hjælp af Navigator til højre på skærmen.
- Find et plan med fokus, hvor cellerne ser hvide ud i forhold til baggrunden, og vælg Registrer manuelt , eller Tillad billedbehandlings flowcytometer at vælge fokusplanet ved at vælge Registrer automatisk.
Bemærk: For de 96 brønd plader, der er foreslået i tabellen over materialer, er en omtrentlig position 4,3 enheder. - Brug musen til at fremhæve alle brønde, der skal scannes. Hele brønd området vil automatisk blive scannet. Vælg Start scanning.
- Vælg analyseindstillinger, som er optimale for plade og celletype.
Bemærk: For hMPCs er følgende indstillinger optimale: intensitet = 6, mættet intensitet = 0, diameter = 8, mindste tykkelse = 3, min klyngestørrelse = 500 og præcision = høj. - Vælg Start analyse.
Bemærk: Visuelt inspicere billeder for at sikre, at brugeren og billedbehandlings flowcytometer enige om omkredsen af celler. Hvis der er en stor uoverensstemmelse, scannes pladen igen med et andet fokus plan eller forskellige analyseindstillinger. Konfluence scanning kan bruges til at sammenligne vækst mellem kulturer, tid administration af en behandling, eller til at overvåge celler og beslutte, hvornår at indlede differentiering. Hvis der ønskes differentiering, angives detaljerne i afsnit 6.
-
Brug billedbehandlings flowcytometer til at tælle celler.
- Der fremstilles en farvningsopløsning indeholdende 12 mL skinke F12, 6 μL Hoechst 33342 og 24 μL propidium Iodid.
- Aspirér mediet og Udskift med Farvningsopløsningen, Inkuber ved 37 °C i 15 minutter.
- Aspirer Farvningsopløsningen og Udskift med skinke F12.
Bemærk: Det er vigtigt at bruge et medie med lave niveauer af phenol rødt for at opnå klare billeder. Alternativt kan PBS anvendes. - Læg pladen på billedbehandlings flowcytometer, og vælg cellens levedygtighed under applikation ≫ Live + Dead + total. Den levende kanal vil være en lys felt billede, den døde kanal vil være propidium iodide, og den samlede kanal vil være Hoechst 33342.
- Indstil Live Channel til Bright-feltet, og klik på Registrer automatisk under fokus opsætning.
- Indstil kanalen til blå under den samlede kanal. Brug Find fokus til at bringe kerner i fokus eller bruge op og ned pilene til manuelt at indstille fokus. Klik på Angiv forskydning for at vælge fokus.
- Indstil kanalen til rød under den døde kanal. Brug Find fokus til at bringe de døde celler i fokus eller bruge op og ned pilene til manuelt at indstille fokus. Klik på Angiv forskydning for at vælge fokus.
- Vælg Start scanning for at starte scanningen.
- Vælg de analyseparametre, der passer til pladen og celle typen. Vælg Start analyse for at starte analysen. Efter analysen er afsluttet, visuelt kontrollere, at analysen er passende tælle celler (f. eks, for den samlede kanal kontrollere, at hver kerne er ved at blive anerkendt som en kerne, og at billedbehandlings flowcytometer ikke tælle nogen pletter i baggrunden, som kerner). Hvis scanningen og analysen er tilfredsstillende, returneres pladen til inkubator, ellers genscannes eller ændres analyseparametre.
6. differentiering af humane Muskelprogenitorceller (Hmpc'er) til Myotubes
- Fastlægge hMPC-konfluensen ved hjælp af protokollen i afsnit 5,1. For at skelne hMPCs i myotubes, er det ideelt for celler at være 80 − 85% konflydende som bestemt af konfluence funktionen på billedbehandlings flowcytometer (se punkt 5). Hvis der anvendes Hmpc'er fra mere end én unik donor, tillader konfluence scanning celler fra forskellige donorer at begynde differentieringen på det tidspunkt, hvor de når sammenløbet.
Bemærk: Ved 80% sammenløbet er der ca. 66.000 celler/cm2. - Vask cellerne 2x med differentierings mediet (97% Hams F12, 2% equin serum, 1% penicillin/streptomycin, pH 7,4, passeret gennem et 0,22 μm filter).
- Vedligehold celler i differentierings medier, så længe eksperimentet dikterer, mens du skifter medie dagligt.
- Direkte vurdering af myotube dannelse ved immun farvning for embryonale myosin tunge kæde, som typisk detekteres efter 7 − 10 dages differentiering.
