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Developmental Biology

अलगाव, संस्कृति, चरित्र, और कंकाल स्नायु बायोप्सी प्रक्रिया से मानव स्नायु संतति कोशिकाओं के भेदभाव

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/59580
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 2, 1
1Division of Nutritional Sciences, Cornell University, 2Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

हम अलग करने के लिए तकनीक मौजूद, culturing, विशेषता, और मानव प्राथमिक मांसपेशी जनक कोशिकाओं (hMPCs) कंकाल मांसपेशी बायोप्सी ऊतक से प्राप्त differentiating. hMPCs प्राप्त और इन तरीकों के माध्यम से विशेषता बाद में मानव myogenesis और कंकाल मांसपेशी पुनर्जनन से संबंधित अनुसंधान सवालों का पता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

प्राथमिक मानव ऊतक और कोशिकाओं का उपयोग इस तरह के कंकाल मांसपेशी पुनर्योजी प्रक्रिया के रूप में जैविक और शारीरिक प्रक्रियाओं की जांच के लिए आदर्श है। मानव प्राथमिक वयस्क स्टेम कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए मान्यता प्राप्त चुनौतियों, विशेष रूप से मानव मांसपेशी जनक कोशिकाओं (hMPCs) कंकाल की मांसपेशी बायोप्सी से व्युत्पन्न, एकत्र ऊतक से कम सेल उपज और दाता विषमता की एक बड़ी डिग्री सहित विकास और संस्कृतियों के बीच मौत मानकों. प्रयोगात्मक डिजाइन में विषमता को शामिल करते समय महत्वपूर्ण प्रभाव का पता लगाने के लिए एक बड़ा नमूना आकार की आवश्यकता है, यह भी हमें तंत्र है कि hMPC विस्तार क्षमता में variability underlie की पहचान करने के लिए अनुमति देता है, और इस तरह हमें बेहतर समझने के लिए अनुमति देता है कंकाल की मांसपेशी पुनर्जनन में विषमता. उपन्यास तंत्र है कि संस्कृतियों के विस्तार की क्षमता भेद कंकाल मांसपेशी पुनर्जनन में सुधार करने के लिए चिकित्सा के विकास के लिए नेतृत्व करने की क्षमता है.

Introduction

कंकाल की मांसपेशी मानव शरीर में सबसे बड़ा अंग प्रणाली है, पूरे शरीर द्रव्यमान1के 30 $40% के लिए लेखांकन. चलन में अपनी अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त भूमिका के अलावा, कंकाल की मांसपेशी शरीर के तापमान और मुद्रा को बनाए रखता है, और पूरे शरीर पोषक तत्व homeostasis में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। मानव प्रतिभागियों, जानवरों, और सेल संस्कृति मॉडल शामिल अनुसंधान सभी कंकाल मांसपेशी जीव विज्ञान और पुनर्जनन से संबंधित सवालों का पता करने के लिए मूल्यवान हैं. अलगाव और मानव प्राथमिक मांसपेशी जनक कोशिकाओं की संस्कृति (hMPCs) एक मजबूत मॉडल है कि सेल संस्कृति तकनीक और जोड़तोड़ के लिए मानव नमूने के लिए लागू किया जा करने के लिए अनुमति देता है प्रदान करता है. एचएमपीसी का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि वे प्रत्येक दाता2,3से आनुवंशिक और उपापचयी फीनोटाइप को बनाए रखते हैं . दाता phenotype के रखरखाव शोधकर्ताओं myogenic प्रक्रिया में अंतर-व्यक्तिगत भिन्नता की जांच करने के लिए अनुमति देता है. उदाहरण के लिए, हमने एचएमपीसी जनसंख्या विस्तार क्षमता4में आयु और लिंग संबंधी अंतरों की पहचान करने के लिए अपनी एचएमपीसी अभिलक्षण पद्धति का प्रयोग किया है।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य अलग करने के लिए तकनीक विस्तार करने के लिए है, संस्कृति, विशेषता, और कंकाल की मांसपेशी बायोप्सी ऊतक से hMPCs अंतर. पिछले काम है कि hMPCs वर्णित पर बिल्डिंग और hMPC अलगाव5,6के लिए संभावित सेल सतह निर्माताओं की पहचान की, इस प्रोटोकॉल hMPCs की विशेषता के लिए अलगाव को जोड़ने के द्वारा ज्ञान में एक महत्वपूर्ण अंतर भरता है. इसके अलावा, विस्तृत कदम दर कदम निर्देश इस प्रोटोकॉल में शामिल hMPC अलगाव और विशेषता एक व्यापक वैज्ञानिक दर्शकों के लिए सुलभ बनाने, hMPCs के साथ सीमित पूर्व अनुभव के साथ उन सहित. हमारे प्रोटोकॉल सेल आबादी को ट्रैक करने के लिए एक इमेजिंग साइटोमीटर के उपयोग का वर्णन करने के लिए पहले के बीच है। नव डिजाइन इमेजिंग cytometers राज्य के-the-कला, उच्च-थ्रूपुट, और microplate आधारित हैं, सक्षम करने लाइव सेल इमेजिंग, सेल गिनती, और multichannel फ्लोरोसेंट विश्लेषण मिनट के भीतर एक संस्कृति पोत के प्रत्येक में सभी कोशिकाओं के. इस प्रणाली के प्रसार और संस्कृति के लिए केवल कम से कम व्यवधान के साथ एक पूरे सेल आबादी की व्यवहार्यता में गतिशील परिवर्तन के तेजी से परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है. उदाहरण के लिए, हम विभिन्न दाताओं से व्युत्पन्न प्रत्येक संस्कृति के विकास गतिकी निर्धारित करने के लिए इन विट्रो में क्रमिक दिनों पर संगम के उद्देश्य उपाय करने में सक्षम हैं। साहित्य में कई प्रोटोकॉल, विशेष रूप से एमपीसी के भेदभाव से जुड़े लोगों के लिए कोशिकाओं को भेदभाव या उपचार7की शुरुआत करने से पहले संगम के एक परिभाषित स्तर तक पहुंचने की आवश्यकता होती है। हमारी विधि शोधकर्ताओं को एक निष्पक्ष, गैर-विषयक तरीके से उपचार शुरू करने की अनुमति देने वाले एक संस्कृति पोत में प्रत्येक कुएं के संगम के उद्देश्य निर्धारण की अनुमति देती है।

अतीत में, प्राथमिक hMPCs का उपयोग करने की एक प्रमुख सीमा कम पैदावार है कि प्रयोगों के लिए उपलब्ध कोशिकाओं की संख्या को सीमित किया गया था. हम और अन्य कंकाल मांसपेशी बायोप्सी ऊतक से एमपीसी की उपज से पता चला है 1 डिग्री 15 MPCs ऊतक के मिलीग्राम प्रति है (चित्र 1)8. क्योंकि हमारे प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई के साथ शुद्धि से पहले कोशिकाओं के चार अंश के लिए अनुमति देता है (FACS), हमारे cryopreserved hMPC पैदावार, बायोप्सी ऊतक की छोटी मात्रा से व्युत्पन्न (50 डिग्री 100 मिलीग्राम), अनुसंधान लक्ष्य ों को संबोधित करने के लिए पर्याप्त हैं जहां कई प्रयोगों की आवश्यकता है. हमारे FACS प्रोटोकॉल एक $ 80% शुद्ध (Pax7 सकारात्मक) एमपीसी आबादी का उत्पादन, इस प्रकार हमारे प्रोटोकॉल दोनों उपज और शुद्धता के लिए अनुकूलित है.

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Protocol

इस प्रोटोकॉल को कॉर्नेल विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी प्रतिभागियों अंतर्निहित स्वास्थ्य स्थितियों के लिए जांच की गई और सूचित सहमति दी.

1. कंकाल स्नायु बायोप्सी के माध्यम से मानव स्नायु ऊतक प्राप्त करना

  1. palpation, शारीरिक स्थलों, और मांसपेशियों के सक्रिय संकुचन के माध्यम से vastus पार्श्वीय मांसपेशियों की पहचान करें।
  2. प्रतिभागी होने से vastus lateralis अपने क्वाड्रीसेप्स मांसपेशियों को कस और मांसपेशियों के पेट मिल जाए, पेटला से कूल्हे के लिए रास्ते के बारे में 1/3, और सिर्फ femur करने के लिए ventrolateral.
  3. एक कागज मापने टेप का उपयोग करने के लिए एक शल्य मार्कर के साथ एक क्षेत्र के निशान के बारे में 4 "6 पेट की मांसपेशियों के पेट का प्रतिनिधित्व पेट का प्रतिनिधित्व पेट.
  4. चिह्नित क्षेत्र के पास किसी भी बाल दाढ़ी और फिर एक शल्य ग्रेड एंटीसेप्टिक कि चिकित्सा प्रक्रियाओं से पहले प्रयोग किया जाता है के साथ शुद्ध (उदाहरण के लिए: 2% chlorhexidine gluconate (CHG) / 70% आइसोप्रोपिल शराब (आईपीए)) .
  5. 1% लिओकेन के साथ बायोप्सी साइट को एनेस्थेटाइज करें।
    नोट: कंकाल की मांसपेशी में लिकेकेकेन इंजेक्शन लगाने से बचें।
  6. चिह्नित स्थल पर एक 4 "5 मिमी चीरा मार्ग बनाओ.
  7. क्षेत्र एनेस्थेटाइज़ किया गया है के बाद, मांसपेशियों के पेट में फासिया के माध्यम से ट्रोकार के साथ एक Bergstrom सुई धक्का (लगभग 2 डिग्री 3 सेमी).
  8. एक सहायक एक संलग्न 60 एमएल सिरिंज प्लंजर को वापस लेने के द्वारा चूषण लागू होता है, जबकि काटने ट्रोकार 2 "3 सेमी वापस लेने के द्वारा Bergstrom सुई में मांसपेशियों के ऊतकों ड्रा।
  9. काटने कक्ष बंद करें.
  10. बायोप्सी सुई के आधार को एक चौथाई मोड़ घुमाएँ और सुई खोलने के अनुक्रम को दोहराएँ, चूषण लागू करें, और सुई को बंद करें।
    नोट: हर बार सुई बंद कर दिया है, मांसपेशियों के ऊतकों की एक कटौती Bergstrom सुई के अंदर प्राप्त किया जाना चाहिए. नमूना संग्रह के दौरान, सुई एक ही ऊर्ध्वाधर स्थिति में जांघ में रहेगी, जबकि यह प्रत्येक नमूना प्राप्त करने के लिए 360 डिग्री के माध्यम से longitudinally घुमाया जाता है। इस क्रम को 3 "4 बार दोहराया जा सकता है.
  11. सुई से एकत्र बायोप्सी ऊतक को एक बाँझ गैर-संलग्न ड्रेसिंग पैड में निष्कासित करें।
  12. ऊतक की जांच और बाँझ स्केलपेल ब्लेड या tweezers का उपयोग कर किसी भी दिखाई वसा और फाइब्रोटिक ऊतकों को हटा दें।
  13. एक भाग रखें (50 डिग्री 100 मिलीग्राम) ऊतक के एक बाँझ ट्यूब में सीओ2- स्वतंत्र पोषक तत्व माध्यम (उदा., Hibernate ए) युक्त.
    नोट: ऊतक का वजन निम्नानुसार निर्धारित किया जाता है। सबसे पहले एक पैमाने और tare पर पोषक तत्व माध्यम युक्त छाया हुआ ट्यूब जगह है. अगले ट्यूब में ऊतक जगह, ट्यूब recap, और फिर पोषक तत्व माध्यम में ऊतक युक्त ट्यूब वजन.
  14. संसाधन तक ऊतक और पोषक तत्व माध्यम युक्त ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: बायोप्सी ऊतक संग्रह के 48 एच के भीतर संसाधित किया जाना चाहिए।

2. बायोप्सी ऊतक से मानव स्नायु संतति कोशिकाओं को अलग करना

  1. मिन्स बायोप्सी ऊतक.
    1. पोषक तत्व माध्यम से मांसपेशियों के ऊतकों को एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट या इसी तरह के बाँझ कार्यस्थल में एक बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
    2. $ 1 मिमी3 टुकड़ों में ऊतक कीमा करने के लिए बाँझ स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग करें।
  2. अवशिष्ट मलबे को हटाने के लिए कीमा बनाया बायोप्सी ऊतक धो लें।
    1. मांसपेशियों के ऊतकों को 15 एमएल शंकु ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 10 एमएल फॉस्फेट-बफर ेड नमकीन (पीबीएस) होता है और ऊतक को गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से व्यवस्थित करने की अनुमति देता है।
    2. मांसपेशियों के ऊतकों को परेशान करने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा supernatant प्रेरित.
    3. धोया ऊतक के लिए पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें और मांसपेशियों के ऊतकों गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से पुनर्स्थापित करने के लिए अनुमति देते हैं।
    4. मांसपेशियों के ऊतकों को परेशान करने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा supernatant प्रेरित.
    5. कम ग्लूकोज Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) के 10 एमएल जोड़ें और ऊतक गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से पुनर्स्थापित करने के लिए अनुमति देते हैं.
    6. मांसपेशियों के ऊतकों को परेशान करने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा supernatant प्रेरित.
  3. डाइजेस्ट मीडिया में ऊतक को इनक्यूबेट करें।
    1. मांसपेशियों के ऊतकों को डाइजेस्ट मीडिया के 3 एमएल में पुन: निलंबित करें (2 कम ग्लूकोज डीएमईएम में मिलीग्राम/एमएल कोलैजाज डी)।
      नोट: Collagenase डी स्टॉक समाधान कम ग्लूकोज DMEM में 20 mg/mL पर तैयार किया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, फिर उपयोग के समय कम ग्लूकोज DMEM में 1:10 पतला।
    2. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में मांसपेशियों के ऊतकों युक्त ट्यूब इनक्यूबेट करें।
    3. एक 10 एमएल सीरम पिपेट या एक विस्तृत बोर पिपेट का उपयोग कर मांसपेशियों के ऊतकों निलंबन हर 10 मिनट Triturate.
    4. अतिरिक्त डाइजेस्ट मीडिया के 83 डिग्री सेल्सियस और डिस्पेस समाधान के 24 डिग्री एल (0.76 एमएम कैल्शियम ऐसीटेट, 1.39 एमएम सोडियम ऐसीटेट, 13.91 मिलीग्राम/एमएल डिस्पा स 2 में कम ग्लूकोज डीएमईएम में जोड़ें)। 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान करने के लिए निलंबन वापस.
    5. एक विस्तृत बोर पाइप टिप के साथ मांसपेशियों के ऊतकों निलंबन हर 5 "10 मिनट Triturate.
    6. एक वर्दी घोल हासिल की है जब तक trituration जारी रखें, और पाचन पर रोकने के लिए 1.5 एच से अधिक नहीं के लिए.
      नोट: ऊतक की पर्याप्त खनन और कोलैजाइन और डिस्पेस की एंजाइमी गतिविधि नमूना पाचन को प्रभावित कर सकती है। एक वर्दी घोल 1.5 एच के बाद कम से कम occlusion के साथ एक सामान्य पिपेट टिप के माध्यम से पारित करने में सक्षम होना चाहिए। यदि 1.5 ज के बाद एक समान घोल प्राप्त नहीं होता है, तो डबल चेक करें कि ऊतक खनन पर्याप्त है, और ऊतक को उचित आकार (चरण 2.1.2) में बनाया जाता है। इसके अतिरिक्त, एंजाइमों की गतिविधि एंजाइमी गतिविधि में बहुत भिन्नता के रूप में बहुत परीक्षण किया जाना चाहिए.
  4. गोली कोशिकाओं और वसूली मीडिया में फ्रीज.
    1. विकास मीडिया के 6 एमएल जोड़ें (जीएम; 79% हैम F12, 20% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन /streptomycin, 5 एनजी /एमएल बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक [bFGF], पीएच 7.4, एक 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया) मांसपेशियों घोल करने के लिए।
    2. एक 50 एमएल शंकु ट्यूब में एक 70 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से निलंबन पिपेट. जीएम के एक अतिरिक्त 4 एमएल के साथ छलनी कुल्ला.
      नोट: नमूना गोली visualizing की आसानी के लिए एक 15 एमएल शंकु ट्यूब में वापस स्थानांतरित किया जा सकता है. एक बड़ा धोने की मात्रा इस्तेमाल किया जा सकता है अगर बाद में सेल पैदावार कम कर रहे हैं.
    3. कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
    4. अतिनिशांत को गोली न आने से रोकने के लिए सुनिश्चित करें। शेष मीडिया में गोली को फिर से निलंबित करने के लिए ट्यूब झटका. यदि कोशिकाओं को सुसंस्कृत नहीं होने जा रहे हैं तुरंत लंबी अवधि के भंडारण पर निर्देश के लिए 2.4.5 कदम आगे बढ़ना, अन्यथा 3.1.6 कदम आगे बढ़ें.
      नोट: यदि तत्काल संस्कृति वांछित है, सेल संस्कृति प्लेटों में जीएम पूर्व इनक्यूबेट किया जाना चाहिए (कदम 3.1.1 और 3.1.2) बायोप्सी प्रसंस्करण शुरू होने से पहले.
    5. बरामद गोली के लिए वसूली सेल संस्कृति ठंड मीडिया (सामग्री की तालिका) के 1.5 एमएल जोड़ें.
    6. घोल को क्रायोविएल में स्थानांतरित करें। एक आइसोप्रोपेनोल-नियंत्रित दर चिलर में क्रायोविएल को रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। संस्कृति के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोविएल स्टोर करें।
      नोट: घोल युक्त Cryovials लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में रखा जा सकता है (1 महीने से अधिक). एक आइसोप्रोपेनोल-नियंत्रित दर चिलर का उपयोग करने से कोशिकाओं को 1 डिग्री सेल्सियस/मिनट की दर से पुन: स्थिर किया जा सकता है जिसके परिणामस्वरूप स्थिर होने के बाद व्यवहार्यता द्वारा प्रमाण के रूप में इष्टतम सेल वसूली दरों में वृद्धि हुई है और सेल संस्कृति के जहाजों के प्रति लगाव की संभावना9हो जाती है। वैकल्पिक रूप से, आरटी आइसोप्रोपेनोल युक्त एक बीकर, जो -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखा गया है, का उपयोग किया जा सकता है।

3. मानव स्नायु संतति कोशिकाओं को गढ़ना

  1. मांसपेशी घोल को थपथपाएं।
    1. एचएमपीसी को थपथपाने और बोने से पहले, जीएम में सेल कल्चर प्लेट्स को पहले से ही समान बनाने से पहले, कोलेजन-कोटेड (कॉलेजन I), 24-वेल सेल कल्चर प्लेट के 4 कुओं में जीएम के 250 डिग्री एल जोड़ें। शेष कुओं को 500 $L के साथ भरें बाँझ आधार मीडिया (यानी, F12) लंबी अवधि की संस्कृति के दौरान वाष्पीकरण को रोकने के लिए.
      नोट: 50 ग्राम और 100 ग्राम के बीच बायोप्सी के लिए 24-वेल प्लेट के चार कुएं उपयुक्त हैं। यदि बायोप्सी ऊतक 50 ग्राम से कम है, दो कुओं अधिक उपयुक्त हो सकता है. अवशिष्ट मलबे और कम सेल नंबर इस कदम पर एक सेल गिनती तकनीक के उपयोग को रोकता है; इसलिए, सटीक बोने घनत्व निर्धारित नहीं है और बायोप्सी से बायोप्सी के लिए थोड़ा भिन्न होता है।
    2. बीज बोने से पहले 1 एच के लिए 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर जीएम के साथ सेल संस्कृति वाहिकाओं इनक्यूबेट सेल संस्कृति वाहिकाओं।
    3. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से क्रायोविल को निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह; ट्यूब में तरल पूरी तरह से पानी में डूब जाना चाहिए।
    4. जब thawing लगभग पूरा हो गया है ($ 5 मिनट), एक बाँझ लेमिनर प्रवाह हुड के लिए cryovial हस्तांतरण. क्रायोविजिक ट्यूब से मांसपेशी घोल को स्थानांतरित करें और 1 एमएल/मिनट की दर से 6 एमएल पूर्व-वार्म्ड जीएम युक्त 15 एमएल शंकु नली में जोड़ें।
    5. आरटी में 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर मांसपेशी घोल को सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: एक झूलते बाल्टी अपकेंद्रित्र यह आसान इस कदम पर छोटे छर्रों कल्पना करने के लिए कर सकते हैं, लेकिन आवश्यक नहीं है.
    6. अतिनिशांत को गोली न आने से रोकने के लिए सुनिश्चित करें। शेष मीडिया में गोली resuspend और जीएम के 1 एमएल में resuspend करने के लिए ट्यूब झटका.
    7. पूर्व इनक्यूबेट ्ड 24-वेल सेल कल्चर प्लेट के 4 कुओं में से प्रत्येक के लिए पुन: निलंबित गोली (अब एक एचएमपीसी निलंबन माना जाता है) के 250 $L स्थानांतरण।
  2. संस्कृति और मार्ग hMPCs.
    1. 5% सीओ2में 37 डिग्री सेल्सियस पर जीएम में hMPC संस्कृतियों को बनाए रखें ।
      नोट: BFGF के बिना जीएम के स्टॉक्स (यानी, F12, एंटीबायोटिक दवाओं, FBS) बैचों में तैयार कर रहे हैं और अप करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा 2 सप्ताह. bFGF उपयोग के दिन जीएम करने के लिए जोड़ा जाता है. मीडिया युक्त bFGF 48 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
    2. अलगाव के चौबीस घंटे बाद, जीएम को प्रेरित करें, धीरे से संस्कृति पोत 2x को पूर्व-गर्म जीएम के साथ धो लें, और नए जीएम जोड़ें।
      नोट: 24 ज hMPCs संलग्न करने के लिए पर्याप्त समय प्रदान करना चाहिए; धोने के बाद एचएमपीसी को हटाया जाना चाहिए। यह चरण सेल फसल के दौरान उत्पन्न किए गए शेष मलबे को भी हटा देगा, जिससे पोत को इमेजिंग साइटोमीटर (नीचे अनुभाग 5) का उपयोग करके सटीक संगम स्कैनिंग के लिए अधिक अनुकूल बना दिया जाएगा। इस प्रारंभिक मीडिया परिवर्तन के बाद, जीएम हर 48 एच बदल गया है.
    3. दर्रा hMPCs जब 70% संगम हासिल की है या जब वे 10 दिनों के लिए एक ही संस्कृति पकवान पर बने रहे हैं, जो भी पहले होता है.
      नोट: 70% संगम लगभग 55,000कोशिकाओं /
    4. पारित करने के लिए, एक 24-वेल सेल संस्कृति प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पूर्व-गर्म trypsin के 250 $L जोड़ें और $ 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    5. HMPCs अलग करने के लिए एक फर्म सतह पर सेल संस्कृति पोत टैप करें। एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का उपयोग यह सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है कि एचएमपीसी अलग हो गया है।
    6. trypsin/hMPC निलंबन एक 15 एमएल शंकु ट्यूब में जीएम के 5 एमएल करने के लिए स्थानांतरण।
    7. आरटी में 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर एचएमपीसी निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
    8. सेंट्रीफ्यूज से एचएमपीसी निलंबन निकालें और बाँझ लेमिनर प्रवाह हुड में बर्फ पर रखें।
      नोट: पासिंग के दौरान बर्फ पर एचएमपीसी को कम सेल एकत्रीकरण में रखने का परिणाम होता है।
    9. एचएमपीसी से एस्पेरेट सुपरनेंट और जीएम के 1 एमएल में धीरे से गोली को फिर से भर नायाब करते हैं।
    10. हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
      नोट: सेल गिनती बफर करने के लिए सेल निलंबन के एक 1:5 कमजोर पड़ने आम तौर पर उपयुक्त है.
    11. कोलेजन लेपित संस्कृति व्यंजनों पर बीज hMPCs जिसमें 3,500 कोशिकाओं प्रति सेमी2के घनत्व पर पूर्व-वार्म्ड जीएम युक्त है। 10 सेमी प्लेटों और 24 अच्छी प्लेटों का एक संयोजन आदर्श है. 24-वेल प्लेट्स को वृद्धि की निगरानी करने के लिए इमेजिंग साइटोमीटर पर प्रतिदिन स्कैन किया जा सकता है।
    12. एक ही प्रक्रिया का पालन करें (चरण 3.2.4.) पर बाद के मार्ग के लिए शुरू.
      नोट: सेल स्वास्थ्य और शुद्धता सेलुलर जीर्णता के एक मार्कर का उपयोग कर मार्ग भर में नजर रखी जा सकती है (उदाहरण के लिए, जेड-galactosidase) और Pax7 के लिए इम्यूनोस्टेनिंग.
  3. क्रायो र्फेंदएचएमसी।
    1. Cryopreserve अतिरिक्त कोशिकाओं के लिए बाद में उपयोग करने के लिए संस्कृति की मात्रा और अधिक प्रबंधनीय बनाने के लिए.
    2. क्रायोप्रेक्षण के लिए, चरण 3.2.4.-3.2.9 में वर्णित ट्रिप्सिनाइजेशन प्रक्रिया का पालन करें।
    3. जबकि सेल निलंबन centrifuged किया जा रहा है, 20% का एक मिश्रण तैयार (जैसे, 200 $L) dimethyl sulfoxide (DMSO) और 80% (जैसे, 800 $L) जीएम Pipette ऊपर और नीचे 20x पर्याप्त मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए. बर्फ पर आराम करने के लिए मिश्रण छोड़ दें.
    4. सेल काउंट के आधार पर एचएमपीसी निलंबन को जीएम में 2 x 106/
    5. एचएमपीसी निलंबन और 20% बाँझ DMSO / 80% जीएम मिश्रण 50/ अंतिम cryopservation मीडिया DMSO का एक संयोजन है (10%) और जीएम (90%) जिसमें 1 x 106 एचएमपीसी/
    6. प्रारंभिक सेल गिनती की अनुमति देता है के रूप में कई cryovials में चरण 3.3.5 में तैयार hMPC निलंबन के 1 एमएल प्लेस. फिर रात भर एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक आइसोप्रोपेनॉल नियंत्रित दर चिलर में एचएमपीसी जगह।
      नोट: इस चरण में, आम तौर पर 5 और 15 मिलियन कोशिकाओं के बीच प्राप्त कर रहे हैं, जिनमें से 30 -60% FACS द्वारा hMPCs के रूप में पहचान कर रहे हैं.

4. प्रवाह Cytometry के माध्यम से Pax7+ मानव स्नायु संतति कोशिकाओं को अलग करना

  1. लाइव संस्कृतियों से hMPCs तैयार करने के लिए (चरण 3.2.11), 1 x 106के लिए पर्याप्त संस्कृति वाहिकाओं trypsinize 6कुल कोशिकाओं. 3.2.4 $3.2.9 चरणों में वर्णित के रूप में सेल निलंबन तैयार करें।
  2. क्रायोपोर्फी संस्कृतियों से एचएमपीसी तैयार करें (चरण 2.4.6 या 3.3.6)।
    1. प्रत्येक दाता के लिए $ 1 x 106 मार्ग चार hMPCs युक्त 1 $2 ट्यूबों का चयन करें।
      नोट: मार्ग का उपयोग करते हुए चार एचएमपीसी पर्याप्त कोशिका उपज की अनुमति देता है जबकि अभी भी मार्ग छह तक प्रोलाइफर क्षमता को बनाए रखने के लिए (चित्र 2)।
    2. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से उन्हें हटाने और ट्यूब में तरल के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में उन्हें रखकर कोशिकाओं को तेजी से thaw पूरी तरह से जलमग्न.
    3. जब thawing लगभग पूरा हो गया है ($ 5 मिनट), एक बाँझ लेमिनर प्रवाह हुड करने के लिए hMPCs हस्तांतरण और 1 एमएल / मिनट की दर से एक 15 एमएल शंकु ट्यूब में पूर्व-वार्म्ड जीएम के 6 एमएल में सेल निलंबन की सामग्री हस्तांतरण।
    4. 3.2.7 $3.2.9 चरणों में वर्णित के रूप में सेल निलंबन तैयार करें।
    5. FACS बफर (500 एमएल पीबीएस, 12.5 एमएल सामान्य बकरी सीरम, 2 एमएल 0.5 एम EDTA, पीएच 7.4, एक 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया) के 3 एमएल में प्रत्येक गोली resuspend.
    6. आरटी में 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेल निलंबन सेंट्रीफ्यूज।
    7. एचएमपीसी से एस्पेरेट सुपरनेंट और एफएसीएस बफर के 250 डिग्री एल में गोली को धीरे से पुन: स्फूंश; बर्फ पर जगह है.
    8. 1ण्7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में कोशिकाओं का 100 डिग्री सेल्सियस रखें और बर्फ पर छोड़ दें जिसका उपयोग लाइव/मृत नियंत्रण (चरण 4.5.1) के रूप में किया जा सकता है।
      नोट: लाइव/मृत नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए कोशिकाओं के 100 ul हल किया जा करने के लिए प्रत्येक दाता से resuspended कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा ($ 20 ul) लेने से आ सकते हैं या banked कोशिकाओं से.
      नोट: यह एक भी दाता से resuspended कोशिकाओं के 20 से अधिक ul नहीं लेने के लिए महत्वपूर्ण है. 100 ul तक की मात्रा को FACS बफर के साथ लाओ यदि 100 ul कोशिकाओं के उपलब्ध है।
  3. सेल सतह मार्करों के लिए दाग hMPCs.
    1. निम्नलिखित एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करें (प्रत्येक संस्कृति के लिए दिखाया गया मात्रा, स्केल-अप उचित रूप से): 5 [L CD56 (न्यूरल सेल आसंजन अणु [NCAM]; PE-Cy7-संयुग्मी) और 5 $L CD29 ($1-integrin; AlexFluor488-संयोजित). अंतिम एंटीबॉडी कमजोर पड़ने 1:50 है.
    2. प्रत्येक hMPC निलंबन और अंधेरे में 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करने के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल के 10 डिग्री एल जोड़ें।
    3. प्रत्येक निलंबन /एंटीबॉडी कॉकटेल मिश्रण करने के लिए FACS बफर के 10 एमएल जोड़ें।
    4. आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर प्रत्येक ट्यूब सेंट्रीफ्यूज।
    5. एफएसीएस बफर के 300 डिग्री एल में गोली को पुन: निलंबित करें और एक 5 एमएल गोल नीचे पॉलीस्टाइरीन ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. बर्फ पर निलंबन रखें और प्रकाश से सुरक्षित.
  4. मुआवजा मोती तैयार करें.
    नोट:     प्रत्येक एंटीबॉडी और एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए सकारात्मक नियंत्रण (बेमिसाल मोती) मुआवजा मोती का उपयोग कर तैयार किया जाना चाहिए. मुआवजा मनका नियंत्रण हल किया जा करने के लिए नमूने से पहले प्रवाह cytometer पर चलाया जाना चाहिए. ये नियंत्रण इस बात के निर्धारण की अनुमति देते हैं कि प्रत्येक एंटीबॉडी से फ्लोरोक्रोम को दूसरे के चैनल में कितना पाया जा सकता है ताकि मुआवजा लागू किया जा सके.
    1. भंवर मुआवजा मोती.
    2. तीन 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में, प्रतिकार मोती की एक बूंद (50 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें।
    3. उपयुक्त ट्यूब के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी के 1 डिग्री एल जोड़ें, या नकारात्मक नियंत्रण करने के लिए कोई नहीं.
    4. 15 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट।
    5. प्रत्येक ट्यूब और भंवर के लिए FACS बफर के 1.5 एमएल जोड़ें.
    6. आरटी में 5 मिनट के लिए एक बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज में 300 x ग्राम पर प्रत्येक ट्यूब सेंट्रीफ्यूज।
    7. Aspirate supernatant और FACS बफर के 200 डिग्री एल में गोली resuspend.
      नोट: गोली कल्पना करने के लिए बहुत मुश्किल हो सकता है; अतिनिकेत को आकृन्तक बनाते समय सावधानी बरती जानी चाहिए।
    8. एक 5 एमएल दौर नीचे polystyrene ट्यूब में निलंबन प्लेस और फिर बर्फ पर ट्यूब रखने के लिए और प्रकाश से संरक्षित.
  5. लाइव और मृत नियंत्रण तैयार करें।
    1. 100 $L hMPCs को चरण 4.2.8 से दो 1ण्7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में विभाजित करें (एक जीवित नियंत्रण के लिए और एक मृत नियंत्रण के लिए)।
    2. मृत नियंत्रण ट्यूब को एक हीटिंग ब्लॉक में रखें जो पहले से 70 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है। इस समय के दौरान, बर्फ पर लाइव नियंत्रण रखें.
    3. आरटी में 5 मिनट के लिए एक बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज में 300 x ग्राम पर प्रत्येक ट्यूब सेंट्रीफ्यूज।
    4. Aspirate supernatant और FACS बफर के 150 डिग्री एल में गोली resuspend.
    5. एक एकल 5 एमएल दौर नीचे polystyrene ट्यूब में रहते / मृत नियंत्रण का मिश्रण.
  6. व्यवहार्यता धुंधला प्रदर्शन.
    1. सभी ट्यूबों में 7-एमिनोऐक्टिनोमाइसिन डी (7-एएडी) का 1 $L जोड़ें, जिसमें कोशिकाओं को हल किया जाए और लाइव/
    2. कोलेजन लेपित 24-वेल (250 डिग्री एल/वेल) और 10 सेमी (8 एमएल/वेल) प्लेटों में जीएम जोड़ें और 5% ब्व्2में 37 डिग्री सेल्सियस में सेल कल्चर इनक्यूबेटर में बराबरी की अनुमति दें।
  7. प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से एचएमपीसी को क्रमबद्ध करें।
    1. 20 साई के दबाव पर 100 डिग्री मीटर नोजल के साथ एक प्रवाह साइटोमीटर पर एचएमपीसी को क्रमबद्ध करें। पक्ष और आगे तितर बितर के आधार पर लाइव एचएमपीसी निर्धारित करने के साथ ही 7-AAD नकारात्मकता (सॉर्टिंग पैरामीटर और एक प्रतिनिधि सॉर्ट चित्र 3में देखा जा सकता है )।
    2. पीई-Cy7 (780/60 एनएम) और AlexFluor488 (530/30 एनएम) के लिए सकारात्मककोशिकाओं CD56 का प्रतिनिधित्व+/ संग्रह ट्यूबों में डबल सकारात्मक कोशिकाओं को सॉर्ट करें जिसमें एफएसीएस बफर का 300 जेडएल कुशन होता है।
      नोट: क्रमबद्ध संस्कृतियों की शुद्धता का निर्धारण पैक्स7 के लिए इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा किया जा सकता है जिसके बाद डाउनस्ट्रीम प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण (चित्र 4) है ।
    3. अन्य सभी कक्षों को छोड़ें.
    4. हल की हुई कोशिकाओं को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें।
    5. आरटी में 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर एचएमपीसी निलंबन स्पिन करें।
    6. जीएम के 1 एमएल में सावधानी से सुपरनेंट को प्रेरित करें और फिर से करें।
    7. हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
      नोट: जबकि कोशिकाओं की संख्या सकारात्मक हल कर रहे हैं कि घटनाओं की संख्या के रूप में अनुमान लगाया जा सकता है, इस गिनती पारंपरिक सेल गिनती विधियों की तुलना में 10 डिग्री 40% से कोशिकाओं की संख्या overestimate करने के लिए पाया गया है.
    8. चरण 3.2.11 में उल्लिखित के रूप में hMPCs बीज.
      नोट: एचएमपीसी जनसंख्या की शुद्धता का सत्यापन पैक्स7 के लिए इम्यूनोस्टेनिंग और प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।

5. एक इमेजिंग Cytometer का उपयोग कर मानव स्नायु संतति सेल (hMPC) संस्कृति की विशेषता

  1. संगम स्कैन करने के लिए इमेजिंग साइटोमीटर (सामग्री तालिका) का उपयोग करें।
    1. नया स्कैन बनाएँ का चयन करें और फिर प्लेट श्रेणी, प्लेट प्रोफ़ाइल और प्लेट आईडीदर्ज करें/ इमेजिंग साइटोमीटर 96, 24, और 6 अच्छी तरह से प्लेटें समायोजित कर सकते हैं.
    2. अनुप्रयोगके अंतर्गत, संगम 1का चयन करें .
    3. स्क्रीन के दाईं ओर नाविक का उपयोग कर देखने के लिए एक अच्छी तरह से चुनें.
    4. फोकस का एक समतल खोजें जहां कोशिकाएं पृष्ठभूमि की तुलना में सफेद दिखाई देती हैं और मैनुअल रजिस्टर का चयन करें या इमेजिंग साइटोमीटर को रजिस्टर ऑटोका चयन करके फोकस के तल का चयन करने की अनुमति दें।
      नोट: सामग्री सारणी में सुझाई गई 96 कूप प्लेटों केलिए, एक अनुमानित स्थिति 4ण्3 इकाई है।
    5. स्कैन किए जाने वाले सभी कुओं को हाइलाइट करने के लिए माउस का उपयोग करें. पूरे अच्छी तरह से क्षेत्र स्वचालित रूप से स्कैन किया जाएगा. स्कैन प्रारंभ करेंका चयन करें.
    6. प्लेट और सेल प्रकार के लिए इष्टतम विश्लेषण सेटिंग्स का चयन करें.
      नोट: hMPCs के लिए, निम्न सेटिंग्स इष्टतम हैं: तीव्रता ] 6, संतृप्त तीव्रता ] 0, व्यास ] 8, न्यूनतम मोटाई ] 3, न्यूनतम क्लस्टर आकार ] 500, और परिशुद्धता ] उच्च।
    7. विश्लेषण प्रारंभ करेंका चयन करें.
      नोट: नेत्रहीन छवियों का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि उपयोगकर्ता और इमेजिंग cytometer कोशिकाओं की परिधि के बारे में सहमत हैं. यदि कोई बड़ी विसंगति मौजूद है, तो फ़ोकस या विभिन्न विश्लेषण सेटिंग्स के किसी भिन्न तल का उपयोग करके प्लेट को पुनः स्कैन करें. संगम स्कैनिंग संस्कृतियों के बीच विकास की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, समय एक उपचार के प्रशासन, या कोशिकाओं की निगरानी और जब भेदभाव आरंभ करने के लिए तय करने के लिए. यदि भेदभाव वांछित है, विवरण अनुभाग 6 में प्रदान की जाती हैं.
  2. कोशिकाओं की गणना करने के लिए इमेजिंग साइटोमीटर का उपयोग करें.
    1. हैम F12 के 12 एमएल युक्त एक धुंधला समाधान तैयार करें, Hoechst 33342 के 6 $L और प्रोपिडियम आयोडाइड के 24 डिग्री एल.
    2. Aspirate मीडिया और धुंधला समाधान के साथ बदलें, 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    3. Aspirate धुंधला समाधान और हैम F12 के साथ बदलें.
      नोट: यह स्पष्ट छवियों को प्राप्त करने के लिए फिनोल लाल के निम्न स्तर के साथ एक मीडिया का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. वैकल्पिक रूप से, PBS का उपयोग किया जा सकता है।
    4. इमेजिंग साइटोमीटर पर और अनुप्रयोगके तहत प्लेट लोड , सेल व्यवहार्यताका चयन करें , जी + मृत + कुल . लाइव चैनल एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि हो जाएगा, मृत चैनल propidium Iodide होगा, और कुल चैनल Hoechst 33342 होगा.
    5. लाइव चैनल को उज्ज्वल फ़ील्ड पर सेट करें और फ़ोकस सेटअपके अंतर्गत ऑटो पंजीकृत करें क्लिक करें.
    6. कुल चैनल के अंतर्गत, चैनल को नीला सेट करें. केन्द्राको ध्यान में लाने या मैन्युअल रूप से फ़ोकस सेट करने के लिए ऊपर और नीचे तीरों का उपयोग करने के लिए फोकस ढूँढें का उपयोग करें. फ़ोकस का चयन करने के लिए ऑफ़सेट सेट करें क्लिक करें।
    7. मृत चैनल के अंतर्गत, चैनल को लाल रंग पर सेट करें. मृत कोशिकाओं को ध्यान में लाने या मैन्युअल रूप से फ़ोकस सेट करने के लिए ऊपर और नीचे तीरों का उपयोग करने के लिए फ़ोकस ढूँढें का उपयोग करें. फ़ोकस का चयन करने के लिए ऑफ़सेट सेट करें क्लिक करें।
    8. स्कैन प्रारंभ करने के लिए स्कैन प्रारंभ करें का चयन करें।
    9. प्लेट और कक्ष प्रकार के लिए उपयुक्त विश्लेषण पैरामीटर का चयन करें. विश्लेषण प्रारंभ करने के लिए विश्लेषण प्रारंभ करें का चयन करें. विश्लेषण पूरा होने के बाद, नेत्रहीन सत्यापित करें कि विश्लेषण उचित रूप से कोशिकाओं की गिनती है (उदाहरण के लिए, कुल चैनल की जांच के लिए कि हर नाभिक एक नाभिक के रूप में मान्यता प्राप्त किया जा रहा है और यह कि इमेजिंग साइटोमीटर पृष्ठभूमि में किसी भी स्थान की गिनती नहीं है के रूप में नाभिक). यदि स्कैन और विश्लेषण संतोषजनक हैं, तो प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस लाएं, अन्यथा विश्लेषण पैरामीटर को पुन: स्कैन या संशोधित करें।

6. Myotubes के लिए मानव मांसपेशी संतति कोशिकाओं (hMPCs) भेदभाव

  1. अनुभाग 5.1 में प्रोटोकॉल का उपयोग कर hMPC संगम निर्धारित करें। hMPCs को मायोट्यूब में अंतर करने के लिए, यह कोशिकाओं के लिए आदर्श है कि इमेजिंग साइटोमीटर पर संगम समारोह द्वारा निर्धारित के रूप में 80-85% confluent हो (अनुभाग 5 देखें). यदि एक से अधिक अद्वितीय दाता से hMPCs उपयोग किया जाता है, संगम स्कैनिंग विभिन्न दाताओं से कोशिकाओं को समय वे संगम तक पहुँचने पर भेदभाव शुरू करने के लिए अनुमति देता है.
    नोट: 80% संगम पर, वहाँ लगभग 66,000कोशिकाओं /
  2. भेदभाव मीडिया के साथ 2x धोने (97% है मॉनीट सीरम, 1% पेनिसिलिन /
  3. दैनिक मीडिया स्विच करते समय प्रयोग के अनुसार जब तक विभेदन मीडिया में कक्षबनाए रखें.
  4. सीधे भ्रूण myosin भारी श्रृंखला है, जो आम तौर पर भेदभाव के 7 डिग्री 10 दिनों के बाद पता लगाने योग्य है के लिए इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा मायोट्यूब गठन का आकलन।
    नोट: मायोट्यूब बनाने के लिए आवश्यक समय दाता और कोशिकाओं की संख्या के आधार पर थोड़ा अलग हो सकता है जब भेदभाव शुरू किया गया था; इसलिए, यह अनुशंसा की जाती है कि प्रत्येक दाता से संस्कृतियों को व्यक्तिगत रूप से निगरानी की जाए।

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Representative Results

मानव मांसपेशी ऊतक से एचएमपीसी अलगाव के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री परिणाम चित्र 1में देखा जा सकता है। hMPCs पक्ष तितर बितर और आगे तितर बितर के आधार पर पहली gating घटनाओं मृत कोशिकाओं या मलबे को खत्म करने के लिए, केवल कोशिकाओं जो 7-AAD के लिए नकारात्मक हैं और इसलिए व्यवहार्य हैं का चयन करके पीछा द्वारा पहचाना जा सकता है. दोनों सेल सतह मार्करCD56 और CD29 के लिए सकारात्मक कोशिकाओं का चयन hMPC जनसंख्या का प्रतिनिधित्व करता है. 60 मिलीग्राम की बायोप्सी केवल लगभग 75 डिग्री 250 एचएमपीसी प्रदान करती है।

एक प्रतिनिधि संगम स्कैन चित्र 2कमें दिखाया गया है। चित्र ााालों में दी गई हरी रूपरेखाओं को इमेजिंग साइटोमीटर द्वारा उत्पन्न किया गया था और यह दर्शाता है कि चयनित विश्लेषण सेटिंग्स के आधार पर इमेजिंग साइटोमीटर का निर्धारण संगम कैसे निर्धारित किया गया था. दिखाए गए दोनों चित्रों में, इमेजिंग साइटोमीटर द्वारा निर्धारित संगम उपयोगकर्ता द्वारा नेत्रहीन निर्धारित संगम से सहमत है। हालांकि, इन छवियों को भी उजागर किया है कि इमेजिंग साइटोमीटर सही नहीं है. उदाहरण के लिए, लाल तीर प्लेट जो कोशिकाओं के रूप में गिना जा रहा है में एक अपूर्णता पर प्रकाश डाला गया. यदि प्लेट पर इन असिद्धता की एक बड़ी संख्या मौजूद है, जिसके परिणामस्वरूप संगम सही कोशिकाओं के संगम का प्रतिनिधित्व नहीं करेगा. चित्र 2C कक्षों (ब्राइटफील्ड, नीले और लाल) और मर्ज की गई छवि की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी तीन चैनलों का प्रतिनिधित्व दर्शाता है. चित्र 2D दाताओं के बीच विषमता से पता चलता है. खोज और सही इस विषमता की विशेषता इमेजिंग साइटोमीटर का एक महत्वपूर्ण अनुप्रयोग है. चित्र 2E से पता चलता है कि संगम माप और अद्वितीय दाताओं से नाभिक मायने रखता है अत्यधिक सहसंबद्ध हैं.

चित्र 3 इस प्रोटोकॉल में वर्णित FACS प्रक्रिया के आधार पर hMPCs की पहचान करने के लिए कैसे के लिए एक दिशानिर्देश प्रदान करता है। आगे और साइड स्कैटर पर आधारित गैटिंग व्यवहार्य कोशिकाओं को मलबे से अलग करने की अनुमति देता है (चित्र 3क) क्षेत्र के अनुसार आगे स्कैटर की तुलना क्षेत्र के अनुसार बिखेरने के लिए अग्र प्रकीर्ण की तुलना एकल कक्षों का प्रतिनिधित्व करने वाले ईवेंट्स को अलग करने के लिए प्रयोग की गई थी (चित्र 3Bमें बॉक्स्ड क्षेत्र). व्यवहार्य कोशिकाओं को व्यवहार्यता दाग 7-AAD (चित्र 3C) को शामिल करने की कमी से चिह्नित किया गया है। अंत में, सीडी 56 और सीडी29 दोनों के लिए सकारात्मक कोशिकाओं को hMPCs के रूप में पहचाने जाते हैं (चित्र 3डी)। इस प्रोटोकॉल में वर्णित FACS प्रक्रिया को मान्य करने के लिए Pax7 सकारात्मक कोशिकाओं का चयन एक Pax7-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा निर्धारित किया जा सकता है और एक प्रवाह cytometer पर अभिव्यक्ति को मापने. चित्र 4 में पैक्स7 इम्युनोस्टेनिंग द्वारा निर्धारित किए गए एचएमपीसी की संख्या की तुलना की गई है (चित्र 4क) बनाम एफएसीएस प्रक्रिया (चित्र 4ख) जो इस प्रोटोकॉल में कोशिकाओं की समान जनसंख्या से विस्तृत है। चित्र 5 में पैक्स7 इम्युनोमिटेनिंग और विश्लेषण का उपयोग करता है ताकि पैक्स7 की समृद्धि को दिखाने के लिए एफएसीएस के बाद कुल जनसंख्या में कोशिकाओं को व्यक्त किया जा सके (चित्र 5क की तुलना में चित्र 5ख) के साथ-साथ पैक्स7 की संख्या के रखरखाव के साथ-साथ पारित होने के बाद कक्षों को व्यक्त करना (चित्र 5ब् की तुलना में चित्र 5ठ) ।

hMPCs अनुभाग 6 का पालन करके मायोट्यूब बनाने के लिए विभेदित किया जा सकता है। निर्धारित करने के लिए कि क्या अलग hMPCs myogenic क्षमता कोशिकाओं को बनाए रखने भ्रूण मायोसिन भारी श्रृंखला के लिए विशिष्ट एक एंटीबॉडी के साथ immunostained जा सकता है और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर visualized. भ्रूणीय मायोसिन भारी शृंखला धनात्मक मायोट्यूब के प्रतिनिधि चित्रों को चित्र 6में देखा जा सकता है .

Figure 1
चित्र 1 : hMPCs के लिए प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री छवियों मांसपेशियों बायोप्सी ऊतक से सीधे बाहर हल. (ए) साइड स्कैटर क्षेत्र (y-अक्ष) बनाम अग्र प्रकीर्णक क्षेत्र (ग-अक्ष) गैटिंग रणनीति जिसका उपयोग दाता नमूने में सभी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया जाता है। (बी) 7-AAD व्यवहार्यता दाग (y-अक्ष) बनाम आगे तितर बितर (x-अक्ष) जीवित कोशिकाओं की पहचान करने के लिए। (C) ऋणात्मक चयन सॉर्टिंग मार्कर प्रोफ़ाइल (-CD11b, -CD31, -CD45, -GlyA [y-अक्ष]] बनाम चयन मार्कर CD34. (घ) ऋणात्मक चयन मार्कर CD34 (y-अक्ष) बनाम धनात्मक चयन मार्कर CD29. (ई) सकारात्मक चयन मार्कर CD56 (y-अक्ष) बनाम धनात्मक चयन मार्कर CD29 (x-अक्ष). (एफ) तीन अलग कंकाल मांसपेशी बायोप्सी से पैदावार. FSC [ आगे तितर बितर; एसएससी ] पक्ष तितर बितर; एचएमपीसी, मानव मांसपेशी जनक कोशिकाओं.

Figure 2
चित्र 2 : मानव दाताओं से प्राप्त hMPCs की संभावित क्षमता 6 मार्गों के बाद बनाए रखा है. (एक) प्रतिनिधि संगम स्कैन. (बी) प्रतिनिधि संगम हरे रंग की रूपरेखा के साथ स्कैन दिखा कैसे इमेजिंग साइटोमीटर निर्धारित संगम. लाल तीर प्लेट पर एक अपूर्णता से पता चलता है. (सी) प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड, होचस्ट 33342 (नीला), और प्रोपिडियम आयोडाइड (लाल) धुंधला और इन तीन चैनलों की विलयित छवि। स्केल बार ] 1mm. (डी) न्यूक्ली 6 अद्वितीय दाताओं से मायने रखता है hMPC विषमता पर प्रकाश डाला गया. (ई) संगम और नाभिकों की गणना अत्यधिक सहसंबद्ध होती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री hMPC अलगाव के लिए मापदंडों छँटाई. (ए) साइड स्कैटर क्षेत्र (y-अक्ष) बनाम अग्र प्रकीर्णक क्षेत्र (ग-अक्ष) गैटिंग रणनीति जिसका उपयोग दाता नमूने में सभी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया जाता है। (ठ) प्रांकी जनसंख्या से डबलेट को अयोग्य करने के लिए अग्र प्रकीर्ण क्षेत्र (ग-अक्ष) बनाम अग्र प्रकीर्णन ऊँचाई (y-अक्ष)। (ग) अग्र प्रकीर्ण ऊंचाई (य-अक्ष) बनाम 7-एएडी विदारक कोशिकाओं की पहचान करने के लिए निगमन। (घ) पीई-Cy7 (CD56) बनाम AF488 (CD29) डबल सकारात्मक कोशिकाओं (hMPCs) का प्रतिनिधित्व करने वाले Q2 के साथ धुंधला। रंग घटनाओं के घनत्व का प्रतिनिधित्व करता है.

Figure 4
चित्र 4 : CD29/CD56 सकारात्मकता बनाम Pax7 सकारात्मकता की तुलना में एक ही दाता से 4 hMPCs पारित करने में. (ए) गणना (y-अक्ष) बनाम Pax7 व्यंजक (x-अक्ष). (बी) सकारात्मक चयन मार्कर CD56 (y-अक्ष) बनाम धनात्मक चयन मार्कर CD29 (x-अक्ष). NCAM - तंत्रिका कोशिका आसंजन अणु; hMPC - मानव मांसपेशी जनक कोशिका.

Figure 5
चित्र 5 : Pax7 सकारात्मकता कई मार्गों पर एक ही दाता से व्युत्पन्न hMPCs में बनाए रखा है. (ए) पैक्स7 अभिव्यक्ति (ग-अक्ष) कोशिकाओं की जो एफएसीएस छँटाई से 4 गुना पहले पारित की गई थी। (बी) PAX7 अभिव्यक्ति (x-अक्ष) hMPCs के 1 मार्ग CD29 और CD56 सकारात्मकता (5 कुल मार्ग) के लिए FACS छँटाई के बाद. (ग) पैक्स7 अभिव्यक्ति (x-अक्ष) एचएमपीसी के 2 अंश सीडी29 और सीडी56 सकारात्मकता (6 कुल मार्ग) के लिए एफएसीएस छँटाई के बाद।

Figure 6
चित्र 6 : एचएमपीसी के दाग भ्रूण myosin भारी श्रृंखला के लिए मायोट्यूब व्युत्पन्न. अलग hMPCs के प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियों सह डीएनए दाग के साथ सना हुआ (Hoechst 33342, नीले) और भ्रूण मायोसिन भारी श्रृंखला (हरी) (एन $ 3). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्राथमिक hMPCs एक महत्वपूर्ण अनुसंधान मॉडल कंकाल मांसपेशी जीव विज्ञान और पुनर्योजी प्रक्रिया को समझने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. इसके अतिरिक्त, hMPCs चिकित्सा के लिए इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है. तथापि, अनुसंधान और चिकित्सा दोनों के लिए प्राथमिक एचएमपीसी का उपयोग करने में मान्यता प्राप्त चुनौतियां हैं, जिनमें मनुष्यों से व्युत्पन्न कोशिकाओं की सीमित समझभी शामिलहै। दाता संस्कृतियों के बीच विस्तार क्षमता में भी काफी भिन्नता है, जो एचएमपीसी के उपयोग की क्षमता को सीमित करती है और अनुसंधान परिणामों को प्रभावित कर सकतीहै। उदाहरण के लिए, यह हाल ही में दिखा दिया गया है कि hMPCs अलग इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि का उपयोग कर कोशिकाओं है कि विस्तार क्षमता में विभिन्न और यह ट्रांसक्रिप्शन प्रोफ़ाइल है कि सेक्स या11साल की उम्र के साथ संरेखित नहीं था द्वारा संचालित किया गया था का उत्पादन किया.

यहाँ, हम myotubes में भेदभाव सहित बहाव अनुप्रयोगों की एक संख्या के लिए पर्याप्त मात्रा में hMPCs अलग करने के लिए एक कुशल और उच्च उपज विधि पेश करते हैं, जिससे इन विट्रो में myogenic प्रक्रिया मॉडलिंग. हमारी विधि CD56+/CD29+ कोशिकाओं को अलग करने के लिए FACS पर निर्भर करता है, जो पहले से एक समृद्ध Pax7 जनसंख्या12व्यक्त प्रतिनिधित्व के रूप में पहचान की गई है. अन्य समान रूप से वैध सेल छँटाई रणनीतियों का भी वर्णन किया गया है5,6.

हमारे hMPC अलगाव और संस्कृति विधि का सबसे महत्वपूर्ण पहलू व्यक्तिगत संस्कृतियों की सावधान निगरानी है. दाता आधारित विषमता प्रत्येक बायोप्सी से प्राप्त hMPCs की संख्या भी शामिल है, उनके समय इन विट्रो में प्रसार आरंभ करने के लिए, और उनकी जनसंख्या विस्तार दर. इसलिए, अगर एक उपचार के बाद myotube गठन में मतभेद ब्याज व्यक्ति का सवाल है, hMPC संस्कृतियों एक संगम एक प्राथमिकता निर्धारित स्तर के आधार पर उपचार के लिए बंद किया जाना चाहिए और निष्पक्ष इमेजिंग साइटोमीटर का उपयोग कर मूल्यांकन.

हमारी विधि को अलग करने और संस्कृति hMPCs अपेक्षाकृत कम शुरू बायोप्सी ऊतक से इन विट्रो प्रयोगों के लिए लाखों में कोशिकाओं की पैदावार प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया है (50 डिग्री 100 मिलीग्राम). इस दृष्टिकोण का प्रमुख लाभ यह है कि कई assays और प्रयोगों एक ही दाता से hMPCs पर किया जा सकता है, प्रयोगों में दाता phenotype के रखरखाव के लिए अनुमति देता है, जबकि थोड़ा अंतर प्रयोग परिवर्तनशीलता शुरू. हमारी विधि हाल ही में प्रकाशित विधियों से भिन्न है जो पैक्स7 की शुद्ध जनसंख्या को निकालने पर ध्यान केंद्रित करती है जो सीधे बायोप्सी ऊतक से कोशिकाओं को व्यक्त करती है जहां फोकस एक्सोट्रांसप्लांटेशन8है . इन पिछले तरीकों के साथ चुनौती हालांकि, यह है कि वे एक ग्राम से अधिक की एक प्रारंभिक ऊतक वजन की आवश्यकता है. इसलिए, वे मानव कंकाल मांसपेशी बायोप्सी शामिल अनुसंधान के लिए व्यावहारिक नहीं हैं. हमारी विधि की एक सीमा यह है कि exotransplantation के लिए क्षमता का मूल्यांकन नहीं किया गया है. हालांकि, इस प्रकार की कार्यविधि मूल इच्छित downstream अनुप्रयोगों में से एक नहीं था। इस विधि के भविष्य के निर्देशों hMPCs के engraftment क्षमता का आकलन शामिल हो सकते हैं, हमारे अलगाव प्रक्रिया से गुजरने के बाद, निर्धारित करने के लिए कि क्या वहाँ एमपीसी प्रत्यारोपण अध्ययन में इस प्रक्रिया के उपयोग के लिए संभावित है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों को कॉर्नेल विश्वविद्यालय, जैव प्रौद्योगिकी संसाधन केंद्र इमेजिंग सुविधा फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई के साथ उनकी मदद के लिए धन्यवाद. हम भी भागीदार भर्ती और एरिका शराबी कंकाल मांसपेशी बायोप्सी के संचालन के लिए के साथ उसकी मदद के लिए मौली Gheller धन्यवाद. अंत में, हम अपने समय और अध्ययन में भाग लेने के लिए प्रतिभागियों को धन्यवाद. यह काम पुरस्कार संख्या R01AG058630 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों की उम्र बढ़ने पर राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था (B.D.C. और A.E.T. करने के लिए), चिकित्सा अनुसंधान के लिए एक ग्लेन फाउंडेशन और जूनियर संकाय के लिए उम्र बढ़ने अनुसंधान अनुदान के लिए अमेरिकी संघ द्वारा (बी करने के लिए . डीसी, और कॉर्नेल महिलाओं के लिए राष्ट्रपति परिषद द्वारा (ए.ई.टी.) के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA Corning 25-053-Cl Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate VWR 664160 Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube Falcon 352196 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate Grenier Bio-One 662 160 Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution eBioscience 00-6993-50 Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 BioLegend 303016 Conjugated antibody for FACS 
Black 96-well cell culture plate Grenier Bio-One 655079 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S Nexcelcom Bioscience Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer VWR 352350 Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail) Corning 354236 Collagen for coating cell culture plates 
Collagenase D Roche 11 088 882 001 Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide VWR WN182 Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II Sigma Life Sciences D4693 A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder Gibco 31600-034 Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 21600-010 PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate J.T. Baker 4040-01  Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum VWR 89510-186  Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12 Gibco 21700-026 Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum Gibco 26-050-070 Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer iNCyto DHC-N0105 Used to count cells
Hibernate A Gibco A1247501 Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate Life Technologies H21492 DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol Fisher Scientific A416P-4 Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer Orflo MXA006 Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes Orflo MXC002 Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter Orflo Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001 Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%) Thermo Fisher Scientific 50062Z Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 BD Pharmingen 557747 Conjugated antibody for FACS 
Penicillin/Streptomycin 100x Solution Corning 30-002-CI Antibiotics added to culture media
Propidium iodide Thermo Fisher Scientific P3566 DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor Promega G5071 Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium  Gibco 12648-010 Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-3 Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes VWR 60818-565 Tubes used for FACS
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42 Compensation beads fort calibrating flow FACS settings

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 150 मानव वयस्क स्टेम सेल मांसपेशी जनक कोशिकाओं कंकाल मांसपेशी बायोप्सी सेल संस्कृति उपग्रह सेल कंकाल की मांसपेशी
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Gheller, B. J., Blum, J., Soueid-Baumgarten, S., Bender, E., Cosgrove, B. D., Thalacker-Mercer, A. Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure. J. Vis. Exp. (150), e59580, doi:10.3791/59580 (2019).

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