Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolation, Kultur, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Muskelprogenitorzellen aus dem Skelettmuskelbiopsieverfahren

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/59580
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 2, 1
1Division of Nutritional Sciences, Cornell University, 2Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

Wir präsentieren Techniken zur Isolierung, Kultivierung, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs), die aus Skelettmuskelbiopsiegewebe gewonnen werden. hMPCs, die durch diese Methoden gewonnen und charakterisiert werden, können anschließend verwendet werden, um Forschungsfragen im Zusammenhang mit menschlicher Myogenese und Skelettmuskelregeneration zu behandeln.

Abstract

Die Verwendung von primärem menschlichem Gewebe und Zellen ist ideal für die Untersuchung biologischer und physiologischer Prozesse wie der Regenerationsprozess des Skelettmuskels. Es gibt anerkannte Herausforderungen bei der Arbeit mit menschlichen primären adulten Stammzellen, insbesondere menschlichen Muskelvorläuferzellen (hMPCs), die aus Skelettmuskelbiopsien abgeleitet sind, einschließlich geringer Zellausbeute aus gesammeltem Gewebe und einem hohen Grad an Spenderheterogenität Wachstums- und Todesparameter zwischen den Kulturen. Während die Integration von Heterogenität in experimentelles Design eine größere Stichprobengröße erfordert, um signifikante Effekte zu erkennen, ermöglicht es uns auch, Mechanismen zu identifizieren, die der Variabilität der hMPC-Erweiterungskapazität zugrunde liegen, und ermöglicht es uns, die Sbeinen-Erweiterungskapazität besser zu verstehen. Heterogenität in der Skelettmuskelregeneration. Neuartige Mechanismen, die die Expansionsfähigkeit von Kulturen unterscheiden, haben das Potenzial, zur Entwicklung von Therapien zur Verbesserung der Regeneration der Skelettmuskulatur zu führen.

Introduction

Skelettmuskel ist das größte Organsystem im menschlichen Körper, macht 30 bis 40% der ganzen Körpermasse1. Neben seiner anerkannten Rolle in der Fortbewegung, Skelettmuskel hält Körpertemperatur und Körperhaltung, und spielt eine zentrale Rolle in ganzkörperlichen Nährstoff Homöostase. Die Forschung unter Beteiligung menschlicher Teilnehmer, Tiere und Zellkulturmodelle ist wertvoll, um Fragen der Skelettmuskelbiologie und Regeneration zu beantworten. Isolation und Kultur der menschlichen Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs) bietet ein robustes Modell, das es ermöglicht, Zellkulturtechniken und Manipulationen auf menschliche Proben anzuwenden. Ein Vorteil der Verwendung von hMPCs ist, dass sie den genetischen und metabolischen Phänotyp von jedem Spender behalten2,3. Die Aufrechterhaltung des Spenderphänotyps ermöglicht es forschern, interindividuelle Variationen im myogenen Prozess zu untersuchen. Zum Beispiel haben wir unsere hMPC-Charakterisierungsmethode eingesetzt, um alters- und geschlechtsbedingte Unterschiede in der hMPC-Populationsexpansionskapazität4zu identifizieren.

Der Zweck dieses Protokolls ist es, Techniken zur Isolierung, Kultur, Charakterisierung und Unterscheidung von hMPCs aus Skelettmuskelbiopsiegewebe zu beschreiben. Aufbauend auf früheren Arbeiten, die hMPCs beschrieben und potenzielle Zelloberflächenhersteller für die hMPC-Isolierung5,6identifiziert haben, schließt dieses Protokoll eine kritische Wissenslücke, indem es die Isolation mit der Charakterisierung von hMPCs verknüpft. Darüber hinaus machen die detaillierten Schritt-für-Schritt-Anleitungen in diesem Protokoll die hMPC-Isolierung und -Charakterisierung einem breiten wissenschaftlichen Publikum zugänglich, einschließlich derjenigen mit begrenzter Vorerfahrung mit hMPCs. Unser Protokoll gehört zu den ersten, die die Verwendung eines bildgebenden Zytometers zur Verfolgung von Zellpopulationen beschreiben. Neu entwickelte bildgebende Zytometer sind modernste, hochdurchsatz- und mikroplattenbasierte, die live zellbildende, Zellzählung und Mehrkanalfluoreszenzanalyse aller Zellen in jedem Brunnen eines Kulturgefäßes innerhalb von Minuten ermöglichen. Dieses System ermöglicht eine schnelle Quantifizierung dynamischer Veränderungen der Proliferation und Lebensfähigkeit einer gesamten Zellpopulation mit nur minimalen Unterbrechungen der Kultur. Beispielsweise sind wir in der Lage, objektive Maßnahmen des Zusammenflusses an aufeinanderfolgenden Tagen in vitro durchzuführen, um die Wachstumskinetik jeder Kultur zu bestimmen, die von verschiedenen Spendern abgeleitet wurde. Viele Protokolle in der Literatur, insbesondere solche, die die Differenzierung von MFC beinhalten, erfordern, dass Zellen ein definiertes Maß an Zusammenfluss erreichen, bevor sie Differenzierung oder Behandlung einführen7. Unsere Methode ermöglicht eine objektive Bestimmung des Zusammenflusses jedes Brunnens in einem Kulturgefäß, so dass Forscher eine unvoreingenommene, nicht-subjektive Behandlung initiieren können.

In der Vergangenheit war eine wesentliche Einschränkung der Verwendung von primären hMPCs niedrige Erträge, die die Anzahl der Zellen begrenzen, die für Experimente verfügbar sind. Wir und andere haben gezeigt, dass die Ausbeute von MPCs aus Skelettmuskelbiopsiegewebe 1-15 MPCs pro Milligramm Gewebe beträgt (Abbildung 1)8. Da unser Protokoll vier Passagen der Zellen vor der Reinigung mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zulässt, reichen unsere kryokonservierten hMPC-Erträge, die aus kleinen Mengen Biopsiegewebe (50 bis 100 mg) gewonnen werden, aus, um Forschungsziele zu erreichen, mehrere Experimente sind erforderlich. Unser FACS-Protokoll erzeugt eine reine (Pax7-positive) MPC-Population von 80 %, daher ist unser Protokoll sowohl für die Ausbeute als auch für die Reinheit optimiert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dieses Protokoll wurde vom Institutional Review Board der Cornell University genehmigt. Alle Teilnehmer wurden auf die zugrunde liegenden gesundheitlichen Bedingungen untersucht und gaben ihre Einwilligung in Kenntnis der Sachlage ab.

