Isolering, kultur, karakterisering, och differentiering av humana muskelstamceller från skelettmuskulaturen biopsi förfarande

Summary

Vi presenterar tekniker för att isolera, odla, karakterisera och differentiera mänskliga primära muskelstamceller (hMPCs) som erhållits från skelettmuskel biopsi vävnad. hmpcs erhålls och kännetecknas genom dessa metoder kan användas för att därefter behandla forskningsfrågor relaterade till mänsklig myogenes och skelettmuskulaturen förnyelse.

Abstract

Användningen av primär mänsklig vävnad och celler är idealisk för utredning av biologiska och fysiologiska processer såsom skelettmuskulaturen regenerativ process. Det finns erkända utmaningar att arbeta med mänskliga primära vuxna stamceller, särskilt humana muskelstamceller (hMPCs) härrör från skelettmuskel biopsier, inklusive låg cell avkastning från insamlade vävnad och en stor grad av givarens heterogenitet av tillväxt och död parametrar bland kulturer. Samtidigt införliva heterogenitet i experimentell design kräver en större urvalsstorlek för att upptäcka betydande effekter, det gör det också möjligt för oss att identifiera mekanismer som ligger bakom variationer i hMPC expansions kapacitet, och därmed ger oss möjlighet att bättre förstå heterogenitet i skelettmuskulaturen förnyelse. Nya mekanismer som skiljer kulturernas expansions förmåga har potential att leda till utveckling av terapier för att förbättra skelettmuskel förnyelse.

Introduction

Skelettmuskulaturen är det största organsystemet i människokroppen, står för 30 − 40% av hela kroppen massa¹. Förutom sin väl erkända roll i Locomotion, skelettmuskulaturen upprätthåller kroppstemperatur och hållning, och spelar en central roll i hela kroppen näringsämnen homeostas. Forskning som involverar mänskliga deltagare, djur och modeller cellkulturer är alla värdefulla för att ta itu med frågor som rör skelettmuskulaturen biologi och förnyelse. Isolering och kultur av mänskliga primära muskelstamceller (hMPCs) ger en robust modell som gör det möjligt för cellkulturer tekniker och manipulationer som skall tillämpas på mänskliga prover. Fördelen med att använda hmpcs är att de behåller den genetiska och metaboliska fenotypen från varje donator^2,3. Underhåll av donatorns fenotyp gör det möjligt för forskarna att undersöka inter-individuell variation i den myogena processen. Till exempel har vi använt vår hMPC karakterisering metod för att identifiera ålder och kön-relaterade skillnader i hMPC populations expansion kapacitet⁴.

Syftet med detta protokoll är att detalj tekniker för att isolera, kultur, karakterisera, och differentiera hMPCs från skelettmuskel biopsi vävnad. Bygger på tidigare arbete som beskrivs hmpcs och identifierade potentiella cell ytan beslutsfattare för HMPC isolering^5,6, detta protokoll fyller ett kritiskt gap i kunskap genom att koppla isoleringen till karakterisering av hmpcs. Vidare, detaljerade steg-för-steg-instruktioner som ingår i detta protokoll gör hMPC isolering och karakterisering tillgänglig för en bred vetenskaplig publik, inklusive de med begränsad tidigare erfarenhet av hMPCs. Vårt protokoll är bland de första som beskriver användningen av en avbildning flödescytometerns för att spåra cellpopulationer. Nydesignade Imaging flödescytometrar är State-of-the-art, hög genomströmning, och Microplate-baserade, möjliggör levande cell avbildning, cellräkning, och flerkanals fluorescens analys av alla celler i varje brunn av ett kultur fartyg inom några minuter. Detta system möjliggör en snabb kvantifiering av dynamiska förändringar i spridningen och livskraften hos en hel cellpopulation med endast minimala störningar i kulturen. Till exempel kan vi utföra objektiva mått av sammanflödet på på varandra följande dagar in vitro för att bestämma tillväxtkinetik av varje kultur som härrör från olika givare. Många protokoll i litteraturen, särskilt de som inbegriper differentiering av MPCs, kräver celler för att nå en definierad nivå av sammanflödet innan du påbörjar differentiering eller behandling⁷. Vår metod möjliggör objektiv bestämning av sammanflödet av varje brunn i ett kultur fartyg som gör det möjligt för forskare att initiera behandling på ett opartisk, icke-subjektivt sätt.

Tidigare var en stor begränsning av att använda primära hMPCs låg avkastning som begränsar antalet celler som är tillgängliga för experiment. Vi och andra har visat avkastningen av MPCs från skelettmuskel biopsi vävnad är 1 − 15 MPCs per milligram vävnad (figur 1)⁸. Eftersom vårt protokoll tillåter fyra passager av cellerna före rening med fluorescens aktiverad cell sortering (FACS), våra nedfrysta HMPC avkastning, som härrör från små mängder av biopsi vävnad (50 − 100 mg), är tillräckliga för att ta itu med forskningsmål där Det krävs flera experiment. Vår FACS-protokollet ger en ~ 80% ren (Pax7 positiv) MPC population, vilket vårt protokoll är optimerad för både avkastning och renhet.

Protocol

Detta protokoll godkändes av den institutionella Granskningsnämnden vid Cornell University. Alla deltagare screenades för underliggande hälsotillstånd och gav informerat samtycke.

