Summary
אנו מציגים טכניקות עבור בידוד, culturing, אפיון, וההבחנה תאים האדם העיקרי שריר השריר (hMPCs) המתקבל רקמת שריר השלד ביופסיה. hmpcs התקבל ומאופיין באמצעות שיטות אלה ניתן להשתמש לאחר מכן לכתובת מחקר שאלות הקשורות מיוגנזה האדם התחדשות השלד שריר.
Abstract
השימוש ברקמות ובתאים האנושיים העיקריים הוא אידיאלי לחקירת תהליכים ביולוגיים ופיזיולוגיים כגון תהליך ההתחדשות של שריר השלד. ישנם אתגרים מזוהים לעבוד עם בתאי גזע האדם העיקרי בוגרים, במיוחד בתאי שריר האדם בתאים (hMPCs) נגזר ביופסיות שריר השלד, כולל התשואה התא נמוך מרקמות שנאספו ומידה גדולה של התורם טרוגניות של מערכי צמיחה ומוות בקרב תרבויות. בעוד שילוב טרוגניות לתוך העיצוב הניסיוני דורש גודל מדגם גדול יותר כדי לזהות אפקטים משמעותיים, זה גם מאפשר לנו לזהות מנגנונים כי השונות ושתתות קיבולת הרחבת hmpc, ובכך מאפשר לנו להבין טוב יותר טרוגניות שרירים התחדשות השלד. מנגנונים חדשניים המבדילים את יכולת ההתרחבות של תרבויות יש את הפוטנציאל להוביל לפיתוח של טיפולים כדי לשפר את התחדשות שריר השלד.
Introduction
שריר השלד הוא מערכת האיברים הגדולה ביותר בגוף האדם, חשבונאות עבור 30-40% של מסת הגוף כולו1. בנוסף התפקיד שלה מזוהה היטב תנועה, שריר השלד שומרת על טמפרטורת הגוף ויציבה, וממלא תפקיד מרכזי הומאוסטזיס מזינים הגוף כולו. מחקרים הקשורים למשתתפים אנושיים, בעלי חיים ומודלים של תרבות התא הם כולם יקרי ערך לטפל בשאלות הנוגעות לביולוגיה שריר השלד והתחדשות. בידוד ותרבות של תאים אנושיים שרירים ראשוניים (hMPCs) מספק מודל חזק המאפשר לטכניקות תרבות התא ומניפולציות להיות מיושם על דגימות אנושיות. היתרון של שימוש hmpcs הוא שהם שומרים את מושגים גנטיים ומטבולית מכל תורם2,3. תחזוקת פנוטיפ התורם מאפשרת לחוקרים לבחון וריאציה בין-אישית בתהליך היוגניים. לדוגמה, העסקנו את שיטת האפיון hMPC שלנו כדי לזהות הבדלים בין הגילאים והמין בקיבולת הרחבת אוכלוסיית hMPC4.
מטרת פרוטוקול זה היא לפרט טכניקות כדי לבודד, תרבות, לאפיין, ולהבדיל hMPCs מרקמת ביופסיה שריר השלד. בניין על עבודה קודמת שתיאר hmpcs וזיהה מקבלי הפנים הפוטנציאליים תאים עבור בידוד hmpcs5,6, פרוטוקול זה ממלא פער קריטי בידע על ידי קישור בידוד לאפיון של hmpcs. עוד, הוראות צעד אחר צעד המפורטים בפרוטוקול זה להפוך את הבידוד hMPC ואפיון נגיש לקהל מדעי רחב, כולל אלה עם ניסיון קודם מוגבל עם Hmpc. הפרוטוקול שלנו הוא בין הראשונים לתאר שימוש בציטוטומטר הדמיה כדי לעקוב אחר אוכלוסיות תאים. ציטוטומטרים מעוצבים לאחרונה הם מדינה-של-האמנות, תפוקה גבוהה ומיקרופלייט, המאפשרת הדמיה של תא חי, ספירת תאים וניתוח של קרינה פלואורסצנטית רב-ערוצית של כל התאים בכל באר של כלי תרבות בתוך דקות. מערכת זו מאפשרת כימות מהירה של שינויים דינמיים בהתפשטות ובכדאיות של אוכלוסיית תאים שלמה עם הפרעה מינימלית בלבד לתרבות. לדוגמה, אנו מסוגלים לבצע פעולות אובייקטיביות של המפגש בימים רצופים בחוץ כדי לקבוע את קינטיקה הגדילה של כל תרבות הנגזרת מתורמים שונים. פרוטוקולים רבים בספרות, במיוחד אלה הקשורים הבידול של MPCs, דורשים תאים כדי להגיע לרמה מוגדרת של המפגש לפני התחלת בידול או טיפול7. השיטה שלנו מאפשרת קביעה אובייקטיבית של הזרימה של כל באר בכלי תרבות המאפשר לחוקרים ליזום טיפול באופן לא משוחד ולא סובייקטיבי.
בעבר, מגבלה עיקרית של שימוש hMPCs הראשי היה תשואה נמוכה המגבילות את מספר התאים הזמינים עבור ניסויים. אנחנו ואחרים הראו את התשואה של MPCs מן רקמת ביופסיה שריר השלד הוא 1-15 MPCs לכל מיליגרם של רקמה (איור 1)8. בגלל הפרוטוקול שלנו מאפשר ארבעה קטעים של התאים לפני טיהור עם מיון התא המופעל על ידי הזריחה (FACS), שלנו היבול hMPC שלנו, נגזר כמויות קטנות של רקמת ביופסיה (50-100 מ ג), הם מספיק כדי לטפל במטרות מחקר שבו יש צורך בניסויים מרובים. פרוטוקול ה-FACS שלנו מפיק אוכלוסיית MPC טהורה של ~ 80% (Pax7 חיוביים), ולכן הפרוטוקול שלנו ממוטב לתשואה ולטוהר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה אושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית באוניברסיטת קורנל. כל המשתתפים הוקרן לתנאי הבריאות הבסיסיים והעניקו הסכמה מושכלת.
1. קבלת רקמת שריר האדם דרך ביופסיה שריר השלד
- לזהות את השריר הווסטוס באמצעות מישוש, ציוני דרך אנטומיים, וכיווץ פעיל של השריר.
- באמצעות המשתתף להדק את שריר הירך הראשי שלהם ולמצוא את הבטן של השריר, על 1/3 של הדרך מן הפאטלה אל הירך, ופשוט לרוחב לעצם הירך.
- השתמש בסרט מדידה נייר כדי לסמן אזור עם סמן כירורגי כ-4-6 סנטימטרים מראש הפאטלה המייצג את בטן השריר.
- לגלח כל שיער ליד האזור המסומן ולאחר מכן לטהר עם חיטוי כיתה כירורגית המשמש לפני הליכים רפואיים (למשל: 2% כלורהקאינין אדל (chg)/70% אלכוהול איזופרופיל (IPA)).
- לעבור על אתר הביופסיה. עם 1% לידוקאין
הערה: הימנע מהזרקת הלידוקאין לשריר השלד. - הפוך מסלול חתך של 4-5 מ"מ באתר המסומן.
- לאחר האזור מורדם, לדחוף מחט ברגסטרום עם נקז דרך fascia לתוך הבטן של השריר (כ 2-3 ס מ).
- לצייר רקמת שריר לתוך המחט ברגסטרום על ידי נסיגה מכונית חיתוך 2-3 ס מ בזמן עוזר מתחיל יניקה על ידי נסיגה 60 מצורף מזרק מוצמד mL.
- . תסגור את תא החיתוך
- לסובב את הבסיס של מחט ביופסיה רבע להפוך ולחזור על רצף של פתיחת המחט, החלת יניקה, וסגירת המחט.
הערה: בכל פעם המחט סגורה, נתח של רקמת השריר צריך להיות מושגת בתוך המחט Bergstrom. במהלך איסוף לדוגמה, המחט יישאר בירך באותו מיקום אנכי בזמן שהוא סובב longitudinally דרך 360 ° כדי להשיג כל מדגם. רצף זה יכול לחזור 3-4 פעמים. - לגרש את רקמת הביופסיה שנאסף מן המחט לתוך משטח ההלבשה ללא מחסיד סטרילי.
- בדקו את הרקמה והסירו את כל רקמות השומן הגלויות והפיברוטיות בעזרת להבי אזמל או מלקחיים סטריליים.
- מניחים חלק (50-100 מ ג) של רקמות לתוך צינור סטרילי המכיל שיתוף בינונית2-עצמאיים מדיום (למשל, שינה a).
הערה: משקל הרקמה נקבע כדלקמן. מקום ראשון הצינור הכתיר המכיל את המדיום התזונתי בקנה מידה וטרה. הבא את הרקמה לתוך הצינור, לסכם את הצינור, ולאחר מכן שוקלים את הצינור המכיל את הרקמה במדיום התזונתי. - אחסן את השפופרת המכילה את הרקמה ואת המדיום התזונתי ב-4 ° צ' עד לעיבוד.
הערה: רקמת ביופסיה צריך להיות מעובד בתוך 48 h של אוסף.
2. בידוד שריר האדם בתאי מחולל מרקמת ביופסיה
- האוהב רקמת ביופסיה.
- להעביר את רקמת השריר מן המדיום התזונתי לתוך צלחת פטרי סטרילי בארון בטיחות ביולוגי או במקום עבודה סטרילי דומה.
- השתמש להבי אזמל סטרילי לרקמת הבשר לתוך ~ 1 מ"מ3 חתיכות.
- רוחצים את רקמת הביופסיה הקצוצה כדי להסיר פסולת שיורית.
- להעביר את רקמת השריר לתוך 15 מ"ל שפופרת חרוטי המכיל 10 מ ל של מלוחים מאגור פוספט (PBS) ולאפשר לרקמות להתיישב באמצעות כוח הכבידה.
- . לא להפריע לרקמת השריר
- הוסף 10 מ ל של PBS אל הרקמה שטף ולאפשר את רקמת השריר ליישב מחדש דרך כוח הכבידה.
- . לא להפריע לרקמת השריר
- הוסף 10 מ ל של גלוקוז נמוך בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) ולאפשר לרקמות להתיישב מחדש דרך כוח הכבידה.
- . לא להפריע לרקמת השריר
- מודטת את הרקמה. בתקשורת לעיכול
- להשעות מחדש את רקמת השריר 3 מ ל של מדיה תקציר (2 מ"ג/mL כולגיראז D ב גלוקוז נמוכה Dמאמ).
הערה: שימוש בפתרונות מלאי באמצעות מוצרים בעלי מניות של 20 מ"ג/mL בגלוקוז נמוך, ומאוחסן ב-80 ° c, אז מדולל 1:10 ב-DMEM גלוקוז נמוכה בזמן השימוש. - דגירה הצינור המכיל את רקמת השריר באמבט מים ב 37 ° c עבור 30 דקות.
- Triturate הבולם רקמת השריר כל 10 דקות באמצעות הצינורות הסרואולוגיים 10 מ"ל או מנשא.
- הוסף 83 μL של מדיית תקציר נוספת ו-24 μL של הפתרון dispase (0.76 mM אצטט סידן, 1.39 mM אצטט נתרן, 13.91 mg/mL dispase II ב-DMEM גלוקוז נמוך). החזר את ההשעיה לאמבט מים ב37 ° c.
- Triturate מתלה רקמת השריר כל 5 כ 10 דקות עם טיפ רחב משעמם.
- המשך במהלך העיבור עד להשגת שאיפה אחידה, וללא יותר מ 1.5 h כדי למנוע את העיכול.
הערה: שיפור מספיק של הרקמה ואת הפעילות האנזימטית של הקולגן ומאפשר להשפיע על העיכול לדוגמה. שאיפה אחידה צריך להיות מסוגל לעבור את הקצה הרגיל של הצנרת עם סגר מינימלי לאחר 1.5 h. אם מ2.1.2 מדים לא מושגת לאחר 1.5 h, כפול לבדוק כי הרקמה המממנת הוא מספיק, ורקמות הוא טחון בגודל המתאים (שלב). בנוסף, הפעילות של האנזימים יש לבדוק כמו הרבה וריאציה הרבה בפעילות אנזימטית מתרחשת.
- להשעות מחדש את רקמת השריר 3 מ ל של מדיה תקציר (2 מ"ג/mL כולגיראז D ב גלוקוז נמוכה Dמאמ).
- גלולה התאים להקפיא במדיה התאוששות.
- הוסף 6 מ ל של מדיית הצמיחה (GM; 79% של האם F12, 20% סרום בפרה העובר, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 5 ng/mL בסיסי מקדם הצמיחה של הגידול [bfgf], pH 7.4, עבר דרך מסנן ה0.22 יקרומטר) אל השריר שריר.
- פיפטה את ההשעיה באמצעות מסננת תא 70 יקרומטר לתוך צינורית חרוט 50 mL. לשטוף את מסננת עם תוספת 4 מ ל של GM.
הערה: ניתן להעביר דגימה בחזרה לצינור מדגם של 15 מ ל בקלות ולהמחיש את הגלולה. נפח כביסה גדול יותר ניתן להשתמש אם התשואות התאים העוקבים הם נמוכים. - צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- . לא לשבש את הגלולה קפיצי את הצינורית כדי להשעות את הגלולה במדיה הנותרת. אם תאים לא הולכים להיות מתורבתים מיד להמשיך שלב 2.4.5 להוראות על אחסון לטווח ארוך, אחרת המשך צעד 3.1.6.
הערה: אם התרבות המיידית היא הרצויה, GM בלוחות תרבות התא צריך להיות מראש מ3.1.1 (שלבים ו3.1.2) לפני עיבוד ביופסיה מתחיל. - הוסף 1.5 mL של התרבות תא ההתאוששות הקפאת מדיה (טבלת חומרים) אל הגלולה המשוחזרת.
- . להעביר את ההקפאה לתוך בקבוקון מניחים את הקריובקבוקון בקצב מבוקר, שנשלט על ידי לילה ב-80 ° c. החנות קריובקבוקון ב-80 ° c עד מוכן לתרבות.
הערה: קריוצלוחיות המכילות שאיפה ניתן לשמור בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך (גדול מחודש אחד). שימוש בקצב מבוקר איזופנול מאפשר לתאים להיות מוקפאים בקצב של 1 ° צ'/דקה וכתוצאה מכך שיעורי התאוששות מיטביים של תאים כפי שמעידים על הכדאיות לאחר הקפאת הסבירות המוגברת של ההחזקה לכלי תרבות התא9. לחילופין, גביע המכיל RT איזופנול, הממוקם במקפיא של 80 ° c עשוי לשמש.
3. שרירי האדם מחולל שרירים תאים
- . להפשיר את שריר השריר
- לפני הפכנף וזריעה hMPCs, לוחיות הרישוי של התאים הקדם-ביוקלוניים ב-GM. הוסף 250 μL של GM ל 4 בארות של קולגן מצופה (קולגן I), 24-היטב לוחית התרבות התא. למלא את הבארות הנותרות עם 500 μL של מדיית בסיס סטרילית (כלומר, F12) כדי למנוע אידוי במהלך התרבות לטווח ארוך.
הערה: עבור ביופסיות בין 50 g ו 100 g, ארבע בארות של צלחת 24-באר מתאימים. אם רקמת הביופסיה היא פחות מ 50 גרם, שתי בארות עשויות להיות מתאימות יותר. שרידי פסולת ומספר תא נמוך מונעים שימוש בטכניקת ספירת תאים בשלב זה; לכן, צפיפות הזריעה המדויקת אינה נקבעת ומשתנה מעט מביופסיה לביופסיה. - מכשיר התרבות של התאים הכליליים עם GM ב 37 ° c ב 5% CO2 עבור 1 h לפני זריעה.
- הסרת קריובקבוקונים ממקפיא-80 ° c ומקום באמבט מים בעלות של 37 ° c; הנוזל בצינור צריך להיות שקוע לחלוטין במים.
- כאשר הפשרה היא כמעט מלאה (~ 5 דקות), להעביר את הקריובקבוקון לתוך כיסוי סטרילי למינארי זרימה. העבר את שריר השריר מתוך שפופרת קריובקבוקון ולהוסיף 15 מ"ל צינור חרוט המכיל 6 מ ל של הקדם מחומם GM בקצב של 1 mL/min.
- צנטריפוגה את השריר שריר ב 300 x g עבור 5 דקות ב-RT.
הערה: צנטריפוגה דלי מנופף יכול להקל על הדמיה של כדורי קטן בשלב זה אבל הוא לא חיוני. - . לא לשבש את הגלולה קפיצי את הצינור כדי להשעות את הגלולה במדיה הנותרים ולהשעות מחדש 1 מ ל של GM.
- העברת 250 μL של הגלולה מחדש (נחשב כיום השעיית hMPC) לכל אחת מ -4 בארות של לוחית טרום התרבות 24-היטב של התאים.
- לפני הפכנף וזריעה hMPCs, לוחיות הרישוי של התאים הקדם-ביוקלוניים ב-GM. הוסף 250 μL של GM ל 4 בארות של קולגן מצופה (קולגן I), 24-היטב לוחית התרבות התא. למלא את הבארות הנותרות עם 500 μL של מדיית בסיס סטרילית (כלומר, F12) כדי למנוע אידוי במהלך התרבות לטווח ארוך.
- תרבות ומעבר של hMPCs.
- לשמור על תרבויות hMPC ב-GM ב 37 ° c ב 5% CO2.
הערה: מלאי של GM ללא bFGF (כלומר, F12, אנטיביוטיקה, FBS) מוכנים בקבוצות ושמרו ב 4 ° צ' עבור עד 2 שבועות. bFGF נוסף ל-GM ביום השימוש. ניתן לאחסן מדיה המכילה bFGF עבור 48 h ב-4 ° c. - עשרים וארבע שעות לאחר בידוד, מותחת את GM, לשטוף בעדינות את כלי התרבות 2x עם GM מחומם מראש, ולהוסיף GM טרי.
הערה: 24 שעות צריך לספק hMPCs זמן מספיק כדי לצרף; לא צריך hMPCs להסרה לאחר שטיפת. שלב זה יהיה גם להסיר את הפסולת הנותרים שנוצר במהלך הקציר התא, מה שהופך את כלי הקיבול יותר קלה סריקת המפגש מדויק באמצעות cytometer הדמיה (סעיף 5 להלן). לאחר שינוי המדיה הראשוני, GM משתנה כל 48 h. - המעבר hMPCs כאשר 70% המפגש מושג או כאשר הם נשארו על אותה צלחת תרבות עבור 10 ימים, המתרחש הראשון.
הערה: 70% המפגש הוא כ 55,000 תאים/cm2. - כדי מעבר, להוסיף 250 μL של הקדם מחומם ביותר לכל הטוב של הלוח 24-היטב התרבות התא ו הדגירה עבור ~ 5 דקות.
- הקש על כלי התרבות של התאים במשטח מוצק כדי לנתק את hMPCs. ניתן להשתמש במיקרוסקופ קל כדי לוודא ש-hMPCs מנותקת.
- העבר את השטריפסין/hMPC ל-5 מ ל של GM בשפופרת חרוט של 15 מ ל.
- צנטריפוגה את ההשעיה hMPC ב 300 x g עבור 5 דקות ב-RT.
- הסירו את השבולים של hMPC מהצנטריפוגה והניחו על הקרח במכסה הזרימה הסטרילי.
הערה: שמירת hMPCs בקרח במהלך העברת תוצאות בצבירת תאים פחות. - ומשהה מחדש בעדינות את הגלולה. ב-1 מ ג של ג'נרל מוטורס
- ספירת תאים באמצעות הטציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
הערה: דילול 1:5 של השעיית תא למאגר ספירת תאים מתאים בדרך כלל. - הזרע hMPCs על מאכלי התרבות מצופה קולגן המכיל טרום מחומם GM בצפיפות של 3,500 תאים לכל ס מ2. שילוב של 10 ס מ לוחות וצלחות 24-טוב הוא אידיאלי. הצלחות 24-היטב ניתן לסרוק מדי יום על cytometer הדמיה לפקח על הצמיחה.
- בצע את אותו ההליך (החל בשלב 3.2.4.) למעברים הבאים.
הערה: תא בריאות וטוהר ניתן לפקח על פני מעברים באמצעות סמן של הזדקנות הסלולר (למשל, β-גלטוסידאז) וכתמים חיסוני עבור Pax7.
- לשמור על תרבויות hMPC ב-GM ב 37 ° c ב 5% CO2.
- הקפאת המלאי של hMPCs.
- Cryopreserve תאים עודפים לשימוש מאוחר יותר כדי להפוך את עוצמת התרבות יותר לניהול.
- לצורך הקפאת ההזמנה, עקבו אחר תהליך הטריציוניזציה המתואר בצעדים 3.2.4.-3.2.9.
- בעוד ההשעיה התא הוא להיות centrifuged, להכין תערובת של 20% (למשל, 200 μL) diמתיל סולפוקסיד (DMSO) ו 80% (g., 800 μL) GM. פיפטה למעלה ולמטה 20x כדי להבטיח ערבוב הולם. להשאיר את התערובת לנוח על הקרח.
- מבוסס על ספירת תאים, לדלל את השעיית hMPC 2 x 106/ML ב GM.
- לשלב את ההשעיה hMPC ואת 20% סטרילי DMSO/80% GM תערובת 50/50. המדיה האחרונה הקריוגנית היא שילוב של DMSO (10%) ו-GM (90%) מכיל 1 x 106 hmpcs/mL.
- מקום 1 מ ל של ההשעיה hMPC מוכן בשלב 3.3.5 לתוך מבחנות קריומות רבים כמו ספירת התא הראשונית מאפשר. לאחר מכן מניחים את hMPCs בקצב מבוקר במחיר איזופרופיל ב-80 ° c במקפיא ללילה.
הערה: בשלב זה, בדרך כלל בין 5 ו 15,000,000 תאים מתקבלים, 30 על 60% מהם מזוהים כמו hMPCs על ידי FACS.
4. בידוד Pax7+ שריר האדם בתאים מחולל באמצעות הcy, הזרמת זרימה
- כדי להכין hMPCs מתרבויות חיים (שלב 3.2.11), טריסיזציה מספיק כלי התרבות עבור 1 x 106על 2 x 106 התאים הכולל. הכינו שתלים סלולאריים כמתואר בצעדים 3.2.4-3.2.9.
- הכינו את hMPCs מתרבויות הקפאת שמורות (שלב 2.4.6 או 3.3.6).
- בחר 1-2 צינורות המכילים ~ 1 x 106 מעבר ארבע hMPCs עבור כל תורם.
הערה: באמצעות מעבר ארבע hMPCs מאפשר תשואה תאים מספקת תוך שמירה על פוטנציאל מתרבים עד מעבר שש (איור 2). - הפשרת תאים במהירות על-ידי הסרתם מ-80 ° c מקפיא והצבת אותם באמבט המים 37 ° c עם הנוזל בצינור שקוע לחלוטין.
- כאשר הפשרה היא כמעט מלאה (~ 5 דקות), העברת hMPCs לתוך כיסוי סטרילי למינארי זרימה ולהעביר את התוכן של השעיית התא ל 6 מ ל של הקדם מחומם GM ב 15 מ ל צינור חרוט בקצב של 1 mL/min.
- הכינו שתלים סלולאריים כמתואר בצעדים 3.2.7-3.2.9.
- השהה מחדש את כל הגלולה ב 3 מ ל של מאגר facs (500 מ"ל PBS, 12.5 ml סרום עז רגיל, 2 מ"ל 0.5 M edta, pH 7.4, עבר דרך מסנן ב0.22 יקרומטר).
- צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 300 x g עבור 5 דקות ב-RT.
- משקם supernatant מ hMPCs ובעדינות להשהות את הגלולה ב 250 μL של מאגר FACS; מקום על הקרח
- מקום 100 μL של תאים בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.7 mL ולעזוב על הקרח כדי לשמש כפקדים חיים/מתים (שלב 4.5.1).
הערה: 100 ul של תאים לשמש עבור שולטת חי/מת יכול לבוא לקחת נפח קטן (~ 20 ul) של תאים מושעה מחדש מכל תורם להיות ממוין או מתאים הפקדה.
הערה: חשוב לא לקחת יותר מ 20 עד של תאים מושעה מתורם יחיד. להביא נפח עד 100 ul עם מאגר FACS אם < 100 ul של תאים זמין.
- בחר 1-2 צינורות המכילים ~ 1 x 106 מעבר ארבע hMPCs עבור כל תורם.
- הכתם hMPCs עבור סמני פני השטח של התא.
- הכן את קוקטייל הנוגדן הבא (כמויות המוצגות הן עבור כל תרבות, היקף כראוי): 5 μL CD56 (מולקולת הדבקה של תא עצבי [NCAM]; PE-Cy7 מצומנת) ו-5 μL CD29 (β1-אינטאין; AlexFluor488). . דילול הנוגדן האחרון הוא 1:50
- הוסף 10 μL של קוקטייל הנוגדן לכל השעיה hMPC ו-דגירה על הקרח 30 דקות בחושך.
- הוסף 10 מ ל של מאגר FACS כדי כל ההשעיה/הנוגדן תערובת קוקטייל.
- צנטריפוגה כל צינור ב 300 x g עבור 5 דקות ב RT.
- השהה מחדש את הגלולה ב-300 μL של מאגר FACS והעבר לצינור פוליסטירן מוקצף באורך 5 מ ל.
- שמור על ההשעיה על קרח ומוגן מפני אור.
- . הכן את חרוזי הפיצויים
הערה: יש להכין בקרות חיוביות לכל נוגדן ולשליטה שלילית (חרוזים בלתי מוכתמים) באמצעות חרוזי פיצוי. בקרת חרוז פיצוי צריך להיות מופעל על cytometer הזרימה לפני הדגימות כדי להיות מיון. פקדים אלה מאפשרים נחישות של כמה fluorochrome מכל נוגדן ניתן לזהות בערוץ של האחר, כך ניתן להחיל פיצוי.- . חרוזי פיצוי מערבולת
- בשלוש 1.7 מ"ל מיקרוצנטריפוגה צינורות, להוסיף טיפה אחת (50 μL) של חרוזי פיצוי.
- הוסף 1 μL של כל נוגדן לשפופרת המתאימה, או לאף אחד לפקד השלילי.
- מודקון בחשכה במשך 15 דקות.
- הוסף 1.5 mL של מאגר FACS לכל צינור ומערבולת.
- צנטריפוגה כל צינור ב 300 x g ב צנטריפוגה העליון שחקן עבור 5 דקות ב RT.
- ולהשעות את הגלולה ב 200 μL של מאגר FACS.
הערה: הגלולה עשויה להיות קשה מאוד לדמיין; הטיפול צריך להילקח כאשר מיי, את הסופרנטאנט. - מניחים את ההשעיה בתוך 5 מ ל קלקר בתחתית הצינור ולאחר מכן לשמור על הצינור על הקרח מוגן מפני אור.
- . הכינו שולטת בחיים ומתים
- לחלק את ה100 μL של hMPCs משלב 4.2.8 לתוך שני 1.7 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות (אחד עבור שליטה חיה אחד עבור שליטה מתים).
- מניחים את צינור הבקרה מת בבלוק חימום מראש מחומם עד 70 ° c עבור > 10 דקות. במהלך הזמן הזה, לשמור על שליטה חיה על קרח.
- צנטריפוגה כל צינור ב 300 x g ב צנטריפוגה העליון שחקן עבור 5 דקות ב RT.
- ולהשעות את הגלולה ב 150 μL של מאגר FACS.
- לשלב את הבקרות חי/מת לתוך בודד 5 מ ל בתוך הצינור התחתון קלקר.
- לבצע כתמים הכדאיות.
- הוסף 1 μL של 7-aminoactinomycin D (7-עמ ') לכל הצינורות המכילים תאים להיות ממוינים ואת שליטה חי/מת.
- הוסף GM כדי קולגן מצופה 24-טוב (250 μL/ובכן) ו 10 ס מ (8 מ"ל/טוב) צלחות ולאפשר שיווי משקל בחממה תרבות התא ב 37 ° צ' ב 5% CO2.
- מיין hMPCs באמצעות זרם cy, לנסות.
- מיין hmpcs על הזרם cytometer עם 100 יקרומטר זרבובית בלחץ של 20 psi. קבע hMPCS חי מבוסס על פיזור צד וקדימה כמו גם 7-עמ מ שליליות (מיון פרמטרים ומיון נציג ניתן לראות באיור 3).
- תאים חיוביים עבור PE-Cy7 (780/60 nm) ו-AlexFluor488 (530/30 nm) מייצגים CD56+/cd29+ תאים ולכן הם Pax7 תאים חיוביים (hmpcs). מיון תאים חיוביים כפולים לצינורות אוסף המכילים כרית 300 μL של מאגר FACS.
הערה: הטוהר של תרבויות מיון ניתן לקבוע על ידי מכתים חיסוני עבור Pax7 ואחריו זרימת הזרם cy try ניתוח (איור 4). - למחוק את כל התאים האחרים.
- העבר את התאים הממוינים לשפופרת חרוט בעלת 15 מ"ל.
- ספין the hMPC ההשעיה ב 300 x g עבור 5 דקות ב-RT.
- . ומשהה מחדש ב -1 מ ג של ג'נרל מוטורס
- ספירת תאים באמצעות הטציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
הערה: בעוד שמספר התאים ניתן להסיק כמספר האירועים הממוינים באופן חיובי, מספר זה נמצא באופן מיותר ביחס למספר התאים ב-10 ש-40% לעומת שיטות ספירת התאים המסורתיות. - הזרע את hMPCs כפי שמתואר בשלב 3.2.11.
הערה: אימות של הטוהר של אוכלוסיית hMPC עשוי להיקבע על ידי הPax7 וניתוח באמצעות הזרימה cy, לנסות.
5. אפיון מחולל שריר אנושי (hMPC) תרבויות באמצעות הדמיה של מכשיר להדמיה
-
השתמש cytometer הדמיה (טבלה של חומרים) לבצע סריקות המפגש.
- בחר באפשרות ' צור סריקה חדשה ' ולאחר מכן הזן/בחר את קטגוריית הלוח, פרופיל הלוח ומזהה הלוח. Cytometer ההדמיה יכול להכיל 96, 24, ו 6 צלחות היטב.
- תחת יישום, בחר באפשרות ' זרימה ' > מפגש 1.
- בחר היטב כדי להציג את השימוש בנווט שבצד המסך.
- מצא מטוס של מיקוד שבו התאים מופיעים לבנים לעומת הרקע ובחר לרשום ידני או לאפשר cytometer הדמיה כדי לבחור את מישור המיקוד על ידי בחירת הרשמה אוטומטית.
הערה: עבור 96 לוחות היטב המוצעים בטבלת חומרים, מיקום משוער הוא 4.3 יחידות. - השתמש בעכבר כדי להדגיש את כל הבארות שיש צורך לסרוק. כל האזור היטב ייסרק באופן אוטומטי. בחר באפשרות ' התחל סריקה'.
- בחר הגדרות ניתוח אופטימליות לצלחת ולסוג תא.
הערה: עבור hMPCs, ההגדרות הבאות מיטביות: עוצמה = 6, אינטנסיביות רוויה = 0, קוטר = 8, עובי מינימלי = 3, גודל אשכול מזערי = 500, ודיוק = גבוה. - בחר באפשרות ' התחל ניתוח'.
הערה: בדוק באופן חזותי תמונות כדי להבטיח כי cytometer המשתמש וההדמיה מסכימים לגבי היקף התאים. אם קיימת אי-התאמה גדולה, סרוק מחדש את הצלחת באמצעות מישור אחר של מיקוד או הגדרות ניתוח שונות. סריקת המפגש יכולה לשמש להשוואת הצמיחה בין התרבויות, הזמן לניהול הטיפול, או לניטור התאים ולהחליט מתי ליזום בידול. במידה ובידול רצוי, הפרטים מסופקים בסעיף 6.
-
השתמש בציטומטר ההדמיה כדי לספור תאים.
- הכינו פתרון מכתים המכיל 12 מ ל של בשר חזיר, 6 μL של Hoechst 33342 ו 24 μL של propidium יודיד.
- מתיף מדיה ולהחליף עם פתרון הצביעת, מודטה ב 37 ° צ' עבור 15 דקות.
- מכתים את פתרון הצביעת ומחליפים באמצעות F12 של Ham.
הערה: חשוב להשתמש במדיה עם רמות נמוכות של פנול אדום כדי לקבל תמונות ברורות. לחילופין, ניתן להשתמש ב-PBS. - לטעון את הצלחת על cytometer הדמיה ותחת יישום, בחר הכדאיות תא > Live + מתים + סך הכל. הערוץ החי יהיה תמונת שדה בהירה, הערוץ המת יהיה propidium יודיד, והערוץ הכולל יהיה הואכסט 33342.
- הגדר את הערוץ החי לשדה בהיר ולחץ על רישום אוטומטי תחת הגדרת המוקד.
- מתחת לערוץ הכולל, הגדר את הערוץ לכחול. השתמש במוקד חיפוש כדי להכניס את הגרעינים למוקד או להשתמש בחיצים למעלה ולמטה כדי להגדיר ידנית את המוקד. לחצו על ' קבע היסט ' לבחירת המוקד.
- , מתחת לערוץ המתים . הגדר את הערוץ לאדום השתמש במוקד חיפוש כדי להביא את התאים המתים לפוקוס או להשתמש בחיצים למעלה ולמטה כדי להגדיר ידנית את המוקד. לחצו על ' קבע היסט ' לבחירת המוקד.
- בחר ' התחל סריקה ' כדי להתחיל בסריקה.
- בחר בפרמטרי ניתוח המתאימים ללוח ולסוג התא. בחר ' התחל ניתוח ' כדי להתחיל בניתוח. לאחר השלמת הניתוח, יש לוודא באופן חזותי כי הניתוח הוא כראוי ספירת תאים (למשל, עבור הערוץ הכולל לבדוק כי כל גרעין מוכר כגרעין וכי cytometer הדמיה לא סופר כתמים ברקע כמו גרעינים). אם הסריקה והניתוח משביעות רצון, החזר את הצלחת לאינקובטור, אחרת בצע סריקה חוזרת או שינוי של פרמטרי ניתוח.
6. הבחנה בתאי שריר האדם (hMPCs) כדי מיופופרות
- קבע את המפגש של hMPC באמצעות הפרוטוקול בסעיף 5.1. כדי להבדיל בין hMPCs לבין מיופים, הוא אידיאלי עבור תאים להיות 80-85% confluent כפי שנקבע על ידי פונקציית המפגש על cytometer הדמיה (ראה סעיף 5). אם משתמשים ב-hMPCs מיותר מתורם ייחודי אחד, הסריקה של המפגש מאפשרת לתאים מתורמים שונים להתחיל בבידול בזמן שיגיעו למפגש.
הערה: ב 80% זרימה, ישנם כ 66,000 תאים/cm2. - לשטוף את התאים 2x עם בידול מדיה (97% Ham ' s F12, 2% סרום הסוסים, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, pH 7.4, עבר דרך מסנן 0.22 יקרומטר).
- לשמור על התאים בחומרי הבחנה כל עוד הניסוי מכתיב במהלך החלפת מדיה מדי יום.
- הערכת ישירות היווצרות מיושפופרת על ידי מכתים חיסוני עבור שרשרת כבדה רירן, אשר בדרך כלל לזיהוי לאחר 7-10 ימים של בידול.
הערה: הזמן הנדרש ליצירת מיופופרות עשוי להשתנות מעט בהתאם לתורם ולמספר התאים בעת התחלת הבידול; לפיכך, מומלץ לעקוב אחר תרבויות מכל תורם בנפרד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זרימת הנציג cy, התוצאות של בידוד hMPC מרקמת השריר האנושי ניתן לראות באיור 1. hMPCs יכול להיות מזוהה על ידי הראשון האירועים מבוסס על פיזור בצד ופיזור קדימה כדי לחסל תאים מתים או פסולת, ואחריו בחירת רק תאים אשר שליליים עבור 7 עמ מ ולכן הם קיימא. בחירת תאים חיובית הן עבור סמני משטח התא CD56 ו-CD29 מייצגת את אוכלוסיית hMPC. ביופסיה של 60 מ ג רק מספק כ 75 ל-250 hMPCs.
סריקת זרימה ייצוגית מוצגת באיור 2A. קווי המתאר הירוקים באיור 2B נוצרו על ידי cytometer הדמיה ולהראות כיצד הדמיה Cytometer התמונה קבע המפגש מבוסס על הגדרות הניתוח שנבחרו. בשתי התמונות המוצגות, המפגש שנקבע על ידי cytometer הדמיה מסכים עם המפגש שנקבע באופן חזותי על-ידי המשתמש. עם זאת, תמונות אלה גם להדגיש כי cytometer הדמיה אינה מושלמת. לדוגמה, החץ האדום מדגיש את הפגם בצלחת אשר נספר כתאים. אם מספר רב של שלמות אלה נמצאים על הצלחת, המפגש שנוצר כתוצאה מכך לא ייצג במדויק את הזרימה של התאים. איור 2C מציג ייצוג של כל שלושת הערוצים המשמשים לספירת תאים (ברייטפילד, כחול ואדום) והתמונה הממוזגת. איור 2D מראה טרוגניות בין תורמים. גילוי ואפיון מדויק של טרוגניות זה הוא יישום מרכזי של cytometer הדמיה. איור 2E מראה כי מדידות הזרימה והגרעין ספירות של תורמים ייחודיים הם בקורלציה גבוהה.
איור 3 מספק מנחה עבור אופן הזיהוי של hMPCs בהתבסס על פרוצדורת ה-facs המתוארת בפרוטוקול זה. מעבר מבוסס על פיזור הקדמי ועל הצד מאפשר הפרדת תאים קיימא מפני פסולת (איור 3A). השוואה של פיזור קדימה לפי גובה כדי להעביר פיזור לפי אזור שימש כדי להבחין בין אירועים המייצגים תאים בודדים (האזור הארוז באיור 3 ב). תאים קיימא מסומנים על ידי חוסר התאגדות של כתם הכדאיות 7 עמ מ (איור 3C). לבסוף, תאים חיוביים עבור שני CD56 ו CD29 מזוהים כ-hMPCs (איור 3D). כדי לאמת את הליך ה-FACS המתואר בפרוטוקול זה, ניתן לקבוע את הבחירה של תאים חיוביים Pax7 על-ידי תאים חיסוניים עם נוגדן מסוים Pax7 וביטוי מדידה על cytometer זרימה. איור 4 משווה את מספר ה-hMPCs כפי שנקבע על-ידי Pax7 כתמים (איור 4a) לעומת הליך ה-Facs (איור 4a) המפורט בפרוטוקול זה מאותם אוכלוסיית תאים. איור 5 משתמשת חיסוני Pax7 וניתוח באמצעות cy, לנסות להראות העשרה של Pax7 ביטוי תאים באוכלוסיה הכוללת לאחר facs (איור 5a לעומת איור 5a), כמו גם את התחזוקה של מספר Pax7 מביע תאים לאחר הפסתו (איור 5B לעומת איור 5b).
hMPCs יכול להיות מבדיל לטופס מיופופרות בעקבות סעיף 6. כדי לקבוע אם hMPCs מבודדת לשמור על תאי קיבולת מיוגניים יכול להיות מוכתם חיסוני עם נוגדן ספציפי עבור שרשרת רירן כבדה עובריים ודמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט. תמונות מייצגות של רירן עובריים שרשרת כבדה מיושפופרות חיוביות ניתן לראות באיור 6.
איור 1 : זרם הנציג cy, לנסות תמונות עבור hMPCs ממוין ישירות מתוך רקמת ביופסיה של השריר. (A) אזור פיזור צדדי (ציר y) לעומת העברת שטח פיזור (ציר x) המשמש לזיהוי כל התאים בדגימת תורם. (ב) כתמי היכולת של (ב) 7-עמ מ (ציר y) מול פיזור (ציר x) לזיהוי תאים חיים. (ג) מיון בחירה שלילית פרופיל סמן (-CD11b,-CD31,-CD45,-glya [y-ציר]) לעומת סמן בחירה CD34. (D) סמן בחירה שלילית CD34 (ציר y) לעומת סמן הבחירה החיובי CD29. E סמן בחירה חיובי CD56 (ציר y) לעומת סמן הבחירה החיובי CD29 (ציר x). F תשואות של שלושה שונים ביופסיות שריר השלד. FSC = פיזור העברה; מו = פיזור צד; , hMPCs. תאים של שרירים אנושיים
איור 2 : פוטנציאל ההתרבות של hMPCs נגזר של תורמים אנושיים נשמרת לאחר 6 מעברים. (א) . סריקת המפגש הייצוגית (ב) המפגש הנציג עם קווי המתאר הירוקים המראים כיצד הדמיה של ההדמיה היתה המפגש הקבוע. החץ האדום מראה. שלמות על הצלחת (ג) נציג ברייטפילד, הואכסט 33342 (כחול), ו Propidium יודיד (אדום) מכתים ותמונה ממוזגת של שלושת הערוצים האלה. סרגל ברים = 1mm. (ד) גרעיני ספירות של 6 תורמים ייחודיים מדגיש hMPC טרוגניות. (ה) זרימה וספירת גרעינים הם בקורלציה גבוהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : זרימת הנציג cy, לנסות פרמטרים מיון עבור בידוד hMPC. (A) אזור פיזור צדדי (ציר y) לעומת העברת שטח פיזור (ציר x) המשמש לזיהוי כל התאים בדגימת תורם. (ב) העבר את גובה הפיזור (ציר y) לעומת אזור פיזור (ציר x), כדי לפסול doublets מאוכלוסיית המיון. (C) העבר גובה פיזור (ציר y) לעומת התאגדות 7-עמ מ כדי לזהות תאים קיימא. (ד) PE-CY7 (CD56) לעומת AF488 (CD29) עם Q2 המייצג תאים חיוביים כפולים (hMPCs). הצבע מייצג את צפיפות האירועים.
איור 4 : השוואה בין CD29/CD56 חיוביות לעומת Pax7 חיוביות במעבר 4 hMPCs מאותו תורם. (A) ספירה (ציר y) לעומת Pax7 ביטוי (ציר x). B סמן בחירה חיובי CD56 (ציר y) לעומת סמן בחירה חיובי CD29 (ציר x). NCAM = מולקולה הדבקה של תא עצבי; hMPC = תא מחולל שרירים אדם.
איור 5 : Pax7 חיוביות נשמרת ב-hMPCs הנגזרת מאותו תורם על פני מספר מעברים. (א) Pax7 ביטוי (ציר x) של תאים שכבר עברו 4 פעמים לפני מיון ה-facs. (ב) Pax7 ביטוי (ציר x) של מעבר של hMPCs 1 לאחר מיון facs עבור CD29 וCD56 חיוביות (5 מעברים כולל). (ג) Pax7 ביטוי (ציר x) של hMPCs 2 מעברים לאחר מיון facs עבור CD29 וCD56 חיוביות (6 כולל מעברים).
איור 6 : צביעת של hMPC נגזר מיוצינורות עבור שרשרת רירן כבדה עובריים. הנציגה מיקרוסקופיים תמונות של hMPCs מוכתם שיתוף עם כתם DNA (Hoechst 33342, כחול) ו עובריים רירן שרשרת כבדה (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הראשי hMPCs הם מודל מחקר חשוב המשמש להבנת ביולוגיה שריר השלד ואת תהליך ההתחדשות. בנוסף, hMPCs יש את הפוטנציאל לשמש טיפול. עם זאת, ישנם אתגרים מזוהים באמצעות hMPCs הראשי עבור מחקר וטיפול, כולל הבנה מוגבלת של תאים הנגזרים מבני אדם10. יש גם מידה גדולה של וריאציה בקיבולת הרחבה בין תרבויות התורמים, אשר מגביל את הפוטנציאל לשימוש hMPCs והוא יכול להשפיע על תוצאות המחקר11. לדוגמה, הוא הוכח לאחרונה כי hMPCs מבודדת באמצעות השיטה המתוארת בפרוטוקול זה הפיק תאים שונים בקיבולת הרחבה וזה היה מונע על ידי פרופיל העברה שלא להתיישר עם סקס או גיל11.
כאן, אנו מציגים שיטת תשואה יעילה וגבוהה עבור בידוד hMPCs בכמויות מספיקות עבור מספר יישומים במורד הזרם כולל בידול לתוך מיופים, ובכך מידול את התהליך מיוגניים בתוך מבחנה. השיטה שלנו מסתמכת על FACS לבודד CD56+/cd29+ תאים, אשר זוהו בעבר כמייצג Pax7 מועשר המבטא אוכלוסייה12. אסטרטגיות מיון אחרות באותה מידה חוקיות של תאים תוארו גם הם5,6.
ההיבט החשוב ביותר של בידוד hMPC שלנו שיטת התרבות היא ניטור זהיר של תרבויות בודדות. טרוגניות מבוסס התורמים כולל מספר hMPCs שהתקבלו מכל ביופסיה, הזמן שלהם ליזום התפשטות מבחנה, ואת שיעור התרחבות האוכלוסייה שלהם. לכן, אם הבדלים היווצרות שפופרת לאחר הטיפול הוא השאלה של עניין אישי, התרבויות hMPC צריך להיות מוחלף לטיפול מבוסס על רמת המפגש קבע פריורי והעריכו באופן אובייקטיבי באמצעות cytometer הדמיה.
השיטה שלנו כדי לבודד את hMPCs התרבות כבר אופטימיזציה כדי לקבל תשואות של תאים במיליונים עבור ניסויים במבחנה מפני רקמת ביופסיה די יחסית התחיל (50-100 מ ג). היתרון העיקרי של גישה זו הוא מספר בחני וניסויים ניתן לבצע על hmpcs מן התורם אותו, ומאפשר תחזוקה של פנוטיפ התורם על פני ניסויים תוך הצגת השונות הבין ניסויים הקטן. השיטה שלנו שונה משיטות שפורסמו לאחרונה התמקדות לחילוץ האוכלוסייה הטהורה של Pax7 הבעת תאים ישירות מתוך רקמת ביופסיה שבו המוקד הוא xenotransplantation שתלת8. האתגר עם השיטות הקודמות הללו עם זאת, הוא שהם דורשים משקל רקמת התחלתי של גדול יותר גרם. לכן, הם אינם מעשיים למחקר הכרוך ביופסיות שריר השלד האנושי. מגבלה אחת של השיטה שלנו היא כי הפוטנציאל של xenotransplantation שתלת לא הוערך. עם זאת, סוג זה של פרוצדורה לא היה אחד מיישומי הזרם המקורי שיועדו למטה. הכיוונים העתידיים של שיטה זו עשויים לכלול את היכולת החרט של hMPCs, לאחר שעברו את הליך הבידוד שלנו, כדי לקבוע אם יש פוטנציאל לשימוש בהליך זה השתלת MPC לימודי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים מודים לאוניברסיטת קורנל, ביוטכנולוגיה מרכז משאבים הדמיה עבור עזרתם עם מיון תא המופעל הקרינה. אנו מודים גם מולי Gheller על עזרתה עם גיוס משתתף ואריקה בנדר על ניהול ביופסיות שריר השלד. לבסוף, אנו מודים למשתתפים על זמנם והשתתפותו במחקר. עבודה זו היתה נתמכת על ידי המכון הלאומי על הזדקנות המוסדות הלאומיים לבריאות תחת הפרס מספר R01AG058630 (כדי B.D.C. ו A.E.T.), על ידי קרן גלן למחקר רפואי הפדרציה האמריקנית למענק מחקר הזדקנות עבור הפקולטה זוטר (ב . Dc), ועל ידי מועצת הנשיא לנשות קורנל (לA.E.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels |
| 10 cm cell culture plate | VWR | 664160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352196 | 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols |
| 24 well cell culture plate | Grenier Bio-One | 662 160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Viability stain for identifying living cells during FACS sorting |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Conjugated antibody for FACS |
| Black 96-well cell culture plate | Grenier Bio-One | 655079 | 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S |
| Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Imaging cytometer used to track hMPC cultures | |
| Cell Strainer | VWR | 352350 | Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing |
| Collagen Type I (Rat Tail) | Corning | 354236 | Collagen for coating cell culture plates |
| Collagenase D | Roche | 11 088 882 001 | Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | WN182 | Used for cryopreservation of hMPCs |
| Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder | Gibco | 31600-034 | Low glucose DMEM for muscle biopsy processing |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 21600-010 | PBS for muscle biopsy processing |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | J.T. Baker | 4040-01 | Required for FACS buffer |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 89510-186 | Fetal bovine serum used for hMPC growth media |
| Ham's F12 | Gibco | 21700-026 | Base media for hMPCs |
| Heat Inactivated Equine Serum | Gibco | 26-050-070 | Horse serum used to make hMPC differentiation media |
| Hemocytometer | iNCyto | DHC-N0105 | Used to count cells |
| Hibernate A | Gibco | A1247501 | Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Life Technologies | H21492 | DNA stain for identifying all cells using the Celigo S |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Used for controlled rate freezing of hMPCs |
| Moxi buffer | Orflo | MXA006 | Buffer for automated cell counter |
| Moxi Cassettes | Orflo | MXC002 | Cassesttes for automated cell counter |
| Moxi z Mini Automated Cell Counter | Orflo | Automated cell counter | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Commerically available controlled rate cell freezing container |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Goat serum used in FACS buffer |
| PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Conjugated antibody for FACS |
| Penicillin/Streptomycin 100x Solution | Corning | 30-002-CI | Antibiotics added to culture media |
| Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S |
| Recombinant Human basic fibroblast growth factor | Promega | G5071 | Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Gibco | 12648-010 | Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | Added to Ham's F12 |
| Sterile Round Bottom 5 mL tubes | VWR | 60818-565 | Tubes used for FACS |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Compensation beads fort calibrating flow FACS settings |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- D'Souza, D. M., et al. Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling. Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).
- Scheele, C., et al. Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
- Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).
- Charville, G. W., et al. Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Alexander, M. S., et al. CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies. Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).
- Thalacker-Mercer, A., et al. Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy. Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).
- Garcia, S. M., et al. High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells. Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).
- Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O.
- Bareja, A., Billin, A. N. Satellite cell therapy - from mice to men. Skeletal Muscle. 3 (1), 2 (2013).
- Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity. Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).
- Xu, X., et al. Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles. Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).