1. Beschaffung von menschlichem Muskelgewebe über die Skelettmuskelbiopsie

  1. Identifizieren Sie den Vastus lateralis Muskel durch Palpation, anatomische Landmarken und aktive Kontraktion des Muskels.
  2. Palpate die vastus lateralis, indem der Teilnehmer ihre Quadrizeps-Muskel straffen und den Bauch des Muskels zu finden, etwa 1/3 des Weges von der Patella zur Hüfte, und nur ventrolateral zum Oberschenkelknochen.
  3. Verwenden Sie ein Papier-Messband, um einen Bereich mit einem chirurgischen Marker etwa 4-6 Zoll von der Oberseite der Patella zu markieren, die den Bauch des Muskels darstellt.
  4. Rasieren Sie alle Haare in der Nähe des markierten Bereichs und reinigen Sie dann mit einem chirurgischen Grad Antiseptikum, das vor medizinischen Verfahren verwendet wird (zum Beispiel: 2% Chlorhexidingluconat (CHG)/ 70% Isopropylalkohol (IPA)) .
  5. Anästhesisieren Sie die Biopsiestelle mit 1% Lidocain.
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Injektion des Lidocains in den Skelettmuskel.
  6. Machen Sie einen 4 x 5 mm Schnittweg an der markierten Stelle.
  7. Nachdem der Bereich anästhesisiert ist, schieben Sie eine Bergstrom-Nadel mit Trokar durch die Faszie in den Bauch des Muskels (ca. 2 x 3 cm).
  8. Ziehen Sie Muskelgewebe in die Bergstrom-Nadel, indem Sie den Schneidtrokar 2 x 3 cm zurückziehen, während ein Assistent Saugkraft anwendet, indem Er einen angeschlossenen 60 ml Spritzenkolben zurückzieht.
  9. Schließen Sie die Schneidkammer.
  10. Drehen Sie die Basis der Biopsienadel um eine Vierteldrehung und wiederholen Sie die Reihenfolge des Öffnens der Nadel, des Aufbringens von Absaugung und des Schließens der Nadel.
    HINWEIS: Jedes Mal, wenn die Nadel geschlossen wird, sollte ein Schnitt von Muskelgewebe innerhalb der Bergstrom-Nadel erhalten werden. Während der Probenentnahme bleibt die Nadel in der gleichen vertikalen Position im Oberschenkel, während sie längs um 360° gedreht wird, um jede Probe zu erhalten. Diese Sequenz kann 3-4 mal wiederholt werden.
  11. Vertreiben Sie das gesammelte Biopsiegewebe aus der Nadel in ein steriles, nicht haftenhaftes Dressingpad.
  12. Untersuchen Sie das Gewebe und entfernen Sie sichtbare Fett- und Fibrotische Gewebe mit sterilen Skalpellklingen oder Pinzetten.
  13. Legen Sie eine Portion (50-100 mg) Gewebein eine sterile Röhre, die CO2-unabhängiges Nährmedium enthält (z. B. Hibernate A).
    HINWEIS: Das Gewicht des Gewebes wird wie folgt bestimmt. Zuerst platzen die gekappte Röhre mit dem Nährmedium auf einer Skala und Tare. Als nächstes legen Sie das Gewebe in die Röhre, rekapitulieren Sie die Röhre, und wiegen Sie dann die Röhre, die das Gewebe im Nährmedium enthält.
  14. Bewahren Sie das Rohr, das das Gewebe und das Nährmedium enthält, bis zur Verarbeitung bei 4 °C aufbewahren.
    HINWEIS: Biopsiegewebe sollte innerhalb von 48 h nach der Entnahme verarbeitet werden.

2. Isolierung menschlicher Muskelvorläuferzellen aus Biopsiegewebe

  1. Mince BiopsieGewebe.
    1. Übertragen Sie das Muskelgewebe aus dem Nährmedium in eine sterile Petrischale in einem biologischen Sicherheitsschrank oder einem ähnlichen sterilen Arbeitsplatz.
    2. Verwenden Sie sterile Skalpellklingen, um Gewebe in 1 mm3 Stück zu zerkleinern.
  2. Waschen Sie gehacktes Biopsiegewebe, um Restmüll zu entfernen.
    1. Übertragen Sie das Muskelgewebe in ein 15 ml konisches Rohr mit 10 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) und lassen Sie das Gewebe über die Schwerkraft absetzen.
    2. Aspirieren Sie den Überstand darauf zu achten, das Muskelgewebe nicht zu stören.
    3. Fügen Sie dem gewaschenen Gewebe 10 ml PBS hinzu und lassen Sie das Muskelgewebe über die Schwerkraft umsiedeln.
    4. Aspirieren Sie den Überstand darauf zu achten, das Muskelgewebe nicht zu stören.
    5. Fügen Sie 10 ml glukosearmes Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) hinzu und lassen Sie das Gewebe über die Schwerkraft neu ansiedeln.
