Isolatie, cultuur, karakterisering, en differentiatie van menselijke spier voorlopercellen van de skeletspier biopsie procedure

Summary

We presenteren technieken voor het isoleren, kweken, karakteriseren en differentiëren van menselijke primaire spier voorlopercellen (Hmpc's) verkregen uit skeletspieren biopsie weefsel. hmpc's verkregen en gekenmerkt door middel van deze methoden kunnen worden gebruikt om vervolgens onderzoek vragen met betrekking tot menselijke myogenese en skeletspier regeneratie aan te pakken.

Abstract

Het gebruik van primair menselijk weefsel en cellen is ideaal voor het onderzoeken van biologische en fysiologische processen zoals het regeneratief proces van skeletspieren. Er zijn erkende uitdagingen voor het werken met humane primaire adulte stamcellen, met name menselijke spier voorlopercellen (Hmpc's) afgeleid van de skeletspieren biopsies, met inbegrip van lage celopbrengst van verzamelde weefsel en een grote mate van donor heterogeniteit van groei en dood parameters onder culturen. Hoewel het opnemen van heterogeniteit in een experimenteel ontwerp een grotere steekproefgrootte vereist om significante effecten te detecteren, kunnen we ook mechanismen identificeren die de variabiliteit in het uitbreidings vermogen van de hMPC ten grondslag liggen, waardoor we beter kunnen begrijpen heterogeniteit in skeletspieren regeneratie. Nieuwe mechanismen die het uitbreidings vermogen van culturen onderscheiden hebben het potentieel om te leiden tot de ontwikkeling van therapieën om de regeneratie van de skeletspieren te verbeteren.

Introduction

Skeletspieren is het grootste orgaansysteem in het menselijk lichaam, dat 30 − 40% van het hele lichaam massa¹. Naast zijn goed erkende rol in motoriek, skeletspieren handhaaft lichaamstemperatuur en houding, en speelt een centrale rol in het hele lichaam nutriënt homeostase. Onderzoek waarbij menselijke deelnemers, dieren en celkweek modellen betrokken zijn, zijn allemaal waardevol om vragen te beantwoorden die betrekking hebben op de biologie en regeneratie van skeletspieren. Isolatie en cultuur van menselijke primaire spier voorlopercellen (Hmpc's) biedt een robuust model waarmee celkweek technieken en manipulaties kunnen worden toegepast op menselijke monsters. Een voordeel van het gebruik van hmpc's is dat zij het genetische en metabole fenotype van elke donor^2,3behouden. Door het onderhoud van het fenotype van de donor kunnen onderzoekers de Inter-individuele variatie in het myogene proces onderzoeken. We hebben bijvoorbeeld onze hMPC-karakterisatie methode gebruikt om leeftijds-en geslachts verschillen in de hMPC-uitbreidingscapaciteit⁴te identificeren.

Het doel van dit protocol is om gedetailleerde technieken te isoleren, cultuur, karakteriseren, en differentiëren hMPCs van skeletspieren biopsie weefsel. Voortbouwend op eerder werk dat hmpc's beschreef en potentiële celoppervlakte makers voor hmpc Isolation^5,6identificeerde, vult dit protocol een kritieke kloof in kennis door de isolatie te koppelen aan de karakterisering van hmpcs. Verder maken de gedetailleerde stapsgewijze instructies in dit protocol hMPC-isolatie en karakterisering toegankelijk voor een breed wetenschappelijk publiek, inclusief mensen met beperkte voorafgaande ervaring met hMPCs. Ons protocol is een van de eersten die het gebruik van een beeldvormings cytometer beschrijven om celpopulaties te volgen. Nieuw ontworpen beeldvormings Cytometers zijn State-of-the-Art, high-throughput en Microplate-gebaseerd, waardoor Live-celbeeldvorming, celtellingen en meerkanaals fluorescentie analyse van alle cellen in elke put van een kweek vaartuig binnen enkele minuten mogelijk is. Dit systeem zorgt voor een snelle kwantificering van dynamische veranderingen in de proliferatie en levensvatbaarheid van een volledige celpopulatie, met slechts minimale verstoring van de cultuur. Zo kunnen we op opeenvolgende dagen in vitro objectieve maatregelen van samenvloeiing uitvoeren om de groei kinetiek van elke uit verschillende donoren afkomstige cultuur te bepalen. Veel protocollen in de literatuur, met name die met betrekking tot de differentiatie van de Mpc's, vereisen dat cellen een bepaald niveau van samenvloeiing bereiken voordat differentiatie of behandeling⁷wordt gestart. Onze methode zorgt voor een objectieve bepaling van de samenvloeiing van elke put in een kweek vaartuig, waardoor onderzoekers de behandeling op een onbevooroordeelde, niet-subjectieve manier kunnen initiëren.

In het verleden was een grote beperking van het gebruik van primaire Hmpc's lage opbrengsten die het aantal beschikbare cellen voor experimenten beperken. Wij en anderen hebben aangetoond dat de opbrengst van de Mpc's van skeletspieren biopsie weefsel is 1 − 15 MPCs per milligram weefsel (Figuur 1)⁸. Omdat ons protocol vier passages van de cellen toestaat voorafgaand aan zuivering met fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), zijn onze cryopreserved hMPC-opbrengsten, afgeleid van kleine hoeveelheden biopsie weefsel (50 − 100 mg), voldoende om onderzoeksdoelen te adressen waar Er zijn meerdere experimenten vereist. Ons FACS-protocol produceert een ~ 80% pure (Pax7 positive) MPC populatie, dus ons protocol is geoptimaliseerd voor zowel opbrengst als zuiverheid.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door de institutioneel beoordelings Raad van de Cornell-universiteit. Alle deelnemers werden gescreend op onderliggende gezondheidsomstandigheden en gaven geïnformeerde toestemming.

