Isolasjon, kultur, karakterisering, og differensiering av Human Muscle stamceller fra skjelettmuskelen biopsi prosedyre

Summary

Vi presenterer teknikker for å isolere, dyrking, karakteriserer, og differensiere menneskelige primære muskel stamceller (hMPCs) innhentet fra skjelettlidelser muskel biopsi vev. hMPCs innhentet og preget gjennom disse metodene kan brukes til senere adresse forskning spørsmål knyttet til menneskelig myogenesis og skjelettlidelser muskel gjenfødelse.

Abstract

Bruken av primære menneskelige vev og celler er ideell for etterforskning av biologiske og fysiologiske prosesser som skjelettlidelser muskel regenererende prosessen. Det er anerkjente utfordringer for å arbeide med menneskelige primære voksne stamceller, spesielt menneskelige muskel stamceller (hMPCs) avledet fra skjelettlidelser muskel biopsier, inkludert lav celle utbytte fra samlet vev og en stor grad av giver heterogenitet av vekst og død parametre blant kulturer. Mens innlemme heterogenitet i eksperimentell design krever en større utvalgsstørrelse for å oppdage betydelige effekter, det gjør det også mulig for oss å identifisere mekanismer som ligger til grunn variasjon i hMPC ekspansjons kapasitet, og dermed gir oss mulighet til å bedre forstå heterogenitet i skjelettlidelser muskel gjenfødelse. Novel mekanismer som skiller ekspansjons kapasitet av kulturer har potensial til å føre til utvikling av terapier for å forbedre skjelettlidelser muskel gjenfødelse.

Introduction

Skjelettmuskel er den største organ system i menneskekroppen, sto for 30 − 40% av hele kroppen masse¹. I tillegg til sin godt anerkjente rolle i bevegelse, opprettholder Skjelettmuskel kroppstemperatur og holdning, og spiller en sentral rolle i hele kroppen næringsstoffer homeostase. Forskning som involverer menneskelige deltakere, dyr, og cellekultur modeller er alle verdifulle for å ta opp spørsmål knyttet til skjelettlidelser muskel biologi og regenerering. Isolering og kultur av menneskets primære muskel stamceller (hMPCs) gir en robust modell som gjør det mulig for cellekultur teknikker og manipulasjoner som skal brukes til menneskelige prøver. En fordel med å bruke hMPCs er at de beholder den genetiske og metabolske fenotype fra hver giver^2,3. Vedlikehold av giver fenotype gjør det mulig for forskere å undersøke forskjellene mellom individuelle variasjoner i myogenic prosessen. For eksempel har vi ansatt vår hMPC karakterisering metode for å identifisere alder-og sex-relaterte forskjeller i hMPC befolknings ekspansjon kapasitet⁴.

Formålet med denne protokollen er å detalj teknikker for å isolere, kultur, karakterisere, og differensiere hMPCs fra skjelettlidelser muskel biopsi vev. Bygger på tidligere arbeid som beskrev hMPCs og identifiserte potensielle celle overflate beslutningstakere for hMPC isolasjon^5,6, denne protokollen fyller en kritisk gap i kunnskap ved å knytte isolasjonen til karakterisering av hMPCs. Videre detaljerte trinn-for-trinn-instruksjoner inkludert i denne protokollen gjør hMPC isolasjon og karakterisering tilgjengelig for et bredt vitenskapelig publikum, inkludert de med begrenset tidligere erfaring med hMPCs. Vår protokoll er blant de første til å beskrive bruken av en tenkelig flowcytometer å spore celle populasjoner. Nydesignede Imaging cytometers er State-of-the-art, høy gjennomstrømming, og mikroplate-basert, slik at Live celle Imaging, celle telling, og flerkanals fluorescens analyse av alle celler i hver brønn av et kultur fartøy i løpet av minutter. Dette systemet gjør det mulig for rask kvantifisering av dynamiske endringer i spredning og levedyktighet av en hel celle befolkning med bare minimale avbrudd i kulturen. For eksempel, vi er i stand til å utføre objektive tiltak av samløpet på etterfølgende dager in vitro å bestemme vekst Kinetics av hver kultur avledet fra ulike givere. Mange protokoller i litteraturen, spesielt de som involverer differensiering av MPCs, krever celler for å nå et definert nivå av samløpet før initiering differensiering eller behandling⁷. Vår metode gir mulighet for objektiv bestemmelse av samløpet av hver brønn i et kultur fartøy som tillater forskere å initiere behandling i en upartisk, ikke-subjektiv måte.

I det siste, en stor begrensning av å bruke primære hMPCs var lav avkastning som begrenser antall celler tilgjengelig for eksperimenter. Vi og andre har vist utbyttet av MPCs fra skjelettlidelser muskel biopsi vev er 1 − 15 MPCs per milligram av vev (figur 1)⁸. Fordi vår protokoll tillater fire passasjer av cellene før rensing med fluorescens aktivert celle sortering (FACS), vår embryo hMPC gir, avledet fra små mengder av biopsi vev (50 − 100 mg), er tilstrekkelig til å ta opp forsknings mål der Det kreves flere eksperimenter. Vår FACS-protokoll produserer en ~ 80% ren (Pax7 positiv) MPC-befolkning, og derfor er vår protokoll optimalisert for både avkastning og renhet.

Protocol

Denne protokollen ble godkjent av den institusjonelle Review styret ved Cornell University. Alle deltakerne ble vist for underliggende helsemessige forhold og ga informert samtykke.

1. innhenting menneskelig muskel vev via skjelettmuskelen biopsi

1. Identifiser Vastus lateralis muskelen via palpasjon, anatomiske landemerker, og aktiv sammentrekning av muskelen.
2. Palpate den Vastus lateralis ved å ha deltakeren stramme sine quadriceps muskler og finne magen av muskelen, ca 1/3 av veien fra patella til hoften, og bare ventrolateral til femur.
3. Bruk et papir målebånd for å markere et område med en kirurgisk markør ca 4 − 6 inches fra toppen av patella representerer magen på muskelen.
4. Barbere noen hår i nærheten av det markerte området og deretter rense med en kirurgisk karakter antiseptisk som brukes før medisinske prosedyrer (for eksempel: 2% klorheksidin gluconate (CHG)/70% isopropylalkohol alkohol (IPA)).
5. Bedøve biopsi området med 1% lidokain.
   Merk: Unngå å injisere lidokain i skjelettmuskelen.
6. Lag en 4 − 5 mm snitt sti på det markerte stedet.
7. Etter at området er anesthetized, trykk en Bergstrom nål med trokaren gjennom konseptet inn i magen av muskelen (ca 2 − 3 cm).
8. Trekk muskelvevet inn i Bergstrom nålen ved å trekke ut skjære trokaren 2 − 3 cm mens en assistent påfører sug ved å trekke et festet 60 mL sprøyte stempel.
9. Lukk skjære kammeret.
10. Roter bunnen av biopsi nålen en kvart sving og gjenta sekvensen av å åpne nålen, påføring av sug, og lukking nålen.
    Merk: Hver gang nålen er lukket, et kutt av muskel vev bør fås inne i Bergstrom nålen. Under prøvetaking, vil nålen forbli i låret i samme vertikale posisjon mens den roteres lengderetningen gjennom 360 ° for å få hver prøve. Denne sekvensen kan gjentas 3 − 4 ganger.
11. Utvise den innsamlede biopsi vev fra nålen inn i en steril nonadherent dressing pad.
12. Undersøk vevet og fjern eventuelle synlige fettstoffer og antifibrotiske vev ved hjelp av sterile skalpell kniver eller pinsett.
13. Plasser en del (50 − 100 mg) av vevet i et sterilt rør som inneholder CO₂-Independent nærings medium (f. eks Hibernate a).
    Merk: Vekten av vevet bestemmes som følger. Først plasserer avkortet rør som inneholder nærings medium på en skala og tare. Neste sted vevet inn i røret, gjenerobre røret, og deretter veie røret som inneholder vevet i nærings medium.
14. Oppbevar røret som inneholder vevet og nærings middelet ved 4 ° c til behandling.
    Merk: Biopsi vev bør behandles innen 48 h av samlingen.

2. isolere Human Muscle stamceller fra biopsi tissue

1. Hakke biopsi vev.
   1. Overfør muskel vev fra næringsstoffet medium til en steril Petri parabolen i en biologisk sikkerhetskabinett eller lignende steril arbeidsplass.
   2. Bruk sterile skalpell blader for å hakke vev i ~ 1 mm³ stk.
2. Vask hakket biopsi vev for å fjerne rester av rusk.
   1. Overfør muskelvevet inn i et 15 mL konisk rør som inneholder 10 mL fosfat-bufret saltvann (PBS) og la vevet bosette seg via tyngdekraften.
   2. Aspirer supernatanten være forsiktig med å forstyrre muskel vev.
   3. Tilsett 10 mL PBS til vasket vev og la muskel vev å omplassere via tyngdekraften.
   4. Aspirer supernatanten være forsiktig med å forstyrre muskel vev.
   5. Tilsett 10 mL lav glukose Dulbecco ' s modifiserte Eagle medium (DMEM) og la vevet omplassere via tyngdekraften.
   6. Aspirer supernatanten være forsiktig med å forstyrre muskel vev.
3. Ruge vevet i fordøye Media.
   1. Resuspend muskel vev i 3 mL Digest Media (2 mg/mL kollagenase D i lavt glukose DMEM).
      Merk: Kollagenase D lager løsninger kan tilberedes ved 20 mg/mL i DMEM med lavt glukose og oppbevares ved-80 ° c, og deretter fortynnes 1:10 i lavt glukose DMEM ved brukstid.
   2. Ruge røret som inneholder muskelvevet i et vannbad ved 37 ° c i 30 min.
   3. Triturate muskel vev suspensjonen hver 10 min ved hjelp av en 10 mL serologisk pipette eller en bred bore pipette.
   4. Tilsett 83 μL av ytterligere fordøye medier og 24 μL av dispase oppløsning (0,76 mM kalsium acetate, 1,39 mM natrium acetate, 13,91 mg/mL dispase II i lavt glukose DMEM). Tilbake suspensjonen til 37 ° c vannbad.
   5. Triturate muskel vev suspensjonen hver 5 − 10 min med en bred bore Pipet tupp.
   6. Fortsett trituration til en ensartet slurry er oppnådd, og ikke lenger enn 1,5 h for å hindre over fordøyelsen.
      Merk: Tilstrekkelig hakking av vevet og enzymatisk aktivitet av kollagenase og dispase kan påvirke prøve fordøyelsen. En ensartet slurry skal kunne passere gjennom en normal pipette spissen med minimal okklusjon etter 1,5 h. Hvis en ensartet slurry ikke oppnås etter 1,5 h, Dobbeltsjekk at vevet hakking er tilstrekkelig, og vevet er hakket til riktig størrelse (trinn 2.1.2). I tillegg bør aktiviteten av enzymer testes så mye til mye variasjon i enzymatisk aktivitet oppstår.
4. Pellet celler og fryse i gjenopprettingsmedier.
   1. Tilsett 6 mL vekst medier (GM; 79% ham er F12, 20% Foster storfe serum, 1% penicillin/Streptomycin, 5 ng/mL grunnleggende Fibroblast vekstfaktor [bFGF], pH 7,4, passerte gjennom en 0,22 μm filter) til muskel slurry.
   2. Pipetter suspensjonen gjennom en 70 μm celle sil inn i en 50 mL konisk rør. Skyll sil med ytterligere 4 mL GM.
      Merk: Sample kan overføres tilbake til en 15 mL konisk rør for enkel visualisering av pellet. Et større vaske volum kan brukes hvis påfølgende celle gir er lav.
   3. Sentrifuger ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur (RT).
   4. Aspirer supernatanten er sikker på ikke å forstyrre pellet. Knips røret for å resuspend pellet i de resterende mediene. Hvis cellene ikke kommer til å bli kultivert umiddelbart videre til trinn 2.4.5 for instruksjoner om langsiktig lagring, ellers går du til trinn 3.1.6.
      Merk: Hvis umiddelbar kultur er ønskelig, GM i cellekultur plater bør være pre-inkubert (trinn 3.1.1 og 3.1.2) før biopsi behandlingen begynner.
   5. Tilsett 1,5 mL gjenopprettings cellekultur fryse medium (tabell av materialer) til den gjenopprettede pellet.
   6. Overfør slurry til en cryovial. Plasser cryovial i en isopropanol hastighets kjøler over natten ved-80 ° c. Store cryovial ved-80 ° c til klar for kultur.
      Merk: Cryovials som inneholder slurry kan oppbevares i flytende nitrogen for langtidslagring (større enn 1 måned). Ved hjelp av en isopropanol-kontrollerte rate chiller kan cellene skal reproduserbar frosset med en hastighet på 1 ° c/min resulterer i optimal celle utvinning priser som dokumentert av levedyktighet etter fryse og økt sannsynlighet for vedlegg til cellekultur fartøy⁹. Alternativt kan et beger som inneholder RT-isopropanol, plassert i en-80 ° c fryser, brukes.

3. dyrking Human Muscle stamceller

1. Tin den muskel slurry.
   1. Før tine og seeding hMPCs, pre-likevekt cellekultur plater i GM. Tilsett 250 μL av GM til 4 brønner av en kollagen-belagt (kollagen I), 24-brønn cellekultur plate. Fyll de resterende brønnene med 500 μL av sterile base medier (dvs. F12) for å hindre fordampning under lang tids kultur.
      Merk: For biopsier mellom 50 g og 100 g, fire brønner av en 24-brønn plate er hensiktsmessig. Hvis biopsi vevet er mindre enn 50 g, to brønner kan være mer hensiktsmessig. Rester av rusk og lavt celle tall hindrer bruk av en celle tellings teknikk på dette trinnet; Derfor er den eksakte seeding tettheten ikke bestemmes og varierer litt fra biopsi til biopsi.
   2. Ruge cellekultur fartøy med GM ved 37 ° c i 5% CO₂ for 1 time før seeding.
   3. Fjern cryovials fra-80 ° c fryseren og plasser i et vannbad på 37 ° c; væsken i røret skal være helt neddykket i vann.
   4. Når tine er nesten ferdig (~ 5 min), overføre cryovial til en steril laminær Flow hette. Overfør muskel slurry ut av cryovial røret og Legg til en 15 mL konisk rør som inneholder 6 mL pre-varmet GM med en hastighet på 1 mL/min.
   5. Sentrifuger den muskel slurry på 300 x g for 5 min på RT.
      Merk: En svingende bøtte sentrifuger kan gjøre det lettere å visualisere små pellets på dette trinnet, men er ikke avgjørende.
   6. Aspirer supernatanten er sikker på ikke å forstyrre pellet. Flick røret å resuspend pellet i de resterende mediene og resuspend i 1 mL GM.
   7. Overføring 250 μL av resuspendert pellet (nå betraktet som en hMPC suspensjon) til hver av de 4 brønner av pre-inkubert 24-brønn cellekultur plate.
2. Kultur og passasje hMPCs.
   1. Opprettholde hMPC kulturer i GM ved 37 ° c i 5% CO₂.
      Merk: Aksjer i GM uten bFGF (dvs. F12, antibiotika, FBS) er utarbeidet i grupper og oppbevares ved 4 ° c i opptil 2 uker. bFGF legges til GM på dagen for bruk. Medier som inneholder bFGF kan lagres for 48 t ved 4 ° c.
   2. Tjuefire timer etter isolasjon, aspirer GM, forsiktig vaske kulturen fartøyet 2x med pre-varmet GM, og legge friske GM.
      Merk: 24 h skal gi hMPCs tilstrekkelig tid til å feste; ingen hMPCs bør fjernes etter vask. Dette trinnet vil også fjerne gjenværende rusk som ble generert under celle innhøstingen, noe som gjør fartøyet mer mottagelig for nøyaktige samløpet skanning ved hjelp av en tenkelig flowcytometer (§ 5 nedenfor). Etter denne første Media endringen, er GM endret hver 48 h.
   3. Passage hMPCs når 70% samløpet er oppnådd, eller når de har vært på samme kultur parabolen i 10 dager, avhengig av hva som skjer først.
      Merk: 70% samløpet er ca 55 000 celler/cm².
   4. Til passasje, tilsett 250 μL av pre-varmet Trypsin til hver brønn av en 24-brønn cellekultur plate og ruge for ~ 5 min.
   5. Trykk på cellekultur fartøyet på en fast overflate for å løsne hMPCs. Et lett mikroskop kan brukes til å verifisere at hMPCs har løsnet.
   6. Overfør Trypsin/hMPC suspensjoner til 5 mL GM i et 15 mL konisk rør.
   7. Sentrifuger hMPC-fjæringen på 300 x g i 5 min ved RT.
   8. Fjern hMPC suspensjoner fra sentrifuge og sted på isen i den sterile laminær Flow Hood.
      Merk: Holde hMPCs på isen under bestått resultater i mindre celle aggregering.
   9. Aspirer supernatanten fra hMPCs og forsiktig resuspend pellet i 1 mL GM.
   10. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer eller en automatisert celle teller.
       Merk: En 1:5 fortynning av celle suspensjon til celle telling buffer er generelt hensiktsmessig.
   11. Seed hMPCs på kollagen-belagt kultur retter som inneholder forvarmet GM i en tetthet på 3 500 celler per cm². En kombinasjon av 10 cm plater og 24-brønn plater er ideelt. De 24-brønn platene kan skannes daglig på en bilde flowcytometer for å overvåke vekst.
   12. Følg samme fremgangsmåte (starter ved trinn 3.2.4.) for etterfølgende avsnitt.
       Merk: Cell Helse og renhet kan overvåkes på tvers av passasjer ved hjelp av en markør av cellulære senescence (f. eks, β-galaktosidase) og immunostaining for Pax7.
3. Lagre nedfryste hMPCs.
   1. Lagre nedfryste overflødige celler for senere bruk for å gjøre kultur volumet mer håndterlig.
   2. For kryonisk bevaring, følg trypsinization prosedyren beskrevet i trinn 3.2.4.-3.2.9.
   3. Mens celle fjæringen blir sentrifugert, klargjør du en blanding av 20% (f.eks. 200 μL) dimethyl sulfoxide (DMSO) og 80% (f.eks. 800 μL) GM. Pipetter opp og ned 20x for å sikre tilstrekkelig miksing. La blandingen til å hvile på isen.
   4. Basert på celle tall, fortynne hMPC suspensjon til 2 x 10⁶/ml i GM.
   5. Kombiner hMPC suspensjon og 20% sterile DMSO/80% GM blanding 50/50. Den endelige kryonisk bevaring Media er en kombinasjon av DMSO (10%) og GM (90%) inneholder 1 x 10⁶ HMPCs/ml.
   6. Plasser 1 mL av hMPC-fjæringen som er klargjort i trinn 3.3.5 inn i så mange cryovials som det første celle antallet tillater. Deretter plasserer aliquoted hMPCs i en isopropanol-kontrollert hastighet chiller i en-80 ° c fryser over natten.
      Merk: På dette trinnet oppnås vanligvis mellom 5 og 15 000 000 celler, 30 − 60% av disse identifiseres som hMPCs av FACS.

4. isolere Pax7⁺ menneskelige muskel stamceller via Flow flowcytometri

1. For å forberede hMPCs fra levende kulturer (trinn 3.2.11), trypsinize nok kultur fartøy for 1 x 10⁶− 2 x 10⁶ totalt celler. Klargjør celle suspensjoner som beskrevet i trinn 3.2.4 − 3.2.9.
2. Forbered hMPCs fra embryo kulturer (trinn 2.4.6 eller 3.3.6).
   1. Velg 1 − 2 rør som inneholder ~ 1 x 10⁶ Passage fire hMPCs for hver giver.
      Merk: Bruke passasje fire hMPCs gir tilstrekkelig celle yield samtidig opprettholde proliferativ potensial til passasje seks (figur 2).
   2. Tine raskt celler ved å fjerne dem fra-80 ° c fryseren og plassere dem i en 37 ° c vannbad med væsken i røret helt neddykket.
   3. Når tine er nesten komplett (~ 5 min), overføre hMPCs til en steril laminær Flow hette og overføre innholdet i cellen suspensjon i 6 mL pre-varmet GM i en 15 mL konisk rør med en hastighet på 1 mL/min.
   4. Klargjør celle suspensjoner som beskrevet i trinn 3.2.7 − 3.2.9.
   5. Resuspend hver pellet i 3 mL FACS buffer (500 mL PBS, 12,5 mL normal geit serum, 2 mL 0,5 M EDTA, pH 7,4, passerte gjennom et 0,22 μm filter).
   6. Sentrifuger celle fjæringen på 300 x g i 5 min ved RT.
   7. Aspirer supernatanten fra hMPCs og forsiktig resuspend pellet i 250 μL av FACS buffer; plass på isen.
   8. Plasser 100 μL av celler i et 1,7 mL mikrosentrifugen rør og la på isen brukes som levende/døde kontroller (trinn 4.5.1).
      Merk: 100 UL av celler som skal brukes til live/Dead kontroller kan komme fra å ta et lite volum (~ 20 UL) av resuspendert celler fra hver giver til å bli sortert eller fra en datacelle.
      Merk: det er viktig å ikke ta mer enn 20 UL av resuspendert celler fra en enkelt donor. Bring volum opp til 100 UL med FACS buffer hvis < 100 UL av celler er tilgjengelig.
3. Stain hMPCs for celleoverflaten markører.
   1. Forbered følgende antistoff cocktail (beløpene som vises er for hver kultur, Skaler opp på riktig måte): 5 μL CD56 (nevrale celle vedheft molekyl [NCAM]; PE-Cy7-bøyd) og 5 μL CD29 (β1-integrin; AlexFluor488-bøyd). Den endelige antistoff fortynning er 1:50.
   2. Tilsett 10 μL av antistoff cocktail til hver hMPC suspensjon og ruge på isen i 30 minutter i mørket.
   3. Tilsett 10 mL FACS buffer til hver suspensjon/antistoff cocktail blanding.
   4. Sentrifuger hvert rør på 300 x g for 5 min ved RT.
   5. Resuspend av pellet i 300 μL av FACS buffer og overføre til en 5 mL rund bunn polystyren tube.
   6. Hold suspensjonen på is og beskyttet mot lys.
4. Forbered kompensasjon perler.
   Merk: positive kontroller for hvert antistoff og en negativ kontroll (unstained perler) bør tilberedes ved hjelp av kompensasjon perler. Kompensasjons perle kontroller bør kjøres på flyt flowcytometer før prøvene som skal sorteres. Disse kontrollene gir mulighet for bestemmelse av hvor mye fluorokromkonjugert fra hvert antistoff kan oppdages i den andre kanalen, slik at kompensasjon kan anvendes.
   1. Vortex kompensasjon perler.
   2. I tre 1,7 mL mikrosentrifugen rør, tilsett en dråpe (50 μL) av kompensasjons perler.
   3. Tilsett 1 μL av hvert antistoff i riktig rør, eller ingen til negativ kontroll.
   4. Ruge i mørket i 15 min.
   5. Tilsett 1,5 mL FACS buffer til hvert rør og Vortex.
   6. Sentrifuger hvert rør på 300 x g i en stasjonære sentrifuge for 5 min ved RT.
   7. Aspirer supernatanten og resuspend pellets i 200 til μL av FACS buffer.
      Merk: Pellet kan være svært vanskelig å visualisere; forsiktighet bør utvises ved aspirating av supernatanten.
   8. Plasser suspensjonen i en 5 mL rund bunn polystyren tube og deretter holde røret på is og beskyttet mot lys.
5. Forbered levende og døde kontroller.
   1. Del 100 μL av hMPCs fra trinn 4.2.8 i to 1,7 mL mikrosentrifugen rør (en for Live kontroll og en for den døde kontroll).
   2. Plasser det døde kontroll røret i en varme blokk forvarmet til 70 ° c i > 10 min. I løpet av denne tiden, holde live kontroll på isen.
   3. Sentrifuger hvert rør på 300 x g i en stasjonære sentrifuge for 5 min ved RT.
   4. Aspirer supernatanten og resuspend pellets i 150 til μL av FACS buffer.
   5. Kombiner Live/Dead kontroller i en enkelt 5 mL rund bunn polystyren tube.
6. Utfør farging av levedyktighet.
   1. Tilsett 1 μL av 7-aminoactinomycin D (7-AAD) til alle rør som inneholder celler som skal sorteres og live/Dead kontroll.
   2. Legg GM til kollagen-belagt 24-brønn (250 μL/brønn) og 10 cm (8 mL/brønn) plater og la det likevekt i en cellekultur inkubator ved 37 ° c i 5% CO₂.
7. Sorter hMPCs via Flow-flowcytometri.
   1. Sorter hMPCs på en strømnings flowcytometer med 100 μm munnstykke ved et trykk på 20 PSI. Bestem Live hMPCS basert på side og videresende scatter samt 7-AAD negativitet (sortering parametere og en representativ sortere kan sees i Figur 3).
   2. Celler positive for PE-Cy7 (780/60 nm) og AlexFluor488 (530/30 NM) representerer CD56⁺/CD29⁺ celler og dermed er Pax7 positive celler (hMPCs). Sorter doble positive celler i oppsamlings rør som inneholder en 300 μL pute av FACS buffer.
      Merk: Renheten av sorterte kulturer kan bestemmes av immunostaining for Pax7 etterfulgt av nedstrøms Flow flowcytometri analyse (Figur 4).
   3. Forkast alle andre celler.
   4. Overfør de sorterte cellene til et 15 mL konisk rør.
   5. Snurr hMPC-fjæringen på 300 x g i 5 minutter ved RT.
   6. Forsiktig aspirer supernatanten og resuspend i 1 mL GM.
   7. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer eller en automatisert celle teller.
      Merk: Mens antall celler kan utledes som antall hendelser som er positivt sortert, har dette antallet blitt funnet å overvurdere antall celler med 10 − 40% sammenlignet med tradisjonelle celle telling metoder.
   8. Seed hMPCs som beskrevet i trinn 3.2.11.
      Merk: Verifisering av renheten av hMPC befolkning kan bestemmes av immunostaining for Pax7 og analyse via Flow flowcytometri.

5. karakteriserer Human Muscle Stamcelle (hMPC) kulturer bruke en Imaging Flowcytometer

1. Bruk Imaging-flowcytometer (innholdsfortegnelsen) til å utføre samløpet skanninger.
   1. Velg Opprett ny skanning , og angi/Velg deretter plate Kategori, plate profil og plate-ID. Bilde flowcytometer kan romme 96, 24 og 6 brønn plater.
   2. Under program, velg Confluence > Confluence 1.
   3. Velg en brønn for å vise ved hjelp av navigatøren til høyre på skjermen.
   4. Finn et fly av fokus der cellene vises hvitt i forhold til bakgrunnen og velg Registrer manuell eller la Imaging flowcytometer å velge flyet av fokus ved å velge Registrer Auto.
      Merk: For 96 brønn platene som foreslås i materialfortegnelsen, er en omtrentlig posisjon 4,3 enheter.
   5. Bruk musen til å utheve alle brønner som må skannes. Hele brønn området blir automatisk skannet. Velg Start skanning.
   6. Velg analyse innstillinger som er optimale for plate-og celle type.
      Merk: For hMPCs, følgende innstillinger er optimale: intensitet = 6, mettet intensitet = 0, diameter = 8, minimum tykkelse = 3, min klyngestørrelse = 500, og presisjon = høy.
   7. Velg Start analyse.
      Merk: Inspiser bilder visuelt for å sikre at brukeren og bilde flowcytometer er enige om omkretsen av cellene. Hvis det finnes et stort avvik, skanner du platen på nytt med et annet fokusplan eller ulike analyse innstillinger. Confluence skanning kan brukes til å sammenligne vekst mellom kulturer, tid administrasjonen av en behandling, eller å overvåke celler og bestemme når man skal initiere differensiering. Hvis du ønsker differensiering, finner du detaljer i avsnitt 6.
2. Bruk bilde flowcytometer til å telle celler.
   1. Forbered en farge løsning som inneholder 12 mL av ham ' s F12, 6 μL av Hoechst 33342 og 24 μL av propidium iodide.
   2. Aspirer Media og erstatte med farging løsning, ruge ved 37 ° c i 15 min.
   3. Aspirer farging løsning og erstatte med ham er F12.
      Merk: Det er viktig å bruke et medium med lave nivåer av fenol rødt for å få klare bilder. Alternativt kan PBS brukes.
   4. Legg platen på bilde flowcytometer og under påføring, velg celle levedyktighet ≫ Live + Dead + total. Live kanalen vil være et lyst felt bilde, den døde kanalen vil være propidium iodide, og den totale kanalen vil være Hoechst 33342.
   5. Sett Live Channel til lyse feltet og klikk Registrer Auto under Focus oppsett.
   6. Under den totale kanalen setter du kanalen til blå. Bruk Finn fokus for å få kjernene i fokus, eller bruk opp-og ned-pilene til å sette fokus manuelt. Klikk Angi forskyvning for å velge fokus.
   7. Under den døde kanalen setter du kanalen til rød. Bruk Finn fokus for å få de døde cellene i fokus, eller bruk opp-og ned-pilene til å sette fokus manuelt. Klikk Angi forskyvning for å velge fokus.
   8. Velg Start skanning for å starte skanningen.
   9. Velg analyse parametere som passer for plate-og celletypen. Velg Start analyse for å starte analysen. Etter at analysen er fullført, visuelt kontrollere at analysen er riktig telling celler (for eksempel for den totale kanalen kontrollere at hver kjerne blir anerkjent som en kjerne, og at Imaging flowcytometer ikke teller noen flekker i bakgrunnen som kjerner). Hvis skanningen og analysen er tilfredsstillende, returnere platen til inkubator, ellers skanne eller endre analyse parametere.

6. differensiere Human Muscle stamceller (hMPCs) til Myotubes

1. Bestem hMPC samløpet ved hjelp av protokollen i § 5,1. For å differensiere hMPCs til myotubes, er det ideelt for celler å være 80 − 85% confluent som bestemmes av samløpet funksjonen på Imaging flowcytometer (se pkt. 5). Hvis hMPCs fra mer enn én unik donor brukes, gjør samløpet skanning celler fra ulike givere til å begynne differensiering på det tidspunkt de når samløpet.
   Merk: På 80% samløpet, er det ca 66 000 celler/cm².
2. Vask celler 2x med differensiering Media (97% ham er F12, 2% equine serum, 1% penicillin/Streptomycin, pH 7,4, passerte gjennom et 0,22 μm filter).
3. Oppretthold celler i differensiering så lenge eksperimentet tilsier mens du bytter Media daglig.
4. Direkte vurdere myotube formasjon ved immunostaining for embryonale myosin tunge kjeden, som vanligvis oppdages etter 7 − 10 dager med differensiering.
   Merk: Tiden som kreves for å danne myotubes kan variere noe avhengig av donor og antall celler når differensiering ble initiert; Derfor anbefales det at kulturer fra hver donor overvåkes individuelt.

Representative Results

Representative Flow flowcytometri resultatene av hMPC isolering fra humant muskel vev kan sees i figur 1. hMPCs kan identifiseres ved første gating hendelser basert på side scatter og videresende scatter for å eliminere døde celler eller rusk, etterfulgt av å velge bare celler som er negative for 7-AAD og derfor er levedyktig. Valg av celler positive for både celleoverflaten markører CD56 og CD29 representerer hMPC befolkningen. En biopsi på 60 mg gir bare ca 75 − 250 hMPCs.

En representativ samløpet skanning er vist i figur 2a. De grønne konturene i figur 2b ble generert av bilde flowcytometer og viser hvordan bilde flowcytometer bestemte samløpet basert på de valgte analyse innstillingene. I begge bildene som vises, samløpet bestemmes av Imaging flowcytometer enig med samløpet visuelt bestemmes av brukeren. Imidlertid, disse profilen likeledes høydepunkt det det tenkelig flowcytometer er ikke perfekt. Den røde pilen uthever for eksempel en ufullkommenhet i platen som telles som celler. Hvis et stort antall av disse ufullkommenhet er til stede på tallerkenen, vil den resulterende samløpet ikke nøyaktig representere samløpet av cellene. Figur 2C viser en representasjon av alle tre kanalene som brukes til å telle celler (brightfield, blå og rød) og det sammenslåtte bildet. Figur 2D viser heterogenitet mellom donorer. Å oppdage og nøyaktig karakteriserer denne heterogenitet er en viktig anvendelse av bilde flowcytometer. Figur 2e viser at samløpet målinger og kjerner teller fra unike givere er svært korrelert.

Figur 3 inneholder en retningslinje for hvordan du identifiserer hMPCs basert på FACS-prosedyren som er beskrevet i denne protokollen. Gating basert på fremover og side scatter gir mulighet for separasjon av levedyktige celler fra rusk (figur 3a). En sammenligning av frem-punktdiagram etter høyde for å videresende punktdiagram etter område ble brukt til å skille mellom hendelser som representerer enkeltceller (boks området i figur 3b). Levedyktige celler er preget av mangel på innlemmelse av levedyktighet flekken 7-AAD (figur 3c). Til slutt identifiseres celler som er positive for både CD56 og CD29, som hMPCs (figur 3D). For å validere FACS-prosedyren som er beskrevet i denne protokollen, kan valget av Pax7 positive celler bestemmes av immunostaining celler med et Pax7-spesifikt antistoff og måle uttrykk på en strømnings flowcytometer. Figur 4 sammenligner antall hMPCs som avgjør ved Pax7 Immunostaining (figur 4a) kontra FACS-prosedyren (figur 4b) som er beskrevet i denne protokollen fra samme populasjon av celler. Figur 5 bruker Pax7 immunostaining og analyse via Flow flowcytometri å vise berikelse av Pax7 uttrykker celler i den totale BEFOLKNINGEN etter FACS (figur 5a i forhold til figur 5B) samt vedlikehold av antall Pax7 å uttrykke celler etter passaging (figur 5B sammenlignet med figur 5c).

hMPCs kan skilles for å danne myotubes ved å følge avsnitt 6. For å finne ut om isolerte hMPCs opprettholder myogenic kapasitets celler kan immunostained med et antistoff spesifikt for embryonale myosin tung kjede og visualisere ved hjelp av fluorescerende mikroskopi. Representative bilder av embryonale myosin tunge kjeden positive myotubes kan sees i figur 6.

Figur 1 : Representative Flow flowcytometri bilder for hMPCs sortert direkte ut av muskel biopsi vev. (A) side XY-område (y-akse) i forhold til frem spredningsområde (x-akse) gating strategi som brukes til å identifisere alle celler i et donor utvalg. (B) 7-AAD levedyktighet flekken (y-aksen) vs fremover scatter (x-aksen) for å identifisere levende celler. (C) negativ markering sortering markør profil (-CD11b,-CD31,-CD45,-GlyA [y-akse]) vs. valg markør CD34. (D) negativt markeringsmerke CD34 (y-akse) kontra det positive MARKERINGS merket CD29. E Positivt markeringsmerke CD56 (y-akse) vs. det positive markerings merket CD29 (x-aksen). F Gir fra tre forskjellige Skjelettmuskel biopsier. FSC = fremover scatter; SSC = side scatter; hMPCs, menneskelige muskel stamceller.

Figur 2 : Proliferativ potensiale av hMPCs avledet fra menneskelige donorer opprettholdes etter 6 passasjer. (A) Representative samløpet skanning. (B) representative samløpet skanning med grønne konturer som viser hvordan Imaging flowcytometer bestemmes samløpet. Den røde pilen viser en ufullkommenhet på tallerkenen. (C) representative Brightfield, Hoechst 33342 (blå) og propidium iodide (rød) farging og et flettet bilde av disse tre kanalene. Skala bars = mm. (D) kjerner teller fra 6 unike donorer fremhever hMPC heterogenitet. (E) samløpet og kjerner teller er svært korrelert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 : Representant flyt flowcytometri sorteringsparametere for hMPC-isolering. (A) side XY-område (y-akse) i forhold til frem spredningsområde (x-akse) gating strategi som brukes til å identifisere alle celler i et donor utvalg. (B) Forward scatter høyde (y-akse) vs. fremover scatter området (x-aksen) for å diskvalifisere doublets fra sorterings populasjonen. (C) Forward scatter høyde (y-akse) vs. 7-AAD innlemmelse å identifisere levedyktige celler. (D) PE-CY7 (CD56) vs. AF488 (CD29) farging med Q2 representerer doble positive celler (hMPCs). Farge representerer tettheten av hendelser.

Figur 4 : Sammenligning av CD29/CD56 positivitet kontra Pax7 positivitet i passasje 4 hMPCs fra samme donor. (A) Count (y-akse) vs. Pax7 uttrykk (x-akse). B Positivt markeringsmerke CD56 (y-akse) vs. positivt markeringsmerke CD29 (x-akse). NCAM = nevrale celle vedheft molekyl; hMPC = den menneskelige muskel Stamcelle.

Figur 5 : Pax7 positivitet opprettholdes i hMPCs avledet fra samme donor over flere passasjer. (A) Pax7 uttrykk (x-akse) av celler som hadde blitt passert 4 ganger før FACS sortering. (B) Pax7 Expression (x-aksen) av hMPCs 1 PASSASJE etter FACS sortering for CD29 og CD56 positivitet (5 totalt passasjer). (C) Pax7 uttrykk (x-aksen) av hMPCs 2 passasjer etter FACS sortering for CD29 og CD56 positivitet (6 totalt passasjer).

Figur 6 : Farging av hMPC avledet myotubes for embryonale myosin tunge kjeden. Representative mikroskopiske bilder av differensiert hMPCs co-beiset med DNA flekk (Hoechst 33342, blå) og embryonale myosin tunge kjeden (grønn) (n = 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Primær hMPCs er en viktig forsknings modell som brukes til å forstå Skjelettmuskel biologi og regenererende prosessen. I tillegg har hMPCs potensial til å bli brukt til terapi. Imidlertid, der er annerkjent angripe inne benytter primære hMPCs for begge to forskning og terapi, inkluderer det begrenset forståelse av celler avledet fra Human¹⁰. Det er også en stor grad av variasjon i Utvidelses kapasiteten blant donor kulturer, som begrenser potensialet for bruk av hMPCs og kan påvirke forskningsresultater¹¹. For eksempel har det nylig blitt demonstrert at hMPCs isolert ved hjelp av metoden beskrevet i denne protokollen produserte celler som varierte i Utvidelses kapasitet og dette var drevet av transcriptional profil som ikke samsvarer med kjønn eller¹¹år.

Her presenterer vi en effektiv og høy avkastning metode for å isolere hMPCs i tilstrekkelige mengder for en rekke nedstrøms applikasjoner, inkludert differensiering i myotubes, og dermed modellering av myogenic prosessen in vitro. Vår metode er avhengig av FACS å isolere CD56⁺/CD29⁺ celler, som tidligere har blitt identifisert som representerer en beriket Pax7 uttrykke befolkning¹². Andre like gyldige celle sorterings strategier har også blitt beskrevet^5,6.

Det viktigste aspektet ved vår hMPC isolasjon og kultur metode er nøye overvåking av individuelle kulturer. Den donor-baserte heterogenitet inkluderer antall hMPCs innhentet fra hver biopsi, deres tid til å initiere spredning in vitro, og deres befolknings ekspansjon rate. Derfor, hvis forskjeller i myotube formasjon etter en behandling er spørsmålet om interesse individuelle, hMPC kulturer bør byttes til behandling basert på samløpet nivå bestemmes a priori og vurderes objektivt ved hjelp av Imaging flowcytometer.

Vår metode for å isolere og kultur hMPCs har blitt optimalisert for å oppnå utbytte av celler i millioner for in vitro eksperimenter fra relativt lite Start biopsi vev (50 − 100 mg). Den store fordelen med denne tilnærmingen er at flere analyser og eksperimenter kan utføres på hMPCs fra samme giver, noe som åpner for vedlikehold av giver fenotype på tvers av eksperimenter, samtidig som det innfører lite variasjon i eksperimentet. Vår metode er forskjellig fra nylig publiserte metoder som fokuserer på å utvinne den reneste befolkningen i Pax7 uttrykke celler direkte ut av biopsi vev hvor fokuset er xenotransplantation⁸. Utfordringen med disse tidligere metodene er imidlertid at de krever en start vev vekt på større enn ett gram. Derfor er de ikke praktisk for forskning som involverer menneskelige Skjelettmuskel biopsier. En begrensning av vår metode er at potensialet for xenotransplantation ikke har blitt vurdert. Men denne type prosedyre var ikke en av de opprinnelige ment nedstrøms applikasjoner. Fremtidige retninger av denne metoden kan omfatte vurdering av engraftment kapasitet hMPCs, etter gjennomgår vår isolasjon prosedyre, for å avgjøre om det er potensial for bruk av denne prosedyren i MPC transplantasjon studier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-Cl	Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate	VWR	664160	Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube	Falcon	352196	15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate	Grenier Bio-One	662 160	Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution	eBioscience	00-6993-50	Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16	BioLegend	303016	Conjugated antibody for FACS
Black 96-well cell culture plate	Grenier Bio-One	655079	96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S	Nexcelcom Bioscience		Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer	VWR	352350	Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail)	Corning	354236	Collagen for coating cell culture plates
Collagenase D	Roche	11 088 882 001	Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide	VWR	WN182	Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II	Sigma Life Sciences	D4693	A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder	Gibco	31600-034	Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	21600-010	PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate	J.T. Baker	4040-01	Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum	VWR	89510-186	Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12	Gibco	21700-026	Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum	Gibco	26-050-070	Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer	iNCyto	DHC-N0105	Used to count cells
Hibernate A	Gibco	A1247501	Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate	Life Technologies	H21492	DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P-4	Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer	Orflo	MXA006	Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes	Orflo	MXC002	Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter	Orflo		Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50062Z	Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159	BD Pharmingen	557747	Conjugated antibody for FACS
Penicillin/Streptomycin 100x Solution	Corning	30-002-CI	Antibiotics added to culture media
Propidium iodide	Thermo Fisher Scientific	P3566	DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor	Promega	G5071	Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Gibco	12648-010	Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-3	Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes	VWR	60818-565	Tubes used for FACS
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42	Compensation beads fort calibrating flow FACS settings