Summary
骨格筋生検組織から得られたヒト原発性筋前駆細胞(hMpAc)を分離、培養、特徴付け、分化する技術を提示する。これらの方法によって得られ、特徴付けられたhMpPCは、その後、ヒトの筋形成および骨格筋再生に関連する研究の質問に対処するために使用することができる。
Abstract
一次ヒト組織および細胞の使用は骨格筋再生プロセスのような生物学的および生理学的プロセスの調査にとって理想的である。ヒト原発性成人幹細胞、特に骨格筋生検に由来するヒト筋肉前駆細胞(hMpC)を用いて働く上で認識された課題があり、採取された組織からの低細胞収率およびドナーの大きな不均一性を含む。文化間の成長と死のパラメータ。不均一性を実験設計に組み込むには、有意な効果を検出するためにより大きなサンプルサイズが必要ですが、hMPC拡張能力の変動性を支えるメカニズムを特定できるため、より深く理解することができます。骨格筋再生における不均一性。培養能力の拡大能力を区別する新しいメカニズムは、骨格筋再生を改善する治療法の開発につながる可能性を秘めている。
Introduction
骨格筋は人体最大の臓器系であり、全身質量1の30~40%を占める。運動におけるそのよく認識された役割に加えて、骨格筋は体温と姿勢を維持し、全身栄養恒常性の中心的な役割を果たしています。人間の参加者、動物、および細胞培養モデルを含む研究はすべて、骨格筋生物学と再生に関する問題に対処するために価値があります。ヒト原発性筋前駆細胞(hMpC)の単離および培養は、細胞培養技術および操作をヒトサンプルに適用することを可能にする堅牢なモデルを提供する。hMpCを使用する利点は、各ドナー2、3からの遺伝的および代謝表現型を保持することです。ドナー表現型の維持は、研究者が筋原性プロセスにおける個々の変動を調べることを可能にする。例えば、hMPC人口拡大能力4の年齢と性別の違いを特定するために、hMPC特性分類法を採用しています。
このプロトコルの目的は、骨格筋生検組織からHMPCを分離、培養、特徴付け、および区別する技術を詳細に説明することです。hMPCを記述し、hMPC分離5、6の潜在的な細胞表面メーカーを同定した前の研究に基づいて、このプロトコルは、hMPCの特性に分離をリンクすることにより、知識の重要なギャップを埋めます。さらに、このプロトコルに含まれる詳細なステップバイステップの指示により、hMPCの分離と特性評価は、hMPCの経験が限られているものを含む幅広い科学的聴衆にアクセス可能になります。我々のプロトコルは、細胞集団を追跡するためのイメージングサイトメーターの使用を記述する最初の一つである。新しく設計されたイメージングサイトメーターは、最先端のハイスループットおよびマイクロプレートベースで、培養容器の各ウェル内のすべての細胞の生細胞イメージング、細胞カウント、多チャンネル蛍光解析を数分以内に可能にします。このシステムは、培養への中断を最小限に抑えながら、細胞集団全体の増殖および生存率の動的変化を迅速に定量することを可能にする。例えば、我々は、異なるドナーから派生した各培養物の成長運動学を決定するために、インビトロで連続した日に合流の客観的な測定を行うことができる。文献中の多くのプロトコル、特にLPCの分化を伴うプロトコルは、分化または治療7を開始する前に、細胞が合流の定義されたレベルに達する必要がある。我々の方法は、研究者が公平で非主観的な方法で治療を開始することを可能にする培養容器内の各井戸の合流を客観的に決定することを可能にする。
以前は、一次hMpNCを使用する主な制限は、実験に利用可能な細胞の数を制限する低収率でした。我々および他の人は、骨格筋生検組織からのMpCの収率が組織のミリグラム当たり1−15 PPCであることを示している(図1)8.私たちのプロトコルは、蛍光活性化細胞選別(FACS)で精製する前に細胞の4つの通路を可能にするので、私たちの凍結保存されたhMPC収率は、少量の生検組織(50−100 mg)に由来し、研究目的に対処するのに十分です。複数の実験が必要です。当社のFACSプロトコルは、約80%の純粋な(Pax7陽性)MPC母集団を生成するため、当社のプロトコルは収量と純度の両方に最適化されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
このプロトコルは、コーネル大学の機関審査委員会によって承認されました.すべての参加者は、基礎となる健康状態についてスクリーニングされ、インフォームドコンセントを与えられた。
骨格筋生検によるヒト筋肉組織の取得
- 触診、解剖学的ランドマーク、および筋肉の活発な収縮を介して広大な横索筋を識別します。
- 参加者に四頭筋を締め付け、膝蓋骨から股関節までの約1/3の筋肉の腹を見つけ、大腿骨に向かうだけの気道を見つけることによって、広大な横子を触診する。
- 紙の測定テープを使用して、筋肉の腹を表す膝蓋骨の上部から約4−6インチの外科マーカーで領域をマークします。
- マークされた領域の近くで任意の髪を剃り、医療処置の前に使用される外科的等級の消毒剤で浄化する(例えば:2%クロルヘキシジングルコン酸(CHG)/70%イソプロピルアルコール(IPA)))
- 1%リドカインで生検部位を麻酔する。
注:骨格筋にリドカインを注入しないでください。. - マークされた部位で4−5mmの切開経路を作る。
- 領域が麻酔された後、筋膜を通してトロカールでベルクストローム針を筋肉の腹(約2−3センチメートル)に押し込みます。
- アシスタントが付属の60 mLシリンジプランジャーを引き抜くことによって吸引を適用しながら、切断トロカー2−3センチメートルを引き抜くことによって、ベルクストローム針に筋肉組織を引き込む。
- 切断室を閉じます。
- 生検針の基部を四分の一回転に回転させ、針を開け、吸引を適用し、針を閉じるシーケンスを繰り返します。
注:針が閉じるたびに、筋肉組織の切り傷はベルクストローム針の内側で得られるべきである。サンプル採取の間、針は各サンプルを得るために360°を通して縦方向に回転させながら、同じ縦の位置の大腿に残る。このシーケンスは 3~4 回繰り返すことができます。 - 採取した生検組織を針から無菌の非付着性ドレッシングパッドに排出する。
- 組織を調べ、滅菌メスの刃またはピンセットを使用して目に見える脂肪および線維組織を取り除きます。
- CO2-独立栄養培地(例えば、休止状態A)を含む無菌チューブに組織の一部(50−100mg)を入れます。
注:組織の重量は以下のように決定される。まず、栄養培地を含むキャップチューブをスケールとタレに入れます。次に、組織をチューブに入れ、チューブを要約し、その後、栄養培地に組織を含むチューブを重量を量る。 - 組織および栄養培地を含むチューブを処理するまで4°Cに保管する。
注:生検組織は、収集の48時間以内に処理する必要があります。
2. 生検組織からヒト筋肉前駆細胞を分離する
- ミンチ生検組織
- 栄養培地から生体安全キャビネットまたは同様の滅菌作業場で無菌ペトリ皿に筋肉組織を移す。
- 生殖不能のメスブレードを使用して、組織を〜1mm3個にミンチさせます。
- ミンチされた生検組織を洗浄して残留破片を除去します。
- リン酸緩衝生理食べ物(PBS)の10 mLを含む15 mL円錐管に筋肉組織を移し、組織が重力によって定着することを可能にする。
- 筋肉組織を乱しないように注意して上清を吸引します。
- 洗浄された組織に10 mLのPBSを追加し、筋肉組織が重力によって再定着することを可能にする。
- 筋肉組織を乱しないように注意して上清を吸引します。
- 低グルコースダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)の10 mLを追加し、組織が重力を介して再定着できるようにします。
- 筋肉組織を乱しないように注意して上清を吸引します。
- 消化媒体で組織をインキュベートします。
- 消化器系の3mLで筋肉組織を再中断する(低グルコースDMEMで2mg/mLコラゲナーゼD)。
注:コラゲナーゼDストック溶液は、低グルコースDMEMで20mg/mLで調製し、-80°Cで保存し、使用時に低グルコースDMEMで1:10を希釈することができます。 - 水浴中の筋肉組織を含むチューブを30分間37°Cでインキュベートします。
- 10 mLの血清ピペットまたは広い穴のピペットを使用して、10分ごとに筋肉組織懸濁液をトリチュレートします。
- 追加のダイジェスト培地の83 μLと24 μLのジスパーゼ溶液(0.76 mM酢酸カルシウム、1.39mM酢酸ナトリウム、13.91mg/mLジスパーゼII低グルコースDMEM)を追加します。懸濁液を37°Cの水浴に戻します。
- 広い穴のピペットの先端と5-10分ごとに筋肉組織の懸濁液をトリチュレートする。
- 均一なスラリーが達成されるまでトリチュレーションを続け、消化を防ぐために1.5時間を超えないようにしてください。
注:組織の十分なミンチとコラゲナーゼおよびジスパーゼの酵素活性は、サンプル消化に影響を与える可能性があります。均一なスラリーは1.5時間後に最低の閉塞で正常なピペットの先端を通ることができるはずである。1.5h後に均一なスラリーが達成されない場合は、組織ミンチが十分であることを再確認し、組織が適切なサイズにミンチされます(ステップ2.1.2)。さらに、酵素の活性は、酵素活性のロット変動が発生するようにロットとしてテストされるべきである。
- 消化器系の3mLで筋肉組織を再中断する(低グルコースDMEMで2mg/mLコラゲナーゼD)。
- 回収媒体中のペレット細胞と凍結。
- 成長培多剤の6mL(GM;79%ハムF12、20%胎児ウシ血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、5ng/mL基本線維芽細胞増殖因子[bFGF]、pH 7.4、筋肉スラリーに0.22 μmフィルターを通過)
- 70 μmセルストレーナーを通して50 mL円錐管に懸濁液をピペットします。GMの追加4 mLでストレーナーをすすいで下します。
注:サンプルはペレットを視覚化する容易のための15 mL円錐形の管に戻すことができる。後続の細胞収率が低い場合は、より大きな洗浄量を使用することができます。 - 室温(RT)で5分間300 x gで遠心分離機。
- ペレットを破壊しないように上清を吸引します。チューブをフリックして、残りのメディアのペレットを再サスペンドします。セルを培養しない場合は、すぐにステップ 2.4.5 に進み、長期保存の手順を実行し、それ以外の場合はステップ 3.1.6 に進みます。
注:即時培養が望ましい場合は、細胞培養プレートのGMを生検処理を開始する前に事前インキュベートする必要があります(ステップ3.1.1および3.1.2)。 - 回収したペレットに回収細胞培養凍結培地(材料表)を1.5mL添加する。
- スラリーを凍結に移します。凍結凍結をイソプロパノール制御レートチラーに一晩-80°Cに置きます。培養の準備ができるまで-80°Cで凍結を保存します。
注:スラリーを含有するクライオビアルは、長期保存(1ヶ月以上)のために液体窒素中に保持することができる。イソプロパノール制御レートチラーを使用すると、細胞を1°C/分の速度で再現可能に凍結することができ、凍結後の生存率および細胞培養容器への付着の可能性の増加によって証明されるように最適な細胞回収率をもたらす9。あるいは、RTイソプロパノールを含むビーカーを、-80°C冷凍庫に入れてもよい。
3. ヒト筋肉前駆細胞の培養
- 筋肉スラリーを解凍します。
- hMpAcの解凍および播種に先立ち、GMで250μLの細胞培養プレートをコラーゲンコーティング(コラーゲンI)の4ウェルに加え、24ウェル細胞培養プレートを追加する。残りのウェルを500μLの滅菌塩基媒体(F12)で充填し、長期培養中の蒸発を防ぎます。
注:50gと100gの間の生検の場合、24ウェルプレートの4つのウェルが適切です。生検組織が50g未満の場合、2つのウェルがより適切である可能性があります。残留デブリと低いセル数は、このステップでセル計数技術の使用を防ぎます。したがって、正確な播種密度は決定されず、生検から生検までわずかに変化する。 - 種子化前に1時間、5%CO2で37°CでGMを用いる細胞培養容器をインキュベートする。
- -80 °C冷凍庫から凍結液を取り出し、37°Cの水浴に置きます。チューブ内の液体は完全に水に浸す必要があります。
- 解凍がほぼ完了したら(約5分)、クライオビアルを無菌層流フードに移します。凍結管から筋肉スラリーを移し、1mL/分の速度で予め温められたGMの6 mLを含む15 mL円錐形の管に加える。
- RTで5分間300 x gで筋肉スラリーを遠心分離します。
注:スイングバケツ遠心分離機は、このステップで小さなペレットを視覚化することが容易になりますが、必須ではありません。 - ペレットを破壊しないように上清を吸引します。チューブをフリックして、残りのメディアでペレットを再サスペンドし、GMの1 mLで再サスペンドします。
- 再懸濁ペレットの250 μL(現在はhMPC懸濁液と考えられる)を、予めインキュベートされた24ウェル細胞培養プレートの4ウェルのそれぞれに移す。
- hMpAcの解凍および播種に先立ち、GMで250μLの細胞培養プレートをコラーゲンコーティング(コラーゲンI)の4ウェルに加え、24ウェル細胞培養プレートを追加する。残りのウェルを500μLの滅菌塩基媒体(F12)で充填し、長期培養中の蒸発を防ぎます。
- 文化と通路のHMpC.
- 5% CO2で 37 °C で GM の hMPC 培養を維持します。
注:bFGFを持たないGMの在庫(すなわち、F12、抗生物質、FBS)はバッチで調製され、最大2週間4°Cに保たれる。bFGFは使用日にGMに追加されます。bFGFを含む媒体は4°Cで48時間貯えることができる。 - 単離後24時間後、GMを吸引し、予め温めたGMで培養容器2xを静かに洗浄し、新鮮なGMを加える。
注: 24 h は、hMpC をアタッチするのに十分な時間を提供する必要があります。洗濯後にhMpACを取り外す必要はありません。このステップはまた、細胞の収穫の間に発生した残りの破片を除去し、容器がイメージングサイトメーター(以下のセクション5)を使用して正確な合流スキャンをより容易にします。この最初のメディア変更後、GM は 48 時間ごとに変更されます。 - 70%の合流が達成された場合、または同じ培養皿に10日間残っている場合、どちらが最初に発生するかの通路hMpC。
注:70%の合流は約55,000細胞/cm2である。 - 通行するには、24ウェル細胞培養プレートの各ウェルに250μLの予め温めたトリプシンを加え、約5分間インキュベートします。
- しっかりした表面の細胞培養容器をタップして、hMpAcを取り外します。光顕微鏡を使用して、hMpCが切り離されたことを確認できます。
- トリプシン/hMPCサスペンションを15mL円錐管でGMの5 mLに移します。
- rtで5分間300 x gでhMPCサスペンションを遠心分離します。
- 遠心分離機からhMPC懸濁液を取り外し、無菌層流フードの氷の上に置きます。
注:通過時にhMpCを氷上に保つと、細胞集約が少なくなります。 - hMPCから上清を吸引し、GMの1 mLでペレットを静かに再中断します。
- ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンタを使用して細胞をカウントします。
注:細胞計数バッファーへの細胞懸濁液の1:5希釈は、一般に適切である。 - 種子hMPCは、cm2当たり3,500細胞の密度で予温められたGMを含むコラーゲンコーティング培養皿に当てはめる。10 cm版および24ウェル版の組合せは理想的である。24ウェルプレートは、画像サイトメーターで毎日スキャンして成長を監視できます。
- 後続の通路についても同じ手順(ステップ3.2.4.から)に従ってください。
注:細胞の健康および純度は、細胞老化のマーカー(例えば、β-ガラクトーシダーゼ)およびPax7の免疫染色を使用して通路を横切って監視することができる。
- 5% CO2で 37 °C で GM の hMPC 培養を維持します。
- hMpC を凍結保存します。
- 培養量をより管理しやすくするために、後で使用するために余分な細胞を凍結保存します。
- 凍結保存については、手順 3.2.4.-3.2.9 で説明するトリプシン化手順に従ってください。
- 細胞懸濁液が遠心分離されている間、20%(例えば、200μL)ジメチルスルホキシド(DMSO)および80%(例えば、800μL)GM.ピペットの上下20xの混合物を調べ、適切な混合を確保する。混合物を氷の上に残しておきます。
- 細胞数に基づいて、hMPC懸濁液をGMで2 x 106/mLに希釈する。
- hMPC懸濁液および20%の無菌DMSO/80%GM混合物50/50を結合する。最終的な凍結保存メディアは、DMSO(10%)の組み合わせです。とGM (90%)1 x 106 hMpMc/mL を含む。
- ステップ3.3.5で調製したhMPC懸濁液の1 mLを、初期細胞数が許す限り多くの凍結液に入れる。その後、アリクォートされたhMpAcをイソプロパノール制御レートチラーに一晩-80°C冷凍庫に入れます。
注:このステップでは、典型的には5〜1500万個の細胞が得られ、そのうちの30−60%がFACSによってhMpCとして同定される。
4. フローサイトメトリーによるPax7+ヒト筋肉前駆細胞の分離
- 生培養からhMpIcを調出す(ステップ3.2.11)、1 x 106-2 x 106全細胞に十分な培養容器をトリプシン化する。手順 3.2.4−3.2.9に記載されているように、細胞懸濁液を準備する。
- 凍結保存された培養物からhMpCを準備する(ステップ2.4.6または3.3.6)。
- 各ドナーに対して~1 x 106通路 4 hMpNc を含む 1-2 チューブを選択します。
注:4つのhMpMcを使用すると、通路6まで増殖性を維持しながら、十分な細胞収率を可能にする(図2)。 - -80°C冷凍庫からそれらを取り除き、チューブ内の液体を完全に水没させた37°Cの水浴に入れて、急速に解凍します。
- 解凍がほぼ完了した場合(約5分)、hMpCを無菌層流フードに移し、細胞懸濁液の内容物を1mL/分の速度で15mL円錐管で予め温めたGMの6mLに移す。
- 手順 3.2.7−3.2.9に記載されているように、細胞懸濁液を準備する。
- 各ペレットをFACSバッファーの3mL(500 mL PBS、12.5 mL正常ヤギ血清、2 mL 0.5 M EDTA、pH 7.4、0.22 μmフィルタ)で再ステーペンします。
- RTで5分間300 x gでセル懸濁液を遠心分離します。
- hMpCから上清を吸引し、FACSバッファーの250 μLでペレットを穏やかに再中断します。氷の上に置く
- 1.7 mLマイクロ遠心分離管に100 μLの細胞を入れ、氷の上に放置して生きた/死んだコントロールとして使用します(ステップ4.5.1)。
注:生きている/死んだコントロールに使用される細胞の100 ulは、ソートまたはバンクされた細胞から各ドナーから再懸濁された細胞の少量(〜20 ul)を取ることから来ることができます。
注:単一のドナーから再懸濁した細胞の20 ul以上を取らないことは重要です。細胞の< 100 ulが利用可能な場合は、FACSバッファで最大100 ulのボリュームを持参してください。
- 各ドナーに対して~1 x 106通路 4 hMpNc を含む 1-2 チューブを選択します。
- セルサーフェス マーカーのステンド hMpIc。
- 以下の抗体カクテルを調製する(表示される量は各培養物に対して、適切にスケールアップ):5 μL CD56(神経細胞接着分子[NCAM];PE-Cy7-共役)および5 μL CD29(β1-インテグリン;AlexFluor488-共役)。最終的な抗体希釈は1:50です。
- 各hMPC懸濁液に10 μLの抗体カクテルを加え、暗闇の中で30分間氷の上でインキュベートします。
- 各懸濁液/抗体カクテル混合物にFACSバッファーの10 mLを追加します。
- RTで5分間300 x gで各管を遠心分離します。
- FACSバッファーの300 μLでペレットを再ステースし、5 mLの丸底ポリスチレンチューブに移します。
- 懸濁液を氷の上に置き、光から保護してください。
- 補正ビーズを準備します。
注:各抗体の正のコントロールと負のコントロール(染色されていないビーズ)は、補償ビーズを使用して調製する必要があります。補正ビードコントロールは、ソートするサンプルの前にフローサイトメーターで実行する必要があります。これらのコントロールは、補償を適用できるように、各抗体からのフルオロクロムを他方のチャネルで検出できる量を決定することを可能にします。- 渦補正ビーズ。
- 3つの1.7 mLマイクロ遠心分離管で、補償ビーズの1滴(50 μL)を追加します。
- 各抗体の1 μLを適切なチューブに添加するか、または負の対照に対して何も加えない。
- 暗闇の中で15分間インキュベートします。
- 各チューブと渦にFACSバッファの1.5 mLを追加します。
- RTで5分間ベンチトップ遠心分離機で300 x gで各チューブを遠心分離します。
- 上清を吸引し、FACSバッファーの200 μLでペレットを再中断します。
注:ペレットを視覚化することは非常に困難な場合があります。上清を吸引する際には注意が必要です。 - サスペンションを5mLの丸底ポリスチレンチューブに入れ、チューブを氷の上に置き、光から保護します。
- ライブコントロールとデッドコントロールを準備します。
- hMPCの100 μLをステップ4.2.8から2つの1.7 mLマイクロ遠心分離管(ライブコントロール用とデッドコントロール用)に分割します。
- デッドコントロールチューブを70°Cに予め温めた加熱ブロックに入れ、>10分間温めます。この間、氷の上でライブコントロールを維持します。
- RTで5分間ベンチトップ遠心分離機で300 x gで各チューブを遠心分離します。
- 上清を吸引し、FACSバッファーの150 μLでペレットを再中断します。
- 単一の5 mLラウンドボトムポリスチレンチューブにライブ/デッドコントロールを組み合わせます。
- 生存率染色を行います。
- ソートする細胞を含むすべてのチューブと生きた/死のコントロールを含むすべてのチューブに7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)の1 μLを追加します。
- コラーゲンコーティングされた24ウェル(250 μL/ウェル)および10cm(8 mL/ウェル)プレートにGMを加え、5%CO2で37°Cの細胞培養インキュベーターで平衡化することができます。
- フローサイトメトリーを介してhMpcをソートします。
- 20 psiの圧力で100 μmのノズルが付いている流れサイトメーターでhMPCを並べ替える。サイドとフォワードの散乱と 7-AAD 否定性に基づいてライブ hMPCS を決定します (並べ替えパラメータと代表的な並べ替えは図 3で確認できます)。
- PE-Cy7(780/60 nm)およびAlexFluor488(530/30 nm)に対して陽性の細胞はCD56+/CD29+細胞を表し、したがってPax7陽性細胞(hMPC)である。FACSバッファーの300 μLクッションを含むコレクションチューブに二重陽性細胞をソートします。
注:ソートされた培養物の純度は、Pax7の免疫染色に続いて下流流細胞メトリー分析によって決定することができる(図4)。 - 他のすべてのセルを破棄します。
- ソートしたセルを15 mL円錐形チューブに移します。
- rt で hMPC サスペンションを 300 x gで 5 分間回転させます。
- 上清を注意深く吸引し、GMの1mLで再中断する。
- ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンタを使用して細胞をカウントします。
注:細胞の数は正にソートされた事象の数として推測されるかもしれませんが、この数は、従来の細胞計数法と比較して10−40%の細胞数を過大評価することが分かっています。 - 手順 3.2.11 で説明されているように、hMpC をシードします。
注:hMPC集団の純度の検証は、Pax7に対する免疫染色およびフローサイトメトリーによる分析によって決定されうる。
5. イメージングサイトメーターを用いてヒト筋前駆細胞(hMPC)培養物を特徴付ける
-
撮像サイトメーター(材料の表)を使用して、合流スキャンを実行します。
- [新しいスキャンを作成]を選択し、[プレート カテゴリ]、[プレートプロファイル]、[プレート ID]を選択します。 イメージ投射のサイトメーターは96、24および6ウェル版を収容できる。
- [アプリケーション]で、[コンフルエンス > コンフルエンス1] を選択します。
- 画面の右側にあるナビゲーターを使用して表示するウェルを選択します。
- セルが背景と比較して白く見えるフォーカス平面を見つけ、[手動登録]を選択するか、イメージングサイトメーターで[自動登録]を選択してフォーカスの平面を選択できるようにします。
注:材料の表に提案された96の井戸の版のために、おおよその位置は4.3単位である。 - マウスを使用して、スキャンする必要があるすべてのウェルを強調表示します。井戸領域全体が自動的にスキャンされます。[スキャンの開始]を選択します。
- プレートとセルの種類に最適な解析設定を選択します。
注:hMPC の場合、次の設定が最適です: 強度 = 6、飽和強度 = 0、直径 = 8、最小厚さ = 3、最小クラスター サイズ = 500、精度 = 高。 - [分析の開始] を選択します。
注:画像を視覚的に検査して、ユーザーとイメージングサイトメーターが細胞の周囲に関して一致していることを確認します。大きな不一致が存在する場合は、フォーカスの異なる平面または異なる解析設定を使用してプレートを再スキャンします。合流スキャンは、培養間の成長、治療の投与時間を比較したり、細胞を監視し、分化を開始するタイミングを決定するために使用できます。差別化が必要な場合は、セクション6で詳細を提供します。
-
イメージングサイトメーターを使用して細胞をカウントします。
- ハムのF12の12mL、6μLのホーチスト33342および24 μLのヨウ化プロピジウムを含有する染色液を調出す。
- 吸引媒体を染色液に置き換え、37°Cで15分間インキュベートする。
- 吸引染色液を吸引し、ハムのF12と交換します。
注:明確な画像を得るためには、フェノール赤の低レベルのメディアを使用することが重要です。あるいは、PBSを用いてもよい。 - 画像化サイトメーターにプレートをロードし、[アプリケーション]の下で[セルの生存率]を選択します。ライブチャンネルは明るいフィールド画像になり、デッドチャンネルはヨウ化プロピジウムとなり、合計チャンネルはHoechst 33342になります。
- ライブチャンネルを明るいフィールドに設定し、[フォーカス設定]の下で[自動登録]をクリックします。
- [合計チャネル)[フォーカスを検索する」を使用して核をフォーカスにするか、上下矢印を使用してフォーカスを手動で設定します。[オフセットを設定] をクリックしてフォーカスを選択します。
- [デッドチャネルの下で、チャネルを赤に設定します。[フォーカスを検索]を使用して、死んだセルをフォーカスに移動したり、上下矢印を使用してフォーカスを手動で設定したりできます。[オフセットを設定] をクリックしてフォーカスを選択します。
- [スキャンの開始]を選択してスキャンを開始します。
- プレートとセルのタイプに適した解析パラメータを選択します。[解析の開始] を選択して解析を開始します。解析が完了した後、分析が細胞を適切にカウントしていることを視覚的に確認します(例えば、すべての核が核として認識されていること、およびイメージングサイトメーターがバックグラウンドで任意のスポットをカウントしていないことを総チャネルチェックします)。核)。スキャンと解析が十分に満足できる場合は、プレートをインキュベーターに戻し、それ以外の場合は解析パラメータを再スキャンまたは修正します。
6. ヒト筋前駆細胞(hMpac)をミオチューブに分ける
- セクション 5.1 のプロトコルを使用して hMPC コンフルエンスを判別します。hMPCをミオチューブに分化させるには、イメージングサイトメーター上の合流関数によって決定される細胞が80~85%のコンフルエントであることが理想的です(セクション5参照)。複数の一意のドナーからのhMpAcを使用する場合、合流スキャンは、異なるドナーからの細胞が合流に達した時点で分化を開始することを可能にする。
注:80%の合流点で、約66,000細胞/cm2があります。 - 分化媒体で細胞2xを洗浄する(97%ハムのF12、2%馬血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、pH 7.4、0.22 μmフィルターを通過)。
- 毎日メディアを切り替えながら、実験が指示する限り、分化メディア内の細胞を維持します。
- 胚性ミオシン重鎖に対する免疫染色による筋管形成を直接評価し、これは通常、7−10日の分化後に検出可能である。
注:ミオチューブの形成に必要な時間は、分化が開始されたときにドナーと細胞の数によって若干異なる場合があります。したがって、各ドナーからの培養物を個別に監視することをお勧めします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ヒト筋肉組織からのhMPC単離の代表的なフローサイトメトリー結果を図1に見ることができる。hMPCは、死んだ細胞や破片を除去するために、サイドスキャッタとフォワードスキャッタに基づく最初のゲーティングイベントによって識別され、続いて7-AADに対して負のセルのみを選択し、したがって実行可能です。細胞表面マーカーCD56およびCD29の両方に対して陽性の細胞の選択は、hMPC母集団を表す。60 mg の生検は約 75−250 hMppc を提供します。
代表的な合流スキャンを図2Aに示します。図2Bの緑色のアウトラインは、イメージングサイトメーターによって生成され、選択された解析設定に基づいてイメージングサイトメーターがどのように合流を決定したかを示す。図示される両方の画像において、撮像サイトメーターによって決定される合流点は、ユーザによって視覚的に決定される合流点と一致する。しかし、これらの画像はまた、イメージングサイトメーターが完全ではないことを強調しています。たとえば、赤い矢印は、セルとしてカウントされているプレートの欠陥を強調表示します。これらの不完全さの多数がプレート上に存在する場合、結果として生じる合流は細胞の合流を正確に表しません。図 2Cは、セル (明るいフィールド、青、赤) とマージされたイメージをカウントするために使用される 3 つのチャネルすべてを表しています。図2Dは、ドナー間の不均一性を示す。この不均一性を発見し、正確に特徴付けることは、イメージングサイトメーターの重要な応用である。図2Eは、一意のドナーからの合流測定と核数が高度に相関していることを示す。
図 3は、このプロトコルで説明されている FACS 手順に基づいて hMpAc を識別する方法のガイドラインを提供します。前方および側面散乱に基づくゲーティングは、破片から生存可能な細胞を分離することを可能にする(図3A)。高さによる前方散布とエリアの前方散布の比較は、単一のセルを表すイベント(図3Bのボックス化領域)を区別するために使用されました。生存細胞は、生存性染色7-AAD(図3C)の組み込みの欠如によって特徴付けられている。最後に、CD56とCD29の両方について陽性の細胞はhMpC(図3D)として同定される。このプロトコルに記載されているFACS手順を検証するために、Pax7陽性細胞の選択は、Pax7特異的抗体を有する免疫染色細胞およびフローサイトメーター上の発現の測定によって決定することができる。図4は、同じ細胞集団からこのプロトコルで詳述されたPax7免疫染色(図4A)とFACS手順(図4B)によって決定されるhMPCの数を比較する。図5は、Pax7免疫染色とフローサイトメトリーによる分析を用いて、FACS後の全集団におけるPax7発現細胞の濃縮(図5Bと比較して図5A)とPax7の数の維持を示す。通過後の細胞を発現する(図5Cと比較して図5B)。
hMpCは、セクション6に従うことによってミオチューブを形成するために区別することができる。単離されたhMpCがミオゲン能力細胞を維持しているかどうかを決定するために、胚性ミオシン重鎖に特異的な抗体を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡を用いて可視化することができる。胚性ミオシン重鎖陽性筋管の代表的な画像を図6に見ることができる。
図 1: 筋肉生検組織から直接選別されたhMpCの代表的なフローサイトメトリー画像。(A) ドナーサンプル内のすべての細胞を識別するために使用される側散布領域(Y軸)と前方散布領域(X軸)ゲーティング戦略。(B) 7-AAD生存率染色(Y軸)と前方散乱(x軸)を用い、生細胞を同定する。(C) 負の選択ソートマーカープロファイル (-CD11b, -CD31, -CD45, -GlyA [y 軸]) 対選択マーカー CD34.(D) 負の選択マーカー CD34 (Y 軸) と正の選択マーカー CD29。(E)正選択マーカー CD56 (Y 軸) と正選択マーカー CD29 (x 軸)(F)3つの異なる骨格筋生検からの収量。FSC = 前方散乱;SSC = サイドスキャッタ。hMpAc, ヒト筋肉前駆細胞.
図 2: ヒトドナー由来のhMpCの増殖可能性は、6節後に維持される。(A)代表的な合流スキャン。(B)代表的な合流点スキャンと緑色の輪郭は、撮像細胞計が合流を決定する方法を示す。赤い矢印は、プレート上の欠陥を示しています。(C)代表的なブライトフィールド、ホーヒスト33342(青)、及びヨウ化プロピジウム(赤色)染色及びこれら3チャンネルの合体画像。スケールバー = 1mm. (D) 6個のユニークなドナーからの核カウントは、hMPCの不均一性を強調する。(E) 合流数と核数は相関性が高い。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: hMPC分離のための代表的なフローサイトメトリーソートパラメータ。(A) ドナーサンプル内のすべての細胞を識別するために使用される側散布領域(Y軸)と前方散布領域(X軸)ゲーティング戦略。(B) 前方散布高(Y 軸)と前方散布領域(x 軸)を使用して、並べ替え母集団から二重のツバキを失格にします。(C) 前方散乱高(Y軸)と7-AAD組み込みで生存可能な細胞を同定する。(D) PE-Cy7 (CD56) 対 AF488 (CD29) 二重陽性細胞(hMPC)を表すQ2で染色する。色はイベントの密度を表します。
図 4: 同じドナーからの通路4 hMpacにおけるCD29/CD56陽性対Pax7陽性の比較。(A) カウント (Y 軸) と Pax7 式 (x 軸)。(B)正選択マーカー CD56 (Y 軸) と正選択マーカー CD29 (x 軸)NCAM = 神経細胞接着分子;hMPC = ヒト筋肉前駆細胞。
図 5: Pax7陽性は、複数の通路にわたって同じドナーから派生したhMpCで維持される。(A) FACS選別前に4回通過していた細胞のPax7発現(x軸)。(B) CD29およびCD56陽性(5つの合計通路)のFACSソート後のhMpCs 1通路のPax7式(x軸)。(C) CD29 および CD56 陽性(6つの合計通路)のFACSソート後のhMpC2通路のPax7式(x軸)。
図 6: 胚性ミオシン重鎖に対するhMPC由来ミオチューブの染色。DNA染色(Hoechst 33342、青)と胚性ミオシン重鎖(緑)(n=3)と共染色された分化されたhMPCの代表的な顕微鏡画像。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
一次hMpPCは、骨格筋生物学と再生プロセスを理解するために使用される重要な研究モデルです。さらに、hMpCは治療に使用される可能性を秘めている。しかし、ヒト10に由来する細胞の限られた理解を含む、研究と治療の両方に一次hMpCを使用する上で認識された課題がある。ドナー培養物間の膨張能力のばらつきも大きく、hMPCの使用の可能性を制限し、研究結果11に影響を与える可能性がある。例えば、最近、このプロトコルに記載された方法を用いてhMpCを単離し、膨張容量が変化する細胞を産生し、これは性別または年齢11と一致しなかった転写プロファイルによって駆動されたことが最近実証された。
ここでは、筋管への分化を含む多数の下流アプリケーションに対して十分な量でhMpCを分離するための効率的かつ高収率法を提示し、それによってインビトロにおける筋原性プロセスをモデル化する。我々の方法は、以前に集団12を発現する濃縮されたPax7を表すとして同定されたCD56+/CD29+細胞を単離するためにFACSに依存している。他の同様に有効な細胞選別戦略も5,6と記載されている。
私たちのhMPCの分離および培養方法の最も重要な側面は、個々の文化の注意深い監視です。ドナーベースの不均一性には、各生検から得られたhMpCの数、インビトロでの増殖を開始する時間、および集団膨張率が含まれる。従って、治療後の筋管形成の違いが関心のある個人の問題である場合、hMPC培養物は、先行性を決定し、画像化サイトメーターを用いて客観的に評価する合流レベルに基づいて治療に切り替えるべきである。
HMPCを単離および培養する方法は、比較的少ない開始生検組織(50−100mg)からインビトロ実験のために数百万の細胞の収率を得るために最適化されています。このアプローチの主な利点は、同じドナーからのhMpCで複数のアッセイと実験を行うことができ、実験間の変動をほとんど導入しながら、実験全体でドナー表現型を維持できることです。我々の方法は、Xeno移植8に焦点を当てた生検組織から直接細胞を発現するPax7の最も純粋な集団を抽出することに焦点を当てた最近発表された方法とは異なる。しかし、これらの以前の方法の課題は、1グラム以上の開始組織重量を必要とすることです。したがって、それらは人間の骨格筋生検を含む研究には実用的ではない。我々の方法の1つの限界は、xeno移植の可能性が評価されていないという。ただし、このタイプのプロシージャは、元の意図されたダウンストリーム アプリケーションの 1 つではありませんでした。この方法の将来の方向性は、我々の分離手順を経た後、MPC移植研究においてこの手順の使用の可能性があるかどうかを決定するために、hMpCの生着容量を評価することを含みよい。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、コーネル大学、バイオテクノロジー・リソース・センター・イメージング・ファシリティーが蛍光活性化細胞選別に協力してくれたことに感謝している。また、モリー・ゲラーが参加者募集に協力してくれたことに感謝し、エリカ・ベンダーが骨格筋生検を行った。最後に、参加者の時間と研究への参加に感謝します。この研究は、国立衛生研究所の高齢化に関する国立研究所の助成金番号R01AG058630(B.D.C.およびA.E.T.)の下で、グレン医学研究財団と米国若手教員のための老化研究助成金連盟(Bに対して)によって支援されました。.D.C.)、およびコーネル女性のための大統領評議会(A.E.T.に)によって。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels |
| 10 cm cell culture plate | VWR | 664160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352196 | 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols |
| 24 well cell culture plate | Grenier Bio-One | 662 160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Viability stain for identifying living cells during FACS sorting |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Conjugated antibody for FACS |
| Black 96-well cell culture plate | Grenier Bio-One | 655079 | 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S |
| Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Imaging cytometer used to track hMPC cultures | |
| Cell Strainer | VWR | 352350 | Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing |
| Collagen Type I (Rat Tail) | Corning | 354236 | Collagen for coating cell culture plates |
| Collagenase D | Roche | 11 088 882 001 | Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | WN182 | Used for cryopreservation of hMPCs |
| Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder | Gibco | 31600-034 | Low glucose DMEM for muscle biopsy processing |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 21600-010 | PBS for muscle biopsy processing |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | J.T. Baker | 4040-01 | Required for FACS buffer |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 89510-186 | Fetal bovine serum used for hMPC growth media |
| Ham's F12 | Gibco | 21700-026 | Base media for hMPCs |
| Heat Inactivated Equine Serum | Gibco | 26-050-070 | Horse serum used to make hMPC differentiation media |
| Hemocytometer | iNCyto | DHC-N0105 | Used to count cells |
| Hibernate A | Gibco | A1247501 | Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Life Technologies | H21492 | DNA stain for identifying all cells using the Celigo S |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Used for controlled rate freezing of hMPCs |
| Moxi buffer | Orflo | MXA006 | Buffer for automated cell counter |
| Moxi Cassettes | Orflo | MXC002 | Cassesttes for automated cell counter |
| Moxi z Mini Automated Cell Counter | Orflo | Automated cell counter | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Commerically available controlled rate cell freezing container |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Goat serum used in FACS buffer |
| PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Conjugated antibody for FACS |
| Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Corning | 30-002-CI | Antibiotics added to culture media |
| Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S |
| Recombinant Human basic fibroblast growth factor | Promega | G5071 | Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Gibco | 12648-010 | Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | Added to Ham's F12 |
| Sterile Round Bottom 5 mL tubes | VWR | 60818-565 | Tubes used for FACS |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Compensation beads fort calibrating flow FACS settings |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- D'Souza, D. M., et al. Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling. Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).
- Scheele, C., et al. Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
- Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).
- Charville, G. W., et al. Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Alexander, M. S., et al. CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies. Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).
- Thalacker-Mercer, A., et al. Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy. Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).
- Garcia, S. M., et al. High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells. Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).
- Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O.
- Bareja, A., Billin, A. N. Satellite cell therapy - from mice to men. Skeletal Muscle. 3 (1), 2 (2013).
- Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity. Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).
- Xu, X., et al. Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles. Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).