1. het verkrijgen van menselijk spierweefsel via de skeletspieren biopsie

1. Identificeer de spier van de quadriceps lateralis via palpatie, anatomische monumenten en actieve contractie van de spier.
2. Palpate de quadriceps lateralis door de deelnemer hun quadriceps spier aan te spannen en de buik van de spier te vinden, ongeveer 1/3 van de weg van de Patella naar de heup, en gewoon ventrolaterale naar het dijbeen.
3. Gebruik een papier meetlint om een gebied te markeren met een chirurgische marker over 4 − 6 inches van de bovenkant van de Patella die de buik van de spier vertegenwoordigt.
4. Scheer elk haar in de buurt van het gemarkeerde gebied en reinig vervolgens met een chirurgische graad antisepticum dat wordt gebruikt voor medische procedures (bijvoorbeeld: 2% chloorhexidine gluconaat (CHG)/70% isopropylalcohol (IPA)).
5. Anesthetiseer de biopsie site met 1% lidocaïne.
   Opmerking: Vermijd het injecteren van de lidocaïne in de skeletspieren.
6. Maak een 4 − 5 mm incisie traject op de gemarkeerde plaats.
7. Nadat het gebied is verdotseerd, duw een Bergstrom naald met trocar door de fascia in de buik van de spier (ongeveer 2 − 3 cm).
8. Trek spierweefsel in de Bergstrom-naald door de snijtrocar 2 − 3 cm uit te trekken terwijl een assistent zuigkracht toepast door een bijgevoegde 60 mL zuiger van de spuit op te trekken.
9. Sluit de snij kamer.
10. Draai de basis van de biopsie naald een kwartslag en herhaal de volgorde van het openen van de naald, het aanbrengen van zuigkracht en het sluiten van de naald.
    Opmerking: Elke keer dat de naald wordt gesloten, een snede van spierweefsel moet worden verkregen binnen de Bergstrom naald. Tijdens de monsterafname blijft de naald in de dij in dezelfde verticale positie terwijl deze in de lengterichting wordt gedraaid tot 360 ° om elk monster te verkrijgen. Deze sequentie kan 3 − 4 keer herhaald worden.
11. Verdrijven het verzamelde biopsie weefsel van de naald in een steriel niet-aanhandig dressing pad.
12. Onderzoek het weefsel en verwijder zichtbare vetweefsels en fibrotische weefsels met behulp van steriele scalpel bladen of pincet.
13. Breng een portie (50 − 100 mg) weefsel in een steriele buis met CO₂-onafhankelijk nutriënt medium (bijv. slaapstand a).
    Opmerking: Het gewicht van het weefsel wordt als volgt bepaald. Plaats eerst de afgetopte buis met het nutriënt medium op een schaal en Tare. Volgende plaats het weefsel in de buis, Recap de buis, en Weeg vervolgens de buis met het weefsel in het nutriënt medium.
14. Bewaar de buis met het weefsel en het nutriënt medium bij 4 °C tot de verwerking.
    Opmerking: Biopsie weefsel moet worden verwerkt binnen 48 h van de inzameling.

2. isoleren van menselijke spier voorlopercellen van biopsie weefsel

1. Mince biopsie weefsel.
   1. Breng het spierweefsel van het nutriënt medium over in een steriel Petri schaaltje in een biologische veiligheidskast of een vergelijkbare steriele werkplek.
   2. Gebruik steriele scalpel messen om weefsel te gehakt in ~ 1 mm³ stuks.
2. Wassen van gehakt biopsie weefselresten resten verwijderen.
   1. Breng het spierweefsel over in een conische buis van 15 mL met 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en laat het weefsel zich via de zwaartekracht vestigen.
   2. Aspireren de supernatant wordt voorzichtig niet te verstoren het spierweefsel.
   3. Voeg 10 mL PBS toe aan het gewassen weefsel en laat het spierweefsel zich via de zwaartekracht herschikken.
   4. Aspireren de supernatant wordt voorzichtig niet te verstoren het spierweefsel.
   5. Voeg 10 mL lage glucose Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) toe en laat het weefsel zich via de zwaartekracht herschikken.
