Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

العزلة والثقافة والتوصيف والتمايز بين خلايا ذرية العضلات البشرية من إجراء خزعة العضلات الهيكلية

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/59580
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 2, 1
1Division of Nutritional Sciences, Cornell University, 2Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

نقدم تقنيات لعزل خلايا ذرية العضلات الأولية البشرية (hMPCs) التي تم الحصول عليها من أنسجة خزعة العضلات الهيكلية، وزراعة وتميزها، وتميزها. ويمكن استخدام hMPCs التي تم الحصول عليها وتتميز من خلال هذه الأساليب لمعالجة الأسئلة البحثية المتعلقة بعضلة عضلية الإنسان وتجديد العضلات الهيكلية.

Abstract

استخدام الأنسجة البشرية الأولية والخلايا مثالية للتحقيق في العمليات البيولوجية والفسيولوجية مثل عملية تجديد العضلات الهيكلية. هناك تحديات معترف بها للعمل مع الخلايا الجذعية البشرية الأولية الكبار، وخاصة خلايا ذرية العضلات البشرية (hMPCs) المستمدة من الخزعات العضلات الهيكلية، بما في ذلك انخفاض غلة الخلايا من الأنسجة التي تم جمعها ودرجة كبيرة من عدم تجانس المانحين من النمو وبارامترات الموت بين الثقافات. في حين أن دمج التباين في التصميم التجريبي يتطلب حجم عينة أكبر للكشف عن آثار كبيرة، فإنه يسمح لنا أيضا لتحديد الآليات التي تكمن وراء التباين في قدرة التوسع hMPC، وبالتالي يسمح لنا لفهم أفضل عدم التجانس في تجديد العضلات الهيكلية. الآليات الجديدة التي تميز القدرة على التوسع من الثقافات لديها القدرة على أن تؤدي إلى تطوير العلاجات لتحسين تجديد العضلات الهيكلية.

Introduction

العضلات الهيكلية هي أكبر جهاز في جسم الإنسان، تمثل 30-40٪ من كتلة الجسم كله1. بالإضافة إلى دورها المعترف بها جيدا في الحركة، العضلات الهيكلية تحافظ على درجة حرارة الجسم والموقف، ويلعب دورا مركزيا في التوازن المغذية لكامل الجسم كله. البحوث التي تشمل المشاركين من البشر، والحيوانات، ونماذج ثقافة الخلايا كلها قيمة لمعالجة المسائل المتعلقة بيولوجيا العضلات الهيكلية وتجديد. العزلة والثقافة من خلايا ذرية العضلات الأولية البشرية (hMPCs) يوفر نموذجا قويا يسمح لتقنيات زراعة الخلايا والتلاعب ليتم تطبيقها على العينات البشرية. ميزة استخدام hMPCs هو أنها تحتفظ النمط الظاهري الوراثي والأيضي من كل مانح2،3. صيانة النمط الظاهري المانح يسمح للباحثين لدراسة التباين بين الأفراد في عملية myogenic. على سبيل المثال، لقد استخدمنا طريقة توصيف HMPC لتحديد الاختلافات المتعلقةبالعمر والجنس في قدرة التوسع السكاني HMPC 4.

الغرض من هذا البروتوكول هو تفصيل تقنيات لعزل وثقافة وتوصيف وتمييز hMPCs من أنسجة خزعة العضلات والهيكل العظمي. واستناداً إلى الأعمال السابقة التي وصفت مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية وصانعات سطح الخلية المحتملة لعزل HMPC5و6، فإن هذا البروتوكول يسد فجوة حرجة في المعرفة من خلال ربط العزلة بتوصيف مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية. وعلاوة على ذلك، فإن التعليمات التفصيلية التدريجية الواردة في هذا البروتوكول تجعل عزل وتوصيف اللجنة في متناول جمهور علمي واسع، بما في ذلك أولئك الذين لديهم خبرة سابقة محدودة مع مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية. بروتوكولنا هو من بين أول من وصف استخدام مقياس الخلايا التصويرية لتعقب مجموعات الخلايا. أجهزة قياس الخلايا التصويرية المصممة حديثًا هي أحدث التقنيات، وعالية الإنتاجية، وقائمة على الصفائح الدقيقة، مما يتيح تصوير الخلايا الحية، وفرز الخلايا، وتحليل الفلورة متعدد القنوات لجميع الخلايا في كل بئر من الأوعية الثقافية في غضون دقائق. ويسمح هذا النظام بالتحديد الكمي السريع للتغيرات الدينامية في انتشار وبقاء مجموعة كاملة من الخلايا مع الحد الأدنى من التعطيل للثقافة. على سبيل المثال، نحن قادرون على تنفيذ مقاييس موضوعية للالتقاء في الأيام المتعاقبة في المختبر لتحديد حركية النمو لكل ثقافة مشتقة من مختلف المانحين. العديد من البروتوكولات في المؤلفات، ولا سيما تلك التي تنطوي على التمييز بين الـ MPCs، تتطلب الخلايا للوصول إلى مستوى محدد من التقاء قبل الشروع في التمايز أو العلاج7. تسمح طريقتنا بتحديد موضوعي للتقاء كل بئر في وعاء ثقافي يسمح للباحثين ببدء العلاج بطريقة غير متحيزة وغير ذاتية.

في الماضي، كان أحد القيود الرئيسية لاستخدام hMPCs الأولية انخفاض الغلة التي تحد من عدد الخلايا المتاحة للتجارب. لقد أظهرنا نحن وآخرون غلة الـ MPCs من أنسجة خزعة العضلات الهيكلية 1-15 MPCs لكل مليغرام من الأنسجة (الشكل 1)8. لأن بروتوكولنا يسمح لأربعة ممرات من الخلايا قبل تنقية مع فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS)، لدينا عوائد hMPC المحفوظة بالتبريد، المستمدة من كميات صغيرة من أنسجة خزعة (50-100 ملغ)، كافية لمعالجة أهداف البحوث حيث هناك حاجة إلى تجارب متعددة. لدينا بروتوكول FACS تنتج ~ 80٪ نقية (Pax7 إيجابية) MPC السكان، وبالتالي يتم تحسين بروتوكولنا لكل من العائد والنقاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافق مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة كورنيل على هذا البروتوكول. وتم فحص جميع المشاركين للاطلاع على الظروف الصحية الأساسية وأعطوا الموافقة المستنيرة.

1. الحصول على أنسجة العضلات البشرية عن طريق خزعة العضلات الهيكلية

  1. تحديد العضلات الجانبية الشاسعة عن طريق الجس، والمعالم التشريحية، والانكماش النشط في العضلات.
  2. Palpate الجانبية vastus عن طريق وجود المشارك تشديد عضلاتهم quadriceps والعثور على بطن العضلات، حوالي 1/3 من الطريق من الرضفة إلى الورك، والبطين فقط إلى عظم الفخذ.
  3. استخدم شريط قياس ورقي لوضع علامة على منطقة تحتوي على علامة جراحية على بعد حوالي 4-6 بوصات من الجزء العلوي من الرضفة التي تمثل بطن العضلات.
  4. حلاقة أي شعر بالقرب من المنطقة ملحوظ ومن ثم تطهير مع مطهر الصف الجراحية التي تستخدم قبل الإجراءات الطبية (على سبيل المثال: 2٪ كلورهيكسيدين غلوكونات (CHG)/ 70٪ كحول ايزوبروبيل (IPA)).
  5. التخدير في موقع خزعة مع 1٪ ليدوكائين.
    ملاحظة: تجنب حقن ليدوكائين في العضلات الهيكلية.
  6. قم بإجراء شق شق 4-5 مم في الموقع المميز.
  7. بعد التخدير في المنطقة، ادفع إبرة بيرغستروم مع التروكار عبر اللفافة إلى بطن العضلات (حوالي 2-3 سم).
  8. ارسم أنسجة العضلات في إبرة Bergstrom عن طريق سحب التروكار القطع2−3 سم في حين يطبق المساعد الشفط عن طريق سحب مغطس حقنة 60 مل مرفق.
  9. أغلق غرفة القطع.
  10. تدوير قاعدة إبرة خزعة بدوره ربع وكرر تسلسل فتح الإبرة، وتطبيق شفط، وإغلاق الإبرة.
    ملاحظة: في كل مرة يتم إغلاق الإبرة ، يجب الحصول على قطع من أنسجة العضلات داخل إبرة بيرغستروم. خلال جمع العينة، ستبقى الإبرة في الفخذ في نفس الوضع الرأسي بينما يتم تدويرها طوليا من خلال 360 درجة للحصول على كل عينة. يمكن تكرار هذا التسلسل 3-4 مرات.
  11. طرد أنسجة الخزعة التي تم جمعها من الإبرة إلى وسادة خلع الملابس غير المعقمة غير الملتصقة.
  12. فحص الأنسجة وإزالة أي الأنسجة الدهنية والليفية مرئية باستخدام شفرات مشرط معقمة أو ملاقط.
  13. ضع جزءًا (50-100 ملغ) من الأنسجة في أنبوب معقم يحتوي علىثانيأكسيد الكربون- وسط مغذي مستقل (مثل السبات A).
    ملاحظة: يتم تحديد وزن الأنسجة على النحو التالي. أولا ً قم بإزالة الأنبوب المتوج الذي يحتوي على المغذيات المتوسطة على مقياس وساري. ثم ضع الأنسجة في الأنبوب، قم بتلخيص الأنبوب، ثم وزن الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة في وسط المغذيات.
  14. تخزين الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة والمغذيات المتوسطة في 4 درجة مئوية حتى المعالجة.
    ملاحظة: يجب معالجة أنسجة الخزعة في غضون 48 ساعة من الجمع.

2. عزل خلايا ذرية العضلات البشرية من أنسجة خزعة

  1. أنسجة خزعة المنمة.
    1. نقل أنسجة العضلات من وسط المغذيات إلى طبق بيتري معقمة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية أو مكان عمل معقم مماثل.
    2. استخدام شفرات مشرط معقمة إلى الأنسجة mince في ~ 1 مم3 قطع.
  2. غسل أنسجة خزعة مفرومة لإزالة الحطام المتبقي.
    1. نقل أنسجة العضلات في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 10 مل من محلول الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) والسماح للأنسجة لتسوية عن طريق الجاذبية.
    2. يستنشق المتناعن من الحرص على عدم إزعاج أنسجة العضلات.
    3. إضافة 10 مل من PBS إلى الأنسجة المغسولة والسماح للأنسجة العضلية لإعادة التوطين عن طريق الجاذبية.
    4. يستنشق المتناعن من الحرص على عدم إزعاج أنسجة العضلات.
    5. إضافة 10 مل من انخفاض الجلوكوز Dulbecco تعديل النسر المتوسطة (DMEM) والسماح للأنسجة لإعادة التوطين عن طريق الجاذبية.
    6. يستنشق المتناعن من الحرص على عدم إزعاج أنسجة العضلات.
  3. احتضان الأنسجة في وسائل الإعلام هضم.
    1. إعادة تعليق أنسجة العضلات في 3 مل من وسائل الإعلام هضم (2 ملغ / مل كولاجيناز د في انخفاض الجلوكوز DMEM).
      ملاحظة: يمكن إعداد حلول الأسهم كولاجيناز D في 20 ملغ / مل في DMEM الجلوكوز منخفضة وتخزينها في -80 درجة مئوية، ثم المخففة 1:10 في DMEM الجلوكوز منخفضة في وقت الاستخدام.
    2. احتضان الأنبوب الذي يحتوي على أنسجة العضلات في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. Triturate تعليق أنسجة العضلات كل 10 دقيقة باستخدام ماصة المصلية 10 مل أو ماصة تتحمل واسعة.
    4. إضافة 83 ميكرولتر من وسائل الإعلام هضم إضافية و 24 ميكرولتر من محلول ديسباسي (0.76 مليون متر خلات الكالسيوم، 1.39 مليون متر خلات الصوديوم، 13.91 ملغ / مل ديسباس الثاني في DMEM الجلوكوز منخفضة). العودة التعليق إلى حمام المياه 37 درجة مئوية.
    5. قم بإقتيال أنسجة العضلات كل 5-10 دقائق مع طرف مُحمل واسع.
    6. استمر في التثاقل حتى يتم تحقيق الطين موحدة، ولمدة لا تزيد عن 1.5 ساعة لمنع أكثر من الهضم.
      ملاحظة: يمكن أن يؤثر الفرم الكافي للأنسجة والنشاط الأنزيمي للكولاجيناز وديسباس على هضم العينة. يجب أن يكون الطين موحدة قادرة على تمرير من خلال طرف ماصة العادي مع الحد الأدنى من انسداد بعد 1.5 ساعة. إذا لم يتم تحقيق الطين موحدة بعد 1.5 ساعة، والتحقق المزدوج من أن الفرم الأنسجة كافية، ويتم فرم الأنسجة إلى الحجم المناسب (الخطوة 2.1.2). بالإضافة إلى ذلك، يجب اختبار نشاط الإنزيمات كما الكثير إلى الكثير الاختلاف في النشاط الأنزيمي لا يحدث.
  4. خلايا بيليه وتجميد في وسائل الإعلام الانتعاش.
    1. إضافة 6 مل من وسائل الإعلام النمو (جنرال موتورز؛ 79٪ لحم الخنزير F12، 20٪ مصل البقر الجنيني، 1٪ البنسلين / العقديات، 5 نانوغرام / مل عامل نمو الليفي الأساسية [bFGF]، درجة الحموضة 7.4، مرت من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر) إلى الطين العضلات.
    2. ماصة التعليق من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 مل. شطف مصفاة مع 4 مل إضافية من جنرال موتورز.
      ملاحظة: يمكن نقل عينة مرة أخرى إلى أنبوب مخروطي 15 مل لسهولة تصور بيليه. يمكن استخدام حجم غسيل أكبر إذا كانت إنتاجية الخلايا اللاحقة منخفضة.
    3. الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
    4. يستنشق الخارق ة على يقين من عدم تعطيل بيليه. نفض الغبار أنبوب لإعادة تعليق بيليه في وسائل الإعلام المتبقية. إذا كانت الخلايا لن يتم المستتزرعة على الفور المضي قدما إلى الخطوة 2.4.5 للحصول على تعليمات بشأن التخزين على المدى الطويل، وإلا انتقل إلى الخطوة 3.1.6.
      ملاحظة: إذا كانت الثقافة الفورية مرغوبة، يجب أن يتم احتضان جنرال موتورز في لوحات زراعة الخلايا مسبقًا (الخطوتان 3-1-1 و3.1.2) قبل بدء معالجة الخزعة.
    5. إضافة 1.5 مل من الانتعاش خليةالثقافة تجميد وسائل الإعلام (جدول المواد) إلى بيليه المستردة.
    6. نقل الطين في التبريد. ضع الفيلة المعفية في مبرد معدل تسيطر عليه ايزوبروبانول بين عشية وضحاها عند -80 درجة مئوية. تخزين التبريد في -80 درجة مئوية حتى تكون جاهزة للثقافة.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالفيوايات التي تحتوي على الطين في النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل (أكثر من شهر واحد). باستخدام المبرد معدل التي تسيطر عليها isopropanol يسمح الخلايا أن تكون مجمدة reproducibly بمعدل 1 درجة مئوية / دقيقة مما أدى إلى معدلات استرداد الخلايا المثلى كما يتضح من الجدوى بعد التجميد وزيادة احتمال التعلق بسفن زراعة الخلايا9. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام كوب يحتوي على إيزوبروبانول RT، يوضع في فريزر -80 درجة مئوية.

3. زراعة خلايا العضلات البشرية السلف

  1. إذابة الطين العضلات.
    1. قبل ذوبان وبذر hMPCs، لوحات ثقافة الخلايا قبل equilibrate في جنرال موتورز. ملء الآبار المتبقية مع 500 درجة مئوية من وسائل الإعلام الأساسية المعقمة (أي F12) لمنع التبخر خلال الثقافة على المدى الطويل.
      ملاحظة: بالنسبة للخزعات بين 50 غرام و 100 غرام، أربعة آبار من لوحة 24 جيدا هي مناسبة. إذا كان نسيج الخزعة أقل من 50 غرام، قد يكون بئران أكثر ملاءمة. الحطام المتبقي وانخفاض عدد الخلايا يمنع استخدام تقنية عد الخلايا في هذه الخطوة; لذلك، لا يتم تحديد كثافة البذر الدقيق ويختلف قليلا من خزعة إلى خزعة.
    2. احتضان سفن زراعة الخلايا مع جنرال موتورز في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 لمدة ساعة واحدة قبل البذر.
    3. إزالة الفيافيال من -80 درجة مئوية الفريزر ووضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية. يجب أن يكون السائل في الأنبوب مغمورة تماما في الماء.
    4. عندما ذوبان كاملة تقريبا (~ 5 دقيقة)، نقل الفيلة الجليدية إلى غطاء محرك السيارة تدفق laminar معقمة. نقل الطين العضلات من أنبوب التبريد وإضافة إلى أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 6 مل من جنرال موتورز قبل تسخينها بمعدل 1 مل / دقيقة.
    5. الطرد المركزي الطين العضلات في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
      ملاحظة: يمكن للطارد ة الطرد المركزي دلو يتأرجح تجعل من الأسهل لتصور الكريات الصغيرة في هذه الخطوة ولكن ليس من الضروري.
    6. يستنشق الخارق ة على يقين من عدم تعطيل بيليه. نفض الغبار أنبوب لإعادة تعليق بيليه في وسائل الإعلام المتبقية وإعادة تعليق في 1 مل من جنرال موتورز.
    7. نقل 250 درجة مئوية من بيليه علقت (تعتبر الآن تعليق hMPC) إلى كل من الآبار 4 من لوحة ثقافة الخلية 24 جيدا precubated.
  2. ثقافة وممر [همبك].
    1. الحفاظ على ثقافات hMPC في جنرال موتورز عند37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
      ملاحظة: يتم إعداد مخزونات من جنرال موتورز دون bFGF (أي F12، والمضادات الحيوية، FBS) على دفعات ويتم الاحتفاظ بها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع. يتم إضافة bFGF إلى جنرال موتورز في يوم الاستخدام. يمكن تخزين الوسائط التي تحتوي على bFGF لمدة 48 ساعة عند 4 درجة مئوية.
    2. بعد 24 ساعة من العزلة، يستنشق الآلية العالمية، ويغسل بلطف وعاء الثقافة 2X مع جنرال موتورز الدافئة مسبقا، وإضافة جنرال موتورز جديدة.
      ملاحظة: ينبغي أن يوفر 24 ساعة للمراكز hMPCs الوقت الكافي لإرفاقه؛ لا ينبغي إزالة hMPCs بعد الغسيل. وستقوم هذه الخطوة أيضا بإزالة الحطام المتبقي الذي تم توليده أثناء حصاد الخلايا، مما يجعل السفينة أكثر قابلية لمسح التقاء دقيق باستخدام مقياس السيتومتر التصويري (القسم 5 أدناه). بعد هذا التغيير الأولي في وسائل الإعلام، يتم تغيير جنرال موتورز كل 48 ساعة.
    3. مرور hMPCs عندما يتم تحقيق التقاء 70٪ أو عندما ظلت على طبق الثقافة نفسه لمدة 10 أيام، أيهما يحدث أولا.
      ملاحظة: التقاء 70٪ هو ما يقرب من 55،000 خلية / سم2.
    4. للمرور، أضف 250 ميكرولتر من التربسين المُدفأ مسبقاً إلى كل بئر من لوحة ثقافة الخلايا 24 بئراً وحضانة لمدة 5 دقائق تقريبًا.
    5. اضغط على وعاء ثقافة الخلية على سطح ثابت لفصل hMPCs. يمكن استخدام المجهر الخفيف للتحقق من أن hMPCs قد انفصلت.
    6. نقل تعليق التربسين / hMPC إلى 5 مل من جنرال موتورز في أنبوب مخروطي 15 مل.
    7. الطرد المركزي تعليق hMPC في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
    8. إزالة تعليق hMPC من الطرد المركزي ووضعها على الجليد في غطاء محرك السيارة تدفق laminar العقيمة.
      ملاحظة: الحفاظ على hMPCs على الجليد أثناء تمرير النتائج في أقل تجميع الخلايا.
    9. يستنشق من hMPCs وبلطف إعادة تعليق بيليه في 1 مل من جنرال موتورز.
    10. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتومات أو عداد الخلية الآلي.
      ملاحظة: تمال تعليق الخلية إلى المخزن المؤقت لعد الخلايا 1:5 بشكل عام.
    11. بذور hMPCs على أطباق الثقافة المغلفة بالكولاجين التي تحتوي على جنرال موتورز الدافئة مسبقافي كثافة 3500 خلية لكل سم 2. مزيج من لوحات 10 سم ولوحات 24 جيدا مثالية. يمكن مسح اللوحات ذات الـ 24 بئرًا يوميًا على مقياس تصوير لمراقبة النمو.
    12. اتبع نفس الإجراء (بدءاً من الخطوة 3.2.4.) للمقاطع اللاحقة.
      ملاحظة: يمكن رصد صحة الخلية ونقاءها عبر الممرات باستخدام علامة من الحساسية الخلوية (على سبيل المثال، β-galactosidase) وتلطيخ المناعة لPax7.
  3. حفظ الـ hMPCs بالتبريد.
    1. حفظ الخلايا الزائدة بالتبريد لاستخدامها في وقت لاحق لجعل حجم الثقافة أكثر سهولة.
    2. للحفظ بالتبريد، اتبع إجراء التربسينية الموضح في الخطوات 3.2.4.-3.2.9.
    3. وفي الوقت الذي يجري فيه الطرد المركزي لتعليق الخلية، قم بإعداد خليط من 20 في المائة (على سبيل المثال، 200 ميكرولتر) من كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO) و80 في المائة (على سبيل المثال، 800 ميكرولتر). يُترك المزيج للراحة على الجليد.
    4. استناداً إلى عدد الخلايا، تمييع تعليق hMPC إلى 2 × 106/mL في جنرال موتورز.
    5. الجمع بين تعليق hMPC و20٪ معقمة DMSO / 80٪ GM خليط 50/50. وسائل الحفظ بالتبريد النهائية هي مزيج من DMSO (10٪) وجنرال موتورز (90 في المائة) تحتوي على 1 × 106 hMPCs / مل.
    6. وضع 1 مل من تعليق hMPC أعدت في الخطوة 3.3.5 في العديد من الفيالات الجليدية كما يسمح العد الأولي للخلايا. ثم ضع hMPCs aliquoted في المبرد معدل ISOpropanol التي تسيطر عليها في -80 درجة مئوية الفريزر بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم الحصول عادة على ما بين 5 و 15 مليون خلية، يتم تحديد 30-60٪ منها على أنها hMPCs من قبل FACS.

4. عزل Pax7+ خلايا العضلات البشرية السلف عن طريق قياس التدفق

  1. لإعداد hMPCs من الثقافات الحية (الخطوة 3.2.11)، جرب ما يكفي من الأوعية الثقافية ل1 × 106-2 × 106 مجموع الخلايا. إعداد تعليق الخلايا كما هو موضح في الخطوات 3-2-4 إلى 3-2-9.
  2. إعداد مركبات hMPCs من الثقافات المحفوظة بالتبريد (الخطوة 2-4-6 أو 3-3-6).
    1. حدد 1-2 أنابيب تحتوي على حوالي 1 × 106 مرور أربعة hMPCs لكل مانح.
      ملاحظة: باستخدام مرور أربعة hMPCs يسمح لغلة الخلية كافية مع الحفاظ على القدرة على التكاثر حتى مرور ستة (الشكل2).
    2. خلايا ذوبان بسرعة عن طريق إزالتها من -80 درجة مئوية الفريزر ووضعها في حمام المياه 37 درجة مئوية مع السائل في أنبوب مغمورة تماما.
    3. عندما ذوبان كاملة تقريبا (~ 5 دقيقة)، نقل hMPCs إلى غطاء محرك السيارة تدفق laminar معقمة ونقل محتويات تعليق الخلية في 6 مل من جنرال موتورز قبل تسخينها في أنبوب مخروطي 15 مل بمعدل 1 مل / دقيقة.
    4. إعداد تعليق الخلايا كما هو موضح في الخطوات 3-2-7 إلى 3-2-9.
    5. إعادة تعليق كل بيليه في 3 مل من المخزن المؤقت FACS (500 مل PBS، 12.5 مل مصل الماعز العادي، 2 مل 0.5 M EDTA، درجة الحموضة 7.4، مرت من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر).
    6. طرد مركزي تعليق الخلية في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
    7. يستنشق supernatant من hMPCs وبلطف إعادة تعليق بيليه في 250 درجة مئوية من المخزن المؤقت FACS؛ مكان على الجليد.
    8. وضع 100 ميكرولتر من الخلايا في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.7 مل وترك على الجليد لاستخدامها كضوابط حية / ميتة (الخطوة 4.5.1).
      ملاحظة: يمكن أن يأتي 100 ul من الخلايا التي سيتم استخدامها للتحكم الحي/الميت من أخذ حجم صغير (~ 20 ul) من الخلايا المعاد تعليقها من كل متبرع ليتم فرزها أو من الخلايا البنكية.
      ملاحظة: من المهم عدم أخذ أكثر من 20 ul من الخلايا المعاد تعليقها من متبرع واحد. جلب حجم يصل إلى 100 ul مع المخزن المؤقت FACS إذا < 100 ul من الخلايا هو متاح.
  3. وصمة عار hMPCs لعلامات سطح الخلية.
    1. إعداد كوكتيل الأجسام المضادة التالية (المبالغ المعروضة هي لكل ثقافة، وتوسيع نطاق مناسب): 5 ميكرول CD56 (جزيء التصاق الخلايا العصبية [NCAM]؛ PE-Cy7-المترافق) و 5 ميكرول CD29 (β1-integrin; AlexFluor488-المترافق). تخفيف الأجسام المضادة النهائي هو 1:50.
    2. أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة إلى كل تعليق hMPC وحضانة على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    3. أضف 10 مل من المخزن المؤقت لـ FACS إلى كل خليط كوكتيل معلق/مضاد.
    4. الطرد المركزي كل أنبوب في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
    5. إعادة تعليق بيليه في 300 درجة مئوية من المخزن المؤقت FACS ونقل إلى أنبوب البوليستيرين أسفل جولة 5 مل.
    6. الحفاظ على تعليق على الجليد ومحمية من الضوء.
  4. إعداد الخرز التعويض.
    ملاحظة:     يجب إعداد عناصر تحكم إيجابية لكل جسم مضاد ومراقبة سلبية (الخرز غير الملون) باستخدام حبات التعويض. يجب تشغيل ضوابط حبة التعويض على مقياس السيتومتر التدفق قبل العينات التي سيتم فرزها. وتسمح هذه الضوابط بتحديد مقدار الفلوروكروم من كل جسم مضاد الذي يمكن اكتشافه في قناة الجسم الآخر بحيث يمكن تطبيق التعويض.
    1. دوامة الخرز التعويض.
    2. في ثلاثة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 مل، إضافة قطرة واحدة (50 درجة مئوية) من الخرز التعويض.
    3. إضافة 1 μL من كل جسم مضاد إلى الأنبوب المناسب، أو لا شيء إلى السيطرة السلبية.
    4. حضانة في الظلام لمدة 15 دقيقة.
    5. إضافة 1.5 مل من المخزن المؤقت FACS إلى كل أنبوب ودوامة.
    6. الطرد المركزي كل أنبوب في 300 × ز في جهاز طرد مركزي على سطح البدلة لمدة 5 دقائق في RT.
    7. يستنشق supernatant وإعادة تعليق بيليه في 200 درجة مئوية من المخزن المؤقت FACS.
      ملاحظة: بيليه قد يكون من الصعب جدا تصور; وينبغي توخي الحذر عندما aspirating supernatant.
    8. وضع التعليق في أنبوب البوليستيرين السفلي جولة 5 مل ثم الحفاظ على أنبوب على الجليد ومحمية من الضوء.
  5. إعداد الضوابط الحية والميتة.
    1. تقسيم 100 درجة مئوية من hMPCs من الخطوة 4.2.8 إلى اثنين من أنابيب الطرد المركزي الصغيرة 1.7 مل (واحد للتحكم الحي وواحد للتحكم الميت).
    2. ضع أنبوب التحكم الميت في كتلة التدفئة التي تم تسخينها مسبقًا إلى 70 درجة مئوية لـ > 10 دقائق. خلال هذا الوقت، والحفاظ على السيطرة الحية على الجليد.
    3. الطرد المركزي كل أنبوب في 300 × ز في جهاز طرد مركزي على سطح البدلة لمدة 5 دقائق في RT.
    4. يستنشق supernatant وإعادة تعليق بيليه في 150 درجة مئوية من المخزن المؤقت FACS.
    5. الجمع بين الضوابط الحية / الميتة في واحد 5 مل جولة أسفل أنبوب البوليسترين.
  6. أداء تلطيخ الصلاحية.
    1. إضافة 1 ميكرولتر من 7-أمينواكتينومايسين D (7-AAD) إلى جميع الأنابيب التي تحتوي على خلايا ليتم فرزها والسيطرة الحية / الميتة.
    2. إضافة جنرال موتورز إلى الكولاجين المغلفة 24 جيدا (250 درجة مئوية / جيدا) و 10 سم (8 مل / جيدا) لوحات والسماح لequilibrate في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
  7. فرز hMPCs عن طريق قياس التدفق.
    1. فرز hMPCs على مقياس السيتومتر تدفق مع فوهة 100 ميكرومتر في ضغط 20 رطل لكل بوصة مربعة. تحديد hMPCS الحية على أساس الجانب وإلى الأمام مبعثر وكذلك السلبية 7-AAD (يمكن رؤية معلمات الفرز وفرز تمثيلي في الشكل3).
    2. الخلايا الإيجابية لPE-Cy7 (780/60 نانومتر) وAlexFluor488 (530/30 نانومتر) تمثل CD56+/CD29+ الخلايا وبالتالي هي الخلايا الإيجابية Pax7 (hMPCs). فرز الخلايا الإيجابية المزدوجة في أنابيب جمع تحتوي على وسادة 300 μL من المخزن المؤقت FACS.
      ملاحظة: ويمكن تحديد نقاء الثقافات التي تم فرزها عن طريق تلطيخ المناعة لPax7 تليها تحليل قياس تدفق المصب (الشكل4).
    3. تجاهل كافة الخلايا الأخرى.
    4. نقل الخلايا التي تم فرزها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
    5. تدور تعليق hMPC في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
    6. يستنشق بعناية supernatant وإعادة تعليق في 1 مل من جنرال موتورز.
    7. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتومات أو عداد الخلية الآلي.
      ملاحظة: في حين يمكن استنتاج عدد الخلايا على أنه عدد الأحداث التي تم فرزها بشكل إيجابي، فقد وجد أن هذا العدد يبالغ في تقدير عدد الخلايا بنسبة 10-40% مقارنة بالأساليب التقليدية لحساب الخلايا.
    8. بذور hMPCs كما هو موضح في الخطوة 3.2.11.
      ملاحظة: ويمكن تحديد التحقق من نقاء السكان hMPC عن طريق تلطيخ المناعة لPax7 والتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي.

5. توصيف خلايا العضلات البشرية (hMPC) الثقافات باستخدام مقياس الخلايا التصويرية

  1. استخدم مقياس السيتومتر التصويري (جدول المواد) لإجراء عمليات مسح التقاء.
    1. حدد إنشاء فحص جديد ثم أدخل/حدد فئة اللوحةوملف تعريف اللوحة ومعرف اللوحة. يمكن أن يستوعب مقياس السيتومتر التصويري 96 و24 و6 لوحات جيدة.
    2. ضمن التطبيق، حدد التقاء > التقاء 1.
    3. حدد بئرًا لعرضها باستخدام الملاح على يمين الشاشة.
    4. العثور على مستوى من التركيز حيث تظهر الخلايا البيضاء مقارنة بالخلفية وحدد دليل التسجيل أو السماح للتصوير cytometer لتحديد مستوى التركيز عن طريق تحديد تسجيل السيارات.
      ملاحظة: وبالنسبة للوحات الآبار الـ 96 المقترحة في جدولالمواد، فإن الموضع التقريبي هو 4.3 وحدات.
    5. استخدام الماوس لتسليط الضوء على جميع الآبار التي تحتاج إلى مسحها ضوئيا. سيتم مسح منطقة البئر بأكملها تلقائيًا. حدد بدء المسح الضوئي.
    6. حدد إعدادات التحليل المثلى لنوع اللوحة والخلية.
      ملاحظة: بالنسبة للمركبات الكمية المتوسطة، تكون الإعدادات التالية هي الأمثل: الكثافة = 6، الكثافة المشبعة = 0، القطر = 8، الحد الأدنى للسمك = 3، الحد الأدنى لحجم الكتلة = 500، والدقة = عالية.
    7. حدد تحليل البدء.
      ملاحظة: فحص الصور بصريا للتأكد من أن المستخدم والتصوير cytometer توافق فيما يتعلق محيط الخلايا. في حالة وجود تباين كبير، قم بإعادة فحص اللوحة باستخدام مستوى مختلف من التركيز أو إعدادات تحليل مختلفة. يمكن استخدام المسح الضوئي للتقاء لمقارنة النمو بين الثقافات، والوقت الذي يتم فيه إدارة العلاج، أو لمراقبة الخلايا وتحديد متى تبدأ التمايز. وإذا كان التمايز مرغوبا فيه، ترد التفاصيل في الفرع 6.
  2. استخدم مقياس الخلايا التصويري لحساب الخلايا.
    1. إعداد محلول تلطيخ يحتوي على 12 مل من F12 لحم الخنزير، 6 ميكرولتر من Hoechst 33342 و 24 ميكرولتر من يوديد البربيديوم.
    2. يستنشق وسائل الإعلام واستبدال مع حل تلطيخ، وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    3. يستنشق حل تلطيخ واستبدال مع F12 لحم الخنزير.
      ملاحظة: من المهم استخدام وسائل الإعلام مع مستويات منخفضة من الفينول الأحمر للحصول على صور واضحة. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام PBS.
    4. تحميل لوحة على مقياس الخلايا التصوير وتحت التطبيق، حدد الخلية Viability > لايف + الميت +المجموع. القناة الحية ستكون صورة ميدانية مشرقة، والقناة الميتة ستكون يوديد بروبيديوم، والقناة الإجمالية ستكون Hoechst 33342.
    5. تعيين القناة المباشرة إلى حقل مشرق وانقر فوق تسجيل تلقائي ضمن إعداد التركيز.
    6. ضمن قناة الإجمالي، قم بتعيين القناة إلى اللون الأزرق. استخدم Find focus لجعل النوى في بؤرة التركيز أو استخدم الأسهم لأعلى ولأسفل لتعيين التركيز يدويًا. انقر فوق تعيين إزاحة لتحديد التركيز.
    7. تحت القناة الميتة، قم بتعيين القناة إلى اللون الأحمر. استخدم Find focus لجعل الخلايا الميتة في بؤرة التركيز أو استخدم الأسهم لأعلى ولأسفل لتعيين التركيز يدويًا. انقر فوق تعيين إزاحة لتحديد التركيز.
    8. حدد بدء الفحص لبدء الفحص.
    9. حدد معلمات التحليل المناسبة لنوع اللوحة والخلية. حدد بدء التحليل لبدء التحليل. بعد اكتمال التحليل، تحقق بصريا من أن التحليل هو تحليل الخلايا بشكل مناسب (على سبيل المثال، للتحقق من مجموع القناة أن يتم التعرف على كل نواة كنواة وأن مقياس الخلايا التصويرية لا يعد أي بقع في الخلفية كما النوى). إذا كان المسح الضوئي والتحليل مرضية، والعودة لوحة إلى الحاضنة، وإلا إعادة تفحص أو تعديل معلمات التحليل.

6. التمييز بين خلايا العضلات البشرية السلف (hMPCs) إلى الأنابيب العضلية

  1. تحديد التقاء hMPC باستخدام البروتوكول في القسم 5.1. للتمييز بين hMPCs في الأنابيب المتوسطة، من المثالي أن تكون الخلايا 80-85٪ متانة كما تحددها وظيفة الالتقاء على مقياس الخلايا التصويري (انظر القسم 5). إذا تم استخدام hMPCs من أكثر من جهة مانحة فريدة من نوعها، فإن مسح التقاء يسمح للخلايا من مختلف الجهات المانحة بالبدء في التمايز في الوقت الذي تصل فيه إلى التقاء.
    ملاحظة: في التقاء 80٪ ، وهناك ما يقرب من 66،000 خلية / سم2.
  2. غسل الخلايا 2X مع وسائل الإعلام التمايز (97٪ لحم الخنزير F12، 2٪ مصل الخيول، 1٪ البنسلين / العقديات، درجة الحموضة 7.4، مرت من خلال مرشح 0.22 درجة مئوية).
  3. الحفاظ على الخلايا في وسائط التمايز طالما أن التجربة تملي أثناء تبديل الوسائط يوميًا.
  4. يقيّم مباشرة تكوين الثيوتوب عن طريق التلطيخ المناعي للسلسلة الثقيلة من الموسين الجنيني، والتي عادة ما تكون قابلة للكشف بعد 7-10 أيام من التمايز.
    ملاحظة: قد يختلف الوقت اللازم لتشكيل الأنابيب الأنبوبية قليلاً تبعاً للمتبرع وعدد الخلايا عند بدء التمايز؛ ولذلك، يوصى برصد الثقافات من كل جهة مانحة على حدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن الاطلاع على نتائج قياس التدفق التمثيلي لعزل hMPC عن أنسجة العضلات البشرية في الشكل 1. ويمكن تحديد hMPCs من خلال الأحداث التغرير الأولى على أساس التشتت الجانبي والتشتت إلى الأمام للقضاء على الخلايا الميتة أو الحطام، تليها اختيار الخلايا السلبية فقط ل7-AAD وبالتالي قابلة للحياة. يمثل تحديد الخلايا الإيجابية لكل من علامات سطح الخلية CD56 و CD29 مجموعة hMPC. توفر خزعة 60 ملغ فقط حوالي 75-250 hMPCs.

يظهر مسح التقاء تمثيلي في الشكل 2A. تم إنشاء الخطوط العريضة الخضراء في الشكل 2B بواسطة مقياس السيتومتر التصويري وتبين كيف يحدد مقياس السيتومتر التصويري التقاء استناداً إلى إعدادات التحليل المحددة. في كلتا الصورتين المعروضتين، يتفق التقاء الذي يحدده مقياس السيتومتر التصويري مع التقاء محدد بصرياً من قبل المستخدم. ومع ذلك، هذه الصور أيضا تسليط الضوء على أن التصوير cytometer ليست مثالية. على سبيل المثال، يسلط السهم الأحمر الضوء على عيب في اللوحة التي يتم حسابها كخلايا. إذا كان هناك عدد كبير من هذه العيوب موجودة على لوحة، والتقاء الناتجة لا تمثل بدقة التقاء الخلايا. يظهر الشكل 2C تمثيلًا لجميع القنوات الثلاث المستخدمة لحساب الخلايا (brightfield والأزرق والأحمر) والصورة المدمجة. ويبين الشكل 2دال عدم التجانس بين المانحين. اكتشاف وتوصيف بدقة هذا التغايرية هو تطبيق رئيسي من مقياس السيتومتر التصوير. ويبين الشكل 2 هاء أن قياسات الالتقاء وحسابات النوى من الجهات المانحة الفريدة مترابطة ترابطاً وثيقاً.

ويقدم الشكل 3 مبدأ توجيهياً لكيفية تحديد مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية استناداً إلى إجراء نظام مراقبة الأصول الميدانية الوارد وصفه في هذا البروتوكول. Gating على أساس مبعثر إلى الأمام والجانب يسمح لفصل الخلايا القابلة للحياة من الحطام (الشكل3A). واستُخدمت مقارنة بين التشتت الأمامي حسب الارتفاع والتشتت الأمامي حسب المنطقة للتمييز بين الأحداث التي تمثل الخلايا المفردة (المنطقة المربعة في الشكل 3B). تتميز الخلايا القابلة للحياة بعدم دمج وصمة عار قابلة للحياة 7-AAD (الشكل3C). وأخيراً، يتم تعريف الخلايا الإيجابية لكل من CD56 وCD29 على أنها hMPCs (الشكل3D). للتحقق من صحة إجراء FACS الموضح في هذا البروتوكول يمكن تحديد الخلايا الإيجابية Pax7 عن طريق الخلايا المناعية مع جسم مضاد خاص Pax7 وقياس التعبير على مقياس التدفق الخلوي. ويقارن الشكل 4 عدد مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية حسب ما يحدده التلطيخ المناعي في Pax7 (الشكل4A)مقابل إجراء نظام مراقبة الأصول الميدانية (الشكل4باء)المفصل في هذا البروتوكول من نفس عدد الخلايا. يستخدم الشكل 5 التلطيخ المناعي وتحليل Pax7 عن طريق قياس التدفق الخلوي لإظهار إثراء الخلايا التي تعبر عن Pax7 في مجموع السكان بعد FACS (الشكل5A مقارنة بالشكل 5B)وكذلك الحفاظ على عدد Pax7 التعبير عن الخلايا بعد تمرير (الشكل5B مقارنة مع الشكل 5C).

يمكن تمييز hMPCs لتشكيل الأنابيب المتوسطة باتباع القسم 6. لتحديد ما إذا كانت مركبات hMPCs المعزولة تحافظ على خلايا القدرة النشودية يمكن أن تكون ملطخة بالمناعة مع جسم مضاد خاص بالسلسلة الثقيلة الموسين الجنينية وتصور باستخدام الفحص المجهري الفلورسنت. ويمكن الاطلاع على الصور التمثيلية للعضلة العضلية الجنينية سلسلة إيجابية الأنابيب العضلية في الشكل 6.

Figure 1
الشكل 1 صور قياس التدفق التمثيلي لـ hMPCs التي تم فرزها مباشرة من أنسجة خزعة العضلات. (أ) منطقة مبعثر جانبي (محور ص) مقابل استراتيجية التبعثر إلى الأمام في منطقة المبعثر (x-axis) المستخدمة لتحديد جميع الخلايا في عينة متبرع. (B) 7-AAD وصمة عار الصلاحية (ص المحور) مقابل مبعثر إلى الأمام (س محور) لتحديد الخلايا الحية. (C) ملف تعريف علامة فرز التحديد السالب (-CD11b، -CD31، -CD45، -GlyA [y-axis]) مقابل علامة التحديد CD34. (D) علامة التحديد السالبCD34 (محور ص) مقابل علامة التحديد الموجبة CD29. (هاء) علامة التحديد الموجبة CD56 (محور ص) مقابل علامة التحديد الموجبة CD29 (محور س). (واو) الغلة من ثلاثة خزعات العضلات الهيكل العظمي مختلفة. FSC = التشتت الأمامي؛ SSC = تشتت الجانب؛ hMPCs، خلايا ذرية العضلات البشرية.

Figure 2
الشكل 2 يتم الحفاظ على الإمكانات التكاثرية للمركبات الصغيرة جداً المستمدة من المتبرعين البشريين بعد 6 مقاطع. (أ) فحص التقاء تمثيلي. (B) مسح التقاء ممثل مع الخطوط العريضة الخضراء تبين كيف تحديد التصوير مقياس الالتقاء. السهم الأحمر يظهر عيب على لوحة. (C) ممثل برايتفيلد، Hoechst 33342 (الأزرق)، وpropidium Iodide (الأحمر) تلطيخ وصورة مدمجة من هذه القنوات الثلاث. قضبان مقياس = 1mm. (D) التهم النوى من 6 المانحين فريدة من نوعها يسلط الضوء على عدم تجانس hMPC. (E) التقاء وعدد النوى مترابطة للغاية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 معلمات فرز تدفق التدفق التمثيلي لعزل hMPC. (أ) منطقة مبعثر جانبي (محور ص) مقابل استراتيجية التبعثر إلى الأمام في منطقة المبعثر (x-axis) المستخدمة لتحديد جميع الخلايا في عينة متبرع. (B) ارتفاع مبعثر للأمام (محور ص) مقابل منطقة مبعثر للأمام (محور س) لاستبعاد المضاعفة من مجموعات الفرز. (C) ارتفاع مبعثر إلى الأمام (y-محور) مقابل 7-AAD التأسيس لتحديد الخلايا القابلة للحياة. (D) PE-Cy7 (CD56) مقابل AF488 (CD29) تلطيخ مع Q2 تمثل الخلايا الإيجابية المزدوجة (hMPCs). يمثل اللون كثافة الأحداث.

Figure 4
الشكل 4 مقارنة بين إيجابية CD29/CD56 مقابل إيجابية Pax7 في المقطع 4 hMPCs من نفس المانح. (أ) عدد (محور ص) مقابل تعبير Pax7 (محور س). (باء) علامة التحديد الموجبة CD56 (محور ص) مقابل علامة التحديد الموجبة CD29 (محور x). NCAM = جزيء التصاق الخلايا العصبية; hMPC = خلية ذرية العضلات البشرية.

Figure 5
الشكل 5 يتم الحفاظ على إيجابية Pax7 في hMPCs المستمدة من نفس المانح عبر مقاطع متعددة. (أ) تعبير Pax7 (محور س) من الخلايا التي تم تمريرها 4 مرات قبل فرز FACS. (B) تعبير Pax7 (x-axis) من hMPCs 1 مرور بعد فرز FACS لـ CD29 وCD56 الإيجابية (5 مقاطع إجمالية). (C) تعبير Pax7 (x-axis) من hMPCs 2 مقاطع بعد فرز FACS لـ CD29 وCD56 الإيجابية (6 مقاطع إجمالية).

Figure 6
الشكل 6 تلطيخ hMPC المستمدة من الأنابيب العضلية لسلسلة الموسين الجنينية الثقيلة. صور مجهرية تمثيلية من hMPCs المتمايزة ملطخة بوصمة عار الحمض النووي (Hoechst 33342، الأزرق) وسلسلة ميوسين الجنينية الثقيلة (الأخضر) (ن = 3). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HMPCs الأولية هي نموذج بحثي مهم يستخدم لفهم بيولوجيا العضلات الهيكلية وعملية التجديد. بالإضافة إلى ذلك، hMPCs لديها القدرة على استخدامها للعلاج. ومع ذلك، هناك تحديات معترف بها في استخدام hMPCs الأولية لكل من البحث والعلاج، بما في ذلك الفهم المحدود للخلايا المشتقة من البشر10. وهناك أيضاً قدر كبير من التباين في القدرة على التوسع فيما بين ثقافات المانحين، مما يحد من إمكانية استخدام مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية ويمكن أن يؤثر على نتائج البحوث11. على سبيل المثال، فقد ثبت مؤخرا أن hMPCs معزولة باستخدام الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول أنتجت الخلايا التي تختلف في القدرة على التوسع، وكان الدافع وراء هذا من قبل ملف تعريف النسخ الذي لا يتماشى مع الجنس أو سن11.

هنا، نقدم طريقة فعالة وعالية الغلة لعزل hMPCs بكميات كافية لعدد من التطبيقات المصب بما في ذلك التمايز في الأنابيب المتوسطة، وبالتالي النمذجة عملية myogenic في المختبر. تعتمد طريقتنا على FACS لعزل CD56+/CD29+ الخلايا، والتي تم تحديدها سابقا على أنها تمثل Pax7 المخصب التعبير عن السكان12. كما تم وصف استراتيجيات أخرى لفرز الخلايا صالحة بنفس القدر5و6.

أهم جانب من جوانب طريقة العزلة والثقافة الخاصة بنا هو الرصد الدقيق للثقافات الفردية. ويشمل عدم التجانس القائم على الجهات المانحة عدد مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية التي يتم الحصول عليها من كل خزعة، ووقتها لبدء الانتشار في المختبر، ومعدل توسعها السكاني. لذلك، إذا كانت الاختلافات في تشكيل myotube بعد العلاج هي مسألة اهتمام الفرد، ينبغي أن تتحول الثقافات hMPC إلى العلاج على أساس مستوى التقاء يحدد مسبقا وتقييمها بموضوعية باستخدام مقياس السيتومتر التصوير.

وقد تم تحسين طريقتنا لعزل وثقافة hMPCs للحصول على غلة الخلايا في الملايين للتجارب في المختبر من أنسجة خزعة بداية صغيرة نسبيا (50-100 ملغ). وتتمثل الفائدة الرئيسية لهذا النهج في أنه يمكن إجراء عمليات وتجارب متعددة على مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية من نفس الجهة المانحة، مما يسمح بالحفاظ على النمط الظاهري للمانحين عبر التجارب مع إدخال القليل من التباين فيما بين التجارب. طريقتنا تختلف عن الأساليب المنشورة مؤخرا التي تركز على استخراج أنقى السكان من Pax7 التعبير عن الخلايا مباشرة من أنسجة خزعة حيث التركيز هو xenotransplant8. التحدي مع هذه الأساليب السابقة ومع ذلك، هو أنها تتطلب وزن الأنسجة بداية أكبر من غرام واحد. ولذلك، فهي ليست عملية للبحوث التي تنطوي على الخزعات العضلات الهيكل العظمي البشري. أحد القيود على طريقتنا هو أن إمكانية زرع xenotransplant لم يتم تقييمها. ومع ذلك، لم يكن هذا النوع من الإجراءات أحد التطبيقات الأصلية المقصودة في المراحل النهائية. قد تشمل الاتجاهات المستقبلية لهذه الطريقة تقييم قدرة الطعوم لـ hMPCs، بعد إجراء العزل، لتحديد ما إذا كان هناك إمكانية لاستخدام هذا الإجراء في دراسات زرع MPC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون جامعة كورنيل، مرفق التصوير مركز موارد التكنولوجيا الحيوية لمساعدتهم في فرز الخلايا المنشطة الفلورية. كما نشكر مولي هيلر على مساعدتها في توظيف المشاركين وإريكا بندر لإجراء الخزعات العضلية الهيكلية. وأخيرا، نشكر المشاركين على وقتهم ومشاركتهم في الدراسة. وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للشيخوخة التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب رقم الجائزة R01AG058630 (إلى B.D.C. وA.E.T.)، من قبل مؤسسة غلين للبحوث الطبية ومنحة أبحاث الاتحاد الأمريكي للشيخوخة لأعضاء هيئة التدريس المبتدئين (إلى B) . العاصمة)، ومجلس الرئيس للمرأة كورنيل (إلى A.E.T.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA Corning 25-053-Cl Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate VWR 664160 Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube Falcon 352196 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate Grenier Bio-One 662 160 Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution eBioscience 00-6993-50 Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 BioLegend 303016 Conjugated antibody for FACS 
Black 96-well cell culture plate Grenier Bio-One 655079 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S Nexcelcom Bioscience Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer VWR 352350 Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail) Corning 354236 Collagen for coating cell culture plates 
Collagenase D Roche 11 088 882 001 Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide VWR WN182 Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II Sigma Life Sciences D4693 A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder Gibco 31600-034 Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 21600-010 PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate J.T. Baker 4040-01  Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum VWR 89510-186  Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12 Gibco 21700-026 Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum Gibco 26-050-070 Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer iNCyto DHC-N0105 Used to count cells
Hibernate A Gibco A1247501 Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate Life Technologies H21492 DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol Fisher Scientific A416P-4 Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer Orflo MXA006 Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes Orflo MXC002 Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter Orflo Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001 Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%) Thermo Fisher Scientific 50062Z Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 BD Pharmingen 557747 Conjugated antibody for FACS 
Penicillin/Streptomycin 100x Solution Corning 30-002-CI Antibiotics added to culture media
Propidium iodide Thermo Fisher Scientific P3566 DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor Promega G5071 Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium  Gibco 12648-010 Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-3 Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes VWR 60818-565 Tubes used for FACS
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42 Compensation beads fort calibrating flow FACS settings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. D'Souza, D. M., et al. Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling. Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).
  3. Scheele, C., et al. Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
  4. Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).
  5. Charville, G. W., et al. Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
  6. Alexander, M. S., et al. CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies. Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).
  7. Thalacker-Mercer, A., et al. Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy. Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).
  8. Garcia, S. M., et al. High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells. Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).
  9. Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Cryopreservation and thawing of cells. Current Protocols in Immunology. , Appendix 3, 3G (2012).
  10. Bareja, A., Billin, A. N. Satellite cell therapy - from mice to men. Skeletal Muscle. 3 (1), 2 (2013).
  11. Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity. Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).
  12. Xu, X., et al. Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles. Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).

Tags

علم الأحياء التنموية العدد 150 الخلايا الجذعية البشرية البالغة خلايا ذرية العضلات خزعة العضلات الهيكلية ثقافة الخلية خلية الأقمار الصناعية العضلات الهيكلية
العزلة والثقافة والتوصيف والتمايز بين خلايا ذرية العضلات البشرية من إجراء خزعة العضلات الهيكلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gheller, B. J., Blum, J.,… More

Gheller, B. J., Blum, J., Soueid-Baumgarten, S., Bender, E., Cosgrove, B. D., Thalacker-Mercer, A. Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure. J. Vis. Exp. (150), e59580, doi:10.3791/59580 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter