Aislamiento, cultivo, caracterización y diferenciación de células progenitoras musculares humanas del procedimiento de biopsia muscular esquelética

Summary

Presentamos técnicas para aislar, cultivar, caracterizar y diferenciar las células progenitoras musculares primarias humanas (hMPC) obtenidas del tejido de biopsia muscular esquelética. los hMPC obtenidos y caracterizados a través de estos métodos se pueden utilizar para abordar posteriormente cuestiones de investigación relacionadas con la miogénesis humana y la regeneración muscular esquelética.

Abstract

El uso de tejido humano primario y células es ideal para la investigación de procesos biológicos y fisiológicos como el proceso regenerativo del músculo esquelético. Existen desafíos reconocidos para trabajar con células madre adultas primarias humanas, particularmente células progenitoras musculares humanas (hMPC) derivadas de biopsias del músculo esquelético, incluyendo bajo rendimiento celular del tejido recogido y un gran grado de heterogeneidad de los donantes de parámetros de crecimiento y muerte entre las culturas. Si bien la incorporación de la heterogeneidad en el diseño experimental requiere un tamaño de muestra mayor para detectar efectos significativos, también nos permite identificar mecanismos que subyacen a la variabilidad en la capacidad de expansión de hMPC, y por lo tanto nos permite entender mejor heterogeneidad en la regeneración muscular esquelética. Nuevos mecanismos que distinguen la capacidad de expansión de los cultivos tienen el potencial de conducir al desarrollo de terapias para mejorar la regeneración muscular esquelética.

Introduction

El músculo esquelético es el sistema de órganos más grande del cuerpo humano, representando entre el 30 y el 40 % de la masa corporal entera¹. Además de su papel bien reconocido en la locomoción, el músculo esquelético mantiene la temperatura corporal y la postura, y juega un papel central en la homeostasis de nutrientes de todo el cuerpo. La investigación en la que participan participantes humanos, animales y modelos de cultivo celular son valiosos para abordar cuestiones relacionadas con la biología y la regeneración del músculo esquelético. El aislamiento y el cultivo de células progenitoras musculares primarias humanas (hMPC) proporcionan un modelo robusto que permite aplicar técnicas de cultivo celular y manipulaciones a muestras humanas. Una ventaja de usar hMPCs es que conservan el fenotipo genético y metabólico de cada donante^2,3. El mantenimiento del fenotipo del donante permite a los investigadores examinar la variación interindividual en el proceso miogénico. Por ejemplo, hemos empleado nuestro método de caracterización hMPC para identificar diferencias relacionadas con la edad y el sexo en la capacidad de expansión de la población de hMPC⁴.

El propósito de este protocolo es detallar técnicas para aislar, cultivar, caracterizar y diferenciar los hMPC del tejido de biopsia muscular esquelética. Basándose en trabajos anteriores que describieron hMPCs e identificaron posibles fabricantes de superficies celulares para el aislamiento hMPC^5,6, este protocolo llena una brecha crítica en el conocimiento al vincular el aislamiento con la caracterización de los hMPC. Además, las instrucciones detalladas paso a paso incluidas en este protocolo hacen que el aislamiento y la caracterización de hMPC sean accesibles para un amplio público científico, incluidas aquellas con experiencia previa limitada con hMPCs. Nuestro protocolo es uno de los primeros en describir el uso de un citómetro de imágenes para rastrear las poblaciones celulares. Los citómetros de imágenes de nuevo diseño son de última generación, de alto rendimiento y basados en microplacas, lo que permite imágenes de células vivas, recuento celular y análisis de fluorescencia multicanal de todas las células en cada pozo de un recipiente de cultivo en cuestión de minutos. Este sistema permite una rápida cuantificación de los cambios dinámicos en la proliferación y viabilidad de toda una población celular con una interrupción mínima de la cultura. Por ejemplo, somos capaces de realizar medidas objetivas de confluencia en días sucesivos in vitro para determinar la cinética de crecimiento de cada cultivo derivada de diferentes donantes. Muchos protocolos en la literatura, particularmente los que implican la diferenciación de los MMP, requieren que las células alcancen un nivel definido de confluencia antes de iniciar la diferenciación o el tratamiento⁷. Nuestro método permite la determinación objetiva de la confluencia de cada pozo en un recipiente de cultivo permitiendo a los investigadores iniciar el tratamiento de una manera imparcial y no subjetiva.

En el pasado, una limitación importante del uso de hMPC primarios era rendimientos bajos que limitan el número de celdas disponibles para los experimentos. Nosotros y otros hemos demostrado que el rendimiento de los MMP del tejido de biopsia de músculo esquelético es de 1 a 15 MMP por miligramo de tejido (Figura1)⁸. Debido a que nuestro protocolo permite cuatro pasajes de las células antes de la purificación con clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), nuestros rendimientos crioconservados de hMPC, derivados de pequeñas cantidades de tejido de biopsia (50-100 mg), son suficientes para abordar los objetivos de investigación donde los objetivos de investigación donde se requieren múltiples experimentos. Nuestro protocolo FACS produce una población MPC pura (Pax7 positiva) del 80 %, por lo que nuestro protocolo está optimizado tanto para el rendimiento como para la pureza.

Protocol

Este protocolo fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Cornell. Todos los participantes fueron examinados para detectar las condiciones de salud subyacentes y se les dio su consentimiento informado.

1. Obtención de tejido muscular humano a través de la biopsia muscular esquelética

1. Identificar el músculo vastus lateralis a través de la palpación, puntos de referencia anatómicas, y la contracción activa del músculo.
2. Palpate el vastus lateralis haciendo que el participante apriete su músculo del cuádriceps y encuentre el vientre del músculo, alrededor de 1/3 del camino de la rótula a la cadera, y sólo ventrolateral al fémur.
3. Utilice una cinta de medición de papel para marcar un área con un marcador quirúrgico a unas 4 x 6 pulgadas de la parte superior de la rótula que representa el vientre del músculo.
4. Afeitar cualquier cabello cerca de la zona marcada y luego limpiar con un antiséptico de grado quirúrgico que se utiliza antes de los procedimientos médicos (por ejemplo: 2% gluconato de clorhexidina (CHG)/ 70% alcohol isopropílico (IPA)) .
5. Anestetiza el sitio de la biopsia con 1% de lidocaína.
   NOTA: Evite inyectar la lidocaína en el músculo esquelético.
6. Haga una vía de incisión de 4 x 5 mm en el sitio marcado.
7. Después de anestesiar el área, empuje una aguja Bergstrom con trocar a través de la fascia en el vientre del músculo (aproximadamente 2 x 3 cm).
8. Extraiga el tejido muscular en la aguja Bergstrom retirando el trocar de corte de 2 x 3 cm mientras un asistente aplica succión retirando un émbolo de jeringa de 60 ml adjunto.
9. Cierre la cámara de corte.
10. Gire la base de la aguja de la biopsia un cuarto de vuelta y repita la secuencia de apertura de la aguja, aplicación de succión y cierre de la aguja.
    NOTA: Cada vez que se cierra la aguja, se debe obtener un corte de tejido muscular dentro de la aguja Bergstrom. Durante la recolección de la muestra, la aguja permanecerá en el muslo en la misma posición vertical mientras se gira longitudinalmente a través de 360o para obtener cada muestra. Esta secuencia se puede repetir 3 a 4 veces.
11. Expulse el tejido de biopsia recogido de la aguja a un vendaje estéril no adherente.
12. Examine el tejido y retire los tejidos adiposos y fibroticos visibles utilizando cuchillas o pinzas estériles para bisturí.
13. Coloque una porción (50-100 mg) detejido en un tubo estéril que contenga un medio nutritivo independiente del CO2 (p. ej., Hibernar A).
    NOTA: El peso del tejido se determina de la siguiente manera. Primero coloque el tubo tapado que contiene el medio nutritivo en una escala y una atadura. A continuación, coloque el tejido en el tubo, recapitule el tubo y luego pese el tubo que contiene el tejido en el medio nutritivo.
14. Almacene el tubo que contiene el tejido y el medio nutritivo a 4 oC hasta su procesamiento.
    NOTA: El tejido de biopsia debe procesarse dentro de las 48 horas de recolección.

2. Aislar las células de progenitores musculares humanos del tejido de la biopsia

1. Tejido de biopsia de picado.
   1. Transfiera el tejido muscular del medio nutritivo a una placa estéril de Petri en un gabinete de seguridad biológica o un lugar de trabajo estéril similar.
   2. Utilice cuchillas de bisturí estériles para picar el tejido en trozos de 1 mm^{y 3} mm.
2. Lave el tejido de biopsia picado para eliminar los desechos residuales.
   1. Transfiera el tejido muscular a un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de solución salina con fosfato (PBS) y permita que el tejido se asienten a través de la gravedad.
   2. Aspirar al sobrenadante teniendo cuidado de no molestar el tejido muscular.
   3. Añadir 10 ml de PBS al tejido lavado y permitir que el tejido muscular se reasienten a través de la gravedad.
   4. Aspirar al sobrenadante teniendo cuidado de no molestar el tejido muscular.
   5. Añadir 10 mL de bajo nivel de glucosa Medio águila modificado (DMEM) y permitir que el tejido se reasienten a través de la gravedad.
   6. Aspirar al sobrenadante teniendo cuidado de no molestar el tejido muscular.
3. Incubar el tejido en medios de digestión.
   1. Resuspender el tejido muscular en 3 ml de medios de digestión (2 mg/ml de colagenasa D en DMEM de baja glucosa).
      NOTA: Las soluciones de stock de colagenasa D se pueden preparar a 20 mg/ml en DMEM de baja glucosa y almacenarse a -80 oC, luego diluirse 1:10 en DMEM de baja glucosa en el momento de su uso.
   2. Incubar el tubo que contiene el tejido muscular en un baño de agua a 37 oC durante 30 min.
   3. Triturar la suspensión del tejido muscular cada 10 minutos utilizando una pipeta serológica de 10 ml o una pipeta de diámetro ancho.
   4. Añadir 83 ml de medios de digestión adicionales y 24 ml de solución de dispensación (0,76 mM de acetato de calcio, 1,39 mM de acetato de sodio, 13,91 mg/ml de dosis II en DMEM bajo en glucosa). Vuelva a colocar la suspensión en el baño de agua de 37oC.
   5. Triturar la suspensión del tejido muscular cada 5 x 10 minutos con una punta de pipeta de diámetro ancho.
   6. Continuar la trituración hasta lograr una suspensión uniforme, y durante no más de 1,5 h para prevenir la digestión excesiva.
      NOTA: La suficiente picadura del tejido y la actividad enzimática de la colagenasa y la dispensación pueden afectar la digestión de la muestra. Una suspensión uniforme debe ser capaz de pasar a través de una punta de pipeta normal con una oclusión mínima después de 1,5 h. Si no se logra una suspensión uniforme después de 1,5 h, compruebe que la picadura del tejido es suficiente y el tejido se pica al tamaño adecuado (paso 2.1.2). Además, la actividad de las enzimas debe probarse como variación de lote a lote en la actividad enzimática se produce.
4. Células de pellet y congelación en medios de recuperación.
   1. Añadir 6 ml de medios de crecimiento (GM; 79% F12 de Ham, 20% de suero bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina, factor de crecimiento de fibroblastobásico básico de 5 ng/ml [bFGF], pH 7,4, pasado a través de un filtro de 0,22 m) a la suspensión muscular.
   2. Pipetear la suspensión a través de un colador de células de 70 m en un tubo cónico de 50 ml. Enjuague el colador con 4 ml adicionales de GM.
      NOTA: La muestra se puede transferir de nuevo a un tubo cónico de 15 ml para facilitar la visualización del pellet. Se puede utilizar un volumen de lavado mayor si los rendimientos celulares subsiguientes son bajos.
   3. Centrífuga a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
   4. Aspirar al sobrenadante asegurándose de no interrumpir el pellet. Deslice el tubo para resuspender el pellet en el medio restante. Si las celdas no se van a cultivar inmediatamente proceda al paso 2.4.5 para obtener instrucciones sobre el almacenamiento a largo plazo, de lo contrario proceda al paso 3.1.6.
      NOTA: Si se desea un cultivo inmediato, se debe preincubar GM en placas de cultivo celular (pasos 3.1.1 y 3.1.2) antes de que comience el procesamiento de la biopsia.
   5. Añadir 1,5 ml de medios de congelación de cultivo de células de recuperación (Tablade materiales)al pellet recuperado.
   6. Transfiera la suspensión en un criovial. Colocar el criovial en un enfriador de velocidad controlado por isopropanol durante la noche a -80 oC. Almacenar criovial a -80oC hasta que esté listo para el cultivo.
      NOTA: Los crioviales que contienen lodos se pueden mantener en nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo (superior a 1 mes). El uso de un enfriador de velocidad controlado por isopropanol permite que las células se congelen reproduciblemente a una velocidad de 1oC/min, lo que resulta en tasas óptimas de recuperación celular como lo demuestra la viabilidad después de la congelación y una mayor probabilidad de apego a los vasos de cultivo celular 9. Alternativamente, se puede utilizar un vaso de precipitados que contenga isopropanol RT, colocado en un congelador de -80 oC.

3. Culturing Human Muscle Progenitor Cells

1. Descongelar la suspensión muscular.
   1. Antes de descongelar y sembrar hMPCs, pre-equilibrar las placas de cultivo celular en GM. Añadir 250 ol de GM a 4 pocillos de una placa de cultivo celular recubierta de colágeno (colágeno I), placa de cultivo celular de 24 pocillos. Llenar los pozos restantes con 500 ml de medios base estériles (es decir, F12) para evitar la evaporación durante el cultivo a largo plazo.
      NOTA: Para biopsias entre 50 g y 100 g, cuatro pocillos de una placa de 24 pocillos son apropiados. Si el tejido de la biopsia es inferior a 50 g, dos pozos pueden ser más apropiados. Los desechos residuales y el número de celda bajo impiden el uso de una técnica de recuento celular en este paso; por lo tanto, la densidad de sembración exacta no se determina y varía ligeramente de la biopsia a la biopsia.
   2. Incubar recipientes de cultivo celular con GM a 37oC en 5% CO2 durante 1 h antes de la sembrada.
   3. Retirar los crioviales del congelador de -80 oC y colocarlos en un baño de agua de 37 oC; el líquido en el tubo debe estar completamente sumergido en agua.
   4. Cuando la descongelación esté casi completa (5 min), transfiera el criovial a una campana de flujo laminar estéril. Transfiera el lodo muscular fuera del tubo criovial y agregue a un tubo cónico de 15 ml que contenga 6 ml de GM precalentado a una velocidad de 1 ml/min.
   5. Centrifugar la suspensión muscular a 300 x g durante 5 min a RT.
      NOTA: Una centrífuga de cubo oscilante puede facilitar la visualización de pequeños pellets en este paso, pero no es esencial.
   6. Aspirar al sobrenadante asegurándose de no interrumpir el pellet. Deslice el tubo para resuspender el pellet en el medio restante y resuspender en 1 ml de GM.
   7. Transferir 250 l del pellet resuspendido (ahora considerado una suspensión hMPC) a cada uno de los 4 pocillos de la placa de cultivo celular preincubado de 24 pocillos.
2. Cultura y pasaje hMPCs.
   1. Mantener los cultivos de hMPC en GM a 37oC en 5% CO₂.
      NOTA: Las existencias de GM sin el bFGF (es decir, F12, antibióticos, FBS) se preparan en lotes y se mantienen a 4 oC durante un máximo de 2 semanas. bFGF se añade a GM el día de uso. Los medios que contengan bFGF se pueden almacenar durante 48 h a 4 oC.
   2. Veinticuatro horas después del aislamiento, aspirar el GM, lavar suavemente el recipiente de cultivo 2veces con GM precalentado, y añadir GM fresco.
      NOTA: 24 h debe proporcionar a los hMPCs el tiempo suficiente para conectar; no se deben retirar los hMPC sdespués del lavado. Este paso también eliminará los restos restantes que se generaron durante la cosecha celular, haciendo que el recipiente sea más susceptible a un escaneo de confluencia preciso utilizando un citómetro de imágenes (sección 5 a continuación). Después de este cambio de medio inicial, GM se cambia cada 48 h.
   3. Pasaje hMPCs cuando 70% se logra confluencia o cuando han permanecido en el mismo plato de cultivo durante 10 días, lo que ocurra primero.
      NOTA: El 70% de confluencia es de aproximadamente 55.000 celdas/cm².
   4. Para el paso, agregue 250 s de trippsina precalentada a cada pocto de una placa de cultivo celular de 24 pocillos e incubar durante 5 min.
   5. Toque el recipiente de cultivo celular en una superficie firme para separar los hMPC. Se puede utilizar un microscopio de luz para verificar que los hMPCs se han separado.
   6. Transfiera las suspensiones de trippsin/hMPC a 5 ml de GM en un tubo cónico de 15 ml.
   7. Centrifugar la suspensión hMPC a 300 x g durante 5 min a RT.
   8. Retire las suspensiones hMPC de la centrífuga y colóquelas sobre hielo en la campana de flujo laminar estéril.
      NOTA: Mantener los hMPC en el hielo durante el paso da como resultado menos agregación celular.
   9. Aspirar sobrenadante de hMPCs y resuspender suavemente el pellet en 1 ml de GM.
   10. Cuente las células usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
       NOTA: Una dilución de 1:5 de la suspensión celular al tampón de recuento celular es generalmente apropiada.
   11. HMPCs de semillas en platos de cultivo recubiertos de colágeno que contienen GM precalentado a una densidad de 3.500 células por cm^2. Una combinación de placas de 10 cm y placas de 24 pocillos es ideal. Las placas de 24 pocillos se pueden escanear diariamente en un catómetro de imágenes para monitorear el crecimiento.
   12. Siga el mismo procedimiento (comenzando en el paso 3.2.4.) para los pasajes posteriores.
       NOTA: La salud y pureza celular se pueden controlar a través de los pasajes utilizando un marcador de senescencia celular (por ejemplo, galactosidasa) e inmunomanchado para Pax7.
3. Cryopreserve los hMPCs.
   1. Cryopreserve el exceso de células para su uso posterior para hacer que el volumen de cultivo sea más manejable.
   2. Para la criopreservación, siga el procedimiento de tripinización descrito en los pasos 3.2.4.-3.2.9.
   3. Mientras se centrifuga la suspensión celular, prepare una mezcla de 20% (p. ej., 200 ol) de dimetilsulfóxido (DMSO) y 80% (por ejemplo, 800 ol) GM. Pipeta hacia arriba y hacia abajo 20veces para asegurar una mezcla adecuada. Deje reposar la mezcla sobre hielo.
   4. Según el recuento de células, diluir la suspensión hMPC a 2 x 10⁶/mL en GM.
   5. Combine la suspensión hMPC y la mezcla 20% estéril DMSO/80% GM 50/50. El medio de criopreservación final es una combinación de DMSO (10%) y GM (90%) que contiene 1 x 10⁶ hMPCs/mL.
   6. Coloque 1 ml de la suspensión hMPC preparada en el paso 3.3.5 en tantos crioviales como permita el recuento inicial de células. A continuación, coloque los hMPC amicotizados en un enfriador de velocidad controlado por isopropanol en un congelador de -80 oC durante la noche.
      NOTA: En este paso, típicamente se obtienen entre 5 y 15 millones de células, 30-60% de las cuales son identificadas como hMPCs por FACS.

4. Aislar Pax7⁺ Células progenitoras musculares humanas a través de la citometría de flujo

1. Para preparar los hMPCs a partir de cultivos vivos (paso 3.2.11), intente estrippsinizar suficientes recipientes de cultivo para 1 x 10⁶x 2 x 10⁶ células totales. Prepare las suspensiones de celdas como se describe en los pasos 3.2.4 a 3.2.9.
2. Preparar hMPCs de culturas crioconservadas (paso 2.4.6 o 3.3.6).
   1. Seleccione 1 x 2 tubos que contengan 1 x 10⁶ pasaje cuatro hPCC para cada donante.
      NOTA: El uso de cuatro hPCC permite un rendimiento celular adecuado sin dejar de mantener el potencial proliferativo hasta el paso seis (Figura2).
   2. Descongelar rápidamente las células extirpándolas del congelador de -80 oC y colocándolas en un baño de agua de 37oC con el líquido en el tubo completamente sumergido.
   3. Cuando la descongelación esté casi completa (5 min), transfiera los hMPCs a una campana de flujo laminar estéril y transfiera el contenido de la suspensión celular a 6 ml de GM precalentado en un tubo cónico de 15 ml a una velocidad de 1 ml/min.
   4. Prepare las suspensiones de celdas como se describe en los pasos 3.2.7 a 3.2.9.
   5. Resuspenda cada pellet en 3 ml de tampón FACS (500 ml de PBS, 12,5 ml de suero normal de cabra, 2 ml de 0,5 M EDTA, pH 7,4, pasado a través de un filtro de 0,22 m).
   6. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min a RT.
   7. Aspirar sobrenadante de hMPCs y resuspender suavemente el pellet en 250 ml de tampón FACS; colocar en el hielo.
   8. Colocar 100 ml de células en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml y dejar en hielo para ser utilizado como controles vivos/muertos (paso 4.5.1).
      NOTA: Los 100 ul de celdas que se utilizarán para controles vivos/muertos pueden provenir de tomar un pequeño volumen (20 ul) de celdas resuspendidas de cada donante para ser ordenadas o de celdas bancarias.
      NOTA: Es importante no tomar más de 20 ul de células resuspendidas de un solo donante. Traiga el volumen hasta 100 ul con el buffer FACS si < 100 ul de las células está disponible.
3. Manchas hMPCs para marcadores de superficie celular.
   1. Preparar el siguiente cóctel de anticuerpos (las cantidades mostradas son para cada cultivo, escalado adecuado): 5 l CD56 (molécula de adhesión celular neural [NCAM]; PE-Cy7-conjugado) y 5 l CD29 (1-integrina; AlexFluor488-conjugado). La dilución final del anticuerpo es 1:50.
   2. Añadir 10 l del cóctel de anticuerpos a cada suspensión de hMPC e incubar sobre hielo durante 30 minutos en la oscuridad.
   3. Añadir 10 ml de tampón FACS a cada mezcla de cóctel de suspensión/anticuerpo.
   4. Centrifugar cada tubo a 300 x g durante 5 min a RT.
   5. Resuspenda el pellet en 300 ml de tampón FACS y transfiera a un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml.
   6. Mantenga la suspensión sobre hielo y protegida de la luz.
4. Preparen las cuentas de compensación.
   NOTA: Los controles positivos para cada anticuerpo y un control negativo (cuentas no manchadas) deben prepararse utilizando perlas de compensación. Los controles de cordón de compensación deben ejecutarse en el citometro de flujo antes de que se ordenen las muestras. Estos controles permiten determinar cuánto se puede detectar el fluorocromo de cada anticuerpo en el canal del otro para que se pueda aplicar la compensación.
   1. Cuentas de compensación de vórtice.
   2. En tres tubos de microcentrífuga de 1,7 ml, añada una gota (50 l) de perlas de compensación.
   3. Añadir 1 l de cada anticuerpo al tubo apropiado, o ninguno al control negativo.
   4. Incubar en la oscuridad durante 15 min.
   5. Agregue 1,5 ml de búfer FACS a cada tubo y vórtice.
   6. Centrifugar cada tubo a 300 x g en una centrífuga de sobremesa durante 5 min a RT.
   7. Aspirar sobrenadant y resuspender el pellet en 200 l de amortiguador FACS.
      NOTA: El pellet puede ser muy difícil de visualizar; se debe tener cuidado al aspirar el sobrenadante.
   8. Coloque la suspensión en un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml y luego mantenga el tubo sobre hielo y protegido de la luz.
5. Prepara controles vivos y muertos.
   1. Divida los 100 ml de hMPCs del paso 4.2.8 en dos tubos de microcentrífuga de 1,7 ml (uno para el control en vivo y otro para el control muerto).
   2. Coloque el tubo de control muerto en un bloque de calentamiento precalentado a 70 oC durante >10 min. Durante este tiempo, mantenga el control en vivo sobre hielo.
   3. Centrifugar cada tubo a 300 x g en una centrífuga de sobremesa durante 5 min a RT.
   4. Aspirar sobrenadant y resuspender el pellet en 150 l de tampón FACS.
   5. Combine los controles vivos/muertos en un solo tubo de poliestireno inferior redondo de 5 ml.
6. Realizar la mancha de viabilidad.
   1. Añadir 1 l de 7-aminoactinomicina D (7-AAD) a todos los tubos que contienen células a clasificar y el control vivo/muerto.
   2. Añadir GM a placas recubiertas de colágeno de 24 pocillos (250 ol/pozo) y 10 cm (8 ml/pozo) y permitirel equilibrio en una incubadora de cultivo celular a 37 oC en 5% de CO 2.
7. Ordene los hMPC a través de la citometría de flujo.
   1. Ordene los hMPCs en un catómetro de flujo con boquilla de 100 m a una presión de 20 psi. Determine el hMPCS vivo basado en la dispersión lateral y hacia adelante, así como la negatividad 7-AAD (los parámetros de clasificación y una ordenación representativa se pueden ver en la Figura3).
   2. Las células positivas para LAS células PE-Cy7 (780/60 nm) y AlexFluor488 (530/30 nm) representan CD56⁺/CD29⁺ células y, por lo tanto, son células positivas Pax7 (hMPC). Ordene las células positivas dobles en tubos de recolección que contengan un cojín de 300 ml de tampón FACS.
      NOTA: La pureza de los cultivos ordenados se puede determinar mediante inmunomanchación para Pax7 seguida de análisis de citometría de flujo aguas abajo (Figura4).
   3. Deseche todas las demás celdas.
   4. Transfiera las células ordenadas a un tubo cónico de 15 ml.
   5. Gire la suspensión hMPC a 300 x g durante 5 min en RT.
   6. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender en 1 mL de GM.
   7. Cuente las células usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
      NOTA: Mientras que el número de celdas se puede inferir como el número de eventos que se ordenan positivamente, este recuento se ha encontrado para sobreestimar el número de celdas en un 10-40% en comparación con los métodos de recuento de celdas tradicionales.
   8. Selen los hMPCs como se describe en el paso 3.2.11.
      NOTA: La verificación de la pureza de la población de hMPC puede determinarse mediante inmunomancha para Pax7 y análisis mediante citometría de flujo.

5. Caracterización de cultivos de células progenitoras musculares humanas (hMPC) utilizando un citómetro de imágenes

1. Utilice el catómetro de imágenes (Tabla de materiales) para realizar exploraciones de confluencia.
   1. Seleccione Crear nuevo escaneo y, a continuación, introduzca/seleccione la categoría de placa,el perfil de placa y el ID de placa. El citómetro de imagen puede acomodar 96, 24 y 6 placas de pozo.
   2. En Aplicación, seleccione Confluencia > Confluencia 1.
   3. Seleccione un pozo para ver utilizando el navegador a la derecha de la pantalla.
   4. Busque un plano de enfoque donde las celdas aparezcan blancas en comparación con el fondo y seleccione registrar manual o permita que el citómetro de imágenes seleccione el plano de enfoque seleccionando register auto.
      NOTA: Para las 96 placas de pozo sugeridas en la Tabla de Materiales,una posición aproximada es de 4,3 unidades.
   5. Utilice el ratón para resaltar todos los pozos que necesitan ser escaneados. Toda el área del pozo se escaneará automáticamente. Seleccione Iniciar análisis.
   6. Seleccione la configuración de análisis óptima para la placa y el tipo de celda.
      NOTA: En el caso de los hMPC, los siguientes ajustes son óptimos: intensidad 6, intensidad saturada, diámetro, diámetro, 8, espesor mínimo, 3, tamaño mínimo del racimo 500 y precisión a alto.
   7. Seleccione Iniciar análisis.
      NOTA: Inspeccione visualmente las imágenes para asegurarse de que el usuario y el citómetro de imágenes están de acuerdo con respecto al perímetro de las células. Si existe una gran discrepancia, vuelva a escanear la placa utilizando un plano de enfoque diferente o diferentes ajustes de análisis. El escaneo de confluencia se puede utilizar para comparar el crecimiento entre cultivos, tiempo en la administración de un tratamiento, o para monitorear las células y decidir cuándo iniciar la diferenciación. Si se desea la diferenciación, los detalles se proporcionan en la sección 6.
2. Utilice el catómetro de imágenes para contar las células.
   1. Preparar una solución de tinción que contenga 12 ml de F12 de Jamón, 6 ml de Hoechst 33342 y 24 ol de yoduro de propidium.
   2. Aspirar los medios y sustituircon es solución de tinción, incubar a 37oC durante 15 min.
   3. Aspirar la solución de tinción y reemplazar con F12 de Jamón.
      NOTA: Es importante utilizar un medio con niveles bajos de fenol rojo para obtener imágenes claras. Alternativamente, se puede utilizar PBS.
   4. Cargue la placa en el citómetro de imágenes y, en Aplicación, seleccione Viabilidad celular > Vivo + Muerto + Total. El canal en vivo será una imagen de campo brillante, el canal muerto será el yoduro propidium, y el canal total será el Hoechst 33342.
   5. Establezca el campo Canal en vivo en campo brillante y haga clic en Registrar automático en Configuración de enfoque.
   6. En el canal Total, establezca el canal en azul. Utilice Buscar enfoque para enfocar los núcleos o utilice las flechas arriba y abajo para establecer manualmente el enfoque. Haga clic en Establecer desfase para seleccionar el foco.
   7. En el canal Muerto, establezca el canal en rojo. Utilice Buscar enfoque para enfocar las celdas muertas o utilice las flechas arriba y abajo para establecer manualmente el enfoque. Haga clic en Establecer desfase para seleccionar el foco.
   8. Seleccione Iniciar análisis para iniciar el análisis.
   9. Seleccione los parámetros de análisis que sean adecuados para la placa y el tipo de celda. Seleccione Iniciar análisis para iniciar el análisis. Una vez completado el análisis, verifique visualmente que el análisis está contando adecuadamente las células (por ejemplo, para la comprobación total del canal que cada núcleo está siendo reconocido como un núcleo y que el citómetro de imagen no está contando ninguna mancha en el fondo como núcleos). Si el escaneo y el análisis son satisfactorios, devuelva la placa a la incubadora, de lo contrario vuelva a escanear o modifique los parámetros de análisis.

6. Diferenciar las células progenitoras musculares humanas (hMPC) a Myotubes

1. Determine la confluencia hMPC usando el protocolo de la sección 5.1. Para diferenciar los hMPCs en miotubos, es ideal que las células sean entre 80 y 85% de confluentes según lo determinado por la función de confluencia en el citómetro de imágenes (ver sección 5). Si se utilizan hMpC de más de un donante único, la exploración de confluencia permite que las células de diferentes donantes comiencen la diferenciación en el momento en que alcanzan la confluencia.
   NOTA: Con una confluencia del 80%, hay aproximadamente66.000 células/cm 2.
2. Lavar las células 2 veces con medios de diferenciación (97% F12 de Ham, 2% suero equino, 1% penicilina/estreptomicina, pH 7.4, pasado a través de un filtro de 0,22 m).
3. Mantenga las células en medios de diferenciación durante el tiempo que el experimento dicte mientras cambia los medios diariamente.
4. Evaluar directamente la formación de miotubos mediante inmunomanchas para la cadena pesada de miosina embrionaria, que normalmente es detectable después de 7 a 10 días de diferenciación.
   NOTA: El tiempo necesario para formar miotubos puede diferir ligeramente dependiendo del donante y el número de células cuando se inició la diferenciación; por lo tanto, se recomienda que los cultivos de cada donante sean monitoreados individualmente.

Representative Results

Los resultados representativos de la citometría de flujo del aislamiento hMPC del tejido muscular humano se pueden ver en la Figura1. los hMPCs se pueden identificar mediante los primeros eventos de gating basados en dispersión lateral y dispersión hacia adelante para eliminar células muertas o escombros, seguidos de seleccionar sólo las celdas que son negativas para 7-AAD y por lo tanto son viables. La selección de celdas positivas para los marcadores de superficie celular CD56 y CD29 representa la población de hMPC. Una biopsia de 60 mg solo proporciona aproximadamente 75 a 250 hMPCs.

En la Figura 2Ase muestra un análisis de confluencia representativo. Los contornos verdes de la Figura 2B fueron generados por el citómetro de imágenes y muestran cómo el citómetro de imágenes determinó la confluencia en función de la configuración de análisis seleccionada. En ambas imágenes mostradas, la confluencia determinada por el catómetro de imágenes está de acuerdo con la confluencia determinada visualmente por el usuario. Sin embargo, estas imágenes también resaltan que el catómetro de imágenes no es perfecto. Por ejemplo, la flecha roja resalta una imperfección en la placa que se cuenta como celdas. Si un gran número de estas imperfecciones están presentes en la placa, la confluencia resultante no representará con precisión la confluencia de las células. La Figura 2C muestra una representación de los tres canales utilizados para contar celdas (brightfield, azul y rojo) y la imagen combinada. La Figura 2D muestra heterogeneidad entre donantes. Descubrir y caracterizar con precisión esta heterogeneidad es una aplicación clave del citómetro de imágenes. La Figura 2E muestra que las mediciones de confluencia y los recuentos de núcleos de donantes únicos están altamente correlacionados.

El cuadro 3 proporciona una guía para identificar los hMPC basados en el procedimiento FACS descrito en este protocolo. La ampliación basada en la dispersión hacia delante y hacia el lado permite la separación de células viables de los desechos (Figura3A). Se utilizó una comparación de dispersión hacia delante por altura a dispersión hacia delante por área para distinguir eventos que representan celdas individuales (el área en caja en la Figura 3B). Las células viables se caracterizan por la falta de incorporación de la mancha de viabilidad 7-AAD (Figura3C). Por último, las células positivas para CD56 y CD29 se identifican como hMPCs (Figura3D). Para validar el procedimiento FACS descrito en este protocolo, la selección de células positivas de Pax7 puede determinarse mediante células de inmunomanchas con un anticuerpo específico de Pax7 y expresión de medición en un citómetro de flujo. La Figura 4 compara el número de hMPCs según lo determinado por la inmunomanchación de Pax7 (Figura4A)frente al procedimiento FACS (Figura4B) detallado en este protocolo de la misma población de células. La Figura 5 utiliza la inmunomancha y el análisis de Pax7 a través de la citometría de flujo para mostrar el enriquecimiento de las células que expresan Pax7 en la población total después de FACS (Figura5A en comparación con la Figura 5B),así como el mantenimiento del número de Pax7 expresar las células después del paso (Figura5B en comparación con la Figura 5C).

hMPCs se pueden diferenciar para formar miotubos siguiendo la sección 6. Determinar si los hMPC aislados mantienen células de capacidad miogénica spueden ser inmunomanchadas con un anticuerpo específico para la cadena pesada de miosina embrionaria y visualizadas mediante microscopía fluorescente. En la Figura 6se pueden ver imágenes representativas de miotubos positivos de miosina embrionaria.

Figura 1 : Imágenes representativas de citometría de flujo para hPMP ordenados directamente fuera del tejido de biopsia muscular. (A) Zona de dispersión lateral (eje Y) frente a la estrategia de gating del área de dispersión hacia delante (eje x) utilizada para identificar todas las células de una muestra de donante. (B) 7-AAD mancha de viabilidad (eje y) frente a dispersión hacia delante (eje x) para identificar celdas vivas. (C) Perfil de marcador de clasificación de selección negativa (-CD11b, -CD31, -CD45, -GlyA [eje y]) frente al marcador de selección CD34. (D) Marcador de selección negativo CD34 (eje y) frente al marcador de selección positivo CD29. (E) Marcador de selección positivo CD56 (eje y) frente al marcador de selección positivo CD29 (eje x). (F) Rendimientos de tres biopsias musculares esqueléticas diferentes. FSC - dispersión hacia adelante; SSC - dispersión lateral; hMPCs, células progenitoras musculares humanas.

Figura 2 : El potencial proliferativo de los hMPC derivados de donantes humanos se mantiene después de 6 pasajes. (A) Escaneo de confluencia representativa. (B) Exploración representativa de la confluencia con contornos verdes que muestran cómo el catómetro de imágenes determinó la confluencia. La flecha roja muestra una imperfección en la placa. (C) El campo brillante representativo, Hoechst 33342 (azul) y la tinción de yoduro propidium (rojo) y una imagen fusionada de estos tres canales. Barras de escala de 1 mm (D) Los núcleos cuentan a partir de 6 donantes únicos destaca la heterogeneidad hMPC. (E) La confluencia y el recuento de núcleos están altamente correlacionados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Parámetros representativos de clasificación de citometría de flujo para el aislamiento de hMPC. (A) Zona de dispersión lateral (eje Y) frente a la estrategia de gating del área de dispersión hacia delante (eje x) utilizada para identificar todas las células de una muestra de donante. (B) Altura de dispersión hacia delante (eje y) frente al área de dispersión hacia delante (eje x) para descalificar dobletes de la población de clasificación. (C) Altura de dispersión hacia delante (eje y) frente a la incorporación de 7-AAD para identificar celdas viables. (D) PE-Cy7 (CD56) vs. AF488 (CD29) tinción con Q2 que representa células positivas dobles (hMPCs). El color representa la densidad de los eventos.

Figura 4 : Comparación de la positividad CD29/CD56 frente a la positividad de Pax7 en el pasaje 4 hPCD del mismo donante. (A) Recuento (eje y) frente a expresión Pax7 (eje x). (B) Marcador de selección positivo CD56 (eje y) frente al marcador de selección positivo CD29 (eje x). NCAM - molécula de adhesión de células neuronales; hMPC - célula progenitora muscular humana.

Figura 5 : La positividad de Pax7 se mantiene en hMPCs derivados del mismo donante sobre múltiples pasajes. (A) Expresión Pax7 (eje x) de celdas que se habían pasado 4 veces antes de la clasificación FACS. (B) Expresión Pax7 (eje x) de hMPCs 1 pasaje después de la clasificación FACS para la positividad CD29 y CD56 (5 pasajes totales). (C) Expresión Pax7 (eje x) de hMPCs 2 pasajes después de la clasificación FACS para la positividad CD29 y CD56 (6 pasajes totales).

Figura 6 : Manchadeación de miotubos derivados de hMPC para cadena pesada de miosina embrionaria. Imágenes microscópicas representativas de hMPCs diferenciados co-teñidos con mancha de ADN (Hoechst 33342, azul) y cadena pesada de miosina embrionaria (verde) (n.o 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Los hMPC primarios son un modelo de investigación importante utilizado para entender la biología muscular esquelética y el proceso regenerativo. Además, los hMPCs tienen el potencial de ser utilizados para la terapia. Sin embargo, hay desafíos reconocidos en el uso de hMPCprimarios primarios para la investigación y la terapia, incluyendo la comprensión limitada de las células derivadas de los seres humanos¹⁰. También hay un gran grado de variación en la capacidad de expansión entre los cultivos de donantes, lo que limita el potencial de uso de hMPCs y puede afectar los resultados de la investigación¹¹. Por ejemplo, recientemente se ha demostrado que los hMPCs aislados utilizando el método descrito en este protocolo produjeron células que variaban en capacidad de expansión y esto fue impulsado por un perfil transcripcional que no se alineaba con el sexo o la edad^{de 11}años.

Aquí, presentamos un método eficiente y de alto rendimiento para aislar hMPCs en cantidades suficientes para una serie de aplicaciones aguas abajo, incluida la diferenciación en miotubos, modelando así el proceso miogénico in vitro. Nuestro método se basa en FACS para aislar CD56⁺/CD29⁺ células, que previamente han sido identificadas como que representan un Pax7 enriquecido que expresa la población¹². También se han descrito otras estrategias de clasificación de celdas igualmente válidas^5,6.

El aspecto más importante de nuestro método de aislamiento y cultivo de hMPC es el seguimiento cuidadoso de las culturas individuales. La heterogeneidad basada en donantes incluye el número de hMPC obtenidos de cada biopsia, su tiempo para iniciar la proliferación in vitro y su tasa de expansión de la población. Por lo tanto, si las diferencias en la formación de miotubos después de un tratamiento es la cuestión del interés individual, los cultivos de hMPC deben cambiarse al tratamiento basado en un nivel de confluencia determinado a priori y evaluarse objetivamente utilizando el citómetro de imágenes.

Nuestro método para aislar y cultivar hMPCs se ha optimizado para obtener rendimientos de células en millones para experimentos in vitro a partir de relativamente poco tejido de biopsia inicial (50-100 mg). El principal beneficio de este enfoque es que se pueden realizar múltiples ensayos y experimentos en hMpCs del mismo donante, lo que permite el mantenimiento del fenotipo de donante a través de experimentos mientras se introduce poca variabilidad entre experimentos. Nuestro método difiere de los métodos publicados recientemente que se centran en extraer la población más purade Pax7 expresando células directamente fuera del tejido de biopsia donde el foco es xenotransplantation 8. El desafío con estos métodos anteriores, sin embargo, es que requieren un peso de tejido inicial de más de un gramo. Por lo tanto, no son prácticos para la investigación que involucra biopsias musculares esqueléticas humanas. Una limitación de nuestro método es que no se ha evaluado el potencial de xenotrasplante. Sin embargo, este tipo de procedimiento no era una de las aplicaciones descendentes previstas originales. Las instrucciones futuras de este método pueden incluir la evaluación de la capacidad de injerto de los hMPCs, después de someterse a nuestro procedimiento de aislamiento, para determinar si existe la posibilidad de utilizar este procedimiento en los estudios de trasplante de MPC.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-Cl	Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate	VWR	664160	Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube	Falcon	352196	15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate	Grenier Bio-One	662 160	Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution	eBioscience	00-6993-50	Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16	BioLegend	303016	Conjugated antibody for FACS
Black 96-well cell culture plate	Grenier Bio-One	655079	96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S	Nexcelcom Bioscience		Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer	VWR	352350	Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail)	Corning	354236	Collagen for coating cell culture plates
Collagenase D	Roche	11 088 882 001	Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide	VWR	WN182	Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II	Sigma Life Sciences	D4693	A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder	Gibco	31600-034	Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	21600-010	PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate	J.T. Baker	4040-01	Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum	VWR	89510-186	Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12	Gibco	21700-026	Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum	Gibco	26-050-070	Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer	iNCyto	DHC-N0105	Used to count cells
Hibernate A	Gibco	A1247501	Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate	Life Technologies	H21492	DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P-4	Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer	Orflo	MXA006	Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes	Orflo	MXC002	Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter	Orflo		Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50062Z	Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159	BD Pharmingen	557747	Conjugated antibody for FACS
Penicillin/Streptomycin 100x Solution	Corning	30-002-CI	Antibiotics added to culture media
Propidium iodide	Thermo Fisher Scientific	P3566	DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor	Promega	G5071	Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Gibco	12648-010	Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-3	Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes	VWR	60818-565	Tubes used for FACS
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42	Compensation beads fort calibrating flow FACS settings