   6. Aspireren de supernatant wordt voorzichtig niet te verstoren het spierweefsel.
3. Inincuberen van het weefsel in Digest media.
   1. Respendeer het spierweefsel in 3 mL Digest-media (2 mg/mL Collagenase D in lage glucose-DMEM).
      Opmerking: Collagenase D-stamoplossingen kunnen worden bereid op 20 mg/mL in lage glucose-DMEM en opgeslagen bij-80 °C, vervolgens verdund 1:10 in lage glucose-DMEM op het moment van gebruik.
   2. Inincuberen de buis met het spierweefsel in een waterbad van 37 °C gedurende 30 minuten.
   3. Triturate de spierweefsel suspensie elke 10 min met behulp van een 10 mL serologische pipet of een Wide Bore pipet.
   4. Voeg 83 μL extra Digest-media en 24 μL dispase oplossing (0,76 mM Calciumacetaat, 1,39 mM Natriumacetaat, 13,91 mg/mL dispase II in lage glucose-DMEM) toe. De suspensie terugbrengen naar het waterbad van 37 °C.
   5. Triturate de spier suspensie elke 5 − 10 min met een pipetpunt met brede boring.
   6. Ga door met de trituratie totdat er een uniforme slurry wordt bereikt, en niet langer dan 1,5 h om de spijsvertering te voorkomen.
      Opmerking: Voldoende hakken van het weefsel en de enzymatische activiteit van Collagenase en dispase kunnen de spijsvertering van het monster beïnvloeden. Een uniforme slurry moet in staat zijn om een normale pipetpunt te passeren met minimale occlusie na 1,5 h. Als na 1,5 h geen uniforme slurry wordt bereikt, controleer dan of de weefsel gehakt voldoende is, en het weefsel wordt fijngemalen tot de juiste grootte (stap 2.1.2). Bovendien, de activiteit van de enzymen moet worden getest als lot-to-lot variatie in enzymatische activiteit doet zich voor.
4. Pellet cellen en bevriezen in herstelmedia.
   1. Voeg 6 mL groeimedia toe (GM; 79% Ham's F12, 20% foetaal runderserum, 1% penicileen/streptomycine, 5 ng/mL basis fibroblast groeifactor [bFGF], pH 7,4, doorgegeven via een 0,22 μm filter) aan de spier slurry.
   2. Pipetteer de suspensie door een celzeef van 70 μm in een conische buis van 50 mL. Spoel de zeef af met een extra 4 mL GM.
      Opmerking: Monster kan terug worden overgebracht in een conische buis van 15 mL voor het gemak van het visualiseren van de pellet. Een groter reinigings volume kan worden gebruikt als de volgende celopbrengsten laag zijn.
   3. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
   4. Aspireren het supernatant zeker niet te verstoren van de pellet. Veeg de buis om de pellet in de resterende media te hervatten. Als cellen niet gaan worden gekweekt onmiddellijk gaan naar stap 2.4.5 voor instructies over de lange termijn opslag, anders gaat u naar stap 3.1.6.
      Opmerking: Als onmiddellijke cultuur gewenst is, moet GM in celkweek platen vooraf worden geïnnobeerd (stappen 3.1.1 en 3.1.2) voordat de biopsie begint.
   5. Voeg 1,5 mL van de herstel celcultuur bevriezing van media (tabel van materialen) aan de herstelde pellet.
   6. Breng de slurry over in een cryovial. Plaats de cryovial in een met isopropanol geregelde debiet koeler, 's nachts bij-80 °C. Bewaar cryovial bij-80 °C tot de cultuur klaar is.
      Opmerking: Cryoflacons die slurry bevatten, kunnen worden bewaard in vloeibare stikstof voor langdurige opslag (langer dan 1 maand). Door gebruik te maken van een door isopropanol gestuurde debiet-koeler kunnen cellen met een snelheid van 1 °C/min worden gereproduceerd, wat resulteert in optimale celterugwinnings snelheden, zoals blijkt uit de levensvatbaarheid na bevriezing en toegenomen waarschijnlijkheid van gehechtheid aan celkweek vaten⁹. Als alternatief kan een bekerglas met RT isopropanol, geplaatst in een vriezer van 80 °C, worden gebruikt.