1. få mänsklig muskelvävnad via skelettmuskulaturen biopsi

1. Identifiera vastus lateralis muskeln via palpation, anatomiska landmärken och aktiv sammandragning av muskeln.
2. Palpate den vastus lateralis genom att ha deltagaren skärpa sina quadriceps muskler och hitta magen av muskeln, om 1/3 av vägen från patella till höften, och bara ventrolaterala till lårbenet.
3. Använd ett papper måttband för att markera ett område med en kirurgisk markör om 4 − 6 inches från toppen av patella representerar magen av muskeln.
4. Raka något hår nära det markerade området och sedan rengöra med en kirurgisk grad antiseptisk som används före medicinska ingrepp (till exempel: 2% klorhexidingglukonat (CHG)/70% isopropylalkohol (IPA)).
5. Anesthetize biopsi webbplats med 1% lidokain.
   Anmärkning: Undvik att injicera lidokain i skelett muskeln.
6. Gör en snitt väg på 4 − 5 mm på den markerade platsen.
7. När området är sövda, tryck en Bergstrom nål med troakaren genom fascian in i magen av muskeln (ca 2 − 3 cm).
8. Dra muskelvävnad i Bergstrom nål genom att dra upp den skärande trobil 2 − 3 cm medan en assistent applicerar sug genom att dra en bifogad 60 mL sprutkolven.
9. Stäng skärkammaren.
10. Rotera basen av biopsinålen ett kvarts varv och upprepa sekvensen för att öppna nålen, tillämpa sug, och stänga nålen.
    Anmärkning: Varje gång nålen är stängd, en klippa av muskelvävnad bör erhållas inuti Bergstrom nål. Under prov insamlingen kommer nålen att finnas kvar i låret i samma vertikala läge medan den roteras längsled genom 360 ° för att erhålla varje prov. Denna sekvens kan upprepas 3 − 4 gånger.
11. Utvisa den insamlade biopsivävnaden från nålen till en steril nonadherent dressing pad.
12. Undersök vävnaden och ta bort alla synliga fett och fibrotiska vävnader med hjälp av sterila skalpell blad eller pincett.
13. Placera en portion (50 − 100 mg) vävnad i ett sterilt rör innehållande CO₂-oberoende näringsmedium (t. ex. viloläge a).
    Anmärkning: Vikten av vävnaden bestäms enligt följande. Placera först det förtäckta röret som innehåller näringsmediet på en skala och Tara. Nästa placera vävnaden i röret, resumé röret, och sedan väga röret som innehåller vävnaden i näringsmediet.
14. Förvara röret som innehåller vävnaden och näringsmediet vid 4 ° c fram till bearbetningen.
    Anmärkning: Biopsi vävnad bör bearbetas inom 48 h av insamling.

2. isolera humana muskelstamceller från Biopsivävnad

1. Finhacka biopsi vävnad.
   1. Överför muskelvävnad från näringsmediet till en steril petriskål i ett biologiskt säkerhetsskåp eller liknande steril arbetsplats.
   2. Använd sterila skalpell blad att finhacka vävnad i ~ 1 mm³ stycken.
2. Tvätta malet biopsi vävnad att ta bort rester av skräp.
   1. Överför muskelvävnaden till ett 15 mL koniskt rör innehållande 10 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och låt vävnaden sedimentera via gravitationen.
   2. Aspirera supernatanten är noga med att inte störa muskelvävnad.
   3. Tillsätt 10 mL PBS till den tvättade vävnaden och låt muskelvävnaden vidarebosätta sig via gravitationen.
   4. Aspirera supernatanten är noga med att inte störa muskelvävnad.
   5. Tillsätt 10 mL låg glukos Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) och låta vävnaden att vidarebosätta via gravitation.
   6. Aspirera supernatanten är noga med att inte störa muskelvävnad.
3. Inkubera vävnaden i sammanfattad media.
   1. Omsuspendera muskelvävnaden i 3 mL sammanfattad media (2 mg/mL kollagenas D i låg glukos DMEM).
      Anmärkning: Kollagenase D-lagerlösningar kan beredas vid 20 mg/mL i låg glukos DMEM och förvaras vid-80 ° c, därefter späddes 1:10 i låg glukos DMEM vid användning.
   2. Inkubera röret som innehåller muskelvävnad i ett vattenbad vid 37 ° c i 30 min.
   3. Triturera muskelvävnad suspensionen varje 10 min med en 10 ml serologiska pipett eller en bred bar pipett.
   4. Tillsätt 83 μl ytterligare Digest-media och 24 μl dispas-lösning (0,76 mm kalciumacetat, 1,39 mm natriumacetat, 13,91 mg/ml dispas II i låg glukos DMEM). Returnera fjädringen till vattenbadet 37 ° c.
   5. Triturera muskelvävnad suspensionen varje 5 − 10 min med en bred bar Pipettera spets.
   6. Fortsätt sönderdelning tills en enhetlig flytgödsel uppnås, och för inte längre än 1,5 h för att förhindra över matsmältningen.
      Anmärkning: Tillräcklig malning av vävnaden och enzymatisk aktivitet av kollagenase och dispas kan påverka prov matsmältningen. En enhetlig flytgödsel bör kunna passera genom en vanlig pipett spets med minimal ocklusion efter 1,5 h. Om en jämn uppslamning inte uppnås efter 1,5 h, dubbelkolla att vävnads malning är tillräcklig, och vävnaden mals till lämplig storlek (steg 2.1.2). Dessutom, aktiviteten av enzymerna bör testas så mycket att partiet variation i enzymatisk aktivitet inträffar.
4. Pellets celler och frysa i återställningsmedia.
   1. Tillsätt 6 mL av tillväxtmedia (GM; 79% skinka F12, 20% foster bovint serum, 1% penicillin/streptomycin, 5 ng/mL grundläggande fibroblast tillväxtfaktor [bFGF], pH 7,4, passerade genom ett 0,22 μm filter) till muskeln slurry.
   2. Pipettera suspensionen genom en 70 μm cell SIL i ett 50 mL koniskt rör. Skölj SIL med ytterligare 4 mL GM.
      Anmärkning: Provet kan överföras tillbaka till ett 15 mL koniskt rör för att underlätta visualisering av pelleten. En större tvätt volym kan användas om efterföljande cell utbyten är låga.
   3. Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur (RT).
   4. Aspirera supernatanten är säker på att inte störa pelleten. Svep röret för att Omsuspendera pelleten i de återstående medierna. Om celler inte kommer att kultiveras omedelbart gå vidare till steg 2.4.5 för instruktioner om långtidslagring, annars gå vidare till steg 3.1.6.
      Anmärkning: Om omedelbar kultur önskas, bör GM i cellkulturer plattor vara förinkuberas (steg 3.1.1 och 3.1.2) innan biopsi bearbetning börjar.
   5. Tillsätt 1,5 mL Recovery cellkultur frysning media (tabell över material) till den återvunna pelleten.
   6. Överför flytgödsel till en kryovial. Placera kryovien i en isopropanol-kontrollerad hastighet kylaggregat över natten vid-80 ° c. Förvara cryovial vid-80 ° c till färdig för kultur.
      Anmärkning: Cryovials som innehåller flytgödsel kan förvaras i flytande kväve för långtidslagring (mer än 1 månad). Med hjälp av en isopropanol-kontrollerad hastighet kylaggregat tillåter celler att vara reproducerbart frysta med en hastighet av 1 ° c/min vilket resulterar i optimala cell återvinningsgrader, vilket framgår av lönsamhet efter frysning och ökad sannolikhet för kvarstad på cellodling fartyg⁹. Alternativt kan en bägare som innehåller RT isopropanol, placerad i a-80 ° c frys användas.

3. odling av humana Muskelprogenitorceller

1. Tina muskeln slurry.
   1. Före upptinning och sådd hmpcs, pre-equilibrate cellodling plattor i GM. Tillsätt 250 μl GM till 4 brunnar av en kollagen-belagda (kollagen I), 24-väl cellkultur plattan. Fyll resterande brunnar med 500 μL sterilt basmedia (dvs F12) för att förhindra avdunstning under långtids kulturen.
      Anmärkning: För biopsier mellan 50 g och 100 g, fyra brunnar av en 24-brunn plattan är lämpliga. Om biopsi vävnaden är mindre än 50 g, två brunnar kan vara lämpligare. Restskräp och lågt cell nummer förhindrar användning av en cell räknings teknik i detta steg; Därför är den exakta sådd densitet inte bestäms och varierar något från biopsi till biopsi.
   2. Inkubera cellkultur fartyg med GM vid 37 ° c i 5% CO₂ för 1 h före sådd.
   3. Ta bort cryovials från-80 ° c frys och placera i en 37 ° c vattenbad; vätskan i röret ska vara helt nedsänkt i vatten.
   4. När upptinning är nästan klar (~ 5 min), överföra cryovial till en steril laminärt flöde huva. Överför muskel slam från kryovialröret och tillsätt i ett 15 mL koniskt rör innehållande 6 mL förvärmda GM med en hastighet av 1 mL/min.
   5. Centrifugera muskel flytgödsel vid 300 x g i 5 minuter vid RT.
      Anmärkning: En svängig skopa centrifug kan göra det lättare att visualisera små pellets i detta steg, men är inte nödvändigt.
   6. Aspirera supernatanten är säker på att inte störa pelleten. Svep röret för att Omsuspendera pelleten i de kvarvarande medierna och Omsuspendera i 1 mL GM.
   7. Överför 250 μL av den återsuspenderade pelleten (nu som en hMPC-suspension) till var och en av de 4 brunnarna i den förinkuberade 24-brunnen cell odlingsplattan.
2. Kultur och passage hMPCs.
   1. Bibehålla hMPC kulturer i GM vid 37 ° c i 5% CO₂.
      Anmärkning: Lager av GM utan bFGF (dvs. F12, antibiotika, FBS) bereds i omgångar och hålls vid 4 ° c i upp till 2 veckor. bFGF tillsätts GM på dagen för användning. Media innehållande bFGF kan förvaras i 48 h vid 4 ° c.
   2. Tjugofyra timmar efter isoleringen, aspirera GM, tvätta försiktigt odlings kärlet 2x med förvärmda GM och tillsätt färsk GM.
      Anmärkning: 24 h bör ge hMPCs tillräcklig tid att fästa; inga hMPCs bör avlägsnas efter tvättning. Detta steg kommer också att ta bort kvarvarande skräp som genererats under cell skörden, vilket gör fartyget mer mottagliga för korrekt sammanflödet scanning med hjälp av en avbildning flödescytometerns (avsnitt 5 nedan). Efter denna första Media förändring, GM ändras varje 48 h.
   3. Passage hmpcs när 70% sammanflödet uppnås eller när de har legat på samma kultur skålen för 10 dagar, beroende på vilket som inträffar först.
      Anmärkning: 70% sammanflödet är cirka 55 000 celler/cm².
   4. Till passage, tillsätt 250 μL av förvärmda trypsin till varje brunn av en 24-brunn cellkultur tallrik och inkubera för ~ 5 min.
   5. Knacka på cell odlings kärlet på en fast yta för att lossa hMPCs. Ett lätt Mikroskop kan användas för att kontrollera att hMPCs har lossnat.
   6. Överför trypsin/hMPC-avstängningarna till 5 mL GM i ett 15 mL koniskt rör.
   7. Centrifugera hMPC-fjädringen på 300 x g i 5 minuter vid RT.
   8. Ta bort HMPC suspensioner från centrifugen och placera på isen i den sterila laminärt Flow Hood.
      Anmärkning: Att hålla hMPCs på is under förbigående resulterar i mindre cell aggregering.
   9. Aspirera supernatanten från hMPCs och försiktigt Omsuspendera pelleten i 1 mL GM.
   10. Räkna celler med hjälp av en hemocytometern eller en automatiserad cell räknare.
       Anmärkning: En 1:5 utspädning av cellsuspensionen till cellräkningsbufferten är i allmänhet lämplig.
   11. Seed hMPCs på kollagen-belagda kultur rätter som innehåller förvärmda GM med en densitet på 3 500 celler per cm². En kombination av 10 cm plattor och 24-bra tallrikar är idealisk. De 24-well plattorna kan skannas dagligen på en avbildning flödescytometerns för att övervaka tillväxten.
   12. Följ samma procedur (börjar vid steg 3.2.4.) för efterföljande passager.
       Anmärkning: Cell hälsa och renhet kan övervakas över passager med hjälp av en markör för cellulära åldras (t. ex., β-galaktosidas) och immunofärgning för Pax7.
3. Cryopreserve den hMPCs.
   1. Cryopreserve överskott celler för senare användning för att göra kulturen volymen mer hanterbar.
   2. För cryopreservation, följ den trypsinization förfarande som beskrivs i steg 3.2.4.-3.2.9.
   3. Medan cellsuspensionen centrifugeras, Bered en blandning av 20% (t. ex. 200 μL) dimetylsulfoxid (DMSO) och 80% (t. ex. 800 μL) GM. Pipettera upp och ner 20x för att säkerställa adekvat blandning. Låt blandningen vila på is.
   4. Baserat på antalet celler, späd hMPC suspensionen till 2 x 10⁶/ml i GM.
   5. Kombinera hMPC suspension och 20% steril DMSO/80% GM blandning 50/50. Den slutliga frysförvaring media är en kombination av DMSO (10%) och GM (90%) innehållande 1 x 10⁶ hmpcs/ml.
   6. Placera 1 mL av hMPC-fjädringen upprättad i steg 3.3.5 i så många kryovier som det initiala cell antalet tillåter. Placera sedan alias hMPCs i en isopropanol-kontrollerad hastighet kylaggregat i a-80 ° c frys över natten.
      Anmärkning: I detta steg erhålls vanligtvis mellan 5 och 15 000 000 celler, varav 30 − 60% är identifierade som hMPCs av FACS.

4. isolerar Pax7⁺ humana muskelstamceller via flödescytometri

1. För att förbereda hMPCs från levande kulturer (steg 3.2.11), trypsinize tillräckligt kultur fartyg för 1 x 10⁶− 2 x 10⁶ totalt celler. Förbered cellsuspensioner enligt beskrivningen i steg 3.2.4 − 3.2.9.
2. Förbered hMPCs från kryopreserverade kulturer (steg 2.4.6 eller 3.3.6).
   1. Välj 1 − 2 rör som innehåller ~ 1 x 10⁶ passage fyra hMPCs för varje givare.
      Anmärkning: Använda passage fyra hMPCs möjliggör adekvat cell utbyte samtidigt bibehålla proliferativ potential tills passage sex (figur 2).
   2. Snabbt Tina celler genom att ta bort dem från-80 ° c frys och placera dem i en 37 ° c vattenbad med vätskan i röret helt nedsänkt.
   3. När upptinningen är nästan klar (~ 5 min), överför hMPCs till ett sterilt laminärt flödes skydd och överför innehållet i cellsuspensionen till 6 mL förvärmda GM i ett 15 mL koniskt rör med en hastighet av 1 mL/min.
   4. Förbered cellsuspensioner enligt beskrivningen i steg 3.2.7 − 3.2.9.
   5. Omsuspendera varje pellet i 3 mL FACS-buffert (500 mL PBS, 12,5 mL normal get serum, 2 mL 0,5 M EDTA, pH 7,4, passerat genom ett filter på 0,22 μm).
   6. Centrifugera cellsuspensionen vid 300 x g i 5 minuter vid RT.
   7. Aspirera supernatanten från hMPCs och försiktigt Omsuspendera pelleten i 250 μL av FACS-bufferten; plats på isen.
   8. Placera 100 μL celler i ett 1,7 mL microcentrifugerör och låt vara på isen för att användas som levande/döda kontroller (steg 4.5.1).
      ANMÄRKNINGAR: de 100 UL-celler som ska användas för levande/döda kontroller kan komma från att ta en liten volym (~ 20 UL) av återsuspenderade celler från varje givare som ska sorteras eller från bankas celler.
      Anmärkning: det är viktigt att inte ta mer än 20 UL av återsuspenderade celler från en enda givare. Få volym upp till 100 UL med FACS buffert om < 100 UL celler är tillgängliga.
3. Fläcken hMPCs för cell ytan markörer.
   1. Förbered följande antikropps cocktail (belopp som visas är för varje kultur, skala upp på lämpligt sätt): 5 μL CD56 (neural cell adhesion molekyl [NCAM]; PE-Cy7-konjugerat) och 5 μL CD29 (β1-integrin; AlexFluor488-konjugerat). Den slutliga antikropps utspädningen är 1:50.
   2. Tillsätt 10 μL av antikropps cocktail till varje hMPC suspension och inkubera på is i 30 min i mörker.
   3. Tillsätt 10 mL FACS-buffert till varje suspension/antikropps cocktailblandning.
   4. Centrifugera varje tub på 300 x g i 5 minuter vid RT.
   5. Omsuspendera pelleten i 300 μL av FACS-bufferten och överför till en 5 mL rund botten polystyren tub.
   6. Håll suspensionen på is och skyddas från ljus.
4. Förbered kompensations pärlorna.
   Obs: positiva kontroller för varje antikropp och en negativ kontroll (ofärgade pärlor) bör förberedas med hjälp av kompensations pärlor. Kompensations Bead kontroller ska köras på flödescytometern innan proverna sorteras. Dessa kontroller gör det möjligt att fastställa hur mycket fluorkrom från varje antikropp kan upptäckas i den andra kanalen så att kompensation kan tillämpas.
   1. Vortex kompensations pärlor.
   2. I tre 1,7 mL microcentrifug rör, tillsätt en droppe (50 μL) av ersättning pärlor.
   3. Tillsätt 1 μL av varje antikropp till lämpligt rör, eller ingen till den negativa kontrollen.
   4. Inkubera i mörkret i 15 min.
   5. Tillsätt 1,5 mL FACS-buffert till varje tub och Vortex.
   6. Centrifugera varje tub vid 300 x g i en bänk centrifug i 5 minuter vid RT.
   7. Aspirera supernatanten och Omsuspendera pelleten i 200 μL av FACS-bufferten.
      Anmärkning: Pelleten kan vara mycket svårt att visualisera; försiktighet bör iakttas när Aspirera supernatanten.
   8. Placera suspensionen i en 5 mL rund botten polystyren röret och sedan hålla röret på is och skyddas från ljus.
5. Förbered levande och döda kontroller.
   1. Dela upp 100 μL av hMPCs från steg 4.2.8 till två 1,7 mL-mikrocentrifugrör (en för den levande kontrollen och en för den döda kontrollen).
   2. Placera det döda kontroll röret i ett värmeblock förvärmt till 70 ° c i > 10 min. Under denna tid, hålla levande kontroll på is.
   3. Centrifugera varje tub vid 300 x g i en bänk centrifug i 5 minuter vid RT.
   4. Aspirera supernatanten och Omsuspendera pelleten i 150 μL av FACS-bufferten.
   5. Kombinera de levande/döda kontrollerna i en enda 5 mL rund botten polystyren röret.
6. Utför genomförbarhet färgning.
   1. Tillsätt 1 μL av 7-aminoactinomycin D (7-AAD) till alla rör som innehåller celler som ska sorteras och levande/död kontroll.
   2. Tillsätt GM till kollagen-belagda 24-brunn (250 μl/brunn) och 10 cm (8 ml/brunn) tallrikar och låt jämvikt i en cellkultur inkubator vid 37 ° c i 5% Co₂.
7. Sortera hMPCs via flödescytometri.
   1. Sortera hMPCs på en flödescytometer med 100 μm munstycke vid ett tryck på 20 psi. Bestäm levande hMPCS baserat på sida och framåt scatter samt 7-AAD negativitet (sortering parametrar och en representativ sort kan ses i figur 3).
   2. Celler positiva för PE-Cy7 (780/60 nm) och AlexFluor488 (530/30 Nm) representerar CD56⁺/Cd29⁺ celler och därmed är Pax7 positiva celler (hmpcs). Sortera dubbla positiva celler i samlingsrör som innehåller en 300 μL kudde av FACS buffert.
      Anmärkning: Renheten av sorterade kulturer kan bestämmas genom immunofärgning för Pax7 följt av nedströms flödescytometri analys (figur 4).
   3. Kassera alla andra celler.
   4. Överför de sorterade cellerna till ett 15 mL koniskt rör.
   5. Snurra hMPC-fjädringen på 300 x g i 5 minuter vid RT.
   6. Aspirera försiktigt supernatanten och Omsuspendera i 1 mL GM.
   7. Räkna celler med hjälp av en hemocytometern eller en automatiserad cell räknare.
      Anmärkning: Även om antalet celler kan härledas som antalet händelser som är positivt sorteras, har detta antal befunnits överskatta antalet celler med 10 − 40% jämfört med traditionella metoder för cellräkning.
   8. Seed den hMPCs som beskrivs i steg 3.2.11.
      Anmärkning: Verifiering av renheten hos hMPC-populationen kan bestämmas genom immunofärgning för Pax7 och analys via flödescytometri.

5. karakterisera humana Muskelprogenitorceller (hMPC) kulturer med hjälp av en avbildning Cytometer

1. Använd Imaging flödescytometerns (tabell över material) för att utföra sammanflödet skanningar.
   1. Välj Skapa ny skanning och ange sedan/Välj plattans kategori, PLATTPROFIL och plattans ID. Den Imaging flödescytometerns rymmer 96, 24 och 6 bra tallrikar.
   2. Under Programväljer Confluence > Confluence 1.
   3. Välj en brunn för att visa med hjälp av navigatorn till höger på skärmen.
   4. Hitta ett plan med fokus där cellerna ser vita ut jämfört med bakgrunden och välj registrera manuellt eller låt Imaging flödescytometerns välja planet i fokus genom att välja Registrera automatiskt.
      Anmärkning: För 96 väl plattorna föreslås i tabellen av material, en ungefärlig position är 4,3 enheter.
   5. Använd musen för att markera alla brunnar som behöver skannas. Hela brunnen området kommer automatiskt att skannas. Välj Starta skanning.
   6. Välj analysinställningar som är optimala för plåt och celltyp.
      Anmärkning: För hMPCs är följande inställningar optimala: intensitet = 6, mättad intensitet = 0, diameter = 8, minsta tjocklek = 3, min klusterstorlek = 500, och precision = hög.
   7. Välj Starta analys.
      Anmärkning: Inspektera bilderna visuellt för att säkerställa att användaren och bildcyklern är överens om cellernas omkrets. Om det finns en stor avvikelse, skanna plattan på nytt med ett annat fokus plan eller olika analysinställningar. Confluence scanning kan användas för att jämföra tillväxt mellan kulturer, tid administrationen av en behandling, eller att övervaka celler och bestämma när man ska initiera differentiering. Om differentiering önskas, finns information i avsnitt 6.
2. Använd Imaging flödescytometerns för att räkna celler.
   1. Bered en infärgnings lösning som innehåller 12 mL skinka F12, 6 μL Hoechst 33342 och 24 μL propidiumjodid iodide.
   2. Aspirera media och Ersätt med Färgnings lösning, inkubera vid 37 ° c i 15 min.
   3. Aspirera färgning lösning och ersätta med Ham: s F12.
      Anmärkning: Det är viktigt att använda ett medium med låga halter av fenolrött för att få tydliga bilder. Alternativt kan PBS användas.
   4. Fyll på plattan på Imaging flödescytometerns och under tillämpning, Välj cellviabilitet ≫ Live + Dead + total. Den levande kanalen kommer att vara en ljus fält bild, kommer den döda kanalen vara propidiumjodid jodid, och den totala kanalen kommer att vara Hoechst 33342.
   5. Ställ in livekanalen till ljust fält och klicka på Registrera automatiskt under Fokusinställning.
   6. Under den totala kanalen ställer du in kanalen på blått. Använd hitta fokus för att få kärnor i fokus eller Använd upp och ner pilarna för att manuellt ställa in fokus. Klicka på Ställ in förskjutning för att välja fokus.
   7. Ställ in kanalen på röd under den döda kanalen. Använd hitta fokus för att få de döda cellerna i fokus eller Använd upp-och nedpilarna för att manuellt ställa in fokus. Klicka på Ställ in förskjutning för att välja fokus.
   8. Välj Starta skanning för att starta skanningen.
   9. Välj analysparametrar som är lämpliga för plattan och celltypen. Välj Starta analys för att starta analysen. När analysen är klar, kontrollera visuellt att analysen är korrekt räkna celler (t. ex. för den totala kanalen Kontrollera att varje kärna som erkänns som en kärna och att Imaging flödescytometerns inte räknar några fläckar i bakgrunden som kärnor). Om skanningen och analysen är tillfredsställande, returnera plattan till inkubatorn, annars scanna om eller modifiera analys parametrarna.

6. differentiera humana Muskelprogenitorceller (hMPCs) till Myotubes

1. Fastställa hMPC-sammanflödet med hjälp av protokollet i avsnitt 5,1. För att differentiera hmpcs till myotubes är den idealisk för att cellerna ska vara 80 − 85% konflytande, vilket bestäms av sammanflödet-funktionen på Imaging flödescytometerns (se avsnitt 5). Om hmpcs från mer än en unik givare används, sammanflödet scanning tillåter celler från olika givare att börja differentieringen vid den tidpunkt de når sammanflödet.
   Anmärkning: Vid 80% Confluence, det finns cirka 66 000 celler/cm².
2. Tvätta celler 2x med differentiering media (97% skinka F12, 2% Equine serum, 1% penicillin/streptomycin, pH 7,4, passerade genom ett 0,22 μm filter).
3. Underhålla celler i differentierings medier så länge som experimentet dikterar när du byter media dagligen.
4. Direkt bedöma myotube formation genom immunofärgning för embryonala myosin tung kedja, som är typiskt detekterbar efter 7 − 10 dagar av differentiering.
   Anmärkning: Den tid som krävs för att bilda myotubes kan skilja sig något beroende på givaren och antalet celler när differentiering inleddes; Därför rekommenderas att kulturer från varje givare övervakas individuellt.

Representative Results

Representativa flödescytometri resultat av hMPC-isolering från mänsklig muskelvävnad kan ses i figur 1. hMPCs kan identifieras genom första gating händelser baserat på sidan scatter och framåt scatter för att eliminera döda celler eller skräp, följt av att välja endast celler som är negativa för 7-AAD och därför är livskraftiga. Val av celler positiva för både cell ytan markörer CD56 och CD29 representerar hMPC populationen. En biopsi av 60 mg ger endast cirka 75 − 250 hMPCs.

En representativ sammanflödet Scan visas i figur 2A. De gröna skisserar i figur 2b genererades av Imaging flödescytometerns och visar hur Imaging flödescytometerns bestäms sammanflödet baserat på de valda analys inställningarna. I båda bilderna visas, sammanflödet bestäms av Imaging flödescytometerns instämmer med sammanflödet visuellt bestäms av användaren. Dessa bilder belyser dock också att Imaging flödescytometerns inte är perfekt. Till exempel, den röda pilen belyser en ofullkomlighet i plattan som räknas som celler. Om ett stort antal av dessa ofullkomlighet är närvarande på plattan, kommer den resulterande sammanflödet inte exakt representera sammanflödet av cellerna. Figur 2C visar en representation av alla tre kanaler som används för att räkna celler (brightfield, Blue och Red) och den sammanslagna bilden. Figur 2D visar heterogenitet mellan givarna. Att upptäcka och noggrant karakterisera denna heterogenitet är en viktig tillämpning av Imaging cytometer. Figur 2e visar att sammanflödet mätningar och kärnor räknas från unika givare är starkt korrelerade.

Figur 3 innehåller en riktlinje för hur hMPCs ska identifieras baserat på den FACS-procedur som beskrivs i detta protokoll. Gating baserat på framåt och sida scatter möjliggör separation av livskraftiga celler från skräp (figur 3a). En jämförelse av framåt scatter med höjd för att vidarebefordra scatter efter område användes för att särskilja händelser som representerar enskilda celler (det inramade området i figur 3b). Livskraftiga celler kännetecknas av bristande införlivande av genomförbarheten fläcken 7-AAD (figur 3c). Slutligen, celler positiva för både CD56 och CD29 identifieras som hMPCs (figur 3D). För att validera FACS-proceduren som beskrivs i detta protokoll kan urvalet av Pax7 positiva celler bestämmas genom immunfärgnings celler med en Pax7-specifik antikropp och mät uttryck på en flödescytometer. Figur 4 jämför antalet hMPCs som bestämmer genom Pax7 immunofärgning (figur 4a) jämfört med FACS-förfarandet (figur 4b) som beskrivs i detta protokoll från samma population av celler. Figur 5 använder Pax7 immunofärgning och analys via flödescytometri för att Visa berikning av Pax7 som uttrycker celler i den totala populationen efter FACS (figur 5a jämfört med Figur 5b) samt bibehållandet av antalet Pax7 att uttrycka celler efter passaging (Figur 5b jämfört med figur 5c).

hMPCs kan differentieras för att bilda myotubes genom att följa avsnitt 6. För att avgöra om isolerade hMPCs bibehålla myogen kapacitet celler kan vara immunostained med en antikropp som är specifik för embryonala myosin tung kedja och visualiseras med fluorescerande mikroskopi. Representativa bilder av embryonala myosin tung kedja positiva myotubes kan ses i figur 6.

Figur 1 : Representativa flödescytometri bilder för hMPCs sorteras direkt ur muskel biopsi vävnad. (A) sido spridningsområde (y-axel) kontra framåt spridningsområde (x-axel) som används för att identifiera alla celler i ett givar prov. (B) 7-AAD viabilitet fläck (y-axeln) kontra framåt scatter (x-axeln) för att identifiera levande celler. C) markör profil för negativ urvals sortering (-CD11b,-CD31,-CD45,-glya [y-axel]) kontra MARKERINGS markör CD34. (D) negativ urvals markör CD34 (y-axel) jämfört med den positiva urvals markören CD29. E Positiv markering markör CD56 (y-axeln) kontra den positiva markeringen markören CD29 (x-axeln). F Skördar från tre olika skelettmuskel biopsier. FSC = framåt scatter; SSC = sida scatter; hMPCs, humana muskelprogenitorceller.

Figur 2 : Proliferativ potential av hMPCs härrör från mänskliga donatorer upprätthålls efter 6 passager. (A) Representativ sammanflödet Scan. (B) representativ sammanflödet Scan med gröna konturer som visar hur Imaging flödescytometerns bestäms sammanflödet. Den röda pilen visar en ofullkomlighet på plattan. C) representativ Brightfield, Hoechst 33342 (blå), och propidiumjodid iodide (röd) färgning och en sammanfogad bild av dessa tre kanaler. Skalstreck = 1mm. (D) kärnor räknas från 6 unika givare belyser HMPC heterogenitet. (E) sammanflödet och antalet kärnor är starkt korrelerade. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 : Representativ flödescytometri sorteringsparametrar för hMPC-isolering. (A) sido spridningsområde (y-axel) kontra framåt spridningsområde (x-axel) som används för att identifiera alla celler i ett givar prov. (B) framåt spridnings höjd (y-axel) kontra framåt spridningsområde (x-axel) för att diskvalificera dubbletter från sorterings populationen. (C) framåt scatter höjd (y-axeln) vs 7-AAD inkorporering för att identifiera livskraftiga celler. D) PE-CY7 (CD56) vs AF488 (CD29) färgning med Q2 som representerar dubbla positiva celler (hMPCs). Färg representerar densiteten av händelser.

Figur 4 : Jämförelse av CD29/CD56 positivitet kontra Pax7 positivitet i passage 4 hMPCs från samma givare. (A) antal (y-axel) kontra Pax7 uttryck (x-axel). B Positiv markerings markör CD56 (y-axel) kontra positiv markerings markör CD29 (x-axel). NCAM = neurala celladhesion molekyl; hMPC = humana muskelstamceller.

Figur 5 : Pax7 positivitet upprätthålls i hMPCs härrör från samma givare över flera passager. (A) Pax7-uttryck (x-axel) av celler som hade varit blint 4 gånger före FACS sortering. (B) Pax7 Expression (x-axel) av hMPCs 1 passage efter FACS sortering för CD29 och CD56 positivitet (5 totalt passager). (C) Pax7 Expression (x-axel) av hMPCs 2 passager efter FACS sortering för CD29 och CD56 positivitet (6 totalt passager).

Figur 6 : Färgning av hMPC härledda myotubes för embryonala myosin tung kedja. Representativa mikroskopiska bilder av differentierade hMPCs Co-färgade med DNA fläcken (Hoechst 33342, blå) och embryonala myosin tung kedja (grön) (n = 3). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Primära hMPCs är en viktig forskningsmodell som används för att förstå skelettmuskulaturen biologi och regenerativ process. Dessutom, hMPCs har potential att användas för behandling. Emellertid, det finns erkända utmaningar i att använda primära hMPCs för både forskning och terapi, inklusive begränsad förståelse av celler som härrör från människor¹⁰. Det finns också en stor grad av variation i expansions kapaciteten bland givar kulturer, vilket begränsar potentialen för användning av hMPCs och kan påverka forskningsresultat¹¹. Det har till exempel nyligen visats att hMPCs som isolerats med den metod som beskrivs i detta protokoll producerade celler som varierade i expansions kapacitet och detta drevs av transkriptionell profil som inte stämmer överens med kön eller ålder¹¹.

Här presenterar vi en effektiv och hög avkastnings metod för att isolera hMPCs i tillräckliga mängder för ett antal nedströms tillämpningar, inklusive differentiering till myotubes, och därmed modellera den myogena processen in vitro. Vår metod förlitar sig på FACS att isolera CD56⁺/Cd29⁺ celler, som tidigare har identifierats som representerar en berikad Pax7 uttrycker befolkningen¹². Andra lika giltiga cell sorterings strategier har också beskrivits^5,6.

Den viktigaste aspekten av vår hMPC isolering och kultur metod är noggrann övervakning av enskilda kulturer. Den donator-baserade heterogenitet innehåller antal hMPCs som erhållits från varje biopsi, deras tid att initiera proliferation in vitro, och deras befolkning expansionstakt. Därför, om skillnader i myotube formation efter en behandling är frågan om intresse individ, hMPC kulturer bör ändras till behandling baserad på en sammanflödet nivå bestäms på förhand och bedömas objektivt med hjälp av Imaging cytometer.

Vår metod för att isolera och kultur hMPCs har optimerats för att få avkastning av celler i miljoner för in vitro-experiment från relativt lite start biopsi vävnad (50 − 100 mg). Den största fördelen med detta tillvägagångssätt är att flera analyser och experiment kan utföras på hMPCs från samma givare, vilket möjliggör underhåll av donatorns fenotyp över experiment samtidigt som man introducerar lite Inter-experiment variation. Vår metod skiljer sig från nyligen publicerade metoder som fokuserar på att utvinna den renaste populationen av Pax7 att uttrycka celler direkt ur biopsivävnad där fokus är xenotransplantation⁸. Utmaningen med dessa tidigare metoder är dock att de kräver en start vävnad vikt på mer än ett gram. Därför, de är inte praktiskt för forskning som involverar mänskliga skelettmuskulaturen biopsier. En begränsning av vår metod är att potentialen för xenotransplantation inte har utvärderats. Denna typ av förfarande var dock inte en av de ursprungliga avsedda nedströmsprogrammen. Framtida riktningar av denna metod kan innefatta bedömning av inympningskapaciteten hos hMPCs, efter att ha genomgått vårt isolerings förfarande, för att avgöra om det finns potential för användning av detta förfarande i MPC-transplantations studier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-Cl	Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels
10 cm cell culture plate	VWR	664160	Plates used for culturing hMPCs
15 mL Falcon tube	Falcon	352196	15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols
24 well cell culture plate	Grenier Bio-One	662 160	Plates used for culturing hMPCs
7-AAD Viability Staining Solution	eBioscience	00-6993-50	Viability stain for identifying living cells during FACS sorting
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16	BioLegend	303016	Conjugated antibody for FACS
Black 96-well cell culture plate	Grenier Bio-One	655079	96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S
Celigo S	Nexcelcom Bioscience		Imaging cytometer used to track hMPC cultures
Cell Strainer	VWR	352350	Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing
Collagen Type I (Rat Tail)	Corning	354236	Collagen for coating cell culture plates
Collagenase D	Roche	11 088 882 001	Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue
Dimethyl Sulfoxide	VWR	WN182	Used for cryopreservation of hMPCs
Dispase II	Sigma Life Sciences	D4693	A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder	Gibco	31600-034	Low glucose DMEM for muscle biopsy processing
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	21600-010	PBS for muscle biopsy processing
EDTA Disodium Salt Dihydrate	J.T. Baker	4040-01	Required for FACS buffer
Fetal Bovine Serum	VWR	89510-186	Fetal bovine serum used for hMPC growth media
Ham's F12	Gibco	21700-026	Base media for hMPCs
Heat Inactivated Equine Serum	Gibco	26-050-070	Horse serum used to make hMPC differentiation media
Hemocytometer	iNCyto	DHC-N0105	Used to count cells
Hibernate A	Gibco	A1247501	Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate	Life Technologies	H21492	DNA stain for identifying all cells using the Celigo S
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P-4	Used for controlled rate freezing of hMPCs
Moxi buffer	Orflo	MXA006	Buffer for automated cell counter
Moxi Cassettes	Orflo	MXC002	Cassesttes for automated cell counter
Moxi z Mini Automated Cell Counter	Orflo		Automated cell counter
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Commerically available controlled rate cell freezing container
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50062Z	Goat serum used in FACS buffer
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159	BD Pharmingen	557747	Conjugated antibody for FACS
Penicillin/Streptomycin 100x Solution	Corning	30-002-CI	Antibiotics added to culture media
Propidium iodide	Thermo Fisher Scientific	P3566	DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S
Recombinant Human basic fibroblast growth factor	Promega	G5071	Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Gibco	12648-010	Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-3	Added to Ham's F12
Sterile Round Bottom 5 mL tubes	VWR	60818-565	Tubes used for FACS
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42	Compensation beads fort calibrating flow FACS settings