Summary
我们介绍从骨骼肌活检组织获得的分离、培养、特征化和区分人类原发性肌肉祖细胞（hMPCs）的技术。通过这些方法获得和特征化的hMC可用于随后解决与人类肌发生和骨骼肌再生相关的研究问题。
Abstract
使用原始人体组织和细胞是研究生物和生理过程，如骨骼肌再生过程的理想选择。在使用人类原发性成人干细胞，特别是从骨骼肌活检中提取的人类肌肉祖细胞（hMPCs）方面，存在着公认的挑战，包括从采集的组织中产生的细胞产量低和大量供体异质性。不同文化之间的生长和死亡参数。虽然在实验设计中引入异质性需要更大的样本大小来检测显著影响，但它也使我们能够识别在 hMPC 扩展容量中产生可变性的机制，从而使我们能够更好地了解骨骼肌再生的异质性。区分文化扩张能力的新机制有可能导致治疗的发展，以改善骨骼肌再生。
Introduction
骨骼肌是人体最大的器官系统，占全身质量的30-40%。除了在运动中公认的作用外，骨骼肌还维持体温和姿势，并在全身营养平衡中起着核心作用。涉及人类参与者、动物和细胞培养模型的研究对于解决骨骼肌生物学和再生相关问题都很有价值。人类原发性肌肉祖细胞（hMPCs）的分离和培养提供了一个可靠的模型，允许将细胞培养技术和操作应用于人体样本。使用hMPCs的一个优点是，它们保留了每个捐赠者2，3的遗传和代谢表型。维持供体表型使研究人员能够检查造血过程的个体间变异。例如，我们采用了hMPC表征方法，以识别hMPC人口扩容能力4中与年龄和性别相关的差异。
该协议的目的是详细说明分离、培养、表征和区分骨骼肌活检组织的hMPC的技术。在以前描述hMP和识别hMPC隔离5、6的潜在细胞表面制造商的工作的基础上，该协议通过将隔离与hMP的表征联系起来，填补了知识方面的重要空白。此外，该协议中包含的详细分步说明使 hMPC 隔离和特性可供广大科学受众访问，包括以前对 hMPC 经验有限的受众。我们的协议是最早描述使用成像细胞仪来跟踪细胞群的协议之一。新设计的成像细胞仪是最先进的、高通量的和基于微板的，能够在几分钟内对培养容器的每个孔中的所有细胞进行活细胞成像、细胞计数和多通道荧光分析。该系统允许快速量化整个细胞群的增殖和生存能力的动态变化，而对培养的干扰最小。例如，我们能够在体外连续几天对汇合进行客观的汇合测量，以确定从不同捐赠者获得的每个培养物的生长动力学。文献中的许多协议，特别是涉及微量体分的的协议，要求细胞在开始分化或治疗之前达到定义的汇合水平7。我们的方法允许客观地确定文化容器中每个孔的汇合，使研究人员能够以不偏不倚、非主观的方式开始治疗。
过去，使用初级 hMPC 的一个主要限制是低产量，限制了可用于实验的细胞数量。我们和其他人已经表明，骨骼肌活检组织的MPC的收率是每毫克组织1~15个MpCs（图1）8。由于我们的协议允许在用荧光活性细胞分拣（FACS）进行纯化之前对细胞进行四个通道，我们的冷冻hMPC产量来自少量活检组织（50-100毫克），足以满足研究目标，需要多个实验。我们的 FACS 协议产生 ±80% 纯（Pax7 阳性）MPC 总体，因此我们的协议针对产量和纯度进行了优化。
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Protocol
该协议得到了康奈尔大学机构审查委员会的批准。对所有参与者进行了基本健康状况筛查，并给予知情同意。
1. 通过骨骼肌活检获得人体肌肉组织
- 通过触觉、解剖地标和肌肉的主动收缩识别巨大的侧侧肌。
- 通过让参与者收紧四头肌和找到肌肉的腹部，大约1/3的方式从骨片到臀部，只是腹肌侧向。
- 使用纸张测量胶带标记一个带手术标记的区域，距离代表肌肉腹部的骨皮顶部约 4⁄6 英寸。
- 在标记区域附近切染任何头发，然后用手术前使用的手术级防腐剂清洗（例如：2%氯西丁葡萄糖酸（CHG）/70%同丙醇（IPA））。
- 用1%利多卡因麻醉活检部位。
注：避免将利多卡因注射到骨骼肌中。 - 在标记的部位进行 4⁄5 mm 的切口通路。
- 麻醉后，将带有小车的Bergstrom针推入肌肉腹部（约2~3厘米）。
- 将肌肉组织吸入 Bergstrom 针头，取出切割小车 2⁄3 厘米，而助手则通过拔取连接的 60 mL 注射器柱塞来施加吸力。
- 关闭切割室。
- 将活检针的底座旋转四分之一圈，然后重复打开针头、施加吸力和关闭针头的顺序。
注：每次针关闭时，在Bergstrom针头内应获得肌肉组织的切口。在采集样品期间，针头将留在大腿上相同的垂直位置，同时纵向旋转 360°以获取每个样品。此序列可以重复 3⁄4 次。 - 将收集的活检组织从针头排入无菌非粘附敷料垫。
- 检查组织，并使用无菌手术刀刀片或钳子去除任何可见的脂肪和纤维组织。
- 将部分（50–100毫克）组织放入含有CO2-独立营养介质的无菌管中（例如，Hibernate A）。
注：组织的重量确定如下。首先将含有营养介质的封顶管放在刻度和量度上。接下来，将组织放入管中，重新盖住管，然后称量含有营养介质中的组织。 - 将含有组织和营养培养物的管子储存在4°C，直到加工。
注：活检组织应在采集后48小时内处理。
2. 从活检组织中分离人类肌肉祖细胞
- 明斯活检组织。
- 将肌肉组织从营养培养基转移到生物安全柜或类似无菌工作场所的无菌培养皿中。
- 使用无菌手术刀刀片将组织切成 ±1 mm3件。
- 清洗切碎的活检组织，以清除残留的碎片。
- 将肌肉组织转移到含有10 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）的15 mL锥形管中，并允许组织通过重力沉降。
- 吸气上清液小心不要干扰肌肉组织。
- 将 10 mL 的 PBS 添加到洗涤的组织，并允许肌肉组织通过重力重新定居。
- 吸气上清液小心不要干扰肌肉组织。
- 加入10 mL的低葡萄糖Dulbeco的改性鹰培养基（DMEM），让组织通过重力重新定居。
- 吸气上清液小心不要干扰肌肉组织。
- 在消化培养剂中孵育组织。
- 在3 mL的消化培养基（2 mg/mL胶原酶D在低葡萄糖DMEM）中重新悬浮肌肉组织。
注：胶原酶D库存溶液可在低血糖DMEM下以20mg/mL制备，储存在-80°C，然后在使用时在低葡萄糖DMEM中稀释1：10。 - 在37°C的水浴中孵育含有肌肉组织的管子30分钟。
- 使用 10 mL 血清学移液器或宽孔移液器，每 10 分钟对肌肉组织悬浮液进行三聚。
- 加入83μL的额外消化介质和24μL的消血液（0.76 mM醋酸钙，1.39 mM醋酸钠，13.91mg/mL消血II在低血糖DMEM中）。将悬架返回到 37°C 水浴。
- 每 5~10 分钟用宽孔移液头对肌肉组织悬浮液进行三聚。
- 继续三聚，直到达到均匀的浆料，并且不超过1.5小时，以防止过度消化。
注：组织的充分切碎和胶原酶和消血酶的酶活性会影响样品消化。均匀的浆料应在 1.5 小时后以最小的遮挡通过正常的移液器尖端。如果在 1.5 小时后未达到均匀浆料，请仔细检查组织切碎是否足够，并且组织被切碎到适当的大小（步骤 2.1.2）。此外，酶的活性应该测试，因为酶活性确实发生很多到很多的变化。
- 在3 mL的消化培养基（2 mg/mL胶原酶D在低葡萄糖DMEM）中重新悬浮肌肉组织。
- 颗粒细胞和冻结在恢复介质。
- 向肌肉浆料添加6 mL的生长介质（GM;79%Ham的F12，20%胎儿牛血清，1%青霉素/链霉素，5纳克/mL基本成纤维细胞生长因子[bFGF]，pH 7.4，通过0.22 μm过滤器）。
- 将悬浮液通过70μm细胞过滤器移入50 mL锥形管中。用额外的 4 mL GM 冲洗滤网。
注：样品可传回15 mL锥形管中，便于可视化颗粒。如果后续细胞产量较低，可以使用较大的洗涤体积。 - 在室温 （RT） 下以 300 x g离心 5 分钟。
- 吸气上清液确保不会破坏颗粒。轻拂管子，在剩余介质中重新悬浮颗粒。如果不对单元格进行培养，请立即转到步骤 2.4.5，以获得长期存储方面的说明，否则将转到步骤 3.1.6。
注：如果需要立即培养，在活检处理开始之前，应在细胞培养板中预孵育转基因（步骤3.1.1和3.1.2）。 - 在回收颗粒中加入1.5 mL的恢复细胞培养冻结介质（材料表）。
- 将浆料转移到冷冻液中。将冷冻液置于异丙醇控制速率冷水机组中过夜，温度为-80°C。将冷冻温度储存在-80°C，直到准备好培养。
注：含有泥浆的冷冻液可保存在液氮中，用于长期储存（大于1个月）。使用异丙醇控制速率冷水机组可使细胞以1°C/min的速度可重复冷冻，从而达到最佳的细胞回收率，冻结后的可行性和附着在细胞培养容器9中的可能性就证明了这一点。或者，可以使用含有RT异丙醇的烧杯，放置在-80°C冰柜中。
3. 培养人类肌肉祖细胞
- 解冻肌肉浆料。
- 在解冻和播种hMC之前，在GM中预平衡细胞培养板。将250μL的转基因添加到4孔胶原蛋白涂层（胶原I），24孔细胞培养板。用500 μL无菌基介质（即F12）填充剩余的井，以防止在长期培养期间蒸发。
注：对于 50 g 和 100 g 之间的活检，24 孔板的四口井是合适的。如果活检组织小于50克，两口井可能更合适。残余碎片和低细胞数阻止在此步骤中使用细胞计数技术;因此，确切的播种密度尚未确定，并且从活检到活检略有不同。 - 在播种前用GM在37°C的5%CO2孵育细胞培养容器1小时。
- 从-80°C冷冻箱中取出冷冻液，放入37°C水浴中;管子中的液体应完全浸入水中。
- 当解冻几乎完成（约5分钟）时，将冷冻液转移到无菌层流罩。将肌肉浆液从冷冻管中移出，并加入含有 6 mL 预加热 GM 的 15 mL 锥形管，速率为 1 mL/min。
- 在 RT 时，将肌肉浆液在 300 x g下离心 5 分钟。
注：摆动式铲斗离心机可以更容易地在此步骤中可视化小颗粒，但并非必不可少。 - 吸气上清液确保不会破坏颗粒。轻拂管子，在剩余的介质中重新悬浮颗粒，并在 1 mL 的 GM 中重新悬浮。
- 将250 μL的再悬浮颗粒（现在视为hMPC悬浮液）转移到预孵育的24孔细胞培养板的4口孔中。
- 在解冻和播种hMC之前，在GM中预平衡细胞培养板。将250μL的转基因添加到4孔胶原蛋白涂层（胶原I），24孔细胞培养板。用500 μL无菌基介质（即F12）填充剩余的井，以防止在长期培养期间蒸发。
- 文化和通道 hMPC。
- 在 5% CO2中保持 GM 的 hMPC 培养值在 37°C。
注：不含bFGF的转基因库存（即F12、抗生素、FBS）分批制备，并保存在4°C下长达2周。bFGF 在使用当天被添加到 GM 中。含有bFGF的介质可在4°C下储存48小时。 - 隔离24小时后，吸气的通用汽车，轻轻地洗文化容器2x与预加热的通用汽车，并添加新鲜的通用汽车。
注：24小时应为 hMC 提供足够的连接时间;洗涤后不应去除 hMPC。此步骤还将清除细胞收获过程中产生的残留碎屑，使容器更便于使用成像细胞仪进行精确的汇合扫描（下文第 5 节）。此初始介质更改后，GM 每 48 小时更改一次。 - 当达到 70% 汇合时或当它们在同一文化盘上停留 10 天（以先发生者为准）时，通过 hMPC。
注：70%汇合约为55，000个细胞/cm2。 - 在通过后，在24孔细胞培养板的每个孔中加入250μL的预加热胰蛋白酶，孵育约5分钟。
- 点击强表面上的细胞培养容器以分离 hMPC。光学显微镜可用于验证 hMPC 是否分离。
- 在15 mL锥形管中将胰蛋白酶/hMPC悬浮液转移到5 mL的转基因。
- 在 RT 时，将 hMPC 悬架在 300 x g下离心 5 分钟。
- 从离心机中取出 hMPC 悬浮液，并放置在无菌层流罩的冰上。
注：在通过过程中将 hMPC 保持在冰上会导致更少的单元聚合。 - 吸气上清液从hMPC和轻轻重新悬浮颗粒在1 mL的转基因。
- 使用血细胞计或自动细胞计数器对细胞进行计数。
注：1：5稀释细胞悬浮液到细胞计数缓冲液通常是适当的。 - 种子hMPCs到胶原蛋白涂层培养皿含有预加热的转基因，密度为每厘米3，500细胞2。10 厘米板和 24 孔板的组合是理想的。24孔板每天可在成像细胞仪上扫描，以监测生长。
- 对于后续段落，请遵循相同的过程（从步骤 3.2.4.开始）。
注：细胞健康和纯度可以使用细胞衰老标记（例如β-乳糖苷酸酶）和Pax7的免疫染色在通道上监测。
- 在 5% CO2中保持 GM 的 hMPC 培养值在 37°C。
- 冷冻保存 hMPC。
- 冷冻保存多余的细胞供以后使用，以使培养卷更易于管理。
- 对于冷冻保存，请遵循步骤 3.2.4.-3.2.9 中描述的胰蛋白酶化过程。
- 当细胞悬浮液离心时，制备20%（例如200μL）二甲基硫酸盐（DMSO）和80%（例如800μL）的混合物。将混合物放在冰上休息。
- 根据细胞计数，将HMPC悬浮液稀释至2 x 106/mL。
- 结合 hMPC 悬架和 20% 无菌 DMSO/80% 转基因混合物 50/50。最后的冷冻保存介质是 DMSO （10%） 的组合和通用汽车（90%）包含 1 x 106 hMPC/mL。
- 将步骤 3.3.5 中准备的 hMPC 悬架的 1 mL 放入初始细胞计数允许的尽可能多的冷冻液中。然后，将无用 hMPC 放入异丙醇控制速率冷水机组中过夜-80°C。
注：在此步骤中，通常获得 500 万到 1500 万个细胞，其中 30-60% 被 FACS 确定为 hMPC。
4. 通过流细胞测定分离 Pax7–人类肌肉祖细胞
- 为了从活培养物制备hMPC（步骤3.2.11），试生足够的培养容器，用于1 x 106+2 x 106个总细胞。如步骤 3.2.4_3.2.9 所述准备细胞悬浮液。
- 从冷冻培养物中制备 hMP（步骤 2.4.6 或 3.3.6）。
- 为每个供体选择 1⁄2 个管，其中包含 +1 x 106通道 4 个 hMPC。
注：使用通道四个 hMPC 允许足够的细胞产量，同时仍然保持增殖电位直到通道 6 （图 2）。 - 将细胞从-80°C冷冻箱中取出，并将其放入37°C的水浴中，将液体完全浸没在管中，从而快速解冻细胞。
- 当解冻几乎完成（约5分钟）时，将hMPCs转移到无菌层流罩，并将细胞悬浮液的内容转移到15 mL锥形管中的6 mL预加热GM中，速率为1 mL/min。
- 如步骤 3.2.7_3.2.9 所述准备细胞悬浮液。
- 将每粒颗粒重新悬浮在 3 mL 的 FACS 缓冲液中（500 mL PBS，12.5 mL 普通山羊血清，2 mL 0.5 M EDTA，pH 7.4，通过 0.22 μm 过滤器）。
- 在RT处将细胞悬浮液在300 x g下离心5分钟。
- 从hMPC吸出上清液，在250μL的FACS缓冲液中轻轻重新悬浮颗粒;放在冰上。
- 将100 μL的细胞放入1.7 mL微离心管中，放在冰上用作活/死控制（步骤4.5.1）。
注：用于活/死对照的100个细胞可能来自从每个供体中取少量（约20 ul）的重新悬浮细胞进行分拣或从银行细胞中分离。
注意：重要的是不要从单个捐赠者中取走超过20 ul的再悬浮细胞。如果 < 100 ul 的单元格可用，则使用 FACS 缓冲区将音量调至 100 ul。
- 为每个供体选择 1⁄2 个管，其中包含 +1 x 106通道 4 个 hMPC。
- 用于细胞表面标记的染色 hMPC。
- 准备以下抗体鸡尾酒（显示量为每种培养物，适当放大）：5[L CD56（神经细胞粘附分子[NCAM];PE-Cy7-结合）和5μL CD29（+1-整数;亚历克斯Fluor488-结合）。最终抗体稀释为1：50。
- 在每个hMPC悬浮液中加入10μL的抗体鸡尾酒，在黑暗中在冰上孵育30分钟。
- 在每个悬浮液/抗体鸡尾酒混合物中加入10 mL的FACS缓冲液。
- 在 RT 时，将每根管在 300 x g 下离心 5 分钟。
- 在 300 μL 的 FACS 缓冲液中重新悬浮颗粒，并转移到 5 mL 圆形底部聚苯乙烯管中。
- 将悬架放在冰上，防止光线照射。
- 准备补偿珠子。
注：应使用补偿珠制备每个抗体的正对照和阴性对照（未染色珠子）。补偿珠控制应在对样本进行排序之前在流动细胞仪上运行。这些控制允许确定每个抗体中的氟铬可以在对方的通道中检测到多少，以便进行补偿。- 漩涡补偿珠。
- 在三个 1.7 mL 微离心管中，添加一滴 （50 μL） 补偿珠子。
- 将每个抗体的1μL添加到适当的管中，或无添加到阴性对照中。
- 在黑暗中孵育15分钟。
- 在每个管和涡流中添加 1.5 mL 的 FACS 缓冲液。
- 在台式离心机中，将每根管在台式离心机中300 x g下离心5分钟。
- 在200 μL的FACS缓冲液中吸气上清和重新悬浮颗粒。
注：颗粒可能很难可视化;吸气时应小心。 - 将悬架放在 5 mL 圆形底部聚苯乙烯管中，然后将管放在冰上，防止光线照射。
- 准备活和死控制。
- 将步骤 4.2.8 中的 100 μL hMPC 分成两个 1.7 mL 微离心管（一个用于实时控制，一个用于死控）。
- 将死控管置于预热至 70°C 的加热块中，为期 10 分钟。在此期间，保持冰上的实时控制。
- 在台式离心机中，将每根管在台式离心机中300 x g下离心5分钟。
- 吸气上清液，在150 μL的FACS缓冲液中重新悬浮颗粒。
- 将带电/死式控制组合到单个 5 mL 圆形底部聚苯乙烯管中。
- 执行可行性染色。
- 向所有含有要排序的细胞和活/死对照的管中加入1 μL的7-氨基霉素D（7-AAD）。
- 将转基因添加到胶原蛋白涂层24孔（250μL/孔）和10厘米（8 mL/孔）板中，并允许在37°C的细胞培养箱中，在5%的CO2中平衡。
- 通过流式细胞测定对 hMPC 进行排序。
- 在压力为 20 psi 时，用 100 μm 喷嘴对流量细胞仪上的 hMPC 进行排序。根据侧和正向散射以及 7-AAD 负性确定实时 hMPCS（排序参数和代表性排序如图3所示）。
- PE-Cy7 （780/60 nm） 和 AlexFluor488 （530/30 nm） 的细胞阳性表示 CD56+/CD29+细胞，因此是 Pax7 阳性细胞 （hMPC）。将双阳性细胞分类到包含300 μLFACS缓冲液的收集管中。
注：排序培养物的纯度可以通过对Pax7的免疫染色来确定，然后通过下游流细胞测定分析确定（图4）。 - 丢弃所有其他单元格。
- 将分拣的细胞转移到15 mL锥形管中。
- 在 RT 下以 300 x g旋转 hMPC 悬架 5 分钟。
- 小心吸出上清液，并在1 mL的GM中重新悬浮。
- 使用血细胞计或自动细胞计数器对细胞进行计数。
注：虽然单元格数可以推断为正排序的事件数，但与传统单元格计数方法相比，此计数高估了单元格数 10-40%。 - 如步骤 3.2.11 中所述，为 hMPC 播种。
注：hMPC 种群纯度的验证可通过 Pax7 的免疫染色和流式细胞测定进行分析来确定。
5. 使用成像细胞仪描述人类肌肉祖细胞 （hMPC） 培养物
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使用成像细胞仪（材料表）执行汇合扫描。
- 选择"创建新扫描"，然后输入/选择"板类别、板型轮廓和板ID"。成像细胞仪可容纳 96、24 和 6 孔板。
- 在"应用"下，选择"汇合 > 汇合 1"。
- 使用屏幕右侧的导航器选择井以查看。
- 找到与背景相比，细胞显示为白色的对焦平面，并选择寄存器手册，或者允许成像细胞仪通过选择自动寄存器来选择对焦平面。
注：对于材料表建议的96个井板，近似位置为4.3个单位。 - 使用鼠标突出显示所有需要扫描的井。将自动扫描整个井区。选择"开始扫描"。
- 选择最适合板和像元类型的分析设置。
注：对于 hMPC，以下设置是最佳：强度 = 6，饱和强度 = 0，直径 = 8，最小厚度 = 3，最小簇大小 = 500，精度 =高。 - 选择"开始分析"。
注：目视检查图像，确保用户和成像细胞仪对细胞周长达成一致。如果存在较大差异，请使用不同的对焦平面或不同的分析设置重新扫描板。汇合扫描可用于比较培养物之间的生长、治疗时间、或监测细胞并决定何时启动分化。如果需要区分，则在第 6 节中提供详细信息。
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使用成像细胞仪对细胞进行计数。
- 准备含有12 mL的哈姆F12、6 μL的Hoechst 33342和24 μL的碘化钠的染色溶液。
- 吸气介质，用染色溶液代替，在37°C孵育15分钟。
- 吸气染色溶液，并替换为火腿的F12。
注：使用低苯酚红色介质获取清晰的图像非常重要。或者，可以使用 PBS。 - 将板加载到成像细胞仪上，并在应用下，选择细胞活力 > 实时 + 死亡 + 总计。实时通道将是一个明亮的场图像，死通道将是碘化物，总通道将是Hoechst 33342。
- 将实时通道设置为明亮字段，然后单击"对焦设置下自动注册"。
- 在"总计"通道下，将通道设置为蓝色。使用"查找焦点"使原子核进入焦点，或使用向上和向下箭头手动设置焦点。单击"设置偏移"以选择焦点。
- 在死通道下，将通道设置为红色。使用"查找焦点"使死单元格进入焦点或使用向上和向下箭头手动设置焦点。单击"设置偏移"以选择焦点。
- 选择"开始扫描"以开始扫描。
- 选择适合板和像元类型的分析参数。选择"开始分析"以开始分析。分析完成后，目视验证分析是否正确计数细胞（例如，对于总通道检查，每个细胞核是否被识别为原子核，并且成像细胞仪没有将背景中的任何点计算为核）。如果扫描和分析令人满意，将板返回到培养箱，否则重新扫描或修改分析参数。
6. 将人类肌肉祖细胞（hMPCs）与肌管区分
- 使用第 5.1 节中的协议确定 hMPC 汇合。为了将hMPC分化为造影管，根据成像细胞仪上的汇合功能确定，细胞的汇合率为80-85%是理想的（见第5节）。如果使用来自多个独特捐赠者的hMPC，汇合扫描允许来自不同捐赠者的细胞在汇合时开始分化。
注：在80%的汇合，有大约66，000细胞/厘米2。 - 用分化介质洗涤细胞2倍（97%Ham的F12，2%的马血清，1%的青霉素/链霉素，pH 7.4，通过0.22 μm过滤器）。
- 在每天切换介质时，只要实验规定，在分化介质中保持细胞。
- 通过免疫染色直接评估胚胎肌苷重链的肌管形成，通常在7~10天的分化后检测出。
注：形成月管所需的时间可能略有不同，取决于发起分化时的供体和细胞数量;因此，建议单独监测每个捐助者的培养物。
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Representative Results
在图1中可以看到hMPC从人体肌肉组织分离的代表性流细胞学结果。hMC 可以通过首先基于侧散射和正向散射的门控事件来识别，以消除死细胞或碎屑，然后仅选择对 7-AAD 呈负的细胞，因此是可行的。对于细胞表面标记 CD56 和 CD29 选择正的细胞表示 hMPC 总体。60毫克的活检仅提供约75-250 hMPC。
图2A显示了一个代表性的汇流扫描。图 2B中的绿色轮廓由成像细胞仪生成，并显示了成像细胞仪如何根据所选的分析设置确定汇合。在所示的两个图像中，由成像细胞仪确定的汇合与用户视觉确定的汇流一致。然而，这些图像也突出表明成像细胞仪并不完美。例如，红色箭头突出显示被计为单元格的板中的瑕疵。如果板上存在大量这些缺陷，则产生的汇合不会准确地表示细胞的汇合。图 2C显示了用于计算单元格（亮场、蓝色和红色）和合并图像的所有三个通道的表示形式。图2D显示了捐赠者之间的异质性。发现并准确描述这种异质性是成像细胞仪的关键应用。图2E显示，来自独特捐赠者的汇合量测量和核计数高度相关。
图 3提供了如何根据该协议中描述的 FACS 过程识别 hMP 的指南。基于正向和侧散射的浇注允许从碎屑分离活细胞（图3A）。使用向前散点按高度与向前散射（按区域）进行比较，用于区分表示单个单元格的事件（图 3B中的盒装区域）。活细胞的特点是缺乏结合的可行性染色7-AAD（图3C）。最后，CD56和CD29的细胞阳性被识别为hMPC（图3D）。为了验证该协议中描述的FACS程序，Pax7阳性细胞的选择可以通过使用Pax7特异性抗体的免疫染色细胞和在流细胞仪上测量表达来确定。图4比较了Pax7免疫染色（图4A）确定的hMC数量与该协议中从相同细胞群中详述的FACS程序（图4B）的数量。图5使用Pax7免疫染色和通过流式细胞测定分析，显示FACS后整个总体中Pax7表达细胞的富集性（图5A与图5B相比），以及Pax7数量的维持传递后表达细胞（图5B与图5C相比为5B）。
hMPC 可以通过遵循第 6 节进行区分以形成表管。确定分离的hMPC是否保持肌原能力细胞可以用胚胎肌苷重链特有的抗体进行免疫染色，并使用荧光显微镜进行可视化。胚胎肌苷重链正肌管的代表性图像可以在图6中查看。
图 1：代表流量细胞学图像的hMPCs直接从肌肉活检组织排序。（A） 侧散射区域（y 轴）与正向散射区域（x 轴）浇注策略，用于识别供体样本中的所有细胞。（B） 7-AAD 活力染色（y 轴）与正向散射（x 轴）以识别活细胞。（C） 负选择排序标记配置文件 （-CD11b， -CD31， -CD45， -GlyA [y 轴]] 与选择标记 CD34。（D） 负选择标记 CD34 （y 轴） 与正选择标记 CD29。（E）正选择标记 CD56（y 轴）与正选择标记 CD29（x 轴）。（F）三种不同的骨骼肌活检的产量。FSC = 正向散射;SSC = 侧散射;hMPCs，人类肌肉祖细胞。
图 2：从人类捐赠者获得的hMPC的增殖潜力在6个通道后得以维持。（A）代表性汇合扫描。（B） 代表汇流扫描与绿色轮廓显示成像细胞仪如何确定汇合。红色箭头显示板上的瑕疵。（C） 代表光明场、Hoechst 33342（蓝色）和碘化（红色）染色和这三个通道的合并图像。比例条 = 1mm. （D） 来自 6 个独特捐赠者的核计数突出了 hMPC 异质性。（E） 汇合和核计数高度相关.请点击此处查看此图的较大版本。
图 3：用于 hMPC 隔离的代表性流量细胞分拣参数。（A） 侧散射区域（y 轴）与正向散射区域（x 轴）浇注策略，用于识别供体样本中的所有细胞。（B） 正向散射高度（y 轴）与正向散射区域（x 轴）取消排序总体中的双精度值。（C） 向前散射高度（y 轴）与 7-AAD 合并，以识别可行的细胞。（D） PE-Cy7 （CD56） 与 AF488 （CD29） 染色，Q2 代表双阳性细胞 （hMPC）。颜色表示事件的密度。
图 4：CD29/CD56正率与来自同一捐赠者的4个hMPC通道中的Pax7正率的比较。（A） 计数 （y 轴） 与 Pax7 表达式 （x 轴）。（B）正选择标记 CD56（y 轴）与正选择标记 CD29（x 轴）。NCAM = 神经细胞粘附分子;hMPC = 人类肌肉祖细胞。
图 5：Pax7的积极性在从同一捐赠者在多个通道上派生的hMPCs中保持。（A） 在 FACS 排序之前经过 4 次的单元格的 Pax7 表达式 （x 轴）。（B） 在 FACS 对 CD29 和 CD56 正度排序后 hMPCs 1 通道的 Pax7 表达式（x 轴）（共 5 个段落）。（C） 在 FACS 对 CD29 和 CD56 正性排序后 hMPCs 2 通道的 Pax7 表达式（x 轴）（共 6 个段落）。
图 6：染色hMPC衍生肌管为胚胎肌苷重链。差异化 hMC 与 DNA 染色（Hoechst 33342，蓝色）和胚胎肌苷重链（绿色）（n = 3）共同染色的代表性显微图像。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
初级hMPCs是一种重要的研究模型，用于了解骨骼肌生物学和再生过程。此外，hMPC有潜力用于治疗。然而，在研究和治疗中使用原发性hMPCs存在公认的挑战，包括对来自人类的细胞的了解有限10。捐助文化之间的扩展能力也有很大差异，这限制了使用hMPC的可能性，并可能影响研究结果11。例如，最近已经证明，使用该协议中描述的方法分离的hMPCs产生的细胞在扩展能力上各不相同，这是由与性别或11岁不一致的转录配置文件驱动的。
在这里，我们提出了一种高效、高产量的方法，用于为包括微管分化在内的多种下游应用进行足够数量的分离hMPC，从而在体外对造血过程进行建模。我们的方法依靠FACS分离CD56+/CD29+细胞，这些细胞以前被鉴定为代表一个丰富的Pax7表达群体12。其他同样有效的单元排序策略也描述了5，6。
我们的 hMPC 隔离和文化方法最重要的方面是仔细监控各个区域性。基于捐赠者的异质性包括从每次活检中获得的hMPC数量、在体外开始增殖的时间及其种群扩张率。因此，如果治疗后在异体形成上的差异是个人感兴趣的问题，hMPC 培养物应根据确定先验和使用成像细胞仪客观地评估的汇合水平切换到治疗。
我们的分离和培养hMC的方法已经过优化，从相对较少的活检组织（50-100毫克）获得数百万细胞的细胞产量，用于体外实验。这种方法的主要好处是，可以在同一捐赠者的hMPCs上进行多重测定和实验，允许在实验中维持供体表型，同时引入很少的实验间变异性。我们的方法不同于最近发表的方法，专注于提取Pax7最纯净的种群，直接从活检组织中表达细胞，重点是异种移植8。然而，这些以前方法的挑战是，它们需要大于一克的起始组织重量。因此，它们对于涉及人类骨骼肌活检的研究并不实用。我们方法的一个局限性是，异种移植的可能性尚未得到评估。但是，这种类型的过程不是最初预期的下游应用程序之一。该方法的未来方向可能包括评估hMPC的移植能力，在接受我们的隔离程序后，以确定是否有可能使用这个程序在MPC移植研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢康奈尔大学生物技术资源中心成像设施对荧光活化细胞分类的帮助。我们还感谢莫莉·盖勒在参与者招募方面的帮助，并感谢埃里卡·本德进行骨骼肌活检。最后，我们感谢与会者的时间和参与。这项工作得到了国家卫生研究院国家老龄研究所的支持，奖励编号为R01AG058630（至B.D.C.和A.E.T.），由格伦医学研究基金会和美国青少年学院老龄研究基金（至B）支持。.华盛顿特区），由康奈尔妇女总统委员会（到A.E.T.）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels |
| 10 cm cell culture plate | VWR | 664160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352196 | 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols |
| 24 well cell culture plate | Grenier Bio-One | 662 160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Viability stain for identifying living cells during FACS sorting |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Conjugated antibody for FACS |
| Black 96-well cell culture plate | Grenier Bio-One | 655079 | 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S |
| Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Imaging cytometer used to track hMPC cultures | |
| Cell Strainer | VWR | 352350 | Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing |
| Collagen Type I (Rat Tail) | Corning | 354236 | Collagen for coating cell culture plates |
| Collagenase D | Roche | 11 088 882 001 | Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | WN182 | Used for cryopreservation of hMPCs |
| Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder | Gibco | 31600-034 | Low glucose DMEM for muscle biopsy processing |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 21600-010 | PBS for muscle biopsy processing |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | J.T. Baker | 4040-01 | Required for FACS buffer |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 89510-186 | Fetal bovine serum used for hMPC growth media |
| Ham's F12 | Gibco | 21700-026 | Base media for hMPCs |
| Heat Inactivated Equine Serum | Gibco | 26-050-070 | Horse serum used to make hMPC differentiation media |
| Hemocytometer | iNCyto | DHC-N0105 | Used to count cells |
| Hibernate A | Gibco | A1247501 | Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Life Technologies | H21492 | DNA stain for identifying all cells using the Celigo S |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Used for controlled rate freezing of hMPCs |
| Moxi buffer | Orflo | MXA006 | Buffer for automated cell counter |
| Moxi Cassettes | Orflo | MXC002 | Cassesttes for automated cell counter |
| Moxi z Mini Automated Cell Counter | Orflo | Automated cell counter | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Commerically available controlled rate cell freezing container |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Goat serum used in FACS buffer |
| PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Conjugated antibody for FACS |
| Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Corning | 30-002-CI | Antibiotics added to culture media |
| Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S |
| Recombinant Human basic fibroblast growth factor | Promega | G5071 | Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Gibco | 12648-010 | Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | Added to Ham's F12 |
| Sterile Round Bottom 5 mL tubes | VWR | 60818-565 | Tubes used for FACS |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Compensation beads fort calibrating flow FACS settings |
References
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