3. culturing menselijke spier voorlopercellen

1. De spier slurry ontdooien.
   1. Voorafgaand aan het ontdooien en zaaien van Hmpc's, pre-equilibraten celkweek platen in GM. Voeg 250 μL GM toe aan 4 putjes van een met collageen bekleed (collageen I), 24-Well celkweek plaat. Vul de overgebleven putjes met 500 μL steriele basismedia (d.w.z. F12) om verdamping te voorkomen tijdens lange-termijn kweek.
      Opmerking: Voor biopsieën tussen 50 g en 100 g zijn vier putjes van een 24-Wells plaat geschikt. Als het biopsie weefsel minder dan 50 g is, kunnen twee putjes geschikter zijn. Rest vuil en laag celgetal voorkomt het gebruik van een celteltechniek bij deze stap; Daarom wordt de precieze zaaien dichtheid niet bepaald en varieert enigszins van biopsie tot biopsie.
   2. Incuberen celkweek vaten met GM bij 37 °C in 5% CO₂ voor 1 uur voorafgaand aan het zaaien.
   3. Verwijder cryoflesjes van de-80 °C vriezer en plaats in een 37 °C waterbad; de vloeistof in de buis moet volledig worden ondergedompeld in water.
   4. Wanneer het ontdooien bijna voltooid is (~ 5 min), breng dan de cryovial over naar een steriele laminaire stroming. Breng de spier slurry uit de cryoviale buis en voeg toe aan een conische buis van 15 mL met 6 mL voorverwarmde GM met een snelheid van 1 mL/min.
   5. Centrifugeer de spier slurry bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT.
      Opmerking: Een swingende emmer centrifuge kan het gemakkelijker maken om kleine pellets in deze stap te visualiseren, maar is niet essentieel.
   6. Aspireren het supernatant zeker niet te verstoren van de pellet. Veeg de buis om de pellet in de resterende media te hervatten en respendeer in 1 mL GM.
   7. Breng 250 μL van de geresuspendeerde pellet (nu beschouwd als een hMPC suspensie) aan op elk van de 4 putjes van de pre-incubated 24-Well celkweek plaat.
2. Cultuur en passage hMPCs.
   1. Handhaaf hMPC-culturen in GM bij 37 °C in 5% CO₂.
      Opmerking: Voorraden van GM zonder de bFGF (d.w.z. F12, antibiotica, FBS) worden in batches bereid en bewaard bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken. bFGF wordt toegevoegd aan GM op de dag van gebruik. Media met bFGF kunnen worden opgeslagen voor 48 uur bij 4 °C.
   2. Vierentwintig uur na isolatie, zuig de GM, spoel het kweek vaartuig 2x met pre-warmed GM, en voeg verse GM toe.
      Opmerking: 24 h moet bieden hMPCs voldoende tijd om te hechten; na het wassen mogen geen Hmpc's worden verwijderd. Deze stap zal ook het resterende vuil dat werd gegenereerd tijdens de celoogst verwijderen, waardoor het vat meer vatbaar voor nauwkeurige samenvloeiing scannen met behulp van een Imaging cytometer (sectie 5 hieronder). Na deze initiële media verandering, wordt GM elke 48 h gewijzigd.
   3. Passage hMPCs wanneer 70% samenvloeiing wordt bereikt of wanneer ze zijn gebleven op hetzelfde cultuur gerecht voor 10 dagen, afhankelijk van wat eerst optreedt.
      Opmerking: 70% samenloop is ongeveer 55.000 cellen/cm².
   4. Om door te gaan, voeg 250 μL voorverwarmde trypsine toe aan elk goed van een 24-Well celcultuurplaat en inincuberen voor ~ 5 min.
   5. Tik op het celcultuurvat op een stevig oppervlak om Hmpc's los te maken. Een lichte Microscoop kan worden gebruikt om te controleren of de Hmpc's zijn losgekoppeld.
   6. Breng de suspensies van trypsine/hMPC over naar 5 mL GM in een conische buis van 15 mL.
   7. Centrifugeer de hMPC suspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT.
   8. Verwijder hMPC suspensies uit de centrifuge en plaats op ijs in de steriele laminaire stroming.
      Opmerking: Het houden van Hmpc's op ijs tijdens het passeren resulteert in minder celaggregatie.
   9. Aspirate supernatant van hMPCs en voorzichtig respenderen pellet in 1 mL GM.
   10. Tel cellen met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller.
       Opmerking: Een 1:5 verdunning van celsuspensie naar celtelbuffer is over het algemeen gepast.
   11. Zaad hMPCs op collageen-gecoate cultuur gerechten met pre-warmed GM met een dichtheid van 3.500 cellen per cm². Een combinatie van 10 cm platen en 24-put platen is ideaal. De 24-Well platen kunnen dagelijks worden gescand op een beeldvormings cytometer om de groei te monitoren.
   12. Volg dezelfde procedure (beginnend bij stap 3.2.4) voor latere passages.
       Opmerking: De celgezondheid en-zuiverheid kunnen in verschillende passages worden bewaakt met behulp van een marker van cellulaire senescentie (bijv. β-galactosidase) en immunokleuring voor Pax7.
3. Cryopreserve de hMPCs.
   1. Cryopreserve overtollige cellen voor later gebruik om het cultuur volume meer beheersbaar te maken.
   2. Voor cryopreservation, volg de trypsinisatie procedure beschreven in stappen 3.2.4.-3.2.9.
   3. Bereid, terwijl de celsuspensie wordt gecentrifugeerd, een mengsel van 20% (bijv. 200 μL) dimethylsulfoxide (DMSO) en 80% (bijv. 800 μL) GM. Pipetteer op en neer 20x om een adequate menging te garanderen. Laat het mengsel rusten op ijs.
   4. Verdun op basis van het aantal cellen de hMPC suspensie tot 2 x 10⁶/ml in GM.
   5. Combineer de hMPC suspensie en het 20% steriel DMSO/80% GM mengsel 50/50. De uiteindelijke cryopreservatie media is een combinatie van DMSO (10%) en GM (90%) bevattende 1 x 10⁶ hmpcs/ml.
   6. Plaats 1 mL van de hMPC suspensie bereid in stap 3.3.5 in zoveel cryoflesjes als het initiële aantal cellen toestaat. Plaats vervolgens aliciteerde Hmpc's in een in een isopropanol gecontroleerd debiet koeler in een vriezer van 80 °C 's nachts.
      Opmerking: Bij deze stap, meestal tussen 5 en 15.000.000 cellen worden verkregen, 30 − 60% van die worden geïdentificeerd als hMPCs door FACS.