    6. Aspirieren Sie den Überstand darauf zu achten, das Muskelgewebe nicht zu stören.
  3. Inkubieren Sie das Gewebe in Verdauungsmedien.
    1. Resuspend das Muskelgewebe in 3 ml Verdauungsmedien (2 mg/ml Kollagenase D bei niedrigem Glukose-DMEM).
      HINWEIS: Kollagenase D-Stammlösungen können mit 20 mg/ml in glukosearmem DMEM hergestellt und bei -80 °C gelagert und dann zum Zeitpunkt der Anwendung 1:10 in glukosearmem DMEM verdünnt werden.
    2. Inkubieren Sie das Rohr, das das Muskelgewebe enthält, in einem Wasserbad bei 37 °C für 30 min.
    3. Trituieren Sie die Muskelgewebesuspension alle 10 min mit einer 10 ml serologischen Pipette oder einer breiten Bohrungspipette.
    4. Fügen Sie 83 l zusätzliche Verdauungsmedien und 24 l Dispaselösung (0,76 mM Calciumacetat, 1,39 mM Natriumacetat, 13,91 mg/ml Dispase II in glukoseniedrigem DMEM) hinzu. Bringen Sie die Suspension in das 37 °C Wasserbad zurück.
    5. Trituieren Sie die Muskelgewebesuspension alle 5 x 10 min mit einer breiten Bohrung Pipettenspitze.
    6. Fortsetzen Sie die Trituration, bis eine gleichmäßige Gülle erreicht ist, und nicht länger als 1,5 h, um eine Überverdauung zu verhindern.
      HINWEIS: Ausreichende Semanzipierung des Gewebes und die enzymatische Aktivität von Kollagenase und Dispase können die Probenverdauung beeinflussen. Eine gleichmäßige Gülle sollte in der Lage sein, eine normale Pipettenspitze mit minimaler Okklusion nach 1,5 h zu passieren. Wenn eine gleichmäßige Gülle nach 1,5 h nicht erreicht wird, überprüfen Sie doppelt, ob die Gewebezerkleinerung ausreichend ist, und wird das Gewebe auf die entsprechende Größe zerkleinert (Schritt 2.1.2). Zusätzlich sollte die Aktivität der Enzyme getestet werden, da eine Chargen-zu-Los-Variation in der enzymatischen Aktivität auftritt.
  4. Pelletzellen und Einfrieren in Wiederherstellungsmedien.
    1. Fügen Sie 6 ml Wachstumsmedien (GM; 79% Hames F12, 20% fetales Rinderserum, 1% Penicillin/Streptomycin, 5 ng/ml Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor [bFGF], pH 7,4, durch einen 0,22-m-Filter) in die Muskelschlämme.
    2. Die Suspension durch ein 70-m-Zellsieb in ein 50 ml konisches Rohr geben. Spülen Sie das Sieb mit zusätzlichen 4 ml GM.
      HINWEIS: Die Probe kann wieder in ein 15 ml konisches Rohr übertragen werden, um das Pellet einfach zu visualisieren. Ein größeres Waschvolumen kann verwendet werden, wenn die nachfolgenden Zellerträge gering sind.
    3. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
    4. Aspirieren Sie den Überstand sicher, nicht das Pellet zu stören. Streichen Sie das Rohr, um das Pellet in den verbleibenden Medien wieder auszusetzen. Wenn Zellen nicht kultiviert werden, fahren Sie sofort mit Schritt 2.4.5 fort, um Anweisungen zur Langzeitspeicherung zu erhalten, andernfalls fahren Sie mit Schritt 3.1.6 fort.
      HINWEIS: Wenn eine unmittelbare Kultur gewünscht wird, sollte GM in Zellkulturplatten vor Beginn der Biopsieverarbeitung vorbebrütet werden (Schritte 3.1.1 und 3.1.2).
    5. Fügen Sie dem wiederhergestellten Pellet 1,5 ml Einfrierungsmedien (Materialtabelle) hinzu.
    6. Die Gülle in eine Kryovial überführen. Legen Sie den Kryovial über Nacht bei -80 °C in einen isopropanol-kontrollierten Ratenkühler. Kryovial bei -80 °C lagern, bis er für die Kultur bereit ist.
      HINWEIS: Kryovials, die Gülle enthalten, können für die langzeitige Lagerung (mehr als 1 Monat) in flüssigem Stickstoff aufbewahrt werden. Die Verwendung eines isopropanol-kontrollierten Ratenkühlers ermöglicht es, Zellen mit einer Rate von 1 °C/min reproduzierbar zu gefroren zu lassen, was zu optimalen Zellwiederherstellungsraten führt, wie die Lebensfähigkeit nach dem Einfrieren und die erhöhte Wahrscheinlichkeit einer Anhaftung an Zellkulturgefäßen9. Alternativ kann ein Becher verwendet werden, der RT Isopropanol enthält und in einen -80 °C-Gefrierschrank gelegt wird.