Bemærk: Den tid, det kræver at danne myotubes, kan variere en smule afhængigt af donor og antal celler, når differentieringen blev påbegyndt; Det anbefales derfor, at kulturer fra hver donor overvåges individuelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative flow cytometri resultater af hMPC isolation fra humant muskelvæv kan ses i figur 1. Hmpc'er kan identificeres ved første gating begivenheder baseret på side scatter og Forward scatter for at eliminere døde celler eller snavs, efterfulgt af kun at vælge celler, der er negative for 7-AAD og derfor er levedygtige. Valg af celler, som er positive for både celleoverflade mærkerne CD56 og CD29 repræsenterer hMPC-populationen. En biopsi på 60 mg giver kun ca. 75 − 250 Hmpc'er.
Der vises en repræsentativ konfluence-scanning i figur 2a. De grønne konturer i figur 2b blev genereret af billedbehandlings flowcytometer og viser, hvordan billedbehandlings flowcytometer fastlægges ud fra de valgte analyseindstillinger. I begge viste billeder er sammenløbet bestemt af billedbehandlings flowcytometer enig i den sammentræf, som brugeren visuelt har bestemt. Men disse billeder også fremhæve, at billedbehandlings flowcytometer ikke er perfekt. For eksempel fremhæver den røde pil en ufuldkommenhed i pladen, der tælles som celler. Hvis et stort antal af disse ufuldkommenhed er til stede på pladen, vil den resulterende sammenløbet ikke præcist repræsentere sammenløbet af cellerne. Figur 2c viser en repræsentation af alle tre kanaler, der bruges til at tælle celler (brightfield, Blue og Red) og det fusionerede billede. Figur 2D viser heterogenitet mellem donorer. At opdage og præcist karakterisere denne heterogenitet er en vigtig applikation af billedbehandlings cytometer. Figur 2E viser, at konfluence målinger og kerner tæller fra unikke donorer er meget korrelerede.
Figur 3 indeholder en retningslinje for, hvordan du identificerer Hmpc'er baseret på den FACS-procedure, der er beskrevet i denne protokol. Gating baseret på fremad og side scatter giver mulighed for adskillelse af levedygtige celler fra snavs (figur 3a). En sammenligning af forlæns scatter for højde til fremad scatter efter område blev brugt til at skelne mellem hændelser, der repræsenterer enkeltceller (det boxed område i figur 3b). Levedygtige celler er præget af manglende inkorporering af levedygtigheden plet 7-AAD (figur 3c). Endelig er celler, der er positive for både CD56 og CD29, identificeret som Hmpc'er (figur 3D). For at validere den FACS-procedure, der er beskrevet i denne protokol, kan udvælgelsen af Pax7 positive celler bestemmes af immunofarvnings celler med et Pax7-specifikt antistof og måle udtryk på et flowcytometer. Figur 4 sammenligner antallet af Hmpc'er som fastlagt ved Pax7 immunofarvning (figur 4a) i forhold til FACS-proceduren (figur 4b), som er beskrevet i denne protokol fra den samme population af celler. I figur 5 anvendes Pax7 immunofarvning og analyse via flowcytometri til at vise tilsætning af Pax7 celler i den samlede population efter FACS (figur 5a sammenlignet med figur 5b) samt opretholdelse af antallet af Pax7 at udtrykke celler efter passaging (figur 5b sammenlignet med figur 5c).
Hmpc'er kan differentieres til at danne myorør ved at følge afsnit 6. For at afgøre, om isolerede Hmpc'er vedligeholder myogene kapacitets celler kan være immun plettet med et antistof specifikt for embryonale myosin tunge kæde og visualiseret ved hjælp af fluorescerende mikroskopi. Repræsentative billeder af embryonale myosin tunge kæde positive myotubes kan ses i figur 6.
Figur 1 : Repræsentative flow flowcytometri billeder til hmpcs sorteret direkte ud af muskelbiopsi væv. (A) side punkt område (y-akse) vs. Forward scatter område (x-akse) gating strategi, der bruges til at identificere alle celler i en donor prøve. (B) 7-Aad levedygtighed Stain (y-aksen) vs. Forward scatter (x-akse) for at identificere levende celler. (C) negativ udvælgelse sorterings markør profil (-CD11b,-CD31,-CD45,-glya [y-akse]) vs. markeringsmarkør CD34. (D) negativ markeringsmarkør CD34 (y-akse) vs. den positive markeringsmarkør CD29. E Positiv markeringsmarkør CD56 (y-akse) vs. den positive markeringsmarkør CD29 (x-aksen). F Udbytter fra tre forskellige skeletmuskulatur biopsier. FSC = Forward scatter; SSC = side scatter; Hmpc'er, humane muskel progenitorceller.
