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Developmental Biology

Isolement, culture, caractérisation et différenciation des cellules de l'ancêtre musculaire humain de la procédure de biopsie musculaire squelettique

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/59580
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 2, 1
1Division of Nutritional Sciences, Cornell University, 2Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons des techniques pour isoler, cultiver, caractériser, et différencier les cellules primaires humaines d'ancêtre de muscle (HMPCs) obtenues du tissu de biopsie de muscle squelettique. les HMPC obtenus et caractérisés par ces méthodes peuvent être utilisés pour aborder ultérieurement des questions de recherche liées à la myogenèse humaine et à la régénération des muscles squelettiques.

Abstract

L'utilisation des tissus et des cellules humaines primaires est idéale pour l'étude des processus biologiques et physiologiques tels que le processus de régénération de muscle squelettique. Il y a des défis reconnus à travailler avec les cellules souches adultes primaires humaines, en particulier les cellules progénitrices de muscle humain (HMPC) dérivées des biopsies squelettiques de muscle, y compris le faible rendement de cellules des tissus rassemblés et un grand degré d'hétérogénéité de distributeur de paramètres de croissance et de mort entre les cultures. Bien que l'intégration de l'hétérogénéité dans la conception expérimentale nécessite une plus grande taille d'échantillon pour détecter des effets significatifs, il nous permet également d'identifier les mécanismes qui sous-tendent la variabilité de la capacité d'expansion hMPC, et nous permet ainsi de mieux comprendre hétérogénéité dans la régénération des muscles squelettiques. De nouveaux mécanismes qui distinguent la capacité d'expansion des cultures ont le potentiel de conduire au développement de thérapies pour améliorer la régénération des muscles squelettiques.

Introduction

Le muscle squelettique est le plus grand système d'organes dans le corps humain, représentant 30-40% de la masse corporelle entière1. En plus de son rôle bien reconnu dans la locomotion, le muscle squelettique maintient la température et la posture du corps, et joue un rôle central dans l'homéostasie nutritive du corps entier. La recherche impliquant des participants humains, des animaux et des modèles de culture cellulaire est précieuse pour répondre aux questions relatives à la biologie et à la régénération des muscles squelettiques. L'isolement et la culture des cellules progénitrices musculaires primaires humaines (HMPC) fournit un modèle robuste qui permet d'appliquer des techniques de culture cellulaire et des manipulations sur des échantillons humains. Un avantage de l'utilisation de HMPCest est qu'ils conservent le phénotype génétique et métabolique de chaque donneur2,3. Le maintien du phénotype du donneur permet aux chercheurs d'examiner la variation interindividuelle du processus myogénique. Par exemple, nous avons utilisé notre méthode de caractérisation du HMPC pour identifier les différences liées à l'âge et au sexe dans la capacité d'expansion de la population du CPMH4.

Le but de ce protocole est de détailler des techniques pour isoler, culture, caractériser, et différencier hMPCs du tissu de biopsie de muscle squelettique. S'appuyant sur des travaux antérieurs qui décrivicomment les HMPC et identifient les fabricants potentiels de surface cellulaire pour l'isolement du HMPC5,6, ce protocole comble une lacune critique dans la connaissance en liant l'isolement à la caractérisation des HMPC. De plus, les instructions détaillées étape par étape incluses dans ce protocole rendent l'isolement et la caractérisation du HMPC accessibles à un large public scientifique, y compris ceux qui ont une expérience antérieure limitée avec les HMPC. Notre protocole est parmi les premiers à décrire l'utilisation d'un cytomètre d'imagerie pour suivre les populations cellulaires. Les cytomètres d'imagerie nouvellement conçus sont à la fine pointe de la technologie, à haut débit et à base de microplaques, ce qui permet l'imagerie cellulaire vivante, le comptage cellulaire et l'analyse de la fluorescence multicanal de toutes les cellules dans chaque puits d'un vaisseau culturel en quelques minutes. Ce système permet une quantification rapide des changements dynamiques dans la prolifération et la viabilité de toute une population cellulaire avec seulement une perturbation minimale de la culture. Par exemple, nous sommes en mesure d'effectuer des mesures objectives de la confluence sur les jours successifs in vitro pour déterminer la cinétique de croissance de chaque culture dérivée de différents donneurs. De nombreux protocoles dans la littérature, en particulier ceux impliquant la différenciation des MPC, exigent que les cellules atteignent un niveau défini de confluence avant d'initier la différenciation ou le traitement7. Notre méthode permet une détermination objective de la confluence de chaque puits dans un récipient de culture permettant aux chercheurs d'initier le traitement d'une manière impartiale et non subjective.

Dans le passé, une limitation majeure de l'utilisation des HMPC primaires était de faibles rendements qui limitent le nombre de cellules disponibles pour les expériences. Nous et d'autres avons montré que le rendement des MPC à partir du tissu de biopsie des muscles squelettiques est de 1 à 15 MPC par milligramme de tissu (Figure 1)8. Parce que notre protocole permet quatre passages des cellules avant la purification avec fluorescence activée tri des cellules (FACS), nos rendements de hMPC cryoconservés, dérivés de petites quantités de tissu de biopsie (50-100 mg), sont suffisants pour répondre aux objectifs de recherche où plusieurs expériences sont nécessaires. Notre protocole FACS produit une population MPC pure (Pax7 positive) de 80 %, de cette façon, notre protocole est optimisé pour le rendement et la pureté.

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Protocol

Ce protocole a été approuvé par la Commission d'examen institutionnel de l'Université Cornell. Tous les participants ont subi un dépistage des problèmes de santé sous-jacents et ont donné leur consentement éclairé.

1. Obtenir le tissu de muscle humain par l'intermédiaire de la biopsie squelettique de muscle

  1. Identifiez le muscle vastus lateralis par l'intermédiaire de la palpation, des repères anatomiques, et de la contraction active du muscle.
  2. Palpate le vastus lateralis en ayant le participant serrer leur muscle quadriceps et de trouver le ventre du muscle, environ 1/3 du chemin de la rotule à la hanche, et juste ventrolatéral au fémur.
  3. Utilisez un ruban à mesurer du papier pour marquer une zone avec un marqueur chirurgical à environ 4 à 6 pouces du haut de la rotule représentant le ventre du muscle.
  4. Raser tous les cheveux près de la zone marquée, puis nettoyer avec un antiseptique de qualité chirurgicale qui est utilisé avant les procédures médicales (Par exemple: 2% chlorhexidine gluconate (CHG)/ 70% isopropyl alcool (IPA)) .
  5. Anesthésiez le site de biopsie avec 1% de lidocaïne.
    REMARQUE: Évitez d'injecter la lidocaïne dans le muscle squelettique.
  6. Faire une voie d'incision de 4 à 5 mm sur le site marqué.
  7. Une fois la zone anesthésiée, poussez une aiguille Bergstrom avec du trocart à travers le fascia dans le ventre du muscle (environ 2 à 3 cm).
  8. Dessiner le tissu musculaire dans l'aiguille Bergstrom en retirant le trocart de coupe de 2 à 3 cm pendant qu'un assistant applique l'aspiration en retirant un piston de seringue de 60 ml attaché.
  9. Fermez la chambre de coupe.
  10. Faites pivoter la base de l'aiguille de biopsie un quart de tour et répétez la séquence d'ouverture de l'aiguille, d'aspiration en appliquant et de fermeture de l'aiguille.
    REMARQUE: Chaque fois que l'aiguille est fermée, une coupe de tissu musculaire doit être obtenue à l'intérieur de l'aiguille Bergstrom. Pendant la collecte de l'échantillon, l'aiguille restera dans la cuisse dans la même position verticale pendant qu'elle est tournée longitudinalement à 360 degrés pour obtenir chaque échantillon. Cette séquence peut être répétée 3 à 4 fois.
  11. Expulsez le tissu de biopsie recueilli de l'aiguille dans un panacle stérile non adhérent.
  12. Examinez le tissu et enlevez tous les tissus adipeux et fibrotiques visibles à l'aide de lames de scalpel stériles ou de pinces à épiler.
  13. Placer une portion (50 à 100 mg) de tissu dans un tube stérile contenant du CO2- milieu nutritif indépendant (p. ex., Hibernate A).
    REMARQUE: Le poids du tissu est déterminé comme suit. D'abord placer le tube plafonné contenant le milieu nutritif sur une échelle et tare. Ensuite, placez le tissu dans le tube, récapitulez le tube, puis pesez le tube contenant le tissu dans le milieu nutritif.
  14. Conserver le tube contenant le tissu et le milieu nutritif à 4 oC jusqu'au traitement.
    REMARQUE: Les tissus de biopsie doivent être traités dans les 48 h suivant la collecte.

2. Isoler les cellules de l'ancêtre musculaire humain du tissu de biopsie

  1. Tissu de biopsie de mince.
    1. Transférer le tissu musculaire du milieu nutritif dans un plat stérile Petri dans un coffret de sécurité biologique ou un lieu de travail stérile similaire.
    2. Utilisez des lames de scalpel stériles pour hacher les tissus en morceaux de1 mm 3.
  2. Laver les tissus de biopsie hachés pour enlever les débris résiduels.
    1. Transférer le tissu musculaire dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de salin tamponné par le phosphate (PBS) et permettre au tissu de se déposer par gravité.
    2. Aspirez le supernatant en prenant soin de ne pas déranger le tissu musculaire.
    3. Ajouter 10 ml de PBS au tissu lavé et permettre au tissu musculaire de se réinstaller par gravité.
    4. Aspirez le supernatant en prenant soin de ne pas déranger le tissu musculaire.
    5. Ajouter 10 ml de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco à faible teneur en glucose et permettre au tissu de se réinstaller par gravité.
    6. Aspirez le supernatant en prenant soin de ne pas déranger le tissu musculaire.
  3. Incuber le tissu dans les médias digesteurs.
    1. Resuspendre le tissu musculaire dans 3 ml de digest e (2 mg/mL de collagène D dans un faible taux de glucose DMEM).
      REMARQUE : Les solutions de stock de collagène D peuvent être préparées à 20 mg/mL dans le DMEM à faible teneur en glucose et stockées à -80 oC, puis diluées 1:10 dans le DMEM à faible teneur en glucose au moment de l'utilisation.
    2. Incuber le tube contenant le tissu musculaire dans un bain d'eau à 37 oC pendant 30 min.
    3. Triturate la suspension des tissus musculaires toutes les 10 min à l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml ou d'une large pipette de forage.
    4. Ajouter 83 l de micromètre digestadditionnel et 24 l de solution de dispase (0,76 mM d'acétate de calcium, 1,39 mm d'acétate de sodium, 13,91 mg/mL de dispase II en faible teneur en glucose DMEM). Remettre la suspension dans le bain d'eau de 37 oC.
    5. Triturate la suspension des tissus musculaires toutes les 5 à 10 min avec une large pointe de tuyauterie.
    6. Poursuivre la trituration jusqu'à ce qu'une boue uniforme soit atteinte, et pour pas plus de 1,5 h pour empêcher la digestion excessive.
      REMARQUE: Le frilage suffisant du tissu et l'activité enzymatique de la collagène et de la dispase peuvent avoir un impact sur la digestion de l'échantillon. Une boue uniforme devrait pouvoir passer à travers une pointe normale de pipette avec l'occlusion minimale après 1.5 h. Si une boue uniforme n'est pas atteinte après 1,5 h, vérifiez que le hachis tissulaire est suffisant et que le tissu est haché à la taille appropriée (étape 2.1.2). En outre, l'activité des enzymes doit être testée comme beaucoup à beaucoup de variation dans l'activité enzymatique se produit.
  4. Pellet cellules et geler dans les médias de récupération.
    1. Ajouter 6 mL de milieux de croissance (GM; 79% De Jambon F12, 20% de sérum bovin fœtal, 1% de pénicilline/streptomycine, 5 ng/mL de facteur de croissance de base du fibroblaste [bFGF], pH 7,4, passé par un filtre de 0,22 m) à la boue musculaire.
    2. Pipette la suspension à travers une passoire à cellules de 70 m dans un tube conique de 50 ml. Rincer la passoire avec 4 ml supplémentaires de GM.
      REMARQUE: L'échantillon peut être transféré de nouveau dans un tube conique de 15 ml pour faciliter la visualisation de la pastille. Un plus grand volume de lavage peut être utilisé si les rendements cellulaires suivants sont faibles.
    3. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à température ambiante (RT).
    4. Aspirez le supernatant en étant sûr de ne pas perturber la pastille. Faites glisser le tube pour suspendre à nouveau la pastille dans le support restant. Si les cellules ne vont pas être cultivées immédiatement procéder à l'étape 2.4.5 pour les instructions sur le stockage à long terme, sinon procéder à l'étape 3.1.6.
      REMARQUE: Si la culture immédiate est souhaitée, les OGM dans les plaques de culture cellulaire doivent être pré-incubés (étapes 3.1.1 et 3.1.2) avant le début du traitement de la biopsie.
    5. Ajouter 1,5 ml de support de congélation de culture cellulaire de récupération (tableaudes matériaux)à la pastille récupérée.
    6. Transférer la boue dans un cryovial. Placer le cryovial dans un refroidisseur à taux contrôlé par l'isopropanol pendant la nuit à -80 oC. Conserver le cryovial à -80 oC jusqu'à ce qu'il soit prêt pour la culture.
      REMARQUE: Les cryoviales contenant de la boue peuvent être conservés dans de l'azote liquide pour un stockage à long terme (plus d'un mois). L'utilisation d'un refroidisseur à taux contrôlé par l'isopropanol permet aux cellules d'être congelées de façon reproductible à un taux de 1 oC/min, ce qui entraîne des taux optimaux de récupération cellulaire, comme en témoigne la viabilité après le gel et une probabilité accrue d'attachement aux vaisseaux de culture cellulaire9. Alternativement, un bécher contenant de l'isopropanol DE RT, placé dans un congélateur de -80 oC peut être utilisé.

3. Cultiver des cellules de progéniteur de muscle humain

  1. Décongeler la boue musculaire.
    1. Avant la décongélation et l'ensemencement des HMPC, les plaques de culture cellulaire pré-équilibrifdans GM. Ajouter 250 L de GM à 4 puits d'une plaque de culture cellulaire enduite de collagène (collagène I). Remplissez les puits restants de 500 l de supports de base stériles (c.-à-d. F12) pour prévenir l'évaporation pendant la culture à long terme.
      REMARQUE: Pour les biopsies entre 50 g et 100 g, quatre puits d'une plaque de 24 puits sont appropriés. Si le tissu de biopsie est inférieur à 50 g, deux puits peuvent être plus appropriés. Les débris résiduels et le faible nombre de cellules empêchent l'utilisation d'une technique de comptage cellulaire à cette étape; par conséquent, la densité exacte de l'ensemencement n'est pas déterminée et varie légèrement d'une biopsie à une biopsie.
    2. Incuber les récipients de culture cellulaire avec GM à 37 oC dans 5 % de CO2 pour 1 h avant l'ensemencement.
    3. Retirer les cryovials du congélateur de -80 oC et les placer dans un bain d'eau de 37 oC; le liquide dans le tube doit être complètement immergé dans l'eau.
    4. Lorsque la décongélation est presque terminée (5 min), transférer le cryovial dans une hotte stérile à débit laminaire. Transférer la boue musculaire hors du tube cryovial et ajouter à un tube conique de 15 ml contenant 6 ml de GM pré-chauffé à un taux de 1 ml/min.
    5. Centrifugeuse la boue musculaire à 300 x g pendant 5 min à RT.
      REMARQUE: Une centrifugeuse à godets oscillant peut faciliter la visualisation de petites pastilles à cette étape, mais n'est pas essentielle.
    6. Aspirez le supernatant en étant sûr de ne pas perturber la pastille. Feuilleter le tube pour resuspendre la pastille dans le support restant et le suspendre à 1 ml de GM.
    7. Transférer 250 ll de la pastille resuspension (maintenant considérée comme une suspension hMPC) à chacun des 4 puits de la plaque de culture cellulaire pré-incubée de 24 puits.
  2. Culture et passage hMPCs.
    1. Maintenir les cultures de hMPC chez GMà 37 oC dans 5 % de CO 2.
      REMARQUE: Les stocks de GM sans le bFGF (c.-à-d., F12, antibiotiques, FBS) sont préparés en lots et conservés à 4 oC pendant jusqu'à 2 semaines. bFGF est ajouté à GM le jour de l'utilisation. Les supports contenant du bFGF peuvent être stockés pendant 48 h à 4 oC.
    2. Vingt-quatre heures après l'isolement, aspirez le GM, lavez doucement le récipient de culture 2x avec GM pré-chauffé, et ajoutez GM frais.
      REMARQUE : 24 h devraient fournir aux HMPC suffisamment de temps pour attacher ; aucun HMPC ne doit être enlevé après le lavage. Cette étape permettra également d'éliminer les débris restants qui ont été générés pendant la récolte cellulaire, ce qui rendra le navire plus propice à un balayage précis de la confluence à l'aide d'un cytomètre d'imagerie (section 5 ci-dessous). Après ce premier changement de média, GM est changé tous les 48 h.
    3. Passage hMPCs lorsque 70% confluence est atteint ou quand ils sont restés sur le même plat de culture pendant 10 jours, selon le premier se produit.
      REMARQUE : 70 % de confluence est d'environ 55 000 cellules/cm2.
    4. Pour le passage, ajouter 250 l de trypsine pré-chauffée à chaque puits d'une plaque de culture cellulaire de 24 puits et incuber pendant 5 min.
    5. Appuyez sur le récipient de culture cellulaire sur une surface ferme pour détacher les HMPC. Un microscope léger peut être utilisé pour vérifier que les HMPC se sont détachés.
    6. Transférer les suspensions trypsine/hMPC à 5 ml de GM dans un tube conique de 15 ml.
    7. Centrifugelant la suspension hMPC à 300 x g pendant 5 min à RT.
    8. Retirer les suspensions hMPC de la centrifugeuse et les placer sur la glace dans le capot stérile à débit laminaire.
      REMARQUE: Le fait de garder les HMPC sur la glace pendant le passage entraîne moins d'agrégation cellulaire.
    9. Aspirez le supernatant des hMPC et resuspendez doucement le granule dans 1 ml de GM.
    10. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre ou d'un compteur cellulaire automatisé.
      REMARQUE: Une dilution de 1:5 de la suspension cellulaire à la mémoire tampon de comptage cellulaire est généralement appropriée.
    11. Les HMPC de semences sur des plats de culture recouverts de collagène contenant des OGM préréchauffés à une densité de 3 500 cellules par cm2. Une combinaison de plaques de 10 cm et de plaques de 24 puits est idéale. Les plaques de 24 puits peuvent être numérisées quotidiennement sur un cytomètre d'imagerie pour surveiller la croissance.
    12. Suivez la même procédure (à partir de l'étape 3.2.4.) pour les passages suivants.
      REMARQUE: La santé et la pureté cellulaires peuvent être surveillées à travers les passages à l'aide d'un marqueur de sénescence cellulaire (p. ex., 'galactosidase) et d'immunostaining pour Pax7.
  3. Cryopreserve les HMPC.
    1. Cryopreserve cellules excédentaires pour une utilisation ultérieure pour rendre le volume de culture plus gérable.
    2. Pour la cryoconservation, suivez la procédure de trypsinisation décrite dans les étapes 3.2.4.-3.2.9.
    3. Pendant que la suspension de la cellule est centrifuge, préparez un mélange de 20 % (p. ex., 200 l) de sulfoxide de diméthyle (DMSO) et de 80 % (p. ex. 800 l) GM. Pipette de haut en bas 20x pour assurer un mélange adéquat. Laisser reposer le mélange sur la glace.
    4. Selon le nombre de cellules, diluer la suspension hMPC à 2 x 106/mL en GM.
    5. Combinez la suspension hMPC et le mélange DMSO/80% GM stérile à 20%. Le dernier support cryopréservation est une combinaison de DMSO (10%) et GM (90%) contenant 1 x 106 hMPCs/mL.
    6. Placez 1 mL de la suspension hMPC préparée à l'étape 3.3.5 en autant de cryovials que le nombre cellulaire initial le permet. Placez ensuite les HMPC aliquoted dans un refroidisseur à taux contrôlé par l'isopropanol dans un congélateur de -80 oC pendant la nuit.
      REMARQUE: À cette étape, généralement entre 5 et 15 millions de cellules sont obtenues, dont 30 à 60 % sont identifiées comme hMPC par les FACS.

4. Isoler Pax7- Cellules de progéniteur de muscle humain par l'intermédiaire de la cytométrie de flux

  1. Pour préparer les HMPC à partir de cultures vivantes (étape 3.2.11), trypsinize assez de vaisseaux de culture pour 1 x 106-2 x 106 cellules totales. Préparer les suspensions cellulaires décrites dans les étapes 3.2.4-3.2.9.
  2. Préparer les HMPC à partir de cultures cryoconservées (étape 2.4.6 ou 3.3.6).
    1. Sélectionnez 1/2 tubes contenant 1 x 106 passages quatre HMPC pour chaque donneur.
      REMARQUE: L'utilisation du passage de quatre HMPC permet un rendement cellulaire adéquat tout en maintenant un potentiel proliférant jusqu'au passage 6 (figure 2).
    2. Décongeler rapidement les cellules en les retirant du congélateur de -80 oC et en les plaçant dans un bain d'eau de 37 oC avec le liquide dans le tube complètement immergé.
    3. Lorsque la décongélation est presque terminée (5 min), transférez les HMPC sur une hotte stérile à débit lamineux et transférez le contenu de la suspension cellulaire en 6 ml de GM pré-chauffé dans un tube conique de 15 ml à une vitesse de 1 ml/min.
    4. Préparer les suspensions cellulaires décrites dans les étapes 3.2.7-3.2.9.
    5. Resuspendre chaque granule dans 3 ml de tampon FACS (500 mL de PBS, 12,5 ml de sérum de chèvre normal, 2 mL 0,5 M EDTA, pH 7,4, passé à travers un filtre de 0,22 m).
    6. Centrifugelant la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min à RT.
    7. Aspirate supernatant des hMPC et resuspend doucement les granulés dans 250 'L de tampon FACS; place sur la glace.
    8. Placer 100 l de cellules dans un tube microcentrifuge de 1,7 ml et laisser sur la glace pour être utilisé comme témoins vivants/morts (étape 4.5.1).
      REMARQUE : Les 100 ul de cellules à utiliser pour les contrôles vivants/morts peuvent provenir de la prise d'un petit volume (20 ul) de cellules suspendues de chaque donneur à trier ou à partir de cellules en banque.
      REMARQUE: Il est important de ne pas prendre plus de 20 ul de cellules suspendues d'un seul donneur. Apportez du volume jusqu'à 100 ul avec le tampon FACS si 100 ul de cellules sont disponibles.
  3. Tainer les HMPC pour les marqueurs de surface cellulaire.
    1. Préparer le cocktail d'anticorps suivant (les quantités indiquées sont pour chaque culture, mise à l'échelle de manière appropriée) : 5 L CD56 (molécule d'adhérence cellulaire neurale [NCAM]; PE-Cy7-conjugué) et 5 CD29 de ll (1-integrin; AlexFluor488-conjugué). La dilution finale des anticorps est de 1:50.
    2. Ajouter 10 l de cocktail d'anticorps à chaque suspension hMPC et incuber sur la glace pendant 30 min dans l'obscurité.
    3. Ajouter 10 mL de tampon FACS à chaque mélange de suspension/cocktail anticorps.
    4. Centrifuger chaque tube à 300 x g pendant 5 min à RT.
    5. Resuspendre la pastille dans 300 oL de tampon FACS et transférer dans un tube de polystyrène à fond rond de 5 ml.
    6. Gardez la suspension sur glace et protégez-la de la lumière.
  4. Préparer les perles de compensation.
    REMARQUE :     Des contrôles positifs pour chaque anticorps et un contrôle négatif (perles non tachées) doivent être préparés à l'aide de perles de compensation. Les contrôles de perles de compensation doivent être exécutés sur le cytomètre de débit avant que les échantillons soient triés. Ces contrôles permettent de déterminer combien le fluorochrome de chaque anticorps peut être détecté dans le canal de l'autre afin que la compensation puisse être appliquée.
    1. Perles de compensation Vortex.
    2. Dans trois tubes microcentrifugeurs de 1,7 ml, ajouter une goutte (50 l) de perles de compensation.
    3. Ajouter 1 l de chaque anticorps au tube approprié, ou aucun au contrôle négatif.
    4. Incuber dans l'obscurité pendant 15 min.
    5. Ajouter 1,5 mL de tampon FACS à chaque tube et vortex.
    6. Centrifuger chaque tube à 300 x g dans une centrifugeuse de banc pendant 5 min à RT.
    7. Aspirez supernatant et resuspendez la pastille dans 200 L de tampon FACS.
      REMARQUE: Le granule peut être très difficile à visualiser; il faut prendre soin d'aspirater le supernatant.
    8. Placez la suspension dans un tube de polystyrène à fond rond de 5 ml, puis gardez le tube sur la glace et protégé de la lumière.
  5. Préparer les contrôles vivants et morts.
    1. Divisez les 100 l de HMPC de l'étape 4.2.8 en deux tubes microcentrifugeurs de 1,7 mL (un pour le contrôle en direct et un pour le contrôle mort).
    2. Placez le tube de commande mort dans un bloc de chauffage pré-chauffé à 70 oC pour 10 min. Pendant ce temps, gardez le contrôle en direct sur la glace.
    3. Centrifuger chaque tube à 300 x g dans une centrifugeuse de banc pendant 5 min à RT.
    4. Aspirez le supernatant et suspendez la pastille dans 150 L de tampon FACS.
    5. Combinez les commandes vivantes/mortes dans un seul tube de polystyrène à fond rond de 5 ml.
  6. Effectuer la coloration de viabilité.
    1. Ajouter 1 l de 7-aminoactinomycine D (7-AAD) à tous les tubes contenant des cellules à trier et le contrôle vivant/mort.
    2. Ajouter des plaques GM aux plaques de 24 puits enduits de collagène (250 l/puits) et de 10 cm (8 ml/puits) et permettre d'équilibrer dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC dans 5 % de CO2.
  7. Trier les HMPC par cytométrie de flux.
    1. Trier les hMPC sur un cytomètre d'écoulement avec une buse de 100 m à une pression de 20 psi. Déterminer les HMPCS vivants en fonction de la diffusion latérale et vers l'avant ainsi que de la négativité 7-AAD (paramètres de tri et une sorte représentative peut être vu dans la figure 3).
    2. Les cellules positives pour lescellules PE-Cy7 (780/60 nm) et AlexFluor488 (530/30 nm) représentent les cellules CD56etCD29 et sont donc des cellules positives Pax7 (HMPC). Triez les cellules doubles positives dans des tubes de collecte contenant un coussin de 300 l de tampon FACS.
      REMARQUE: La pureté des cultures triées peut être déterminée par l'immunostaining pour Pax7 suivie de l'analyse de cytométrie de flux en aval (Figure 4).
    3. Jeter toutes les autres cellules.
    4. Transférer les cellules triées dans un tube conique de 15 ml.
    5. Faites tourner la suspension hMPC à 300 x g pendant 5 min à RT.
    6. Aspirez soigneusement le supernatant et resuspend dans 1 ml de GM.
    7. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre ou d'un compteur cellulaire automatisé.
      REMARQUE: Bien que le nombre de cellules puisse être déduit comme le nombre d'événements qui sont triés positivement, ce nombre s'est avéré pour surestimer le nombre de cellules de 10-40% par rapport aux méthodes traditionnelles de comptage cellulaire.
    8. Ensemencez les HMPC tels qu'ils sont décrits à l'étape 3.2.11.
      REMARQUE: La vérification de la pureté de la population de hMPC peut être déterminée par immunostaining pour Pax7 et analyse par l'intermédiaire de la cytométrie de flux.

5. Caractériser les cultures de cellules de progéniture de muscle humain (hMPC) utilisant un cytomètre d'imagerie

  1. Utilisez le cytomètre d'imagerie (Tableau des matériaux) pour effectuer des balayages de confluence.
    1. Sélectionnez Créer un nouvel balayage, puis entrez/sélectionnez la catégorie deplaque, le profil de plaque et l'ID deplaque. Le cytomètre d'imagerie peut accueillir 96, 24 et 6 plaques de puits.
    2. Sous application, sélectionnez Confluence 'gt; Confluence 1.
    3. Sélectionnez un puits à afficher à l'aide du navigateur à droite de l'écran.
    4. Trouver un plan de mise au point où les cellules semblent blanches par rapport à l'arrière-plan et sélectionnez le manuel d'enregistrement ou permettre au cytomètre d'imagerie de sélectionner le plan de mise au point en sélectionnant enregistrer auto.
      REMARQUE: Pour les 96 plaques depuits suggérées dans la Table des Matériaux, une position approximative est de 4,3 unités.
    5. Utilisez la souris pour mettre en évidence tous les puits qui doivent être numérisés. Toute la zone du puits sera automatiquement numérisée. Sélectionnez Start Scan.
    6. Sélectionnez les paramètres d'analyse optimaux pour le type de plaque et de cellule.
      REMARQUE: Pour les HMPC, les réglages suivants sont optimaux : intensité 6, intensité saturée 0, diamètre, 8, épaisseur minimale 3, min taille de cluster 500, et précision et haute.
    7. Sélectionnez L'analyse de démarrage.
      REMARQUE: Inspecter visuellement les images pour s'assurer que l'utilisateur et le cytomètre d'imagerie s'entendent sur le périmètre des cellules. S'il existe un écart important, rescanner la plaque à l'aide d'un plan de mise au point différent ou de différents paramètres d'analyse. Le balayage de confluence peut être employé pour comparer la croissance entre les cultures, le temps l'administration d'un traitement, ou pour surveiller des cellules et pour décider quand initier la différenciation. Si la différenciation est souhaitée, les détails sont fournis à la section 6.
  2. Utilisez le cytomètre d'imagerie pour compter les cellules.
    1. Préparer une solution de coloration contenant 12 ml de F12 de Ham, 6 l de Hoechst 33342 et 24 l d'iodure de propidium.
    2. Aspirez les supports et remplacez-les par une solution de coloration, incubez à 37 oC pendant 15 min.
    3. Aspirate solution de coloration et de remplacer par La F12 de Ham.
      REMARQUE: Il est important d'utiliser un média avec de faibles niveaux de phenol rouge pour obtenir des images claires. Alternativement, PBS peut être utilisé.
    4. Chargez la plaque sur le cytomètre d'imagerie et sous application, sélectionnez Cell Viability 'gt; Live ' Dead ' Total. Le canal en direct sera une image de champ lumineux, le canal mort sera le propidium Iodide, et le canal total sera le Hoechst 33342.
    5. Définir le canal Live sur le champ lumineux et cliquez sur Enregistrer auto sous Focus Setup.
    6. Sous le canal Total, mettre le canal en bleu. Utilisez la mise au point Trouver pour mettre les noyaux au point ou utilisez les flèches de haut en bas pour définir manuellement la mise au point. Cliquez sur Le décalage de l'ensemble pour sélectionner la mise au point.
    7. Sous le canal Dead, mettre le canal au rouge. Utilisez la mise au point Trouver pour mettre les cellules mortes au point ou utiliser les flèches de haut en bas pour définir manuellement la mise au point. Cliquez sur Le décalage de l'ensemble pour sélectionner la mise au point.
    8. Sélectionnez L'analyse Démarrer pour démarrer l'analyse.
    9. Sélectionnez les paramètres d'analyse qui conviennent à la plaque et au type de cellule. Sélectionnez L'analyse de démarrage pour commencer l'analyse. Une fois l'analyse terminée, vérifiez visuellement que l'analyse compte de façon appropriée les cellules (p. ex., pour la vérification totale du canal, chaque noyau est reconnu comme un noyau et que le cytomètre d'imagerie ne compte aucune des taches en arrière-plan comme noyaux). Si l'analyse et l'analyse sont satisfaisantes, retournez la plaque à l'incubateur, sinon rescannez ou modifiez les paramètres d'analyse.

6. Différencier les cellules de l'ancêtre musculaire humain (HMPC) en myotubes

  1. Déterminer la confluence hMPC à l'aide du protocole à la section 5.1. Pour différencier les hMPC en myotubes, il est idéal pour les cellules d'être 80-85% confluents comme déterminé par la fonction de confluence sur le cytomètre d'imagerie (voir la section 5). Si l'on utilise des HMPC de plus d'un donneur unique, la parmodenagéson permet aux cellules de différents donneurs de commencer à se différencier au moment où elles atteignent la confluence.
    REMARQUE: À 80 % de confluence, il y aenviron 66 000 cellules/cm 2.
  2. Laver les cellules 2x avec des supports de différenciation (97% De F12 de Ham, 2% de sérum équin, 1% de pénicilline/streptomycine, pH 7.4, passé par un filtre de 0,22 m).
  3. Maintenir les cellules dans les médias de différenciation aussi longtemps que l'expérience le dicte tout en changeant de média tous les jours.
  4. Évaluer directement la formation de myotube par immunostaining pour la chaîne lourde embryonnaire de myosine, qui est typiquement détectable après 7-10 jours de différenciation.
    REMARQUE: Le temps nécessaire pour former des myotubes peut différer légèrement selon le donneur et le nombre de cellules lorsque la différenciation a été initiée; par conséquent, il est recommandé que les cultures de chaque donneur soient surveillées individuellement.

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Representative Results

Les résultats représentatifs de cytométrie de flux de l'isolement de hMPC du tissu de muscle humain peuvent être vus dans la figure 1. les hMPC peuvent être identifiés par les premiers événements de gating basés sur la diffusion latérale et la diffusion vers l'avant pour éliminer les cellules mortes ou les débris, suivis par la sélection des cellules qui sont négatives pour 7-AAD et sont donc viables. La sélection des cellules positives pour les marqueurs de surface cellulaire CD56 et CD29 représente la population de hMPC. Une biopsie de 60 mg ne fournit qu'environ 75 à 250 HMPC.

Une analyse de confluence représentative est indiquée à la figure 2A. Les contours verts de la figure 2B ont été générés par le cytomètre d'imagerie et montrent comment le cytomètre d'imagerie a déterminé la confluence en fonction des paramètres d'analyse sélectionnés. Dans les deux images montrées, la confluence déterminée par le cytomètre d'imagerie est conforme à la confluence visuellement déterminée par l'utilisateur. Cependant, ces images soulignent également que le cytomètre d'imagerie n'est pas parfait. Par exemple, la flèche rouge met en évidence une imperfection dans la plaque qui est comptée comme cellules. Si un grand nombre de ces imperfections sont présentes sur la plaque, la confluence résultante ne représentera pas exactement la confluence des cellules. La figure 2C montre une représentation des trois canaux utilisés pour compter les cellules (champ lumineux, bleu et rouge) et l'image fusionnée. La figure 2D montre l'hétérogénéité entre les donneurs. Découvrir et caractériser avec précision cette hétérogénéité est une application clé du cytomètre d'imagerie. La figure 2E montre que les mesures de confluence et le nombre de noyaux provenant de donneurs uniques sont fortement corrélés.

La figure 3 fournit une ligne directrice sur la façon d'identifier les HMPC en fonction de la procédure FACS décrite dans ce protocole. Le gating basé sur la diffusion vers l'avant et latérale permet la séparation des cellules viables des débris (Figure 3A). Une comparaison de la diffusion vers l'avant par hauteur et de la diffusion vers l'avant par zone a été utilisée pour distinguer les événements représentant des cellules individuelles (la zone en boîte de la figure 3B). Les cellules viables sont marquées par un manque d'incorporation de la tache de viabilité 7-AAD (figure 3C). Enfin, les cellules positives pour les CD56 et CD29 sont identifiées comme hMPC (figure 3D). Pour valider la procédure FACS décrite dans ce protocole, la sélection des cellules positives de Pax7 peut être déterminée par des cellules immunostaining avec un anticorps Pax7-spécifique et l'expression de mesure sur un cytomètre de flux. La figure 4 compare le nombre de HMPC déterminés par Pax7 immunostaining (Figure 4A) par rapport à la procédure FACS (figure 4B) détaillée dans ce protocole à partir de la même population de cellules. La figure 5 utilise l'immunostaining et l'analyse de Pax7 par cytométrie de flux pour montrer l'enrichissement des cellules exprimant Pax7 dans la population totale après LE FACS (figure 5A par rapport à la figure 5B) ainsi que le maintien du nombre de Pax7 l'expression des cellules après le passage (figure5B par rapport à la figure 5C).

les hMPC peuvent être différenciés pour former des myotubes en suivant la section 6. Déterminer si les HMPC isolés maintiennent des cellules de capacité myogéniques peuvent être immunostained avec un anticorps spécifique pour la chaîne lourde embryonnaire de myosine et visualisés utilisant la microscopie fluorescente. Des images représentatives des myotubes positifs à chaîne lourde de myosine embryonnaire peuvent être vues dans la figure 6.

Figure 1
Figure 1 : Images cytométiques représentatives de flux pour les HMPC triés directement à partir du tissu de biopsie de muscle. (A) Zone de diffusion latérale (axe y) par rapport à la zone de diffusion vers l'avant (axe X) stratégie de gating utilisée pour identifier toutes les cellules d'un échantillon de donneur. (B) tache de viabilité 7-AAD (axe y) par rapport à la diffusion vers l'avant (axe X) pour identifier les cellules vivantes. (C) Profil de marqueur de tri de sélection négative (-CD11b, -CD31, -CD45, -GlyA [y-axis]) vs marqueur de sélection CD34. (D) Marqueur de sélection négatif CD34 (y-axe) vs le marqueur de sélection positif CD29. (E) Marqueur de sélection positif CD56 (axe y) par rapport au marqueur de sélection positif CD29 (axe x). (F) Rendements de trois biopsies musculaires squelettiques différentes. FSC - diffusion vers l'avant; SSC - diffusion latérale; hMPCs, cellules progénitrices musculaires humaines.

Figure 2
Figure 2 : Le potentiel de prolifération des HMPC dérivés de donneurs humains est maintenu après 6 passages. (A) Analyse de la confluence représentative. (B) Balayage de confluence représentatif avec des contours verts montrant comment le cytomètre d'imagerie a déterminé la confluence. La flèche rouge montre une imperfection sur la plaque. (C) Représentant brightfield, Hoechst 33342 (bleu), et propidium Iodide (rouge) coloration et une image fusionnée de ces trois canaux. Les barres d'échelle de 1 mm. (D) Les nombres de noyaux de 6 donneurs uniques mettent en évidence l'hétérogénéité du HMPC. (E) La confluence et le nombre de noyaux sont fortement corrélés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Paramètres de tri cytométrie de flux représentatifs pour l'isolement hMPC. (A) Zone de diffusion latérale (axe y) par rapport à la zone de diffusion vers l'avant (axe X) stratégie de gating utilisée pour identifier toutes les cellules d'un échantillon de donneur. (B) Hauteur de diffusion vers l'avant (y-axe) vs zone de diffusion vers l'avant (axe X) pour disqualifier les doublets de la population de tri. (C) Hauteur de diffusion vers l'avant (axe y) vs incorporation 7-AAD pour identifier les cellules viables. (D) PE-Cy7 (CD56) vs AF488 (CD29) coloration avec Q2 représentant des cellules double ment positives (HMPC). La couleur représente la densité des événements.

Figure 4
Figure 4 : Comparaison de la positivité CD29/CD56 par rapport à la positivité Pax7 dans le passage 4 HMPC du même donneur. (A) Compte (y-axe) vs expression Pax7 (x-axe). (B) Marqueur de sélection positif CD56 (axe y) vs marqueur de sélection positif CD29 (x-axe). NCAM - molécule d'adhérence des cellules neurales; hMPC - cellule progénitrice musculaire humaine.

Figure 5
Figure 5 : La positivité de Pax7 est maintenue dans les HMPC dérivés du même donneur sur plusieurs passages. (A) Expression Pax7 (x-axe) des cellules qui avaient été passages 4 fois avant le tri FACS. (B) Expression Pax7 (x-axe) des hMPC1 passage après tri FACS pour la positivité CD29 et CD56 (5 passages totaux). (C) Expression Pax7 (x-axe) des hMPC2 passages après tri FACS pour la positivité CD29 et CD56 (6 passages totaux).

Figure 6
Figure 6 : Coloration des myotubes dérivés de hMPC pour la chaîne lourde de myosine embryonnaire. Images microscopiques représentatives de HMPC différenciés co-tachés avec la tache d'ADN (Hoechst 33342, bleu) et la chaîne lourde embryonnaire de myosine (vert) (n - 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Les HMPC primaires sont un modèle de recherche important utilisé pour comprendre la biologie des muscles squelettiques et le processus régénérateur. En outre, les HMPC ont le potentiel d'être utilisés pour la thérapie. Cependant, il y a des défis reconnus en utilisant les HMPC primaires pour la recherche et la thérapie, y compris la compréhension limitée des cellules dérivées des humains10. Il existe également une grande variation de la capacité d'expansion entre les cultures de donneurs, ce qui limite le potentiel d'utilisation des HMPC et peut affecter les résultats de la recherche11. Par exemple, il a été récemment démontré que les HMPC isolés à l'aide de la méthode décrite dans ce protocole produisaient des cellules dont la capacité d'expansion variait, ce qui était attribuable au profil transcriptionnel qui ne correspondait pas au sexe ou à l'âgede 11ans.

Ici, nous présentons une méthode efficace et à haut rendement pour isoler les HMPC en quantités suffisantes pour un certain nombre d'applications en aval, y compris la différenciation en myotubes, modélisant ainsi le processus myogénique in vitro. Notre méthode s'appuie sur les cellules CD56etCD29, qui ont déjà été identifiées comme représentant une population pax7 enrichiede 12. D'autres stratégies de tri cellulaire tout aussi valables ont également été décrites5,6.

L'aspect le plus important de notre méthode d'isolement et de culture hMPC est le suivi attentif des cultures individuelles. L'hétérogénéité fondée sur les donneurs comprend le nombre de HMPC obtenus à partir de chaque biopsie, leur temps pour initier la prolifération in vitro et leur taux d'expansion de la population. Par conséquent, si les différences dans la formation de myotube après un traitement est la question d'intérêt individuel, les cultures de hMPC devraient être commutées au traitement basé sur un niveau de confluence déterminé a priori et évalué objectivement utilisant le cytomètre d'imagerie.

Notre méthode d'isolement et de culture hMPCs a été optimisée pour obtenir des rendements de cellules dans les millions pour des expériences in vitro à partir de tissu de biopsie de départ relativement peu (50-100 mg). Le principal avantage de cette approche est que de multiples essais et expériences peuvent être effectués sur des HMPC du même donneur, permettant le maintien du phénotype des donneurs à travers les expériences tout en introduisant peu de variabilité inter-expériences. Notre méthode diffère des méthodes récemment publiées qui se concentrent sur l'extraction de la population la plus pure de Pax7 exprimant des cellules directement à partir de tissu de biopsie où l'accent est xenotransplantation8. Le défi avec ces méthodes précédentes cependant, est qu'ils exigent un poids de tissu de départ de plus d'un gramme. Par conséquent, ils ne sont pas pratiques pour la recherche impliquant des biopsies de muscle squelettique humain. Une limitation de notre méthode est que le potentiel pour la xénotransplantation n'a pas été évalué. Toutefois, ce type de procédure n'était pas l'une des applications originales prévues en aval. Les orientations futures de cette méthode peuvent inclure l'évaluation de la capacité d'engraftment des HMPC, après avoir subi notre procédure d'isolement, pour déterminer s'il y a possibilité d'utilisation de cette procédure dans les études de transplantation de MPC.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs remercient l'Université Cornell, Biotechnology Resource Center Imaging Facility pour leur aide au tri des cellules activées par la fluorescence. Nous remercions également Molly Gheller pour son aide dans le recrutement des participants et Erica Bender pour la conduite des biopsies musculaires squelettiques. Enfin, nous remercions les participants pour leur temps et leur participation à l'étude. Ce travail a été soutenu par le National Institute on Aging of the National Institutes of Health sous le numéro de prix R01AG058630 (à B.D.C. et A.E.T.), par une Glenn Foundation for Medical Research et l'American Federation for Aging Research Grant for Junior Faculty (à B . D.C.), et par le President's Council for Cornell Women (à A.E.T.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA Corning 25-053-Cl Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate VWR 664160 Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube Falcon 352196 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate Grenier Bio-One 662 160 Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution eBioscience 00-6993-50 Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 BioLegend 303016 Conjugated antibody for FACS 
Black 96-well cell culture plate Grenier Bio-One 655079 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S Nexcelcom Bioscience Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer VWR 352350 Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail) Corning 354236 Collagen for coating cell culture plates 
Collagenase D Roche 11 088 882 001 Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide VWR WN182 Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II Sigma Life Sciences D4693 A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder Gibco 31600-034 Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 21600-010 PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate J.T. Baker 4040-01  Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum VWR 89510-186  Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12 Gibco 21700-026 Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum Gibco 26-050-070 Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer iNCyto DHC-N0105 Used to count cells
Hibernate A Gibco A1247501 Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate Life Technologies H21492 DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol Fisher Scientific A416P-4 Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer Orflo MXA006 Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes Orflo MXC002 Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter Orflo Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001 Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%) Thermo Fisher Scientific 50062Z Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 BD Pharmingen 557747 Conjugated antibody for FACS 
Penicillin/Streptomycin 100x Solution Corning 30-002-CI Antibiotics added to culture media
Propidium iodide Thermo Fisher Scientific P3566 DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor Promega G5071 Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium  Gibco 12648-010 Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-3 Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes VWR 60818-565 Tubes used for FACS
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42 Compensation beads fort calibrating flow FACS settings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  8. Garcia, S. M., et al. High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells. Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).
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  11. Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity. Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).
  12. Xu, X., et al. Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles. Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).

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Biologie du développement Numéro 150 cellules souches adultes humaines cellules progénitrices musculaires biopsie des muscles squelettiques culture cellulaire cellule satellite muscle squelettique
Isolement, culture, caractérisation et différenciation des cellules de l'ancêtre musculaire humain de la procédure de biopsie musculaire squelettique
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Gheller, B. J., Blum, J., Soueid-Baumgarten, S., Bender, E., Cosgrove, B. D., Thalacker-Mercer, A. Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure. J. Vis. Exp. (150), e59580, doi:10.3791/59580 (2019).

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