Summary
Nós apresentamos técnicas para isolar-se, cultivando, caracterizando, e diferenciando pilhas preliminares humanas do progenitor do músculo (hMPCs) obtidas do tecido esqueletal da biópsia do músculo. os hmpcs obtidos e caracterizados através destes métodos podem ser usados para abordar subseqüentemente as perguntas da pesquisa relativas à miogenesis humana e à regeneração do músculo esqueletal.
Abstract
O uso do tecido humano primário e das células é ideal para a investigação de processos biológicos e fisiológicos, como o processo regenerativo do músculo esquelético. Há desafios reconhecidos para trabalhar com células-tronco adultas primárias humanas, particularmente células progenitoras musculares humanas (hMPCs) derivadas de biópsias de músculo esquelético, incluindo a baixa produção de células de tecido coletado e um grande grau de heterogeneidade de doadores de parâmetros de crescimento e morte entre culturas. Ao incorporar a heterogeneidade no projeto experimental exige um tamanho de amostra maior para detectar efeitos significativos, igualmente permite que nós identifiquem os mecanismos que fundamentam a variabilidade na capacidade da expansão de hmpc, e permitem assim que nós compreendam melhor heterogeneidade na regeneração muscular esquelética. Novos mecanismos que distinguem a capacidade de expansão das culturas têm o potencial de levar ao desenvolvimento de terapias para melhorar a regeneração muscular esquelética.
Introduction
O músculo esquelético é o maior sistema de órgãos do corpo humano, representando 30 − 40% da massa corporal inteira1. Além do que seu papel bem reconhecido na locomoção, o músculo esqueletal mantem a temperatura e a postura de corpo, e joga um papel central na homeostase nutriente do corpo inteiro. Pesquisas envolvendo participantes humanos, animais e modelos de cultura celular são valiosas para abordar questões relacionadas à biologia e regeneração do músculo esquelético. A isolação e a cultura de pilhas preliminares humanas do progenitor do músculo (hMPCs) fornecem um modelo robusto que permita que as técnicas e as manipulações da cultura de pilha sejam aplicadas às amostras humanas. Uma vantagem de usar hmpcs é que eles mantêm o fenótipo genético e metabólico de cada doador2,3. A manutenção do phenotype do doador permite que os investigadores examinem a variação inter-individual no processo myogenic. Por exemplo, empregamos nosso método de caracterização do hMPC para identificar diferenças relacionadas à idade e ao sexo na capacidade de expansão da população de hMPC4.
A finalidade deste protocolo é detalhar técnicas para isolar, cultura, caracterizar, e diferenciar hMPCs do tecido da biópsia do músculo esqueletal. Com base no trabalho anterior que descreveu hmpcs e identificou potenciais fabricantes de superfície celular para o isolamento de hmpc5,6, este protocolo preenche uma lacuna crítica noconhecimento, ligandoo isolamento à caracterização de hmpcs. Além disso, as instruções detalhadas passo a passo incluídas neste protocolo tornam o isolamento e a caracterização do hMPC acessíveis a um amplo público científico, incluindo aqueles com experiência prévia limitada com hMPCs. Nosso protocolo está entre os primeiros a descrever o uso de um citômetro da imagem latente para seguir populações da pilha. Os citômetros recentemente projetados da imagem latente são State-of-the-art, elevado-throughput, e microplate-baseado, permitindo a imagem latente viva da pilha, a contagem da pilha, e a análise multicanais da fluorescência de todas as pilhas em cada poço de uma embarcação da cultura dentro dos minutos. Este sistema permite a quantificação rápida de mudanças dinâmicas na proliferação e na viabilidade de uma população inteira da pilha com somente o rompimento mínimo à cultura. Por exemplo, somos capazes de realizar medidas objetivas de confluência em dias sucessivos in vitro para determinar a cinética de crescimento de cada cultura derivada de diferentes doadores. Muitos protocolos na literatura, particularmente aqueles que envolvem a diferenciação de MPCs, necessitam de células para atingir um nível definido de confluência antes de iniciar a diferenciação ou tratamento7. Nosso método permite a determinação objetiva da confluência de cada poço em um vaso de cultura, permitindo que os pesquisadores iniciem o tratamento de forma imparcial e não-subjetiva.
No passado, uma limitação principal de usar hMPCs preliminares era baixos rendimentos que limitam o número de pilhas disponíveis para experiências. Nós e outros mostraram que o rendimento de MPCs do tecido de biópsia do músculo esquelético é de 1 − 15 MPCs por miligrama de tecido (Figura 1)8. Como nosso protocolo permite quatro passagens das células antes da purificação com a triagem de células ativadas por fluorescência (FACS), nossos rendimentos criopreservados de hMPC, derivados de pequenas quantidades de tecido de biópsia (50 − 100 mg), são suficientes para abordar os objetivos de pesquisa onde são necessários vários experimentos. Nosso protocolo FACS produz um ~ 80% puro (Pax7 positivo) MPC população, assim, nosso protocolo é otimizado tanto para o rendimento e pureza.
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Protocol
Este protocolo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Cornell. Todos os participantes foram rastreados por condições de saúde subjacentes e deram consentimento informado.
1. obtendo o tecido muscular humano através da biópsia do músculo esquelético
- Identifique o músculo vasto vasto lateral via palpação, marcos anatômicos e contração ativa do músculo.
- Palpar o vasto vasto lateral por ter o participante apertar o músculo quadríceps e encontrar a barriga do músculo, cerca de 1/3 do caminho da patela para o quadril, e apenas ventrolateral para o fêmur.