Figur 2 : Proliferativ potentiale af Hmpc'er afledt af humane donorer opretholdes efter 6 passager. (A) Repræsentativ konfluence scanning. (B) repræsentativ konfluence scanning med grønne konturer, der viser, hvordan billedbehandlings flowcytometer bestemmes sammenløbet. Den røde pil viser en ufuldkommenhed på pladen. C) repræsentativt brightfield, Hoechst 33342 (Blue) og propidium iodide (rød) farvning og et fusioneret billede af disse tre kanaler. Skala stænger = 1mm. (D) kerner tæller fra 6 unikke donorer højdepunkter HMPC heterogenitet. (E) sammenløbet og kerner tæller er meget korreleret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Repræsentative flow cytometri-sorteringsparametre for hMPC-isolation. (A) side punkt område (y-akse) vs. Forward scatter område (x-akse) gating strategi, der bruges til at identificere alle celler i en donor prøve. (B) forlæns punkt højde (y-akse) vs. Forward scatter-område (x-akse) for at diskvalificere form fra sorterings populationen. (C) forlæns punkt højde (y-akse) vs. 7-Aad inkorporering for at identificere levedygtige celler. (D) PE-CY7 (CD56) vs. AF488 (CD29) farvning med Q2, der repræsenterer dobbelte positive celler (Hmpc'er). Farve repræsenterer tætheden af hændelser.
Figur 4 : Sammenligning af CD29/CD56 positivitet vs. Pax7 positivitet i passage 4 Hmpc'er fra den samme donor. (A) count (y-akse) vs. Pax7 Expression (x-aksen). B Positiv markeringsmarkør CD56 (y-akse) vs. positiv markeringsmarkør CD29 (x-akse). NCAM = neurale celle adhæsions molekyle; hMPC = humant muskel progenitorcelle.
Figur 5 : Pax7 positivitet bevares i Hmpc'er afledt af den samme donor over flere passager. (A) Pax7 ekspression (x-akse) af celler, der var blevet urerne 4 gange før FACS sortering. (B) Pax7 udtryk (x-akse) af hMPCs 1 passage efter FACS sortering for CD29 og CD56 positivitet (5 samlede passager). (C) Pax7 udtryk (x-akse) af hMPCs 2 passager efter FACS sortering for CD29 og CD56 positivitet (6 samlede passager).
Figur 6 : Farvning af hMPC-afledte myotubes til embryonale myosin-tunge kæde. Repræsentative mikroskopiske billeder af differentierede Hmpc'er, som er co-plettet med DNA-pletter (Hoechst 33342, blå) og embryonale myosin tunge kæde (grøn) (n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Primære hmpc'er er en vigtig forskningsmodel, der bruges til at forstå skeletmuskulatur biologi og den regenerativ proces. Derudover har Hmpc'er potentialet til at blive brugt til behandling. Der er dog anerkendte udfordringer ved at bruge primære Hmpc'er til både forskning og terapi, herunder den begrænsede forståelse af celler afledt af mennesker10. Der er også en stor grad af variation i ekspansions kapaciteten blandt donor kulturer, som begrænser potentialet for brug af Hmpc'er og kan påvirke forskningsresultater11. For eksempel er det for nylig blevet påvist, at hMPCs isoleret ved hjælp af metoden beskrevet i denne protokol producerede celler, der varierede i ekspansions kapacitet, og dette blev drevet af transkriptional profil, der ikke er justeret med køn eller alder11.
Her præsenterer vi en effektiv og høj udbytte metode til isolering af Hmpc'er i tilstrækkelige mængder til en række downstream-anvendelser, herunder differentiering i myotubes, og dermed modellering af den myogene proces in vitro. Vores metode er baseret på FACS at isolere CD56+/CD29+ celler, som tidligere er blevet identificeret som repræsenterer en beriget Pax7 udtrykker befolkning12. Andre lige så gyldige celle sortering strategier er også blevet beskrevet5,6.
Det vigtigste aspekt ved vores hMPC-Isolations-og kultur metode er den omhyggelige overvågning af de enkelte kulturer. Donor-baserede heterogenitet omfatter antallet af Hmpc'er opnået fra hver biopsi, deres tid til at indlede spredning in vitro, og deres befolkning ekspansion sats. Derfor, hvis forskelle i myotube dannelse efter en behandling er spørgsmålet om interesse individuel, hMPC kulturer bør skiftes til behandling baseret på et konfluence niveau bestemmes a priori og vurderes objektivt ved hjælp af billedbehandlings cytometer.
Vores metode til at isolere og kultur hMPCs er blevet optimeret til at opnå udbytter af celler i de millioner for in vitro eksperimenter fra relativt lidt start biopsi væv (50 − 100 mg). Den største fordel ved denne fremgangsmåde er, at flere analyser og eksperimenter kan udføres på Hmpc'er fra den samme donor, hvilket giver mulighed for vedligeholdelse af donor fænotype på tværs af eksperimenter, samtidig med at der indføres lidt intereksperiment variabilitet. Vores metode adskiller sig fra nyligt offentliggjorte metoder, der fokuserer på udvinding af den reneste population af Pax7 ekspanderende celler direkte ud af biopsi væv, hvor fokus er xenotransplantation8. Udfordringen med disse tidligere metoder er imidlertid, at de kræver en start vævs vægt på mere end et gram. Derfor, de er ikke praktisk for forskning, der involverer humane skeletmuskulatur biopsier. En begrænsning af vores metode er, at potentialet for xenotransplantation ikke er blevet vurderet. Denne type procedure var imidlertid ikke en af de oprindeligt påtænkte downstream-ansøgninger. Denne metodes fremtidige anvisninger kan omfatte vurdering af hMPCs ' engraftment-kapacitet efter at have gennemgået vores isolations procedure for at afgøre, om der er mulighed for at anvende denne procedure i MPC-transplantations undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Cornell University, bioteknologi Resource Center Imaging facilitet for deres hjælp med fluorescens aktiveret celle sortering. Vi takker også Molly Gheller for hendes hjælp med deltageren rekruttering og Erica Bender for at gennemføre skeletmuskulatur biopsier. Endelig takker vi deltagerne for deres tid og deltagelse i studiet. Dette arbejde blev støttet af det nationale Institut for aldring af de nationale institutter for sundhed under Award nummer R01AG058630 (til B.D.C. og A.E.T.), af en Glenn Foundation for Medical Research og American Federation for aging forskning Grant for Junior Faculty (til B . D.C.), og af præsidentens råd for Cornell Women (til A.E.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels |
| 10 cm cell culture plate | VWR | 664160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352196 | 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols |
| 24 well cell culture plate | Grenier Bio-One | 662 160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Viability stain for identifying living cells during FACS sorting |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Conjugated antibody for FACS |
| Black 96-well cell culture plate | Grenier Bio-One | 655079 | 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S |
| Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Imaging cytometer used to track hMPC cultures | |
| Cell Strainer | VWR | 352350 | Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing |
| Collagen Type I (Rat Tail) | Corning | 354236 | Collagen for coating cell culture plates |
| Collagenase D | Roche | 11 088 882 001 | Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | WN182 | Used for cryopreservation of hMPCs |
| Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder | Gibco | 31600-034 | Low glucose DMEM for muscle biopsy processing |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 21600-010 | PBS for muscle biopsy processing |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | J.T. Baker | 4040-01 | Required for FACS buffer |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 89510-186 | Fetal bovine serum used for hMPC growth media |
| Ham's F12 | Gibco | 21700-026 | Base media for hMPCs |
| Heat Inactivated Equine Serum | Gibco | 26-050-070 | Horse serum used to make hMPC differentiation media |
| Hemocytometer | iNCyto | DHC-N0105 | Used to count cells |
| Hibernate A | Gibco | A1247501 | Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Life Technologies | H21492 | DNA stain for identifying all cells using the Celigo S |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Used for controlled rate freezing of hMPCs |
| Moxi buffer | Orflo | MXA006 | Buffer for automated cell counter |
| Moxi Cassettes | Orflo | MXC002 | Cassesttes for automated cell counter |
| Moxi z Mini Automated Cell Counter | Orflo | Automated cell counter | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Commerically available controlled rate cell freezing container |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Goat serum used in FACS buffer |
| PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Conjugated antibody for FACS |
| Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Corning | 30-002-CI | Antibiotics added to culture media |
| Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S |
| Recombinant Human basic fibroblast growth factor | Promega | G5071 | Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Gibco | 12648-010 | Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | Added to Ham's F12 |
| Sterile Round Bottom 5 mL tubes | VWR | 60818-565 | Tubes used for FACS |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Compensation beads fort calibrating flow FACS settings |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- D'Souza, D. M., et al. Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling. Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).
- Scheele, C., et al. Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
- Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).
- Charville, G. W., et al. Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Alexander, M. S., et al. CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies. Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).
- Thalacker-Mercer, A., et al. Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy. Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).
- Garcia, S. M., et al. High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells. Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).
- Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Cryopreservation and thawing of cells. Current Protocols in Immunology. , Appendix 3, 3G (2012).
- Bareja, A., Billin, A. N. Satellite cell therapy - from mice to men. Skeletal Muscle. 3 (1), 2 (2013).
- Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity. Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).
- Xu, X., et al. Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles. Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).