3. Kultivieren menschlicher Muskelvorläuferzellen

  1. Die Muskelschlämme auftauen.
    1. Vor dem Auftauen und Säen von hMPCs, vor-Gleichgewicht Zellkulturplatten in GM. Fügen Sie 250 L GM zu 4 Brunnen einer kollagenbeschichteten (Kollagen I), 24-Well-Zellkulturplatte. Füllen Sie die verbleibenden Brunnen mit 500 l sterilen Basismedien (d. h. F12), um Verdunstung während der Langzeitkultur zu verhindern.
      HINWEIS: Für Biopsien zwischen 50 g und 100 g sind vier Brunnen einer 24-Well-Platte geeignet. Wenn das Biopsiegewebe weniger als 50 g beträgt, können zwei Brunnen besser geeignet sein. Restmüll und geringe Zellzahl verhindert die Verwendung einer Zellzähltechnik in diesem Schritt; Daher wird die genaue Saatdichte nicht bestimmt und variiert leicht von Biopsie zu Biopsie.
    2. Zellkulturgefäße mit GM bei 37 °C in 5% CO2 für 1 h vor der Aussaat inkubieren.
    3. Kryovials aus dem Gefrierschrank -80 °C entfernen und in ein 37 °C-Wasserbad geben; die Flüssigkeit im Rohr sollte vollständig in Wasser getaucht werden.
    4. Wenn das Auftauen fast abgeschlossen ist (ca. 5 min), übertragen Sie den Kryovial auf eine sterile laminare Strömungshaube. Die Muskelschlämme aus dem Kryovialrohr übertragen und zu einem 15 ml konischen Rohr mit 6 ml vorgewärmten GV mit einer Rate von 1 ml/min geben.
    5. Zentrifugieren Sie die Muskelschlämme bei 300 x g für 5 min bei RT.
      HINWEIS: Eine schwingende Eimerzentrifuge kann es einfacher machen, kleine Pellets bei diesem Schritt zu visualisieren, ist aber nicht unbedingt notwendig.
    6. Aspirieren Sie den Überstand sicher, nicht das Pellet zu stören. Streichen Sie das Rohr, um das Pellet in den verbleibenden Medien wieder auszusetzen und in 1 ml GM wieder auszusetzen.
    7. Übertragen Sie 250 l des resuspendierten Pellets (heute als hMPC-Suspension) auf jede der 4 Brunnen der vorbebrütenten 24-Well-Zellkulturplatte.
  2. Kultur und Passage hMPCs.
    1. HMPC-Kulturen in GV bei 37 °C in 5%CO2pflegen.
      HINWEIS: Die Bestände an GV ohne bFGF (d. h. F12, Antibiotika, FBS) werden in Chargen hergestellt und bis zu 2 Wochen bei 4 °C gehalten. bFGF wird GM am Tag der Anwendung hinzugefügt. BFGF-haltige Medien können für 48 h bei 4 °C gelagert werden.
    2. 24 Stunden nach der Isolierung, aspirieren Sie die GM, waschen Sie das Kulturgefäß vorsichtig 2x mit vorgewärmtem GM, und fügen Sie frische GM.
      ANMERKUNG: 24 h sollten hMPCs ausreichend Zeit zum Anbringen zur Verfügung stellen; nach dem Waschen sollten keine hMPCs entfernt werden. Dieser Schritt wird auch restliche Trümmer entfernen, die während der Zellernte erzeugt wurden, wodurch das Gefäß mit einem bildgebenden Zytometer genauere Konfluenzscans ermöglicht wird (Abschnitt 5 unten). Nach diesem ersten Medienwechsel wird GM alle 48 Stunden gewechselt.
    3. Passage hMPCs, wenn 70% Zusammenfluss erreicht wird oder wenn sie auf dem gleichen Kulturgericht für 10 Tage geblieben sind, je nachdem, was zuerst auftritt.
      HINWEIS: 70% Zusammenfluss beträgt ca. 55.000 Zellen/cm2.
    4. Um dies zu verfolgenden, fügen Sie 250 l vorgewärmten Trypsin zu jedem Brunnen einer 24-Well-Zellkulturplatte hinzu und brüten für 5 min.
    5. Tippen Sie auf das Zellkulturgefäß auf einer festen Oberfläche, um hMPCs zu lösen. Mit einem Lichtmikroskop kann überprüft werden, ob sich die hMPCs gelöst haben.
    6. Die Trypsin/hMPC Suspensionen in einem 15 ml konischen Rohr auf 5 ml GM übertragen.
    7. Zentrifugieren Sie die hMPC-Aufhängung bei 300 x g für 5 min bei RT.
    8. HMPC-Suspensionen von der Zentrifuge entfernen und in der sterilen laminaren Durchflusshaube auf Eis legen.
      HINWEIS: HMPCs während des Passierens auf Eis zu halten, führt zu weniger Zellaggregation.
    9. Aspirieren Sie Überstand aus hMPCs und setzen Sie Pellet in 1 ml GM sanft wieder auf.
    10. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
      HINWEIS: Eine Verdünnung der Zellsuspension auf den Zellzählpuffer ist in der Regel angemessen.
    11. Saat-hMPCs auf kollagenbeschichtete Kulturgerichte mit vorgewärmtem GV mit einer Dichte von 3.500 Zellen pro cm2. Eine Kombination aus 10 cm Platten und 24-Well-Platten ist ideal. Die 24-Well-Platten können täglich auf einem bildgebenden Zytometer gescannt werden, um das Wachstum zu überwachen.
    12. Befolgen Sie das gleiche Verfahren (ab Schritt 3.2.4.) für nachfolgende Passagen.
      HINWEIS: Die Gesundheit und Reinheit der Zellen kann über Passagen hinweg mit einem Marker für zelluläre Seneszenz (z.B. "Galactosidase" und Immunfärbung für Pax7 überwacht werden.
  3. Cryopreserve die hMPCs.
    1. Cryopreserve überschüssige Zellen für die spätere Verwendung, um die KulturVolumen handlicher zu machen.
    2. Für die Kryokonservierung folgen Sie dem in den Schritten 3.2.4.-3.2.9 beschriebenen Trypsinisierungsverfahren.
    3. Während die Zellsuspension zentrifugiert wird, bereiten Sie eine Mischung aus 20% (z.B. 200 l) Dimethylsulfoxid (DMSO) und 80% (z.B. 800 l) GM vor. Pipette nach oben und unten 20x, um eine ausreichende Mischung zu gewährleisten. Lassen Sie die Mischung auf Eis ruhen.
    4. Basierend auf der Zellzahl die hMPC Suspension bei GM auf 2 x 106/ml verdünnen.
    5. Kombinieren Sie die hMPC Suspension und das 20% sterile DMSO/80% GM-Gemisch 50/50. Das letzte Kryokonservierungsmedium ist eine Kombination aus DMSO (10%) und GM (90%) 1 x 106 hMPCs/ml enthalten.
    6. Platzieren Sie 1 ml der hMPC Suspension in Schritt 3.3.5 in so viele Kryovials, wie es die anfängliche Zellzahl erlaubt. Dann legen Sie aliquoted hMPCs in einem isopropanol-kontrollierten Ratenkühler in einem -80 °C Gefrierschrank über Nacht.
      HINWEIS: In diesem Schritt werden in der Regel zwischen 5 und 15 Millionen Zellen gewonnen, von denen 30 bis 60 % von FACS als hMPCs identifiziert werden.