- Use uma fita de medição do papel para marcar uma área com um marcador cirúrgico aproximadamente 4 − 6 polegadas da parte superior da patela que representa a barriga do músculo.
- Raspar qualquer cabelo perto da área marcada e, em seguida, limpar com um anti-séptico de grau cirúrgico que é usado antes dos procedimentos médicos (por exemplo: gluconato de clorexidina a 2% (CHG)/70% álcool isopropílico (IPA)).
- Anestesie o local da biópsia com lidocaína a 1%.
Nota: Evite injetar a lidocaína no músculo esquelético. - Faça uma via de incisão de 4 − 5 mm no local marcado.
- Depois que a área é anestesiada, empurre uma agulha de Bergstrom com trocar através da fáscia na barriga do músculo (aproximadamente 2 − 3 cm).
- Desenhe o tecido muscular na agulha de Bergstrom retirando o trocarte de corte 2 − 3 cm enquanto um assistente aplica sucção retirando um êmbolo de seringa 60 mL anexado.
- Feche a câmara de corte.
- Gire a base da agulha de biópsia um quarto de volta e repita a sequência de abertura da agulha, aplicando sucção, e fechando a agulha.
Nota: Cada vez que a agulha é fechada, um corte de tecido muscular deve ser obtido dentro da agulha de Bergstrom. Durante a coleta da amostra, a agulha permanecerá na coxa na mesma posição vertical enquanto é girada longitudinalmente através de 360 ° para obter cada amostra. Esta seqüência pode ser repetida 3 − 4 vezes. - Expelir o tecido coletado da biópsia da agulha em uma almofada de limpeza nonaderaderente estéril.
- Examine o tecido e remova quaisquer tecidos adiposos visíveis e fibróticos usando lâminas ou pinças de bisturi estéreis.
- Coloque uma porção (50 − 100 mg) de tecido em um tubo estéril contendo um meio nutriente independente de CO2(por exemplo, Hibernate a).
Nota: O peso do tecido é determinado como se segue. Primeiro coloque o tubo tampado contendo o meio nutriente em uma escala e Tara. Em seguida coloque o tecido no tubo, Recapitule o tubo e, em seguida, pesar o tubo que contém o tecido no meio nutriente. - Conservar o tubo que contém o tecido e o meio nutriente a 4 ° c até ao processamento.
Nota: O tecido da biópsia deve ser processado dentro de 48 h da coleção.
2. isolando células progenitoras do músculo humano do tecido da biópsia
- Tecido de biópsia de mince.
- Transfira o tecido muscular do meio nutriente para um prato de Petri estéril em um armário de segurança biológico ou local de trabalho estéril similar.
- Use lâminas de bisturi estéreis para triturar o tecido em ~ 1 mm3 peças.
- Lave o tecido da biópsia picada para remover detritos residuais.
- Transfira o tecido muscular para um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e permita que o tecido se estabeleça através da gravidade.
- Aspirar o sobrenadante ter cuidado para não perturbar o tecido muscular.
- Adicionar 10 ml de PBS para o tecido lavado e permitir que o tecido muscular para reassentar através da gravidade.
- Aspirar o sobrenadante ter cuidado para não perturbar o tecido muscular.
- Adicionar 10 ml de baixa glicose Dulbecco ' s modificado Eagle médio (DMEM) e permitir que o tecido para reassentar via gravidade.
- Aspirar o sobrenadante ter cuidado para não perturbar o tecido muscular.
- Incubar o tecido na mídia Digest.
- Ressuscite o tecido muscular em 3 ml de meios de digestão (2 mg/ml de colagenase D em baixa glicose DMEM).
Nota: as soluções de colagenase D podem ser preparadas a 20 mg/mL em DMEM de baixa glicose e armazenadas a-80 ° c, depois diluídas 1:10 em baixa glicose DMEM no momento do uso. - Incubar o tubo que contém o tecido muscular num banho de água a 37 ° c durante 30 min.
- Triturar a suspensão do tecido muscular a cada 10 min usando uma pipeta serológica de 10 mL ou uma pipeta de furo largo.
- Adicionar 83 μL de meios de digestão adicionais e 24 μL de solução de Dispase (acetato de cálcio 0,76 mM, acetato de sódio a 1,39 mM, 13,91 mg/mL de Dispase II em DMEM de baixa glucose). Retorne a suspensão ao banho de água de 37 ° c.
- Triturar a suspensão do tecido muscular a cada 5 − 10 min com uma ponta de Pipet de furo largo.
- Continue a trituração até que um chorume uniforme seja conseguido, e para não mais do que 1,5 h para impedir sobre a digestão.
Nota: A picada suficiente do tecido e a atividade enzimática da colagenase e Dispase podem impactar a digestão da amostra. Um chorume uniforme deve poder passar através de uma ponta normal da pipeta com oclusão mínima após 1,5 h. Se um chorume uniforme não for conseguido após 1,5 h, verifique se o tecido que picou é suficiente, e o tecido é picado ao tamanho apropriado (etapa 2.1.2). Além disso, a atividade das enzimas deve ser testada como lote para variação de lote na atividade enzimática ocorre.
- Ressuscite o tecido muscular em 3 ml de meios de digestão (2 mg/ml de colagenase D em baixa glicose DMEM).
- Células da pelota e congelar em meios de recuperação.
- Adicionar 6 mL de meios de crescimento (GM; 79% Ham ' s F12, 20% soro fetal bovino, 1% penicilina/estreptomicina, 5 ng/mL fator de crescimento básico de fibroblastos [bFGF], pH 7,4, passou através de um filtro de 0,22 μm) para a pasta muscular.