4. isoleren van Pax7⁺ menselijke spier voorlopercellen via flow Cytometrie

1. Voor het bereiden van hMPCs van levende culturen (stap 3.2.11), trypsinize genoeg cultuur vaten voor 1 x 10⁶− 2 x 10⁶ totaal cellen. Bereid de celsuspensies voor zoals beschreven in de stappen 3.2.4 − 3.2.9.
2. Bereid Hmpc's van cryopreserved culturen (stap 2.4.6 of 3.3.6).
   1. Selecteer 1 − 2 buizen met ~ 1 x 10⁶ passage vier Hmpc's voor elke donor.
      Opmerking: Met behulp van passage vier Hmpc's zorgt voor een adequate celopbrengst terwijl het behoud van proliferatieve potentieel tot passage zes (Figuur 2).
   2. Cellen snel ontdooien door ze uit de vriezer-80 °C te verwijderen en ze in een waterbad van 37 °C te plaatsen met de vloeistof in de buis volledig ondergedompeld.
   3. Wanneer het ontdooien bijna voltooid is (~ 5 min), breng hMPCs over naar een steriele laminaire stroom afzuigkap en breng de inhoud van de celsuspensie over in 6 mL voorverwarmde GM in een conische buis van 15 mL met een snelheid van 1 mL/min.
   4. Bereid de celsuspensies voor zoals beschreven in stap 3.2.7 − 3.2.9.
   5. Respendeer elke pellet in 3 mL FACS buffer (500 mL PBS, 12,5 mL normaal geiten serum, 2 mL 0,5 M EDTA, pH 7,4, door een 0,22 μm filter).
   6. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT.
   7. Aspirate supernatant van hMPCs en voorzichtig respenderen pellet in 250 μL FACS buffer; plaats op ijs.
   8. Plaats 100 μL cellen in een micro centrifugebuis van 1,7 mL en laat op ijs om te worden gebruikt als levende/dode besturingselementen (stap 4.5.1).
      Opmerking: de 100 ul van cellen die moeten worden gebruikt voor Live/Dead-besturingselementen, kan afkomstig zijn van het nemen van een klein volume (~ 20 UL) van geresuspendeerde cellen van elke donor die moet worden gesorteerd of van gestort cellen.
      Opmerking: het is belangrijk om niet meer dan 20 ul van geresuspendeerde cellen van één donor te nemen. Breng volume tot 100 ul met FACS buffer als < 100 ul cellen beschikbaar is.
3. Vlek Hmpc's voor celoppervlak markeringen.
   1. Bereid de volgende cocktail van antilichamen voor (de getoonde bedragen zijn voor elke kweek, schaal-up op de juiste wijze): 5 μL CD56 (heupcel adhesie molecuul [NCAM]; PE-Cy7-geconjugeerd) en 5 μL CD29 (β1-integrin; AlexFluor488-geconjugeerd). De uiteindelijke verdunning van het antilichaam is 1:50.
   2. Voeg 10 μL van de antilichaam cocktail toe aan elke hMPC suspensie en inincuberen op ijs gedurende 30 minuten in het donker.
   3. Voeg 10 mL FACS buffer toe aan elke suspensie/antilichaam cocktail mengsel.
   4. Centrifugeer elke buis op 300 x g gedurende 5 minuten bij RT.
   5. Respendeer de pellet in 300 μL FACS buffer en breng over naar een 5 mL ronde onderkant polystyreen buis.
   6. Houd de suspensie op ijs en beschermd tegen licht.
4. Bereid de compensatie kralen voor.
   Opmerking: positieve controles voor elk antilichaam en een negatieve controle (Onbevlekte kralen) moeten worden bereid met behulp van compensatie kralen. Compensatie Bead Controls moeten worden uitgevoerd op de flow cytometer voordat de monsters moeten worden gesorteerd. Deze controles maken het mogelijk te bepalen hoeveel het fluor chroom van elk antilichaam in het kanaal van de andere kan worden gedetecteerd, zodat compensatie kan worden toegepast.
   1. Vortex compensatie kralen.
   2. Voeg in drie microcentrifugebuisjes van 1,7 mL één druppel (50 μL) compensatie kralen toe.
   3. Voeg 1 μL van elk antilichaam toe aan de juiste buis of geen aan de negatieve controle.
   4. Inincuberen in het donker gedurende 15 minuten.
   5. Voeg 1,5 mL FACS buffer toe aan elke buis en Vortex.
   6. Centrifugeer elke buis op 300 x g in een tafel centrifuge gedurende 5 minuten bij RT.
   7. Aspirate supernatant en rediëren de pellet in 200 μL FACS buffer.
      Opmerking: De pellet kan zeer moeilijk te visualiseren zijn; zorg moet worden genomen bij het aspireren van de supernatant.
   8. Plaats de suspensie in een 5 mL ronde onderkant polystyreen buis en houd vervolgens de buis op ijs en beschermd tegen licht.
5. Bereid Live en dode besturingselementen.
   1. Verdeel de 100 μL Hmpc's van stap 4.2.8 in twee microcentrifugebuisjes van 1,7 mL (één voor de Live controle en één voor de dode controle).
   2. Plaats de dode controle buis in een verwarmingsblok voorverwarmd tot 70 °C gedurende > 10 min. Houd gedurende deze tijd de Live controle op ijs.
   3. Centrifugeer elke buis op 300 x g in een tafel centrifuge gedurende 5 minuten bij RT.
   4. Aspirate supernatant en rediëren de pellet in 150 μL FACS buffer.
   5. Combineer de Live/Dead Controls in een enkele 5 mL ronde onderkant polystyreen buis.
6. Levensvatbaarheid te kleuring.
   1. Voeg 1 μL 7-aminoactinomycine D (7-AAD) toe aan alle buisjes die cellen bevatten die moeten worden gesorteerd en de levende/dode controle.
   2. Voeg GM toe aan collageen-gecoate 24-Well (250 μL/well) en 10 cm (8 mL/well) platen en laat een evenwicht in een celkweek incubator bij 37 °C in 5% CO₂.
7. Sorteer Hmpc's via flow Cytometry.
   1. Sorteer Hmpc's op een flow-cytometer met een nozzle van 100 μm bij een druk van 20 psi. Bepaal Live Hmpc's op basis van Side en forward Scatter, evenals 7-AAD negativiteit (sorteerparameters en een representatieve sortering kan worden gezien in Figuur 3).
   2. Cellen die positief zijn voor PE-Cy7 (780/60 nm) en AlexFluor488 (530/30 nm) vertegenwoordigen CD56⁺/Cd29⁺ cellen en zijn dus Pax7 positieve cellen (hmpc's). Sorteer dubbele positieve cellen in Verzamel buisjes met een 300 μL-kussen van FACS-buffer.
      Opmerking: De zuiverheid van gesorteerde culturen kan worden bepaald door immunokleuring voor Pax7 gevolgd door een downstream-Flowcytometrie analyse (Figuur 4).
   3. Gooi alle andere cellen weg.
   4. Breng de gesorteerde cellen over in een conische buis van 15 mL.
   5. Draai de hMPC suspensie op 300 x g gedurende 5 min bij RT.
   6. Zuig voorzichtig de supernatant en respendeer in 1 mL GM.
   7. Tel cellen met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller.
      Opmerking: Hoewel het aantal cellen kan worden afgeleid als het aantal gebeurtenissen dat positief is gesorteerd, is dit aantal gevonden om het aantal cellen met 10 − 40% te overschatten in vergelijking met traditionele celtellings methoden.
   8. Zaai de Hmpc's zoals beschreven in stap 3.2.11.
      Opmerking: Verificatie van de zuiverheid van de hMPC populatie kan worden bepaald door immunokleuring voor Pax7 en analyse via Flowcytometrie.

5. karakteriseren van humane spier voorlopercellen (hMPC) culturen met behulp van een beeldvormings cytometer

1. Gebruik de Imaging cytometer (tabel met materialen) voor het uitvoeren van confluence-scans.
   1. Selecteer nieuwe scan maken en voer vervolgens/Selecteer de plaat categorie, plaatprofiel en plaat-id. De beeldvormings cytometer is geschikt voor 96, 24 en 6 goed platen.
   2. Selecteer samenvloeiing ≫ confluence 1onder toepassing.
   3. Selecteer een goed om te bekijken met behulp van de Navigator aan de rechterkant van het scherm.
   4. Zoek een vlak van focus waar de cellen wit worden weergegeven in vergelijking met de achtergrond en selecteer handmatig registreren of laat de Imaging-cytometer het focus vlak selecteren door automatisch registrerente selecteren.
      Opmerking: Voor de 96 put platen voorgesteld in de tabel van de materialen, een geschatte positie is 4,3 eenheden.
   5. Gebruik de muis om alle putten te markeren die moeten worden gescand. De hele well Area wordt automatisch gescand. Selecteer Start scan.
   6. Selecteer analyse-instellingen optimaal voorplaat-en celtype.
      Opmerking: Voor Hmpc's zijn de volgende instellingen optimaal: intensiteit = 6, verzadigde intensiteit = 0, diameter = 8, minimumdikte = 3, min clustergrootte = 500, en Precision = hoog.
   7. Selecteer analyse starten.
      Opmerking: Inspecteer afbeeldingen visueel om ervoor te zorgen dat de gebruikers-en beeldvormings cytometer het eens zijn over de omtrek van cellen. Als er een grote discrepantie bestaat, u de plaat opnieuw scannen met een ander scherpstel vlak of met verschillende analyse-instellingen. Samenvloeiing scannen kan worden gebruikt om de groei tussen culturen te vergelijken, tijd de toediening van een behandeling, of om cellen te bewaken en te beslissen wanneer differentiatie te initiëren. Indien differentiatie gewenst is, worden de details vermeld in rubriek 6.
2. Gebruik de Imaging cytometer om cellen te tellen.
   1. Maak een kleurings oplossing met 12 mL van de F12 van Ham, 6 μL Hoechst 33342 en 24 μL propidium jodide.
   2. Aspirate media en vervang met kleurings oplossing, inbroed bij 37 °C gedurende 15 minuten.
   3. Aspirate kleuring oplossing en vervangen door Ham van F12.
      Opmerking: Het is belangrijk om een medium met een laag gehalte aan fenolrood te gebruiken om duidelijke beelden te verkrijgen. U ook PBS gebruiken.
   4. Laad de plaat op de beeldvormings cytometer en selecteer onder toepassingde levensvatbaarheid van de cel ≫ Live + Dead + Total. Het live-kanaal zal een helderveld beeld zijn, het dode kanaal zal de propidium Iodide zijn, en het totale kanaal zal de Hoechst zijn 33342.
   5. Stel het Live -kanaal in op het veld Bright en klik op automatisch registreren onder focus instellen.
   6. Stel onder het kanaal totaal het kanaal in op blauw. Gebruik Zoek focus om de kernen scherp te stellen of gebruik de pijlen omhoog en omlaag om handmatig de focus te zetten. Klik op verschuiving instellen om de focus te selecteren.
   7. Stel onder het dode kanaal het kanaal in op rood. Gebruik Zoek focus om de dode cellen scherp te maken of gebruik de pijlen omhoog en omlaag om de focus handmatig in te stellen. Klik op verschuiving instellen om de focus te selecteren.
   8. Selecteer Start scan om de scan te starten.
   9. Selecteer analyseparameters die geschikt zijn voor de plaat en het celtype. Selecteer analyse starten om de analyse te starten. Nadat de analyse is voltooid, controleert u visueel of de analyse correct cellen telt (bijvoorbeeld voor de totale kanaal controle dat elke Nucleus als een Nucleus wordt herkend en dat de beeldvormings cytometer geen vlekken op de achtergrond telt als nuclei). Als de scan en analyse bevredigend zijn, stuurt u de plaat terug naar de incubator, anders u de analyseparameters opnieuw controleren of wijzigen.

6. differentiëren van humane spier voorlopercellen (Hmpc's) naar Myotubes

1. Bepaal de samenvloeiing van de hMPC met behulp van het protocol in paragraaf 5,1. Om Hmpc's in myotubes te differentiëren, is het ideaal voor cellen om 80 − 85% Confluent Health te zijn, zoals bepaald door de confluence-functie op de beeldvormings cytometer (zie rubriek 5). Als Hmpc's van meer dan één unieke donor worden gebruikt, kan confluence Scanning cellen van verschillende donoren om differentiatie te beginnen op het moment dat ze samenvloeiing bereiken.
   Opmerking: Bij 80% samenvloeiing, er zijn ongeveer 66.000 cellen/cm².
2. Was de cellen 2x met differentiatie media (97% Ham van F12, 2% paarden serum, 1% penicileen/streptomycine, pH 7,4, doorgegeven via een 0,22 μm filter).
3. Houd cellen in differentiatie media zo lang als het experiment dicteert tijdens het overschakelen van media dagelijks.
4. Direct beoordelen myotube vorming door immunokleuring voor embryonale myosin zware keten, die is meestal detecteerbaar na 7 − 10 dagen van differentiatie.
   Opmerking: De tijd die nodig is om myotubes te vormen kan enigszins afwijken, afhankelijk van de donor en het aantal cellen wanneer differentiatie werd geïnitieerd; Daarom wordt aanbevolen dat de culturen van elke donor afzonderlijk worden gecontroleerd.

Representative Results

Representatieve Flowcytometrie resultaten van hMPC-isolatie van menselijk spierweefsel kunnen worden bekeken in Figuur 1. Hmpc's kunnen worden geïdentificeerd door eerste gating gebeurtenissen op basis van Side Scatter en forward Scatter om dode cellen of puin te elimineren, gevolgd door het selecteren van alleen cellen die negatief zijn voor 7-AAD en daarom levensvatbaar zijn. Selectie van cellen positief voor zowel de cel oppervlak markeringen CD56 en CD29 vertegenwoordigt de hMPC populatie. Een biopsie van 60 mg levert slechts ongeveer 75 − 250 Hmpc's.

Een representatieve confluence-scan wordt weergegeven in Figuur 2a. De groene contouren in Figuur 2b werden gegenereerd door de beeldvormings cytometer en laten zien hoe de beeldvormende cytometer bepaalde samenloop op basis van de geselecteerde analyse-instellingen. In beide getoonde afbeeldingen, de samenvloeiing bepaald door de Imaging cytometer stemt overeen met de samenvloeiing visueel bepaald door de gebruiker. Deze beelden benadrukken echter ook dat de beeldvormings cytometer niet perfect is. De rode pijl markeert bijvoorbeeld een onvolmaaktheid in de plaat die als cellen wordt geteld. Als een groot aantal van deze onvolmaaktheid aanwezig zijn op de plaat, de resulterende samenvloeiing zal niet nauwkeurig vertegenwoordigen de samenvloeiing van de cellen. Afbeelding 2c toont een representatie van alle drie de kanalen die worden gebruikt om cellen te tellen (brightfield, Blue en Red) en de samengevoegde afbeelding. Figuur 2D toont heterogeniteit tussen donoren. Het ontdekken en nauwkeurig karakteriseren van deze heterogeniteit is een belangrijke toepassing van de beeldvormings cytometer. Figuur 2e toont aan dat samenvloeiing metingen en kernen graven van unieke donoren zijn sterk gecorreleerd.

Figuur 3 bevat een richtsnoer voor het identificeren van Hmpc's op basis van de procedure voor FACS die in dit protocol wordt beschreven. Gating op basis van voorwaartse en zijverstrooiing zorgt voor scheiding van levensvatbare cellen uit puin (Figuur 3a). Een vergelijking van voorwaartse spreiding per hoogte naar voorwaarts spreidings gebied werd gebruikt om gebeurtenissen van afzonderlijke cellen te onderscheiden (het gebied in afbeelding 3B). Levensvatbare cellen worden gekenmerkt door een gebrek aan opneming van de levensvatbaarheid vlek 7-AAD (figuur 3c). Ten slotte worden cellen die positief zijn voor zowel CD56 als CD29 geïdentificeerd als hMPCs (figuur 3D). Om de in dit protocol beschreven FACS-procedure te valideren, kan de selectie van Pax7 positieve cellen worden bepaald door immunokleurings cellen met een Pax7-specifiek antilichaam en meet expressie op een flow-cytometer. Figuur 4 vergelijkt het aantal Hmpc's zoals bepaald door Pax7-immunokleuring (Fig. 4a) versus de FACS-procedure (figuur 4b) die in dit protocol wordt beschreven uit dezelfde populatie cellen. Figuur 5 gebruikt Pax7-immunokleuring en-analyse via Flowcytometrie om de verrijking van Pax7 cellen in de totale populatie na FACS te laten zien (figuur 5a ten opzichte van Figuur 5b), evenals het behoud van het aantal Pax7 het uitdrukken van cellen na de passage (Figuur 5b vergeleken met figuur 5c).

Hmpc's kunnen worden gedifferentieerd om myotubes te vormen door sectie 6 te volgen. Om te bepalen of geïsoleerde Hmpc's myogenic capaciteit cellen onderhouden kunnen worden immunogekleurd met een antilichaam specifiek voor embryonale myosin zware keten en gevisualiseerd met behulp van fluorescerende microscopie. Representatieve afbeeldingen van embryonale myosine zware keten positieve myotubes kunnen worden bekeken in Figuur 6.

Figuur 1 : Representatieve flow cytometrie beelden voor hMPCs gesorteerd direct uit spier biopsie weefsel. (A) het zijspreidings gebied (y-as) versus het voorwaartse spreidings gebied (x-as) dat wordt gebruikt om alle cellen in een donor monster te identificeren. (B) 7-Aad levensvatbaarheid vlek (y-as) versus forward Scatter (x-as) om te identificeren van levende cellen. C) het profiel voor de sorteer markering van de negatieve selectie (-CD11b,-CD31,-CD45,-glya [y-as]) versus de selectiemarkering CD34. D) negatieve selectiemarkering CD34 (y-as) versus de positieve selectiemarkering CD29. E Positieve selectiemarkering CD56 (y-as) versus de positieve selectiemarkering CD29 (x-as). F Opbrengsten uit drie verschillende skeletspieren biopsies. FSC = voorwaartse spreiding; SSC = zijverstrooiing; hMPCs, menselijke spier voorlopercellen.

Figuur 2 : Het proliferatieve potentieel van Hmpc's afkomstig van menselijke donoren wordt gehandhaafd na 6 passages. (A) Representatieve confluence scan. (B) representatieve samenvloeiing scan met groene contouren die laten zien hoe de Imaging cytometer bepaalde samenvloeiing. De rode pijl toont een onvolmaaktheid op de plaat. C) een representatieve Brightfield, Hoechst 33342 (blauw) en propidium Iodide (rood) kleuring en een samengevoegd beeld van deze drie kanalen. Schaal staven = 1mm. (D) nuclei telt van 6 unieke donoren belicht hmpc-heterogeniteit. (E) samenvloeiing en kernen telling zijn sterk gecorreleerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3 : Representatieve flowcytometry sorteerparameters voor hMPC-isolatie. (A) het zijspreidings gebied (y-as) versus het voorwaartse spreidings gebied (x-as) dat wordt gebruikt om alle cellen in een donor monster te identificeren. B) spreidings hoogte (y-as) versus voorwaartse spreidings gebied (x-as) om dubbeltjes van de sorteer populatie te diskwalificeren. (C) voorwaartse spreidings hoogte (y-as) versus 7-Aad-integratie om levensvatbare cellen te identificeren. (D) PE-CY7 (CD56) versus AF488 (CD29) kleuring met Q2 die dubbele positieve cellen (Hmpc's) vertegenwoordigt. Kleur geeft de dichtheid van gebeurtenissen aan.

Figuur 4 : Vergelijking van CD29/CD56 positiviteit versus Pax7 positiviteit in passage 4 Hmpc's van dezelfde donor. (A) Count (y-as) versus Pax7 expressie (x-as). B Positieve selectiemarkering CD56 (y-as) versus positieve selectiemarkering CD29 (x-as). NCAM = hechtings molecuul neurale cel; hMPC = menselijke spier voorlopercellen.

Figuur 5 : Pax7 positiviteit wordt gehandhaafd in Hmpc's die afkomstig zijn van dezelfde donor over meerdere passages. A) Pax7 uitdrukking (x-as) van cellen die 4 keer vóór de sortering van de FACS waren gepasseerde. B) Pax7 expressie (x-as) van de doorgang van hMPCs 1 na het sorteren van de FACS op CD29 en CD56 positiviteit (5 totale passages). C) Pax7 expressie (x-as) van hMPCs 2-passages na het sorteren van FACS op CD29 en CD56 positiviteit (6 totale passages).

Figuur 6 : Kleuring van met hMPC afgeleide myotubes voor embryonale myosine zware keten. Representatieve microscopische beelden van gedifferentieerde Hmpc's met DNA-vlek (Hoechst 33342, blauw) en embryonale myosin zware keten (groen) (n = 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Primaire Hmpc's zijn een belangrijk onderzoeksmodel dat wordt gebruikt om de skeletspieren biologie en het regeneratieve proces te begrijpen. Daarnaast hebben Hmpc's het potentieel om te worden gebruikt voor therapie. Echter, er zijn erkende uitdagingen in het gebruik van primaire Hmpc's voor zowel onderzoek en therapie, met inbegrip van de beperkte kennis van cellen die zijn afgeleid van mensen¹⁰. Er is ook een grote mate van variatie in de uitbreidingscapaciteit tussen donor culturen, die het potentieel voor het gebruik van Hmpc's beperkt en de onderzoeksresultaten¹¹kan beïnvloeden. Zo is onlangs aangetoond dat hmpc's die zijn geïsoleerd volgens de methode die in dit protocol is beschreven, cellen produceren die varieerden in uitbreidingscapaciteit en dit werd gedreven door transcriptionele profiel dat niet was uitgelijnd met seks of leeftijd¹¹.

Hier presenteren we een efficiënte en hoge opbrengst methode voor het isoleren van Hmpc's in voldoende hoeveelheden voor een aantal downstreamtoepassingen, waaronder differentiatie in myotubes, waardoor het myogene proces in vitro wordt gemodelleerd. Onze methode vertrouwt op FACS om CD56⁺/Cd29⁺ cellen te isoleren, die eerder zijn geïdentificeerd als een verrijkte Pax7 die de populatie¹²weergeeft. Andere even geldige Sorteer strategieën voor cellen zijn ook beschreven op^5,6.

Het belangrijkste aspect van onze hMPC-isolatie-en-cultuur methode is de zorgvuldige controle van individuele culturen. De heterogeniteit op basis van donoren omvat het aantal Hmpc's dat is verkregen van elke biopsie, hun tijd om de proliferatie in vitro te initiëren en hun bevolkings uitbreidingspercentage. Daarom, als de verschillen in myotube vorming na een behandeling de kwestie van de rente individuele is, hMPC culturen moeten worden overgeschakeld op de behandeling op basis van een samenvloeiing niveau bepaald a priori en beoordeeld objectief met behulp van de Imaging cytometer.

Onze methode om Hmpc's te isoleren en te kweken is geoptimaliseerd om de opbrengsten van cellen in de miljoenen te verkrijgen voor in vitro experimenten van relatief weinig beginnend biopsie weefsel (50 − 100 mg). Het grote voordeel van deze aanpak is dat er meerdere testen en experimenten kunnen worden uitgevoerd op Hmpc's van dezelfde donor, waardoor het fenotype van donoren gedurende experimenten kan worden onderhouden, terwijl er weinig variabiliteit van Inter-experiment wordt ingevoerd. Onze methode verschilt van onlangs gepubliceerde methoden die zich richten op het extraheren van de zuiverste populatie van Pax7 het uitdrukken van cellen rechtstreeks uit biopsie weefsel waar de focus is xenotransplantatie⁸. De uitdaging met deze voorgaande methoden is echter dat ze een start weefsel gewicht van meer dan één gram nodig hebben. Daarom, ze zijn niet praktisch voor onderzoek waarbij menselijke skeletspieren biopsies. Een beperking van onze methode is dat het potentieel voor xenotransplantatie niet is beoordeeld. Dit type procedure was echter niet een van de oorspronkelijk beoogde downstreamtoepassingen. Toekomstige richtingen van deze methode kunnen omvatten het beoordelen van de engraftment capaciteit van Hmpc's, na het ondergaan van onze isolatie procedure, om te bepalen of er potentieel voor gebruik van deze procedure in MPC transplantatie studies.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-Cl	Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate	VWR	664160	Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube	Falcon	352196	15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate	Grenier Bio-One	662 160	Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution	eBioscience	00-6993-50	Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16	BioLegend	303016	Conjugated antibody for FACS
Black 96-well cell culture plate	Grenier Bio-One	655079	96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S	Nexcelcom Bioscience		Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer	VWR	352350	Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail)	Corning	354236	Collagen for coating cell culture plates
Collagenase D	Roche	11 088 882 001	Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide	VWR	WN182	Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II	Sigma Life Sciences	D4693	A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder	Gibco	31600-034	Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	21600-010	PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate	J.T. Baker	4040-01	Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum	VWR	89510-186	Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12	Gibco	21700-026	Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum	Gibco	26-050-070	Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer	iNCyto	DHC-N0105	Used to count cells
Hibernate A	Gibco	A1247501	Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate	Life Technologies	H21492	DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P-4	Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer	Orflo	MXA006	Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes	Orflo	MXC002	Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter	Orflo		Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50062Z	Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159	BD Pharmingen	557747	Conjugated antibody for FACS
Penicillin/Streptomycin 100x Solution	Corning	30-002-CI	Antibiotics added to culture media
Propidium iodide	Thermo Fisher Scientific	P3566	DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor	Promega	G5071	Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Gibco	12648-010	Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-3	Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes	VWR	60818-565	Tubes used for FACS
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42	Compensation beads fort calibrating flow FACS settings