4. Isolierung von Pax7+ Human Muscle Progenitor Cells via Flow Cytometry

  1. Um hMPCs aus lebenden Kulturen (Schritt 3.2.11) vorzubereiten, versuchen Sie genügend Kulturgefäße für 1 x 106x 106 Gesamtzellen. Bereiten Sie Zellsuspensionen vor, wie in den Schritten 3.2.4-3.2.9 beschrieben.
  2. Bereiten Sie hMPCs aus kryokonservierten Kulturen vor (Schritt 2.4.6 oder 3.3.6).
    1. Wählen Sie für jeden Spender 1 x 2 Tuben mit einem Durchlauf von 1 x 106 Durchgängen von vier hMPCs aus.
      HINWEIS: Die Verwendung von Durchgang vier hMPCs ermöglicht eine ausreichende Zellausbeute bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung des proliferativen Potenzials bis zum 6. Durchgang (Abbildung 2).
    2. Schnelles Auftauen von Zellen, indem sie sie aus dem -80 °C Gefrierschrank entfernen und in ein 37 °C-Wasserbad legen, wobei die Flüssigkeit im Rohr vollständig untergetaucht ist.
    3. Wenn das Auftauen fast abgeschlossen ist (ca. 5 min), übertragen Sie hMPCs auf eine sterile laminare Durchflusshaube und übertragen Sie den Inhalt der Zellsuspension in 6 ml vorgewärmtes GV in einem 15 ml konischen Rohr mit einer Rate von 1 ml/min.
    4. Bereiten Sie Zellsuspensionen vor, wie in den Schritten 3.2.7-3.2.9 beschrieben.
    5. Setzen Sie jedes Pellet in 3 ml FACS-Puffer (500 ml PBS, 12,5 ml normales Ziegenserum, 2 ml 0,5 M EDTA, pH 7,4, durch einen 0,22 m Filter) ab.
    6. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min bei RT.
    7. Aspirat-Überstand aus hMPCs und sanft resuspend Pellet in 250 L FACS Puffer; auf Eis.
    8. Legen Sie 100 l Zellen in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr und lassen Sie sie auf Eis, um sie als Live/Dead-Steuerung zu verwenden (Schritt 4.5.1).
      HINWEIS: Die 100 ul Zellen, die für Leben/Tote-Kontrollen verwendet werden sollen, können von der Einnahme eines kleinen Volumens (20 ul) resuspendedr Zellen von jedem Spender zu sortieren oder aus Bankzellen stammen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, nicht mehr als 20 ul resuspendierte Zellen von einem einzigen Spender zu nehmen. Bringen Sie Volumen bis zu 100 ul mit FACS-Puffer, wenn < 100 ul von Zellen verfügbar ist.
  3. Stain hMPCs für Zelloberflächenmarker.
    1. Bereiten Sie den folgenden Antikörper-Cocktail vor (die gezeigten Mengen sind für jede Kultur, entsprechend skalieren): 5 l CD56 (neurales Zelladhäsionsmolekül [NCAM]; PE-Cy7-konjugiert) und 5 l CD29 (1-Integrin; AlexFluor488-konjugiert). Die endgültige Antikörperverdünnung ist 1:50.
    2. Fügen Sie jede hMPC-Suspension 10 l des Antikörpercocktails hinzu und bebrüten sie 30 min im Dunkeln auf Eis.
    3. Fügen Sie 10 ml FACS-Puffer zu jeder Suspension/Antikörper-Cocktail-Mischung hinzu.
    4. Zentrifugieren Sie jedes Rohr bei 300 x g für 5 min bei RT.
    5. Das Pellet in 300 l FACS-Puffer wieder aufhängen und in ein 5 ml rundes Unter-Polystyrolrohr übertragen.
    6. Halten Sie die Suspension auf Eis und vor Licht geschützt.
  4. Bereiten Sie die Kompensationsperlen vor.
    HINWEIS:     Positive Kontrollen für jeden Antikörper und eine Negativkontrolle (ungefärbte Perlen) sollten mit Kompensationsperlen vorbereitet werden. Kompensationsperlenkontrollen sollten auf dem Durchflusszytometer ausgeführt werden, bevor die Proben sortiert werden. Diese Kontrollen ermöglichen die Bestimmung, wie viel das Fluorchrom aus jedem Antikörper im Kanal des anderen detektiert werden kann, so dass eine Kompensation angewendet werden kann.
    1. Wirbel Kompensation Perlen.
    2. In drei 1,7 ml Mikrozentrifugenröhren einen Tropfen (50 l) Kompensationsperlen hinzufügen.
    3. Fügen Sie dem entsprechenden Röhrchen 1 L oder keinen der Negativkontrolle hinzu.
    4. 15 min im Dunkeln bebrüten.
    5. Fügen Sie jedem Rohr und Wirbel 1,5 ml FACS-Puffer hinzu.
    6. Zentrifugieren Sie jedes Rohr bei 300 x g in einer Tischzentrifuge für 5 min bei RT.
    7. Aspirieren Sie Überstand und setzen Sie das Pellet in 200 l FACS Puffer.
      HINWEIS: Das Pellet kann sehr schwer zu visualisieren sein; beim Anaspirieren des Überstandes ist Vorsicht geboten.
    8. Legen Sie die Suspension in ein 5 ml rundes Unterteil Polystyrolrohr und halten Sie dann die Röhre auf Eis und vor Licht geschützt.
  5. Bereiten Sie Live- und Totkontrollen vor.
    1. Teilen Sie die 100 l hMPCs aus Schritt 4.2.8 in zwei 1,7 ml Mikrozentrifugenröhren (eine für die Live-Steuerung und eine für die Totkontrolle).
    2. Legen Sie das tote Steuerrohr in einen Heizblock, der für >10 min auf 70 °C vorgewärmt ist. Während dieser Zeit, halten Sie die Live-Kontrolle auf Eis.
    3. Zentrifugieren Sie jedes Rohr bei 300 x g in einer Tischzentrifuge für 5 min bei RT.
    4. Aspirieren Sie Überstand und setzen Sie das Pellet in 150 l FACS Puffer.
    5. Kombinieren Sie die Live/Dead-Steuerungen in einem einzigen 5 ml runden unteren Polystyrolrohr.
  6. Führen Sie Lebensfähigkeitsfärbung.
    1. Fügen Sie allen zu sortierenden Zellröhren und der Live/Dead-Kontrolle 1 L 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) hinzu.
    2. Fügen Sie GM zu kollagenbeschichteten 24-Well-Platten (250 l/well) und 10 cm (8 ml/well) Platten hinzu und lassen Siesie in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C in 5% CO2 ausdemieren.
  7. Sortieren Sie hMPCs über die Durchflusszytometrie.
    1. Sortieren Sie hMPCs auf einem Durchflusszytometer mit 100 m Düse bei einem Druck von 20 psi. Bestimmen Sie Live-hMPCS basierend auf Seiten- und Vorwärtsstreuung sowie 7-AAD-Negativität (Sortierparameter und eine repräsentative Sortierung sind in Abbildung 3zu sehen).
    2. Zellen positiv für PE-Cy7 (780/60 nm) und AlexFluor488 (530/30 nm) stellen CD56+/CD29+ Zellen dar und sind somit Pax7-positive Zellen (hMPCs). Sortieren Sie doppelte positive Zellen in Sammelröhrchen, die ein 300-L-Kissen faCS-Puffer enthalten.
      HINWEIS: Die Reinheit sortierter Kulturen kann durch Immunfärbung für Pax7 bestimmt werden, gefolgt von einer nachgeschalteten Durchflusszytometrieanalyse (Abbildung 4).
    3. Verwerfen Sie alle anderen Zellen.
    4. Übertragen Sie die sortierten Zellen in ein 15 ml konisches Rohr.
    5. Drehen Sie die hMPC-Aufhängung bei 300 x g für 5 min bei RT.
    6. Den Überstand vorsichtig ansaugen und in 1 ml GM resuspendieren.
    7. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
      HINWEIS: Während die Anzahl der Zellen als die Anzahl der Ereignisse abgeleitet werden kann, die positiv sortiert sind, wurde festgestellt, dass diese Anzahl die Anzahl der Zellen im Vergleich zu herkömmlichen Methoden zur Zellzählung um 10 bis 40 % überschätzt.
    8. Seed die hMPCs wie in Schritt 3.2.11 beschrieben.
      HINWEIS: Die Überprüfung der Reinheit der hMPC-Population kann durch Immunfärbung für Pax7 und Analyse mittels Durchflusszytometrie bestimmt werden.