- Pipetar a suspensão através de um filtro de células de 70 μm para um tubo cônico de 50 mL. Enxague o filtro com um adicional de 4 mL de GM.
Nota: A amostra pode ser transferida de volta para um tubo cônico de 15 mL para facilitar a visualização do pellet. Um volume maior da lavagem pode ser usado se os rendimentos de pilha subseqüentes forem baixos. - Centrifugador a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente (RT).
- Aspirar o sobrenadante ter certeza de não interromper o pellet. Deslize o tubo para resuspender o pellet nos suportes restantes. Se as células não vão ser cultivadas imediatamente proceder ao passo 2.4.5 para obter instruções sobre o armazenamento de longo prazo, caso contrário, prossiga para a etapa 3.1.6.
Nota: Se a cultura imediata é desejada, GM em placas da cultura da pilha deve pre-ser incubada (etapas 3.1.1 e 3.1.2) antes que o processamento da biópsia comece. - Adicione 1,5 mL de mídia de congelamento de cultura de células de recuperação (tabela de materiais) ao pellet recuperado.
- Transfira a pasta para um crio-frasco. Coloc o CryoVial em um refrigerador isopropanol-controlado da taxa durante a noite em-80 ° c. Armazene o CryoVial em-80 ° c até pronto para a cultura.
Nota: Os cryovials que contêm a pasta podem ser mantidos no nitrogênio líquido para o armazenamento a longo prazo (maior de 1 mês). O uso de um resfriador de taxa controlado por isopropanol permite que as células sejam reprovadas de forma reversível a uma taxa de 1 ° c/min, resultando em taxas de recuperação celular ideais, como evidenciado pela viabilidade após congelamento e aumento da probabilidade de apego aos vasos de cultura celular9. Alternativamente, pode ser utilizado um copo contendo isopropanol RT, colocado num congelador a-80 ° c.
3. cultivando células progenitoras do músculo humano
- Descongelar a pasta muscular.
- Antes de descongelar e semear hMPCs, pré-equilibram placas de cultura celular em GM. Adicionar 250 μL de GM a 4 poços de um colágeno-revestido (colágeno I), 24-bem placa de cultura celular. Encha os poços restantes com 500 μL de suportes de base estéreis (ou seja, F12) para evitar a evaporação durante a cultura a longo prazo.
Nota: Para biópsias entre 50 g e 100 g, quatro poços de uma placa 24-well são apropriados. Se o tecido da biópsia for inferior a 50 g, dois poços podem ser mais apropriados. Restos residuais e baixo número de células impedem o uso de uma técnica de contagem de células nesta etapa; Conseqüentemente, a densidade de semeadura exata não é determinada e varia ligeiramente da biópsia à biópsia. - Incubar vasos de cultura celular com GM a 37 ° c em 5% CO2 para 1 h antes da semeadura.
- Remova os cryovials do congelador-80 ° c e coloc em um banho de água de 37 ° c; o líquido no tubo deve ser completamente submerso em água.
- Quando o descongelamento estiver quase completo (~ 5 min), transfira o criofrasco para uma capa de fluxo laminar estéril. Transfira o chorume do músculo para fora do tubo CryoVial e adicione a um tubo cônico de 15 mL contendo 6 mL de GM pré-aquecido a uma taxa de 1 mL/min.
- Centrifugue a pasta muscular a 300 x g durante 5 min em RT.
Nota: Uma centrífuga de balde oscilante pode facilitar a visualização de pequenas pelotas nesta etapa, mas não é essencial. - Aspirar o sobrenadante ter certeza de não interromper o pellet. Deslize o tubo para resuspender o pellet nos suportes restantes e ressuscite em 1 mL de GM.
- Transferir 250 μL do pellet ressuspendido (agora considerado uma suspensão de hMPC) para cada um dos 4 poços da placa de cultura de células pré-incubadas 24-bem.
- Antes de descongelar e semear hMPCs, pré-equilibram placas de cultura celular em GM. Adicionar 250 μL de GM a 4 poços de um colágeno-revestido (colágeno I), 24-bem placa de cultura celular. Encha os poços restantes com 500 μL de suportes de base estéreis (ou seja, F12) para evitar a evaporação durante a cultura a longo prazo.
- Cultura e passagem hMPCs.
- Manter as culturas de hMPC em GM a 37 ° c em 5% CO2.
Nota: Os estoques de GM sem o bFGF (ou seja, F12, antibióticos, FBS) são preparados em lotes e mantidos a 4 ° c por até 2 semanas. o bFGF é adicionado à GM no dia do uso. Os meios que contêm bFGF podem ser armazenados para 48 h em 4 ° c. - Vinte e quatro horas após o isolamento, aspirar o GM, lave suavemente o vaso de cultura 2x com pre-aquecido GM, e adicionar fresco GM.
Nota: 24 h deve fornecer hMPCs tempo adequado para anexar; Não devem ser removidos hMPCs após a lavagem. Esta etapa também removerá restos remanescentes que foram gerados durante a colheita da célula, tornando o vaso mais receptáculo à varredura precisa de confluência usando um citometro de imagem (seção 5 abaixo). Após esta mudança de mídia inicial, GM é alterado a cada 48 h. - Passagem hMPCs quando 70% confluência é alcançada ou quando eles permaneceram no mesmo prato de cultura por 10 dias, o que ocorrer primeiro.
Nota: 70% confluência é de aproximadamente 55.000 células/cm2. - Para a passagem, adicione 250 μL de tripsina pré-aquecida a cada poço de uma placa de cultura de 24 poços e incubar durante ~ 5 min.
- Bata a embarcação da cultura da pilha em uma superfície firme para desanexar hMPCs. Um microscópio de luz pode ser usado para verificar se os hMPCs se destacaram.
- Transfira as suspensões de Trypsin/hMPC para 5 mL de GM em um tubo cônico de 15 mL.
- Centrifugue a suspensão hMPC a 300 x g durante 5 min em RT.
- Retire as suspensões hMPC da centrífuga e coloque no gelo na capa de fluxo laminar estéril.
Nota: Mantendo hMPCs no gelo durante a passagem resulta em menos agregação de células. - Aspirar sobrenadante de hMPCs e gentilmente ressuscito pellet em 1 mL de GM.
- Contagem de células usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado.
Nota: Uma diluição 1:5 da suspensão da pilha ao amortecedor de contagem da pilha é geralmente apropriada. - HMPCs da semente em pratos colagénio-revestidos da cultura que contêm GM pre-aquecido em uma densidade de 3.500 pilhas por o cm2. Uma combinação de placas de 10 cm e de 24 placas do poço é ideal. As 24 placas do poço podem ser escaneadas diariamente em um citômetro da imagem latente para monitorar o crescimento.
- Siga o mesmo procedimento (começando na etapa 3.2.4.) para passagens subsequentes.
Nota: A saúde e a pureza das células podem ser monitoradas através de passagens usando um marcador de senescência celular (por exemplo, β-galactosidase) e imunocoloração para Pax7.
- Manter as culturas de hMPC em GM a 37 ° c em 5% CO2.
- Cryopreserve os hMPCs.
- Crio preservar células em excesso para uso posterior para tornar o volume de cultura mais gerenciável.
- Para a criopreservação, siga o procedimento de tripsinização descrito nas etapas 3.2.4.-3.2.9.
- Enquanto a suspensão celular está sendo centrifugada, prepare uma mistura de 20% (por exemplo, 200 μL) dimetil sulfóxido (DMSO) e 80% (por exemplo, 800 μL) GM. pipeta acima e para baixo 20x para assegurar a mistura adequada. Deixe a mistura para descansar no gelo.
- Com base na contagem de células, diluir a suspensão hMPC para 2 x 106/ml em GM.
- Combine a suspensão hMPC e o 20% estéril DMSO/80% GM mistura 50/50. A mídia de criopreservação final é uma combinação de DMSO (10%) e GM (90%) contendo 1 x 106 hmpcs/ml.
- Coloc 1 mL da suspensão de hMPC preparada na etapa 3.3.5 em tantos como cryovials como a contagem inicial da pilha permite. Em seguida, coloque hMPCs aliquotadas em um refrigerador de taxa controlada por isopropanol em um freezer de-80 ° c durante a noite.
Nota: Nesta etapa, tipicamente entre 5 e 15 milhões células são obtidas, 30 − 60% dos quais são identificados como hMPCs por FACS.
4. isolando células progenitoras de músculo humano Pax7+ via citometria de fluxo
- Para preparar hMPCs das culturas vivos (etapa 3.2.11), Trypsinize bastante embarcações da cultura para 1 x 106− 2 x 106 pilhas totais. Prepare suspensões da pilha como descritas nas etapas 3.2.4 − 3.2.9.
- Prepare hMPCs de culturas criopreservadas (Step 2.4.6 ou 3.3.6).
- Selecione 1 − 2 tubos contendo ~ 1 x 106 passagem quatro hMPCs para cada doador.
Nota: Usando a passagem quatro hMPCs permite o rendimento de pilha adequado ao ainda manter o potencial proliferative até a passagem seis (Figura 2). - Rapidamente descongelar as células, removendo-os do freezer-80 ° c e colocando-os em um banho de água de 37 ° c com o líquido no tubo completamente submerso.
- Quando o descongelar está quase completo (~ 5 min), transfira hMPCs para uma capa de fluxo laminar estéril e transfira o conteúdo da suspensão celular em 6 mL de GM pré-aquecido em um tubo cônico de 15 mL a uma taxa de 1 mL/min.
- Prepare suspensões da pilha como descritas nas etapas 3.2.7 − 3.2.9.
- Ressuscitem cada pellet em 3 mL de tampão FACS (500 mL de PBS, 12,5 mL de soro de cabra normal, 2 mL 0,5 M EDTA, pH 7,4, passados através de um filtro de 0,22 μm).
- Centrifugue a suspensão da pilha em 300 x g por 5 minutos em RT.
- Aspirar sobrenadante de hMPCs e resuspender suavemente a pelota em 250 μL de tampão FACS; lugar no gelo.
- Coloque 100 μL de células num tubo de microcentrifugação de 1,7 mL e deixe no gelo para ser utilizado como controlos vivos/mortos (passo 4.5.1).
Nota: o UL 100 das pilhas a ser usada para controles vivos/inoperantes pode vir de tomar um volume pequeno (~ 20 UL) de pilhas ressuspenso de cada doador a ser classificado ou das pilhas bancados.
Nota: é importante não tomar mais de 20 UL de células ressuscipended de um único doador. Traga o volume até 100 UL com tampão de FACS se < 100 UL das pilhas está disponível.
- Selecione 1 − 2 tubos contendo ~ 1 x 106 passagem quatro hMPCs para cada doador.
- Mancha hMPCs para marcadores de superfície celular.
- Prepare o seguinte cocktail do anticorpo (os montantes mostrados são para cada cultura, escala-acima apropriadamente): 5 μL CD56 (molécula de adesão da pilha neural [NCAM]; PE-Cy7-conjugados) e 5 μL CD29 (β1-integrina; AlexFluor488-conjugados). A diluição final do anticorpo é 1:50.
- Adicione 10 μL do coquetel de anticorpos a cada suspensão de hMPC e incubar no gelo por 30 min no escuro.
- Adicionar 10 mL de tampão FACS para cada mistura de suspensão/cocktail de anticorpos.
- Centrifugue cada tubo em 300 x g por 5 min em RT.
- Ressuspender o pellet em 300 μL de tampão FACS e transferir para um tubo de poliestireno de 5 mL de fundo redondo.
- Mantenha a suspensão no gelo e protegida da luz.
- Prepare as contas de compensação.
Nota: os controles positivos para cada anticorpo e um controle negativo (grânulos não manchados) devem ser preparados usando grânulos da compensação. Os controles de talão de compensação devem ser executados no citometro de fluxo antes das amostras serem classificadas. Estes controles permitem a determinação de quanto o fluorocromo de cada anticorpo pode ser detectado no outro canal de modo que a compensação possa ser aplicada.- Contas de compensação vortex.
- Em três tubos de microcentrífuga de 1,7 mL, adicione uma gota (50 μL) de contas de compensação.
- Adicionar 1 μL de cada anticorpo ao tubo apropriado, ou nenhum ao controlo negativo.
- Incubar no escuro por 15 min.
- Adicione 1,5 mL de tampão FACS a cada tubo e Vortex.
- Centrifugue cada tubo em 300 x g em um centrifugador do de bancada por 5 minutos em RT.
- Aspirar sobrenadante e ressuspender o pellet em 200 μL de tampão FACS.
Nota: A pelota pode ser muito difícil de Visualizar; deve tomar-se cuidado ao aspirar o sobrenadante. - Coloque a suspensão em um tubo de poliestireno de 5 mL de fundo redondo e, em seguida, mantenha o tubo no gelo e protegido da luz.
- Prepare controles vivos e mortos.
- Divida o 100 μL de hMPCs da etapa 4.2.8 em dois tubos do microcentrifugador de 1,7 mL (um para o controle vivo e um para o controle inoperante).
- Coloque o tubo de controle morto em um bloco de aquecimento pré-aquecido para 70 ° c por > 10 min. Durante este tempo, manter o controle ao vivo sobre o gelo.
- Centrifugue cada tubo em 300 x g em um centrifugador do de bancada por 5 minutos em RT.
- Aspirar sobrenadante e ressuspender o pellet em 150 μL de tampão FACS.
- Combine os controles vivos/inoperantes em um único tubo inferior redondo do poliestireno de 5 mL.
- Realizar coloração de viabilidade.
- Adicionar 1 μL de 7-aminoactinomicina D (7-AAD) a todos os tubos contendo células a serem classificadas e ao controle vivo/morto.
- Adicionar GM a 24-poço revestido com colágeno (250 μL/poço) e 10 cm (8 mL/poço) placas e permitir equilibrar em uma incubadora de cultura celular em 37 ° c em 5% CO2.
- Classifique hMPCs via citometria de fluxo.
- Classifique hmpcs em um citômetro do fluxo com bocal de 100 μm em uma pressão de 20 libras por polegada quadrada. Determine hMPCS ao vivo com base em dispersão lateral e direta, bem como negatividade 7-AAD (parâmetros de classificação e uma classificação representativa podem ser vistos na Figura 3).
- As células positivas para PE-Cy7 (780/60 nm) e AlexFluor488 (530/30 nm) representam CD56+/Cd29+ células e, portanto, são Pax7 células positivas (hmpcs). Classifique células positivas duplas em tubos de coleta contendo uma almofada de 300 μL de tampão FACS.
Nota: A pureza das culturas classificadas pode ser determinada por imunocoloração para Pax7 seguida de análise de citometria de fluxo a jusante (Figura 4). - Descarte todas as outras células.
- Transfira as células classificadas para um tubo cônico de 15 mL.
- Gire a suspensão hMPC em 300 x g por 5 min em RT.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuscito em 1 mL de GM.
- Contagem de células usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado.
Nota: Enquanto o número de células pode ser inferido como o número de eventos que são classificados positivamente, essa contagem foi encontrada para superestimar o número de células por 10 − 40% em comparação com os métodos tradicionais de contagem de células. - Semeie os hMPCs conforme descrito na etapa 3.2.11.
Nota: A verificação da pureza da população de hMPC pode ser determinada por imunomarcação para Pax7 e análise via citometria de fluxo.
5. caracterizando culturas do progenitor do músculo humano (hMPC) que usam um cytometer da imagem latente
-
Use o citômetro da imagem latente (tabela dos materiais) para executar varreduras da confluência.
- Selecione criar nova digitalização e, em seguida, insira/selecione a categoria da chapa, perfil da placa e identificação da placa. O citômetro da imagem latente pode acomodar 96, 24, e 6 placas do poço.
- Em aplicativo, selecione confluência > confluência 1.
- Selecione um poço para ver usando o navegador à direita da tela.
- Encontre um plano de foco onde as células aparecem em branco em comparação com o fundo e selecione registrar manual ou permitir que o citometro de imagem para selecionar o plano de foco, selecionando Register auto.
Nota: Para as 96 placas de poços sugeridas na tabela de materiais, uma posição aproximada é de 4,3 unidades. - Use o mouse para destacar todos os poços que precisam ser verificados. Toda a área do poço será automaticamente digitalizada. Selecione Iniciar digitalização.
- Selecione as configurações de análise ideais para placa e tipo de célula.
Nota: Para hMPCs, as seguintes configurações são ideais: intensidade = 6, intensidade saturada = 0, diâmetro = 8, espessura mínima = 3, tamanho de cluster mín = 500 e precisão = alta. - Selecione iniciar análise.
Nota: Inspecione visualmente imagens para assegurar que o usuário e o citômetro da imagem latente concordem a respeito do perímetro das pilhas. Se existir uma grande discrepância, Rescan a placa usando um plano diferente de foco ou configurações de análise diferentes. A digitalização de confluência pode ser usada para comparar o crescimento entre culturas, tempo de administração de um tratamento ou para monitorar células e decidir quando iniciar a diferenciação. Se a diferenciação for desejada, os detalhes são fornecidos na seção 6.
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Use o citômetro da imagem latente para contar pilhas.
- Prepare uma solução de coloração contendo 12 mL de Ham ' s F12, 6 μL de Hoechst 33342 e 24 μL de iodeto de propiídio.
- Aspirar a mídia e substituir com a solução de coloração, incubar a 37 ° c por 15 min.
- Aspirar a solução de coloração e substituir por Ham ' s F12.
Nota: É importante usar uma mídia com baixos níveis de fenol vermelho para obter imagens claras. Alternativamente, PBS pode ser usado. - Carregue a placa no citômetro da imagem latente e a aplicação, selecione a viabilidade da pilha > vivo + inoperante + total. A canaleta viva será uma imagem brilhante do campo, o canal inoperante será o iodeto do propidium, e o canal total será o Hoechst 33342.
- Defina o canal ao vivo para o campo brilhante e clique em registrar auto em configuração de foco.
- No canal total , defina o canal para azul. Use o foco de localizar para colocar os núcleos em foco ou use as setas para cima e para baixo para definir manualmente o foco. Clique em definir deslocamento para selecionar o foco.
- No canal morto , defina o canal para vermelho. Use Localizar foco para colocar as células mortas em foco ou use as setas para cima e para baixo para definir manualmente o foco. Clique em definir deslocamento para selecionar o foco.
- Selecione Iniciar digitalização para iniciar a digitalização.
- Selecione os parâmetros de análise que são apropriados para a placa e o tipo de célula. Selecione iniciar análise para iniciar a análise. Após a conclusão da análise, verifique visualmente se a análise está adequadamente contando as células (por exemplo, para o canal total de verificação de que cada núcleo está sendo reconhecido como um núcleo e que o citometro de imagem não está contando quaisquer manchas no fundo como núcleos). Se a varredura e a análise forem satisfatórias, retorne a placa à incubadora, de outra maneira Rescan ou modifique parâmetros da análise.
6. diferenciando células progenitoras do músculo humano (hMPCs) para Miotubos
- Determine a confluência hMPC usando o protocolo na seção 5,1. Para diferenciar hmpcs em myotubes, é ideal para que as pilhas sejam 80 − 85% confluentes como determinado pela função da confluência no citômetro da imagem latente (veja a seção 5). Se os hMPCs de mais de um doador original são usados, a exploração da confluência permite que as pilhas dos doadores diferentes comecem a diferenciação na altura onde alcangam a confluência.
Nota: Na confluência de 80%, há aproximadamente 66.000 células/cm2. - Células de lavagem 2x com meios de diferenciação (97% Ham ' s F12, 2% soro eqüino, 1% penicilina/estreptomicina, pH 7,4, passou através de um filtro de 0,22 μm).
- Mantenha as células em meios de diferenciação durante o tempo que a experiência dita ao mudar a mídia diariamente.
- Avalie diretamente a formação do formação pela imunocoloração para a cadeia pesada do miosina embrionário, que é tipicamente detectável após 7 − 10 dias da diferenciação.
Nota: O tempo necessário para formar miotubos pode diferir ligeiramente dependendo do doador e do número de células quando a diferenciação foi iniciada; Portanto, recomenda-se que as culturas de cada doador sejam monitoradas individualmente.
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Representative Results
Os resultados da citometria de fluxo representativo do isolamento do hMPC do tecido muscular humano podem ser visualizados na Figura 1. hMPCs pode ser identificado pela primeira gating eventos baseados em dispersão lateral e dispersão para a frente para eliminar células mortas ou detritos, seguido por selecionar apenas as células que são negativas para 7-AAD e, portanto, são viáveis. A seleção de células positivas para ambos os marcadores de superfície celular CD56 e CD29 representa a população de hMPC. Uma biópsia de 60 MGS fornece somente aproximadamente 75 − 250 hMPCs.
Uma verificação de confluência representativa é mostrada na Figura 2a. Os contornos verdes na Figura 2b foram gerados pelo citômetro da imagem latente e mostram como o citômetro da imagem latente determinou a confluência baseada nos ajustes da análise selecionados. Em ambas as imagens mostradas, a confluência determinada pelo citometro de imagem concorda com a confluência visualmente determinada pelo usuário. No entanto, essas imagens também destacam que o citometro de imagem não é perfeito. Por exemplo, a seta vermelha destaca uma imperfeição na placa que está sendo contada como células. Se um grande número destas imperfeição estiver presente na placa, a confluência resultante não representará com precisão a confluência das células. A Figura 2C mostra uma representação de todos os três canais usados para contar células (brightfield, azul e vermelho) e a imagem mesclada. A Figura 2D mostra a heterogeneidade entre os doadores. Descobrir e caracterizar com precisão essa heterogeneidade é uma aplicação chave do citometro de imagem. A Figura 2e mostra que as medições de confluência e as contagens de núcleos de doadores únicos são altamente correlacionadas.
A Figura 3 fornece uma diretriz para saber como identificar hMPCs com base no procedimento FACS descrito neste protocolo. A gating com base no espalhamento dianteiro e lateral permite a separação de células viáveis de detritos (Figura 3a). Uma comparação de dispersão direta por altura para encaminhar dispersão por área foi usada para distinguir eventos representando células individuais (a área em caixa na Figura 3B). As células viáveis são marcadas pela falta de incorporação da mancha de viabilidade 7-AAD (Figura 3C). Finalmente, as células positivas para CD56 e CD29 são identificadas como hMPCs (Figura 3D). Para validar o procedimento de FACS descrito neste protocolo a seleção de pilhas positivas de Pax7 pode ser determinada por pilhas de imunocoloração com um anticorpo Pax7-specific e uma expressão de medição em um cytometer do fluxo. A Figura 4 compara o número de hMPCs como determinar pela imunocoloração Pax7 (figura 4a) versus o procedimento FACS (Figura 4B) detalhado neste protocolo da mesma população de células. A Figura 5 utiliza a imunocoloração e a análise de Pax7 através da citometria de fluxo para demonstrar o enriquecimento de Pax7 expressando células na população total após FACS (Figura 5a em comparação com a Figura 5b), bem como a manutenção do número de Pax7 expressar células após o de (Figura 5b em comparação com a Figura 5C).
os hMPCs podem ser diferenciados para formar miotubos seguindo a seção 6. Para determinar se os hMPCs isolados mantêm células de capacidade miogênica podem ser imunomanchadas com um anticorpo específico para a cadeia pesada de miosina embrionária e visualizadas usando microscopia fluorescente. Imagens representativas de miotubos positivos de cadeia pesada de miosina embrionária podem ser visualizadas na Figura 6.
Figura 1 : Imagens representativas do fluxo citometria para hmpcs classificados diretamente fora do tecido da biópsia do músculo. (A) área de dispersão lateral (eixo y) versus área de dispersão direta (eixo x) que gating a estratégia usada para identificar todas as células em uma amostra de doador. (B) mancha de viabilidade 7-AAD (eixo y) versus dispersão direta (eixo x) para identificar células ao vivo. (C) seleção negativa que classifica o perfil do marcador (-CD11b,-CD31,-CD45,-glya [y-Axis]) contra o marcador de seleção CD34. (D) marcador de seleção negativa CD34 (eixo y) versus o marcador de seleção positivo CD29. E Marcador de seleção positivo CD56 (eixo y) versus o marcador de seleção positivo CD29 (eixo x). F Rendimentos de três biópsias diferentes do músculo esqueletal. FSC = dispersão direta; SSC = dispersão lateral; hMPCs, células progenitoras do músculo humano.
Figura 2 : O potencial proliferativo de hMPCs derivado de doadores humanos é mantido após 6 passagens. (A) Análise de confluência representativa. (B) varredura representativa da confluência com esboços verdes que mostram como o citômetro da imagem latente determinou a confluência. A seta vermelha mostra uma imperfeição na placa. (C) o brightfield representativo, o Hoechst 33342 (azul), e o iodeto do propidium (vermelho) que mancha e uma imagem fundida destes três canais. Barras de escala = 1mm. (D) as contagens dos núcleos de 6 doadores originais destacam a heterogeneidade de hmpc. (E) confluência e contagem de núcleos são altamente correlacionadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Parâmetros de classificação de citometria de fluxo representativo para isolamento de hMPC. (A) área de dispersão lateral (eixo y) versus área de dispersão direta (eixo x) que gating a estratégia usada para identificar todas as células em uma amostra de doador. (B) altura de dispersão para frente (eixo y) versus área de dispersão direta (eixo x) para desqualificar os doublets da população de classificação. (C) altura de dispersão para frente (eixo y) versus incorporação de 7-AAD para identificar células viáveis. (D) PE-CY7 (CD56) vs. AF488 (CD29) coloração com Q2 representando células duplas positivas (hMPCs). A cor representa a densidade de eventos.
Figura 4 : Comparação da positividade CD29/CD56 versus positividade Pax7 na passagem 4 hMPCs do mesmo doador. (A) contagem (eixo y) vs. expressão Pax7 (eixo x). B Marcador de seleção positivo CD56 (eixo y) versus marcador de seleção positivo CD29 (eixo x). NCAM = molécula de adesão de células neurais; hMPC = célula progenitor do músculo humano.
Figura 5 : Pax7 a positividade é mantida em hMPCs derivada do mesmo doador em várias passagens. (A) expressão Pax7 (eixo x) das células que haviam sido passadas 4 vezes antes da triagem do FACS. (B) expressão Pax7 (eixo x) de hMPCs 1 passagem após FACS triagem para CD29 e CD56 positividade (5 passagens totais). (C) expressão Pax7 (eixo x) de hmpcs 2 passagens após FACS que classificam para o positividade CD29 e CD56 (6 passagens totais).
Figura 6 : Coloração de miotubos derivados de hMPC para cadeia pesada de miosina embrionária. Imagens microscópicas representativas de hMPCs diferenciados cocoradas com coloração de DNA (Hoechst 33342, azul) e cadeia pesada de miosina embrionária (verde) (n = 3). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os hMPCs primários são um importante modelo de pesquisa usado para compreender a biologia do músculo esquelético e o processo regenerativo. Adicionalmente, os hMPCs têm o potencial ser usado para a terapia. Entretanto, há uns desafios reconhecidos em usar hMPCs preliminares para a pesquisa e a terapia, incluindo a compreensão limitada das pilhas derivadas dos seres humanos10. Há também um grande grau de variação na capacidade de expansão entre as culturas doadoras, o que limita o potencial de uso de hMPCs e pode afetar os resultados da pesquisa11. Por exemplo, tem sido demonstrado recentemente que os hMPCs isolados utilizando o método descrito neste protocolo produziram células que variaram na capacidade de expansão e isso foi impulsionado pelo perfil transcricional que não se alinham com o sexo ou a idade11.
Aqui, nós apresentamos um método eficiente e elevado do rendimento para isolar hMPCs em quantidades suficientes para um número de aplicações a jusante que incluem a diferenciação em myotubes, modelando desse modo o processo myogenic in vitro. Nosso método confia em FACS para isolar CD56+/Cd29+ Cells, que foram identificados previamente como representando um Pax7 enriquecido que expressa a população12. Outras estratégias de triagem celular igualmente válidas também foram descritas5,6.
O aspecto mais importante do nosso método de isolamento e cultura hMPC é a monitorização cuidadosa de culturas individuais. A heterogeneidade baseada em doadores inclui o número de hMPCs obtidos de cada biópsia, seu tempo para iniciar a proliferação in vitro e sua taxa de expansão populacional. Conseqüentemente, se as diferenças na formação do formação após um tratamento forem a pergunta do indivíduo do interesse, as culturas de hmpc devem ser comutadas ao tratamento baseado em um nível da confluência determinada a priori e avaliada objetiva usando o cytometer da imagem latente.
Nosso método para isolar e hMPCs da cultura foi aperfeiçoado para obter rendimentos das pilhas nos milhões para experimentos in vitro do tecido começando relativamente pequeno da biópsia (50 − 100 MGS). O benefício principal desta aproximação é que os ensaios e os experimentos múltiplos podem ser executados em hMPCs do mesmo doador, permitindo a manutenção do phenotype do doador através dos experimentos ao introduzir a variabilidade interexperimental pequena. Nosso método difere dos métodos recentemente publicados que focalizam em extrair a população a mais pura de Pax7 que expressam pilhas diretamente fora do tecido da biópsia onde o foco é xenotransplante8. O desafio com estes métodos precedentes entretanto, é que exigem um peso começando do tecido de maior de um grama. Conseqüentemente, não são práticos para a pesquisa que envolve biópsias humanas do músculo esqueletal. Uma limitação do nosso método é que o potencial de xenotransplante não foi avaliado. No entanto, esse tipo de procedimento não foi um dos aplicativos originais a jusante pretendidos. Os sentidos futuros deste método podem incluir avaliar a capacidade do Engraftment de hMPCs, após ter submetido a nosso procedimento do isolamento, para determinar se há um potencial para o uso deste procedimento em estudos da transplantação do MPC.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem à Universidade de Cornell, centro de recursos de biotecnologia Imaging Facility por sua ajuda com a triagem de células ativadas por fluorescência. Agradecemos também Molly Gheller por sua ajuda com o recrutamento participante e Erica Bender para a realização das biópsias de músculo esquelético. Por fim, agradecemos aos participantes pelo seu tempo e participação no estudo. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de envelhecimento dos institutos nacionais de saúde o prêmio número R01AG058630 (para B.D.C. e A.E.T.), por uma Fundação Glenn para pesquisa médica e Federação Americana para o envelhecimento Research Grant para a faculdade Júnior (para B . D.C.), e pelo Conselho do Presidente para as mulheres de Cornell (para A.E.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels |
| 10 cm cell culture plate | VWR | 664160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352196 | 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols |
| 24 well cell culture plate | Grenier Bio-One | 662 160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Viability stain for identifying living cells during FACS sorting |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Conjugated antibody for FACS |
| Black 96-well cell culture plate | Grenier Bio-One | 655079 | 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S |
| Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Imaging cytometer used to track hMPC cultures | |
| Cell Strainer | VWR | 352350 | Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing |
| Collagen Type I (Rat Tail) | Corning | 354236 | Collagen for coating cell culture plates |
| Collagenase D | Roche | 11 088 882 001 | Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | WN182 | Used for cryopreservation of hMPCs |
| Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder | Gibco | 31600-034 | Low glucose DMEM for muscle biopsy processing |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 21600-010 | PBS for muscle biopsy processing |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | J.T. Baker | 4040-01 | Required for FACS buffer |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 89510-186 | Fetal bovine serum used for hMPC growth media |
| Ham's F12 | Gibco | 21700-026 | Base media for hMPCs |
| Heat Inactivated Equine Serum | Gibco | 26-050-070 | Horse serum used to make hMPC differentiation media |
| Hemocytometer | iNCyto | DHC-N0105 | Used to count cells |
| Hibernate A | Gibco | A1247501 | Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Life Technologies | H21492 | DNA stain for identifying all cells using the Celigo S |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Used for controlled rate freezing of hMPCs |
| Moxi buffer | Orflo | MXA006 | Buffer for automated cell counter |
| Moxi Cassettes | Orflo | MXC002 | Cassesttes for automated cell counter |
| Moxi z Mini Automated Cell Counter | Orflo | Automated cell counter | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Commerically available controlled rate cell freezing container |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Goat serum used in FACS buffer |
| PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Conjugated antibody for FACS |
| Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Corning | 30-002-CI | Antibiotics added to culture media |
| Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S |
| Recombinant Human basic fibroblast growth factor | Promega | G5071 | Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Gibco | 12648-010 | Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | Added to Ham's F12 |
| Sterile Round Bottom 5 mL tubes | VWR | 60818-565 | Tubes used for FACS |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Compensation beads fort calibrating flow FACS settings |
References
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