5. Charakterisierung der Kulturen der menschlichen Muskelprogenitorzelle (hMPC) mit einem bildgebenden Zytometer

  1. Verwenden Sie das bildgebende Zytometer (Materialtabelle), um Zusammenflussscans durchzuführen.
    1. Wählen Sie Neue Scan erstellen aus, und geben Sie dann die Plattenkategorie, das Plattenprofil und die Platten-IDein. Das bildgebende Zytometer kann 96, 24 und 6 Wellplatten aufnehmen.
    2. Wählen Sie unter Anwendungdie Option Einmündung > Konfluence 1aus.
    3. Wählen Sie einen Brunnen aus, der mit dem Navigator auf der rechten Seite des Bildschirms angezeigt werden soll.
    4. Suchen Sie eine Fokusebene, in der die Zellen im Vergleich zum Hintergrund weiß erscheinen, und wählen Sie das Registerhandbuch aus, oder erlauben Sie dem bildgebenden Zytometer, die Fokusebene auszuwählen, indem Sie Register Autoauswählen.
      HINWEIS: Für die 96 Brunnenplatten, die in der Tabelle der Materialienvorgeschlagen werden, beträgt eine ungefähre Position 4,3 Einheiten.
    5. Verwenden Sie die Maus, um alle Brunnen hervorzuheben, die gescannt werden müssen. Der gesamte Brunnenbereich wird automatisch gescannt. Wählen Sie Scan starten.
    6. Wählen Sie die Analyseeinstellungen optimal für Den Platten- und Zelltyp aus.
      HINWEIS: Für hMPCs sind die folgenden Einstellungen optimal: Intensität = 6, gesättigte Intensität = 0, Durchmesser = 8, Mindestdicke = 3, min Clustergröße = 500 und Genauigkeit = hoch.
    7. Wählen Sie Analyse startenaus.
      HINWEIS: Sehen Sie Bilder visuell, um sicherzustellen, dass der Benutzer und das bildgebende Zytometer hinsichtlich des Umfangs der Zellen übereinstimmen. Wenn eine große Diskrepanz besteht, scannen Sie die Platte erneut mit einer anderen Fokusebene oder anderen Analyseeinstellungen. Konfluence Scanning kann verwendet werden, um das Wachstum zwischen Kulturen zu vergleichen, zeitweise die Verabreichung einer Behandlung zu bestimmen oder Zellen zu überwachen und zu entscheiden, wann eine Differenzierung eingeleitet werden soll. Wenn eine Differenzierung gewünscht wird, werden Details in Abschnitt 6 angegeben.
  2. Verwenden Sie das bildgebende Zytometer, um Zellen zu zählen.
    1. Bereiten Sie eine Färbelösung vor, die 12 ml Von Hams F12, 6 l Von Hoechst 33342 und 24 l Propidiumjodid enthält.
    2. Aspirieren Sie Medien und ersetzen Sie durch Färbelösung, inkubieren bei 37 °C für 15 min.
    3. Aspirieren Färbung Lösung und ersetzen mit Hamf12.
      HINWEIS: Es ist wichtig, ein Medium mit niedrigem Phenolrotgehalt zu verwenden, um klare Bilder zu erhalten. Alternativ kann PBS verwendet werden.
    4. Laden Sie die Platte auf das bildgebende Zytometer und wählen Sie unter Anwendung, wählen Sie Zelllebensfähigkeit > Live + Tot + Total. Der Live-Kanal wird ein helles Feldbild sein, der tote Kanal wird das Propidium Iodide sein, und der gesamte Kanal wird der Hoechst 33342 sein.
    5. Legen Sie den Live-Kanal auf ein helles Feld fest, und klicken Sie unter Fokus-Setupauf Auto registrieren .
    6. Legen Sie unter dem Kanal Total den Kanal auf blau fest. Verwenden Sie Fokus suchen, um die Kerne in den Fokus zu rücken, oder verwenden Sie die Auf- und Abwärtspfeile, um den Fokus manuell einzustellen. Klicken Sie auf Versatz festlegen, um den Fokus auszuwählen.
    7. Stellen Sie unter dem Dead-Kanal den Kanal auf Rot ein. Verwenden Sie Fokus suchen, um die toten Zellen in den Fokus zu rücken, oder verwenden Sie die Auf- und Abwärtspfeile, um den Fokus manuell festzulegen. Klicken Sie auf Versatz festlegen, um den Fokus auszuwählen.
    8. Wählen Sie Scan starten aus, um den Scan zu starten.
    9. Wählen Sie Analyseparameter aus, die für den Platten- und Zelltyp geeignet sind. Wählen Sie Analyse starten aus, um die Analyse zu starten. Überprüfen Sie nach Abschluss der Analyse visuell, ob die Analyse Zellen angemessen zählt (z. B. für die Gesamtkanalprüfung, ob jeder Kern als Kern erkannt wird und dass das bildgebende Zytometer keine Flecken im Hintergrund Nuklei). Wenn der Scan und die Analyse zufriedenstellend sind, geben Sie die Platte an den Inkubator zurück, andernfalls scannen oder ändern Sie die Analyseparameter.

6. Unterscheidung von humanen Muskelvorläuferzellen (hMPCs) auf Myotuben

  1. Bestimmen Sie den hMPC-Zusammenfluss mithilfe des Protokolls in Abschnitt 5.1. Um hMPCs in Myoröhren zu differenzieren, ist es ideal, dass Zellen 80 bis 85 % konfluent sind, wie durch die Zusammenflussfunktion auf dem bildgebenden Zytometer bestimmt (siehe Abschnitt 5). Wenn hMPCs von mehr als einem eindeutigen Spender verwendet werden, ermöglicht das Konfluenzscanning Zellen verschiedener Spender, mit der Differenzierung zu beginnen, wenn sie den Zusammenfluss erreichen.
    HINWEIS: Bei 80% Zusammenfluss gibt es ca. 66.000 Zellen/cm2.
  2. Waschzellen 2x mit Differenzierungsmedien (97% Schinkenf12, 2% Pferdeserum, 1% Penicillin/Streptomycin, pH 7,4, durchlaufen einen 0,22-m-Filter).
  3. Bewahren Sie Zellen in Differenzierungsmedien so lange, wie das Experiment diktiert, während Sie täglich die Medien wechseln.
  4. Bewerten Sie die Myotube-Bildung direkt durch Immunfärbung für embryonale Myosin-Schwerekette, die typischerweise nach 7-10 Tagen Differenzierung nachweisbar ist.
    HINWEIS: Die Zeit, die für die Bildung von Myotuben benötigt wird, kann je nach Spender und Anzahl der Zellen, wenn die Differenzierung eingeleitet wurde, leicht variieren; Daher wird empfohlen, die Kulturen jedes Spenders einzeln zu überwachen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repräsentative Durchflusszytometrie Ergebnisse der hMPC-Isolierung aus menschlichem Muskelgewebe können in Abbildung 1dargestellt werden. hMPCs können durch erste Gating-Ereignisse identifiziert werden, die auf Seitenstreuung und Vorwärtsstreuung basieren, um abgestorbene Zellen oder Trümmer zu beseitigen, gefolgt von der Auswahl nur von Zellen, die für 7-AAD negativ sind und daher lebensfähig sind. Die Auswahl der Zellen, die sowohl für die Zelloberflächenmarker CD56 als auch für CD29 positiv sind, stellt die hMPC-Population dar. Eine Biopsie von 60 mg liefert nur etwa 75-250 hMPCs.

Abbildung 2Azeigt einen repräsentativen Konfluenzscan . Die grünen Umrisse in Abbildung 2B wurden durch das bildgebende Zytometer erzeugt und zeigen, wie das bildgebende Zytometer den Zusammenfluss basierend auf den ausgewählten Analyseeinstellungen ermittelt. In beiden gezeigten Bildern stimmt der durch das bildgebende Zytometer ermittelte Zusammenfluss mit dem vom Benutzer visuell bestimmten Zusammenfluss überein. Diese Bilder zeigen aber auch, dass das bildgebende Zytometer nicht perfekt ist. Der rote Pfeil hebt beispielsweise eine Unvollkommenheit in der Platte hervor, die als Zellen gezählt wird. Wenn eine große Anzahl dieser Unvollkommenheiten auf der Platte vorhanden ist, stellt der resultierende Zusammenfluss den Zusammenfluss der Zellen nicht genau dar. Abbildung 2C zeigt eine Darstellung aller drei Kanäle, die zur Zählung von Zellen (Hellfeld, Blau und Rot) und des zusammengeführten Bildes verwendet werden. Abbildung 2D zeigt die Heterogenität zwischen Spendern. Diese Heterogenität zu entdecken und genau zu charakterisieren, ist eine schlüsselfertige Anwendung des bildgebenden Zytometers. Abbildung 2E zeigt, dass Zusammenflussmessungen und Kernzahlen von Einzelspendern stark korreliert sind.

Abbildung 3 enthält eine Richtlinie zum Identifizieren von hMPCs auf der Grundlage des in diesem Protokoll beschriebenen FACS-Verfahrens. Gating basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuung ermöglicht die Trennung lebensfähiger Zellen von Ablagerungen (Abbildung 3A). Ein Vergleich der Vorwärtsstreuung nach Höhe zu Vorwärtsstreuung nach Fläche wurde verwendet, um Ereignisse zu unterscheiden, die einzelne Zellen darstellen (der geschachtelte Bereich in Abbildung 3B). Lebensfähige Zellen sind durch einen Mangel an Einbeziehung des Lebensfähigkeitsflecks 7-AAD gekennzeichnet (Abbildung 3C). Schließlich werden Zellen, die sowohl für CD56 als auch für CD29 positiv sind, als hMPCs identifiziert (Abbildung 3D). Zur Validierung des in diesem Protokoll beschriebenen FACS-Verfahrens kann die Auswahl von Pax7-positiven Zellen durch immunstainierende Zellen mit einem Pax7-spezifischen Antikörper und Messexpression auf einem Durchflusszytometer bestimmt werden. Abbildung 4 vergleicht die Anzahl der hMPCs, die durch Pax7-Immunostainierung bestimmt werden (Abbildung 4A) im Vergleich zum FACS-Verfahren (Abbildung 4B), das in diesem Protokoll von derselben Zellpopulation beschrieben wird. Abbildung 5 verwendet Pax7-Immunostainierung und -analyse mittels Durchflusszytometrie, um die Anreicherung von Pax7-exzessizierenden Zellen in der Gesamtpopulation nach FACS (Abbildung 5A im Vergleich zu Abbildung 5B) sowie die Aufrechterhaltung der Anzahl von Pax7 zu zeigen. Zell nach dem Passaging exprossieren (Abbildung 5B im Vergleich zu Abbildung 5C).

hMPCs können durch folger6 zu Myoröhren unterschieden werden. Um festzustellen, ob isolierte hMPCs myogene Kapazitätszellen erhalten, können Sie mit einem Antikörper immunstainiert werden, der für embryonale Myosin-Schwereketten spezifisch ist, und mittels Fluoreszenzmikroskopie visualisiert werden. Repräsentative Bilder von embryonalen Myosin-positiven Ketten-positiven Myoröhren können in Abbildung 6eingesehen werden.

Figure 1
Abbildung 1 : Repräsentative Durchflusszytometrie-Bilder für hMPCs, die direkt aus Muskelbiopsiegewebe sortiert werden. (A) Seitenstreufläche (y-Achse) vs. Vorwärtsstreufläche (x-Achse) Gating-Strategie verwendet, um alle Zellen in einer Spenderprobe zu identifizieren. (B) 7-AAD-Lebensfähigkeitsfleck (y-Achse) vs. Vorwärtsstreuung (x-Achse), um lebende Zellen zu identifizieren. (C) Negatives Sortiermarkierungsprofil (-CD11b, -CD31, -CD45, -GlyA [y-Achse]) vs. Auswahlmarker CD34. (D) Negative Auswahlmarkierung CD34 (y-Achse) im Vergleich zur positiven Auswahlmarkierung CD29. (E) Positive Auswahlmarkierung CD56 (y-Achse) im Vergleich zur positiven Auswahlmarkierung CD29 (x-Achse). (F) Erträge aus drei verschiedenen Skelettmuskelbiopsien. FSC = Vorwärtsstreuung; SSC = Seitenstreuung; hMPCs, menschliche Muskelvorläuferzellen.

Figure 2
Abbildung 2 : Das proliferative Potenzial von hMPCs, die von menschlichen Spendern abgeleitet werden, wird nach 6 Passagen aufrechterhalten. (A) Repräsentativer Zusammenflussscan. (B) Repräsentativer Zusammenflussscan mit grünen Umrissen, die zeigen, wie das bildgebende Zytometer den Zusammenfluss bestimmt. Der rote Pfeil zeigt eine Unvollkommenheit auf der Platte. (C) Repräsentatives Hellfeld, Hoechst 33342 (blau) und Propidium Iodid (rot) Färbung und ein zusammengeführtes Bild dieser drei Kanäle. Skalenbalken = 1mm. (D) Kerne zählt aus 6 einzigartigen Spendern hebt die hMPC-Heterogenität hervor. (E) Die Konfluenz und die Anzahl der Kerne sind stark korreliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3 : Repräsentative Fließzytometrie-Sortierparameter für die hMPC-Isolierung. (A) Seitenstreufläche (y-Achse) vs. Vorwärtsstreufläche (x-Achse) Gating-Strategie verwendet, um alle Zellen in einer Spenderprobe zu identifizieren. (B) Vorwärtsstreuhöhe (y-Achse) vs. Vorwärtsstreufläche (x-Achse), um Doublets von der Sortierpopulation zu disqualifizieren. (C) Vorwärtsstreuhöhe (y-Achse) vs. 7-AAD-Einarbeitung zur Identifizierung lebensfähiger Zellen. (D) PE-Cy7 (CD56) vs. AF488 (CD29) Färbung mit Q2 für doppelte positive Zellen (hMPCs). Farbe stellt die Dichte von Ereignissen dar.

Figure 4
Abbildung 4 : Vergleich der CD29/CD56 Positivität im Vergleich zur Pax7-Positivität in Durchgang 4 hMPCs desselben Spenders. (A) Anzahl (y-Achse) vs. Pax7-Ausdruck (x-Achse). B) Positive Auswahlmarkierung CD56 (y-Achse) vs. positive Auswahlmarkierung CD29 (x-Achse). NCAM = Nervenzelladhäsionsmolekül; hMPC = menschliche Muskelvorläuferzelle.

Figure 5
Abbildung 5 : Pax7-Positivität wird in hMPCs beibehalten, die von demselben Spender über mehrere Passagen abgeleitet werden. (A) Pax7-Expression (x-Achse) von Zellen, die vor der FACS-Sortierung viermal durchgegangen wurden. (B) Pax7-Ausdruck (x-Achse) von hMPCs 1 Passage nach FACS-Sortierung für CD29 und CD56 Positivität (5 Gesamtpassagen). (C) Pax7-Ausdruck (x-Achse) von hMPCs 2 Passagen nach FACS-Sortierung für CD29 und CD56 Positivität (6 Gesamtpassagen).

Figure 6
Abbildung 6 : Färbung von hMPC abgeleiteten Myotuben für embryonale Myosin schwere Kette. Repräsentative mikroskopische Bilder von differenzierten hMPCs, die mit DNA-Färbung (Hoechst 33342, blau) und embryonaler Myosin-Schwerekette (grün) (n = 3) ko-gebeizt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Primäre hMPCs sind ein wichtiges Forschungsmodell, das verwendet wird, um skelettierte Muskelbiologie und den regenerativen Prozess zu verstehen. Darüber hinaus haben hMPCs das Potenzial, für die Therapie verwendet zu werden. Es gibt jedoch anerkannte Herausforderungen bei der Verwendung von primären hMPCs für Forschung und Therapie, einschließlich des begrenzten Verständnisses von Zellen, die vom Menschen abgeleitet sind10. Es gibt auch eine große Variation in der Expansionskapazität zwischen den Geberkulturen, die das Potenzial für den Einsatz von hMPCs begrenzt und die Forschungsergebnisse beeinflussen kann11. So wurde beispielsweise kürzlich nachgewiesen, dass hMPCs, die mit der in diesem Protokoll beschriebenen Methode isoliert wurden, Zellen erzeugten, die in der Erweiterungskapazität variierten, und dies wurde durch ein Transkriptionsprofil angetrieben, das nicht mit dem Geschlecht oder dem Altervon 11Jahren übereinstimmte.

Hier stellen wir eine effiziente und ertragsstarke Methode zur Isolierung von hMPCs in ausreichenden Mengen für eine Reihe nachgelagerter Anwendungen vor, einschließlich der Differenzierung in Myotuben, wodurch der myogene Prozess in vitro modelliert wird. Unsere Methode basiert auf FACS, um CD56+/CD29+ Zellen zu isolieren, die zuvor als eine angereicherte Pax7-Exzesspopulation12identifiziert wurden. Andere ebenso gültige Zellsortierstrategien wurden ebenfalls beschrieben5,6.

Der wichtigste Aspekt unserer hMPC Isolations- und Kulturmethode ist die sorgfältige Überwachung einzelner Kulturen. Die auf Spendern basierende Heterogenität umfasst die Anzahl der hMPCs, die aus jeder Biopsie gewonnen wurden, ihre Zeit, die Proliferation in vitro zu initiieren, und ihre Bevölkerungsexpansionsrate. Wenn daher Unterschiede in der Myotubebildung nach einer Behandlung die Frage des individuellen Interesses sind, sollten hMPC-Kulturen auf der Grundlage eines von vorndefinierten Zusammenflussniveaus auf eine Behandlung umgestellt und objektiv mit dem bildgebenden Zytometer bewertet werden.

Unsere Methode zur Isolierung und Kultur von hMPCs wurde optimiert, um Erträge von Zellen in Millionenhöhe für In-vitro-Experimente aus relativ wenig beginnendem Biopsiegewebe (50-100 mg) zu erhalten. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass mehrere Assays und Experimente an hMPCs desselben Spenders durchgeführt werden können, was die Aufrechterhaltung des Spenderphäpnotyps über Experimente hinweg ermöglicht und gleichzeitig eine geringe Variabilität zwischen Experimenten einführt. Unsere Methode unterscheidet sich von kürzlich veröffentlichten Methoden, die sich auf die Extraktion der reinsten Population von Pax7 konzentrieren, die Zellen direkt aus Biopsiegewebe exzessiiert, wo der Fokus xenotransplantation8liegt. Die Herausforderung mit diesen früheren Methoden ist jedoch, dass sie ein Anfangsgewebegewicht von mehr als einem Gramm benötigen. Daher sind sie nicht praktisch für die Forschung mit menschlichen Skelettmuskelbiopsien. Eine Einschränkung unserer Methode ist, dass das Potenzial für Xenotransplantationnicht bewertet wurde. Diese Art von Verfahren gehörte jedoch nicht zu den ursprünglich vorgesehenen nachgelagerten Anwendungen. Zukünftige Richtungen dieser Methode können die Bewertung der Transplantationskapazität von hMPCs nach unserem Isolationsverfahren umfassen, um festzustellen, ob es Potenzial für die Anwendung dieses Verfahrens in MPC-Transplantationsstudien gibt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren danken der Cornell University, Biotechnology Resource Center Imaging Facility für ihre Hilfe bei der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung. Wir danken auch Molly Gheller für ihre Hilfe bei der Rekrutierung von Teilnehmern und Erica Bender für die Durchführung der Skelettmuskelbiopsien. Abschließend danken wir den Teilnehmern für ihre Zeit und ihre Teilnahme an der Studie. Diese Arbeit wurde vom National Institute on Aging of the National Institutes of Health unter der Award-Nummer R01AG058630 (nach B.D.C. und A.E.T.), von einer Glenn Foundation for Medical Research und der American Federation for Aging Research Grant for Junior Faculty (zu B) unterstützt. . D.C.) und vom President es Council for Cornell Women (bis A.E.T.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA Corning 25-053-Cl Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate VWR 664160 Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube Falcon 352196 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate Grenier Bio-One 662 160 Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution eBioscience 00-6993-50 Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 BioLegend 303016 Conjugated antibody for FACS 
Black 96-well cell culture plate Grenier Bio-One 655079 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S Nexcelcom Bioscience Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer VWR 352350 Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail) Corning 354236 Collagen for coating cell culture plates 
Collagenase D Roche 11 088 882 001 Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide VWR WN182 Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II Sigma Life Sciences D4693 A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder Gibco 31600-034 Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 21600-010 PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate J.T. Baker 4040-01  Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum VWR 89510-186  Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12 Gibco 21700-026 Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum Gibco 26-050-070 Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer iNCyto DHC-N0105 Used to count cells
Hibernate A Gibco A1247501 Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate Life Technologies H21492 DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol Fisher Scientific A416P-4 Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer Orflo MXA006 Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes Orflo MXC002 Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter Orflo Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001 Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%) Thermo Fisher Scientific 50062Z Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 BD Pharmingen 557747 Conjugated antibody for FACS 
Penicillin/Streptomycin 100x Solution Corning 30-002-CI Antibiotics added to culture media
Propidium iodide Thermo Fisher Scientific P3566 DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor Promega G5071 Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium  Gibco 12648-010 Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-3 Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes VWR 60818-565 Tubes used for FACS
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42 Compensation beads fort calibrating flow FACS settings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. D'Souza, D. M., et al. Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling. Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).
  3. Scheele, C., et al. Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
  4. Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).
  5. Charville, G. W., et al. Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
  6. Alexander, M. S., et al. CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies. Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).
  7. Thalacker-Mercer, A., et al. Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy. Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).
  8. Garcia, S. M., et al. High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells. Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).
  9. Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Cryopreservation and thawing of cells. Current Protocols in Immunology. , Appendix 3, 3G (2012).
  10. Bareja, A., Billin, A. N. Satellite cell therapy - from mice to men. Skeletal Muscle. 3 (1), 2 (2013).
  11. Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity. Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).
  12. Xu, X., et al. Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles. Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).

Tags

Entwicklungsbiologie Ausgabe 150 menschliche adulte Stammzellen Muskelvorläuferzellen Skelettmuskelbiopsie Zellkultur Satellitenzelle Skelettmuskel
Isolation, Kultur, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Muskelprogenitorzellen aus dem Skelettmuskelbiopsieverfahren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gheller, B. J., Blum, J.,… More

Gheller, B. J., Blum, J., Soueid-Baumgarten, S., Bender, E., Cosgrove, B. D., Thalacker-Mercer, A. Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure. J. Vis. Exp. (150), e59580, doi:10.3791/59580 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter