Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

היכרות גנטית הסתרה ישירות לתוך השלב Amastigote של טריאנוסומה cruzi באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

Published: July 31, 2019 doi: 10.3791/59962
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להחדיר נוקאאוט גן לתוך amastigote החילוץ של טריאנוסומה cruzi, באמצעות מערכת CRISPR/Cas9. פנוטיפ הצמיחה ניתן לעקוב גם על ידי ספירת התאים של התרבות האמסטימית axenic או על ידי התפשטות amastigote תאיים לאחר הפלישה התא מארח.

Abstract

טריאנוסומה cruzi היא מחלת פתוזוזה טפיל הגורם המחלה של חגיאס בעיקר באמריקה הלטינית. כדי לזהות מטרה התרופה הרומן נגד T. cruzi, חשוב לאמת את החומריות של הגן היעד בשלב היונקים של הטפיל, amastigote. Amastigotes של T. cruzi לשכפל בתוך התא המארח; לפיכך, קשה לבצע ניסוי מנוקאאוט מבלי לעבור בשלבים התפתחותיים אחרים. לאחרונה, הקבוצה שלנו דיווחה על מצב גדילה שבו amastigote יכול לשכפל באופן מאקסיבי עד 10 ימים מבלי לאבד מאפיינים כמו amastigote שלה. באמצעות התרבות הרקתית הטמפורלית הזאת, הצגנו בהצלחה gRNAs ישירות לתוך Cas9 ביטוי amastigote כדי לגרום הסתרה גנים וניתח פנוטיפים שלהם באופן בלעדי בשלב amastigote. בדוח זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט כדי לייצר בעלי מיסוי מתורבת, amastigotes הנגזרים, ולהשתמש בתרבות axenic ב-CRISPR/Cas9-מתווך ניסוי הסתרה. פנוטיפ הצמיחה של בנוקאאוט amastigotes יכול להיות מוערך גם על ידי ספירות התא של התרבות axenic, או על ידי השכפול של amastigotes תאיים לאחר הפלישה תא מארח. שיטה זו עוקפת את השלב הטפיל בידול בדרך כלל מעורב בהפקת הטרנסגניים או amastigote נוק. הניצול של התרבות הרקתית הטמפורלית יש את הפוטנציאל להרחיב את החופש הניסיוני של מחקרים ספציפיים לבמה ב -T. cruzi.

Introduction

טריאנוסומה cruzi הוא הסוכן סיבתי של מחלת חגיאס, אשר נפוצה בעיקר באמריקה הלטינית1. T. cruzi יש שלבים מחזור החיים הייחודיים כפי שהוא נע בין וקטור חרק מארח יונקים2. T. cruzi משכפל כמו epimastigote ב באמצע המעיים של חרק triatomine דם מוצץ ומבדיל לתוך המעי הקדמי זיהומיות טריאואסטיגוטה בבטן לפני שהופקדו על מארח אדם או בעלי חיים. ברגע שטריאומואסטיט נכנס לגוף המארח דרך אתר העקיצה או דרך קרום רירי, הטפיל פולש לתא מארח והופך לצורה עגולה פחות שנקראת amastigote. ה-amastigote משכפל בתא המארח ובסופו של דבר מבדיל לטרימטואסטיגוטה, הפורץ מתוך התא המארח ונכנס לזרם הדם כדי להדביק תא מארח נוסף.

מאז הזמינים כיום סוכני כימותרפיה, בנזיל ו nifurטימופייביץ ', לגרום תופעות לוואי שליליות אינן יעילות בשלב כרונית של המחלה3, זה מעניין מאוד לזהות מטרות התרופה הרומן נגד T. cruzi. בשנים האחרונות, מערכת CRISPR/Cas9 הפכה כלי רב עוצמה כדי לבצע ביעילות בנוקאאוט גנים ב T. cruzi, או על ידי התפתחות של נפרד או בודד פלמיד (s) המכיל grna ו Cas94, על ידי ביטוי יציב של Cas9 ואחריו מבוא של grna5,6,7 או שעתוק תבנית של grna8, או על ידי אלקטרופורציה של הוקמה מראש grna/Cas9 rnp קומפלקס7,9. התקדמות טכנולוגית זו צפויה להאיץ את מחקר מטרות הסמים במחלת צ'אס.

כדי להמשיך בפיתוח התרופה, חיוני לאמת את החיוניות של הגן היעד או היעילות של תרכובות מועמדים לסמים ב-amastigote של T. cruzi, כפי שהוא שלב השכפול של הטפיל במארח היונקים. עם זאת, זוהי משימה מאתגרת, בגלל amastigotes לא ניתן לטפל ישירות בשל נוכחותם של תא מארח חסימתית. ב לישמניה, הקשורות באופן הדוק מאוד טפיל ל T. cruzi, השיטה האמסטימית amastigote שפותחה והיה מנוצל בסינון תרופות בחני10,11,12, 13. למרות שיש כמה אי-התאמות ברגישות לתרכובות בין האקסטיגוטים amastigotes ו תאיים מאוד14, היכולת לשמור על התרבות axenic בכל זאת מספק כלים ניסיוניים יקרי ערך ללמוד את ביולוגיה בסיסית של השלב הרלבנטי הקליני של לישמניה15,16. במקרה של T. cruzi, הספרות לגבי נוכחות של מוצרים באופן טבעי amastigotes (ea)17 ובייצור מחוץ לתחום של EA17,18,19 תאריך חזרה . לפני עשרות שנים בנוסף, EA ידוע יש יכולת מדבקת20, אם כי פחות מזה של טריאומואסטיגוטה, ואת המנגנון של הפלישה מארח amastigote כבר הובהר בשנים האחרונות (נבדקו על ידי bonfim-מלו אל.21). עם זאת, בניגוד לישמניה, EA לא היה מנוצל ככלי ניסיוני ב -T. cruzi, בעיקר בגלל EA היה נחשב כטפיל מחייב תאיים, ולכן לא נחשב בתור "הטופס replicative בצורה מעשית גיוני.

לאחרונה, הקבוצה שלנו הציע לנצל EA של T. cruzi כתרבות האקסון הזמני22. Amastigotes של T. cruzi tulahuen מאמץ יכול לשכפל חינם של תאים מארחים במדיום LIT ב 37 ° צ' עד 10 ימים ללא הידרדרות מרכזית או אובדן של תכונות כמו amastigotes. במהלך תקופת הצמיחה המארחת ללא תשלום, EA היה מנוצל בהצלחה עבור ביטוי גנים אקסוסוגני על ידי electroporation קונבנציונאלי, התרופה טיטור שיטת עם תרכובות טרינורצח, ו CRISPR/Cas9-בתיווך הנוקאאוט ואחריו בניטור הצמיחה פנוטיפ. בדו ח זה, אנו מתארים את הפרוטוקול המפורט כדי לייצר ב-EA מחוץ למבחנה ולנצל את האמסטיגוטה האקסון בניסויי הנוקאאוט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: סקירה של הזרימה הניסיונית כולה מתוארת באיור 1.

Figure 1
איור 1: מבט כולל על ניסוי ההסתרה באמצעות EA. רקמת התרבות-הטרימטיקה הנגזרת של העור הם קוצרים והבדיל לתוך EA. gRNA הוא מנוכר לתוך Cas9-ביטוי amastigotes על ידי אלקטרופורציה, והצמיחה פנוטיפ של הסתרה amastigotes מוערך גם על ידי שכפול axenic או על ידי שכפול תאיים לאחר פלישת התאים המארחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

1. ההכנות לתרבות הטפיל

  1. Tulahuen המתח של טריאנוסומה cruzi משמש לאורך הדו ח הזה. לשמור על epimastigotes של T. cruzi ב- LIT בינונית (10% fcs, ראה שולחן משלים 1). סגרו את המכסה באופן מאובטח ושמרו על הבקבוקון של התרבות ב -28 ° c.
  2. צור זן הטרנסגניים של T. cruzi כי הנמלים Cas9 endonuclease. דוגמאות של פלמידים הביטוי המכילים רצף Cas9 coding ו G418 (ניאוr) בחירת סמן ניתן למצוא לנדר ואח '4 ופנג ואח '5
    1. באמצעות הקיט הרשום בטבלת החומרים, מעביר את הפלסטלינה למעלה לאפימסטיגוטה על ידי אלקטרופורציה. עבור 1 קובט, ספין למטה 2 x 107 תאים, למחוק את supernatant, ולהשעות מחדש עם 100 μl של מאגר אלקטרופורציה המכיל את הפתרון המוסף המסופק.
      הערה: מאגר אלקטרופורציה יכול להיות מוחלף עם מאגר EM24 (3:1 תערובת של cytomix25 ו פוספט-סוכרוז מאגר).
    2. הוסף 20-40 μg של פלאמיד והעבר את התערובת לתוך קובט אלקטרופורציה מרווח של 2 מ"מ. החל את הפעימה בהתקן אלקטרופורציה (ראה טבלת חומרים), באמצעות תוכנית X-1426.
    3. העבר את תוכן קובט לבקבוקון T-25 המכיל 5 מ ל של מדיום מוארת (10% FCS). מפעיל את הבקבוקון ב -28 ° c. במשך 24 שעות
    4. הוסף G418 לריכוז הסופי של 250 μg/mL והמשך הדגירה ב -28 ° c. זה לוקח בערך שבוע לכבות. את האפימסטיטים הלא-מזוהמים לאחר האוכלוסיה עמיד G418 מתחיל להתאושש, מעבר התרבות פעם או פעמיים בשבוע כדי למנוע רוויה ולדלל את התאים המתים. הקמת קו תא יציב בדרך כלל לוקח בסך הכל 4 שבועות.
      הערה: אם הביטוי הקונסטיטוטיבי של Cas9 הוא נטל של התא5, להפוך את הביטוי ספציפי לשלב amastigote על ידי מעלה את 3 '-utr של גן amastin מיד במורד הCas9 פתוח קריאה מסגרת27. התיאור המפורט של מרכז הCas9 המסוים הספציפי ביותר ניתן למצוא בטקאגי אל.22
  3. להקים שיתוף הטפיל האנטי-שותף של Cas9-הביע T. cruzi ותאים מארחים מיונקים. בדו ח זה, השתמש בתאים 3T3-השוויצרי לבקן פיברוסט כמארח.
    1. להבדיל בין טי. קרוזי לבין. לקבוע את צפיפות התא של התרבות epimastigote באמצעות המטוציטומטר ולאסוף 5 x 107 תאים על ידי צנטריפוגה עבור 15 דקות ב 2,100 x g. בטל את הסופרנטאנט והשהה מחדש את התאים עם 10 מ ל של מדיום RPMI. מודאת הטפיל ב 28 ° צ' עבור 1 שבוע28.
    2. לאסוף את הטריסטיסטילסטיגוטים. בRPMI בינוני להטות בזהירות את הבקבוקון ואת ללטף את הפתרון מבלי להפריע טפילים דבקה על פני השטח התחתון. העבר את המדיום לצינור חרוט וצנטריפוגה עבור 15 דקות ב 2,100 x g. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הטפיל עם 5 מ ל של DMEM (10% FCS).
      הערה: אוכלוסיית הטפיל היא תערובת של מטאקלוסטיגוטיס, אפימטאסטטים וצורות ביניים מסוימות. למרות שאין צורך בכך, ניתן לבודד את הטריאומואסטיט באמצעותכרומטוגרפיה של שערי היון של deae. לחילופין, epimastigotes ניתן לחסל על ידי הדגירה טפילים עם סרום פעיל לנושא אותם כדי להשלים את הליזה30.
    3. זרעי 3T3-השוויצרי לבקן פיברוהפיצוץ תא 60-70% שליטה, או על 1.7-2.0 x 106 תאים ב 5 מ ל של dmem (10% fcs) בבקבוקון תרבות T-25. להסיר בינוני גדילה להחיל את התערובת טפיל משלב 1.3.2. מודטה עבור 24 h ב 37 ° c תחת 5% CO2 בחממה מחולל לחות כדי ליצור זיהום.
    4. הסירו את הטפילים שנותרו מחוץ לתאים המארחים 3T3 על ידי שטיפת תרבות שיתוף עם DMEM (10% FCS) פעמיים.
    5. לאחר שיתוף התרבות המשותף רווי, מעבר לתאי המחשב הפונדקאי הנגוע באמצעות טריסינוניזציה. . ולשטוף את התרבות פעם אחת עם הערוץ החל 1 מ ל של 0.05% טריפסין פתרון לכסות את משטח התרבות כולו, ו דגירה למשך כמה דקות בטמפרטורת החדר עד התאים המארחים המחוברים להשתחרר. ניתוק התאים ממשטח הבקבוקון על-ידי שטיפה 3 מ ל של DMEM (10% FCS) על התאים.
    6. להעביר תאים מארחים מנותקים לתוך צינור חרוט, ו צנטריפוגה עבור 3 דקות ב 300 x g. משלחים את הסופרנטאנט ומחדשים את התאים עם 3 מ ל של DMEM טרי (10% FCS). שלב זה מסייע בסילוק אפימסטיגוטים שנותרו. העבר הכל לתוך בקבוקון T-75 נקי המכיל 9 מ ל של DMEM (10% FCS). המשיכו לעשות זאת עד שטריאומואסטיט משתחרר לתוך התרבות הסופרנטית.
    7. שמור על תרבות השיתוף על ידי הפסשה עם טריסיזציה פעמיים בשבוע. לאחר 70-80% של האוכלוסייה המארחת להידבק, באופן קבוע להוסיף מארח נגוע 3T3 תאים ביחס של 5:1 (בנושא: טרי), על מנת למנוע הידרדרות התרבות. טריאומואסטיט מגרפות ברציפות אם האיזון בין תאים מארחים לבין T. cruzi נשמר כראוי.

2. הבדלה באמצעות טרימטואסטיגוטס לתוך EA

  1. ביום שלפני הניסוי הזה, להסיר את המדיום צמיחה של שיתוף הפעולה טפיל מארח ולהוסיף DMEM טרי (10% FCS) לשטוף את EA ו טריאומווליטים כי כבר שוחרר מן התאים המארחים בימים קודמים. ניסויים רגילים דורשים לפחות שתי מבחנות T-75 של תרבות שוטפת של confluent.
  2. לאסוף את התרבות הסופר לתוך צינור חרוט לקצור את טריאומואסטיגוטס טרי. בדוק את המדגם תחת מיקרוסקופ (10x או 20x עדשה אובייקטיבית) עבור איכות. אם יש פסולת תא מארחים, יש לפרק בקצרה את הדגימה ולהעביר את הסופרנטאנט לתוך צינורית חדשה. אם יש מספר משמעותי של Ea, לבודד את הטריאואסטיוליטים על ידי הליך השחיה הבא.
    1. לסובב את התערובת של טריאומוסטיגוטים ו-amastigotes עבור 15 דקות ב 2,100 x g. התעלם מרוב הסופרנטנט, והשאיר 0.5-1.0 מ ל של המדיום בצינור.
      הערה: הפחתת אמצעי האחסון היא אופציונלית, אך היא הופכת את השלב הבא לקל יותר.
    2. דגירה את הגלולה ב 37 ° c עבור 1-2 h, המאפשר טריאומואסטיגוטים פעילים לשחות מתוך הגלולה (איור 2).
    3. העבר את הסופרנאנט המכיל טריקומאסטיוליטים לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
  3. צנטריפוגה את צינור החרוט עבור 15 דקות ב 2,100 x g כדי לאסוף טריאומואסטיוליטים. אם הליך השחייה-out התבצע לעיל, צנטריפוגה את שפופרת 1.5 mL עבור 2 דקות ב 4,000 x g כדי הגלולה טריאואסטיגוטה. . מחק את הסופרנטאנט
  4. השהה מחדש את הגלולה עם 5 מ ל של DMM באגירה עם 20 מ"מ MES (pH 5.0), שיושלם עם 0.4% BSA19. להעביר את הטפיל. לבקבוקון תרבות טי -25 . תשאיר את הכובע רופף צפיפות התא חייבת להיות סביב או מתחת 1 x 107 תאים/mL, מאז הרוויה מגביר את הסיכוי של מוות התא.
    הערה: צבע ה-DMEM חייב להיות צהוב, לא כתום. אם DMEM המקורי היה קיבולת אגירה גבוהה, 20 מ"מ MES (pH 5.0) אינו מספיק כדי להקטין את ה-pH. ה-pH של המדיום חייב להיות מותאם על ידי הוספת HCl במקרה זה. ניתן לשמור על המדיום החומצי ב -4 ° c, אך לא יותר מחודש אחד.
  5. מודטה את הבקבוקון של התרבות ב 37 ° c תחת 5% CO2 באינקובטור מחולל. סביב 95% של טפילים להבדיל לתוך amastigotes לאחר 24 h.

3. אלקטרופורציה של EA

  1. הכן gRNA עבור אלקטרופורציה. זה יכול להיעשות על ידי שעתוק חוץ גופית, או פשוט על ידי רכישת רנ א סינתטי oligונומ מהיצרן. בדוח זה, crRNA ו tracrRNA מ-DNA משולבת טכנולוגיות, Inc. משמשים.
  2. צנטריפוגה את התרבות של המלווים עבור 15 דקות ב 2,100 x g. . להיפטר מסופרנטאנט
  3. השהה מחדש את הגלולה עם מאגר אלקטרופורציה המכיל את הפתרון המוסף לצפיפות התא הסופית של 1 x 108 תאים/mL.
    הערה: מאגר EM גורם למותם יותר של תאים בהשוואה למאגר האלקטרופורציה המפורט ברשימת החומרים; לפיכך, היא אינה מומלצת לתרגום מדהים (איור משלים 1).
  4. Aliquot 100 μL של טפילים מושעה (1 x 107 תאים) לתוך 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות. הוסף 5-10 μg של gRNA ולערבב בעדינות על ידי ליטוף.
  5. העבר את התערובת לקובט אלקטרופורציה מרווח של 2 מ"מ. החל את הפעימה בהתקן האלקטרופורציה, באמצעות תוכנית X-14.
  6. העבר את תוכן קובט לבקבוקון T-25 המכיל 5 מ ל של מדיום מחומם מראש (10% FCS). להשאיר את הכובע רופף ומלא את הבקבוקון ב 37 ° c תחת 5% CO2.
  7. לנטר את צמיחת התא על ידי המשך של culenic קולטיורינג (סעיף 4) או כמו amastigotes תאיים לאחר זיהום תא מארח (סעיף 5).

4. ניטור התפתחותם של תאים מנוקאאוט כמו Axenic Amastigotes

  1. המלווים להתיישב בתחתית בינונית התרבות, כל כך בעדינות לנער את הבקבוקון כדי להשעות אותם מחדש לתוך הפתרון. שטיפת משטח הבקבוקון באמצעות ליטוף עוזרת, מכיוון שתאים מסוימים מתאחדים לבקבוקון.
  2. מערבבים 1 μL של propidium יודיד (PI) פתרון (20 μg/mL) עם 20 μL של תרבות amastigote.
    הערה: אין להשאיר את הבקבוקון התרבותי מחוץ לחממה במשך זמן רב מהדרוש. טמפרטורה היא אחד הגורמים המאפשרים התפשטות axenic22.
  3. החילו את המדגם על הימוציטומטר וצפו תחת מיקרוסקופ של זריחה. PI הוא התכוון לפגום קרום התא אבל הוא נשלל מתאים חיים. לספור את מספר amastigotes קיימא שאינם מוכתם על ידי PI (לשעבר/em 570 nm/602 nm).

5. ניטור הצמיחה של תאים נוקאאוט כמו Amastigotes תאיים

  1. הזרע מארח 3T3 תאים בצלחת 12-באר עם DMEM (10% FCS). כוונן את צפיפות התא ל-70-80% בשטף, או כ-3 x 105 תאים לכל היותר.
    הערה: כיוון שהמאמסטיגוטים אינם מורצפת, המכסה את רוב משטח הגדילה בתאי המחשב המארח משפרת את יעילות הזיהום.
  2. לאסוף הסתרה amastigotes משלב 3.6 על ידי צנטריפוגה יום אחד לאחר electroporation. השמט את הסופרנטאנט, והשהה מחדש את הטפיל עם 2 מ ל של DMEM (10% FCS).
  3. הסר את המדיום מתרבית התא המארח והחל השעיה מחדש של amastigotes. ריבוי של זיהום צריך להיות 20 או יותר. דגירה את הצלחת ב 37 ° c תחת 5% CO2 עבור 2 ימים כדי לאפשר amastigotes להקים זיהום.
    הערה: תקופת הזיהום יכולה להיות. יום אחד, בהתאם למטרה
  4. שטוף את האות נשאר מחוץ לתאי המחשב המארח פעמיים עם DMEM (10% FCS).
  5. הוסיפו DMEM טרי (10% FCS) לתרבות המארחת-שיתוף הטפיל והמשיכו בדגירה ב-37 ° c למשך יומיים נוספים.
  6. כדי להעריך את יעילות הזיהום, להמחיש גרעינים של התאים המארחים ו amastigote תאיים.
    הערה: הגרעינים     נוטים להיות חופפים בתרבות רווי-שיתוף. לציפוי מחדש של התאים בצפיפות תא נמוכה יותר (כגון 1:5 דילול) לפני קיבוע והצביעת מסייע לספור גרעינים בקלות רבה יותר.
    1. להסיר בינוני התרבות ולהחיל 1 מ"ל של 10% הפתרון פורמלין ב-PBS כדי לתקן את התאים. מודטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. החלף את פתרון פורמלין עם 1 mL של PBS המכיל 1 μg/mL hoechst 33342 ו 0.1% טריטון X-100. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. להסיר את הפתרון Hoechst ולשטוף את התאים פעם אחת עם PBS. הוסף 1 מ ל של PBS טרי.
  7. להתבונן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית ולזהות גרעיני תא מארח המשויכים גרעיני טפיל קטן יותר (איור 4). תאים מארחים המכילים יותר מ-2 amastigotes צריך להיחשב כנגועים, לא לכלול זיהום ראשוני שאינו פרודוקטיבי או לא מדומה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בידוד של טרימטואסטיוליטים על ידי הליך השחייה

כדי לקצור טריאומואסטיגוטים טריים מזהמים הישן על ידי הליך לשחות-out, כדורי תא צריך להיות מודבטים לפחות עבור 1 h. הדגירה של כדורי עבור יותר 2 h אינו מגדיל באופן משמעותי את מספר טריאומואסטיגוטים שחייה בתמיסה ( איור 2B). בניסוי מסוים זה, אחוז טריאומואסטיגוט בתערובת הראשונית היה 38%, והאחוז שלאחר השחייה היה מעל 98% בכל נקודת זמן נתונה. משני T-75 מבחנות של שיתוף תרבות confluent, אנחנו באופן שגרתי להשיג 3-4 x 107 תאים של טריאומואסטיגוט טהור על ידי זה לשחות-out פרוטוקול.

ניטור גדילה של הסתרה כתרבות האקנית

שלא כמו בשלבים התפתחותיים אחרים של T. cruzi, מדהים פחות האמאסטוליטים הם למעשה סטטי. לכן, הצביעת עם PI מסייעת להבחין בין האמסטיגוטים חיים מתים. PI הוא אטום קרום התא שלם אך חודר בקלות תאים מתים (איור 3A). Amastigotes מזוהמים gRNA נגד הגן חיוני, TcCGM1 (tcclb. 511807.80), הראה פגם גדילה משמעותי השוואת לקבוצה בקרת כי קיבל grna לא הומוולוגי ל -T. cruzi הגנום (איור 3b).

ניטור הצמיחה של טפילים הנוקאאוט כמו האמסטיגוטים תאיים

המואליות של הגן היעד בשלב amastigote יכול להיות גם הפגינו על ידי הערכה של הצמיחה פנוטיפ של נוקאאוט T. cruzi כמו amastigote תאיים (איור 4). שבריר של גרעיני מארח המשויכים לגרעיני T. cruzi קטנים יותר הייתה נמוכה באופן משמעותי בקבוצת TcCGM1-KO השווה לקבוצת הבקרה.

נוקאאוט של גן ספציפי לבמה גורם להבדל פנוסטיכי בשלבים amastigote ו טרימטואסטיציט

מוט הPAR1 מרכיב מאוד מבוטא ב טריאומואסטיט הבמה, אבל הוא מוסדר בשלב amastigote של T. cruzi22,31. אכן, העברה של gRNA נגד TcPAR1 (tcclb. 506755.20) לא השפיע באופן משמעותי על הצמיחה של EA לאחר 4 ימים של culenic קולטיורינג (איור 5b). gRNA לאחר מכן הפלישה תא מארח הראו גם כי TcPAR1-KO לא לעכב את הצמיחה של amastigotes תאיים, במונחים של חלק של תאים מארחים נגועים 4 ימים לכתוב זיהום (איור 5c). מספר הטפילים בתוך תא מארח יחיד לא נראה מושפע הנוק-אאוט, או (איור משלים 2). תוצאות אלה מעידות על כך שTcPAR1 אינו חיוני בשלב הamastigote של T. cruzi.

עם זאת, מספר טריאומואסטיגוטים הגיח מתוך תאים מארחים ב 5 ימים הזיהום הפוסט היה נמוך באופן משמעותי ב- TcPAR1-KO שיתוף תרבות, השוואת שיתוף התרבות השליטה (איור 5d). כמו כן, הבדיל טריאואסטיגוטים בתוך תא 3T3 מארח לפני שנראה האנפת להיות פעיל למדי בקבוצת שליטה (סרט משלים 1) אבל נראה איטי ב TcPAR1-KO הקבוצה (סרטים משלימים 2). תוצאות אלה מרמזות כי TcPAR1 ממלא תפקיד חשוב בשלב הטרימטואסטיט של T. cruzi, ככל הנראה על ידי מתן תנועתיות כדי לעזור האנפת, למרות הלא מהואליות שלה בשלב amastigote.

Figure 2
איור 2: בידוד של טרימטואסטיט על ידי הליך השחיה. (א) ייצוג סכמטי של הפרוטוקול. אדום = נוכחות של טריאואסטיגוטה. (ב) מספר הטרימוסטיגוטים שלהם יש חית מתוך הגלולה בנקודות זמן שצוינו. כדורי הראשונית הכיל סך של 3 x 107 טפילים, 38% מהם היו טריאומואסטיוליטים והשאר היו amastigotes. ניסויים נערכו באמצעות טרילקאט וערכים מתכוון (± SD) מותווים. הטוהר של טריאומואסטיגוטס בפתרון היה מעל 98% בכל נקודות זמן נתון. (ג) מיקרוסקופ תמונות של טפילים לפני הליך לשחות-out (שמאל), טריאומואסטיגוטים כי יש חית מתוך הגלולה (באמצע), וטפילים שנותרו בגלולה (מימין) אחרי 1 h של דגירה. קנה מידה של סרגלים = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניטור הצמיחה של האקסון האמסטיגוטה. (א) Propidium יודידה (PI) שיטת הדרה. תמונות מיקרוסקופית של EA על הומוציטומטר בשדה בהיר (משמאל), ערוץ הזריחה (האמצעי), ותמונה מצופה (מימין). חיצים צהובים מצביעים. על תאים מתים מוכתמים פאי קנה מידה ברים = 20 μm. (ב) מונה תא של Cas9-ביטוי amastigotes לאחר החצייה עם grnas נגד TcCGM1 (מעגל פתוח) ו grnas שליטה עם הומולוגיה לא הגנום T. cruzi (סגור מעגל). אלקטרופורציות נערכו בטריליטים, וערכים מושמעות (± SD) מותווים. (* * p < 0.01 על ידי מבחן t של וולש). דמות זו השתנתה מטקאגי ואח '22אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הצמיחה של בנוקאאוט מדהים לאחר הפלישה מארח. (A) גרעיני מכתים של הפונדקאי-טפיל שיתוף התרבות לאחר השכפול תאיים של amastigotes מזוהמים grnas נגד TcCGM1 ושליטה grnas. grna-העברה האחרונה הוחלו על 3t3 תאים 1 יום לאחר אלקטרופורציה ומותר להדביק תאים מארחים עבור 2 ימים. Amastigotes נשאר מחוץ לתאים המארחים נשטפו, ואת המשותף הטפיל שיתוף התרבות היה מודתה עבור 2 ימים נוספים. קנה מידה של סרגלים = 20 μm. איור זה שונה מטקאגי ואח '22 (ב) אחוז מהמארח 3t3 תאים נגוע amastigotes שליטה (בר שחור) ו TcCGM1-KO amastigotes (בר אפור). ממוצע (± SD) של שלושה ניסויים זיהום מותווים (* * p < 0.01, וולש של t-test). דמות זו השתנתה מטקאגי ואח '22אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ההבדל פנוסטיאני בין הסתרה האמאסטרגוט לבין טרימטואסטיגוטה. (א) ייצוג סכמטי של קו הזמן הניסיוני. (ב) ספירת תאים של האקסון בארבע ימים לאחר הספירה עבור השליטה amastigote (בר שחור) ו TcPAR1-KO amastigote (בר אפור). ערכים משמעותיים (± SD) של שלושה ניסויים אלקטרופורציה מותווים (נ: לא משמעותי, מאן-ויטני U מבחן). (ג) אחוז של מארח נגוע 3t3 תאים ב 4 ימים לאחר זיהום על ידי שליטה amastigote (שחור בר) ו TcPAR1-KO amastigote (בר אפור). ערכים משמעותיים (± SD) של שלוש בארות תרבות מותווים (נ: לא משמעותי, מאן-ויטני U מבחן). (ד) מספר טריקומאסטיגוטה שוחרר לתוך התווך התרבותי ב 5 ימים לאחר זיהום לשליטה שיתוף תרבות (בר שחור) ו- TcPAR1-KO התרבות (בר אפור). ערכים ממוצע (± SD) של שלוש בארות התרבות מותווים (* p < 0.05, מאן-ויטני U מבחן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה 1: הרכב של מדיום LIT. מדיום LIT הוכן על פי atcc 1029, למעט כמות של ניתרן מימן פוספט. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן.

משלים איור 1: אפקט של מאגר אלקטרופורציה על הכדאיות תא amastigote. EA הייתה אלקטרופורתה במאגר אלקטרופורציה או במאגר EM. Amastigote היה מוכתם ב-PI אחרי 24 שעות כדי לספור את מספר amastigote חי ומת. אחוזים של תאים מתים בכל קבוצה ובכל קבוצת הדופק לא מותווים. ממוצע (± SD) של שלושה ניסויים אלקטרופורציה מוצגים (* p < 0.05, נ: לא משמעותי, מבחן קרוקאל-ווליס). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

איור משלים 2: תמונות מיקרוסקופית של TcPAR1מוכתם גרעינית-KO ושליטה האמסטיגוטים. שיתוף תרבות של מארח 3T3 תאים ו amastigotes מזוהמים היו קבועים מוכתם 4 ימים לאחר הזיהום. סרגלי קנה מידה: 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה איור 3: הצמיחה פנוטיפ של Cas9-הביטוי epimastigote. התא ספירות של מסוג wildmastigotes (WT), epimastigotes כי מבטא באופן מדויק Cas9-EGFP (Cas9-EGFP), ו epimastigotes המבטא Cas9-EGFP תחת התקנה של amastigote ספציפי 3 '-UTR (Cas9-EGFP-AmaUTR) מותווים בקנה מידה. Epimastigotes היו מעובדים ב-LIT בינונית (10% FCS) ב -28 ° c. צפיפות התא הטפיל הותאמה ל 1 x 106 תאים/ML ביום 0. ספירות תאים מצטברות מחושבות כדחיסות תאים המוכפלות בפקטור הדילול הכולל. ממוצע (± SD) של שלושה מבחנות התרבות מוצגים (* p < 0.05, נ: לא משמעותי, מבחן קרוקאל-ווליס). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלים סרט 1: תמונת מיקרוסקופיה של התרבות המשותף שליטה. מספר ואקטיביות של טריאומואסטיגוטים שהיו. מובכים מהאמסטיגוטים השולטים תמונת וידאו ב 5 ימים לאחר זיהום מוצג.  אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט.

משלים סרט 2: תמונת וידאו מיקרוסקופית של TcPAR1-KO שיתוף התרבות. מספר ואקטיביות של טריאומואסטיגוטים. שהובלו מTcPAR1-קו אמסטיגוטס תמונת וידאו ב 5 ימים לאחר זיהום מוצג. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הדגמנו כי התרבות axenic של T. cruzi amastigotes יכול להיות מנוצל CRISPR/Cas9-תיווך גן בנוקאאוט, על ידי electroporating grna ישירות לתוך Cas9-המבטא EA. בדרך זו, החיוני של הגן היעד במיוחד בשלב amastigote ניתן להעריך מבלי לעבור בשלבים התפתחותיים אחרים.

עוד היבט מועיל של מעבר החצייה הוא הנוחות בבדיקות עבור מספר רב של גנים מטרה. לאחר שיתוף התרבות של Cas9-ביטוי T. cruzi ומארחים תא היונקים הוא הוקם, זה לוקח רק כמה ימים כדי להפוך את הרקמה הנגזרת טריאומווליטים לתוך EA ו transfect grna כדי לקבל הסתרה amastigotes. gRNA הוא החומר היחיד שצריך להיות מותאם לכל גן יעד, אבל gRNA סינתטי זמין ממספר יצרנים, כך ניתן פשוט לרכוש. שיטה חלופית כדי לנתח את השלב הסגולי ספציפי של גנים היעד יהיה להקים מערכת הנוקאאוט inducible32. במקרה כזה, יש לבנות פלמידים עבור כל גן יעד ומנוכר הטפיל בשלב epimastigote כדי לאפשר בחירת סמים של הטרנסלורים, מאז היעילות הטרנסגנטית של הפלבאמצע הוא הרבה יותר נמוך מזה של gRNA (< 15% עבור פלאמיד 26 כאמור ל> 96% עבור grna22). הטרנסגררים שנבחרו חייב להיות מובחנים לתוך מטאכלחץ טרימטוסטיטיס כדי להדביק את התאים המארחים לבסוף לגרום נוקאאוט באמסטיגוציטים תאיים. . כל התהליך הזה ייקח 1-2 חודשים

בדו ח זה, השתמשנו ב-PI כדי להבחין בין תאים מתים בתרבות האמסטימית של axenic כדי לכמת את צפיפות התא עם המטוציטומטר. לחילופין, בחני מטבולית כגון שיטת הכדאיות resazurin יכול להיות מועסק כדי להעריך את מספר amastigotes חי, אשר מתאים יותר בפורמט תפוקה גבוהה. בידינו, 1 x 105 amastigotes לכל התשואה גם פעילות החמצון מספיק להתגלות על ידי שיטת resazurin לאחר 5 h של דגירה.

חיסרון אחד של הקמת קו תא Cas9 ביטוי הוא העומס התאי הפוטנציאלי והמחשוף שאינו ספציפי בשל Cas9 overexpression5,33. ישנם מספר דיווחים המציינים כי הביטוי הקונסטיטוטיבי של Cas9 אין השפעה על שיעור הצמיחה של T. cruzi4,6,7,8. עם זאת, במקרה אחד5 וגם בידינו, Cas9 ביטוי טפיל הראה צמיחה איטית השוואת לסוג wildtype על מנת להתגבר על בעיה זו, העסקנו את הייחודיות 3 '-UTR כדי להגביל את הביטוי של Cas9 לשלב amastigote22. הקונאוסטין 3 '-utr אל Cas9 פתוח מסגרת הקריאה שוחזר את שיעור השכפול של הטפיל טרנסגניים (משלים איור 3), ובכך לייצר חזק מארח-טפיל שיתוף תרבות לספק ברציפות טריקומאסטיוליטים עבור מבחנה . מאוד מדהים לאחרונה, קבוצות אחרות הפגינו כי הקדמה של grna/Cas9 rnp מורכבות כדי הטפיל מסוג wildtype יכול לגרום לעריכת הגנום ב -T. cruzi7,9. שיטה זו יש לחקור כגישה פחות מלחיץ את הטפיל9, מאז המחקר בתאי היונקים מרמז כי השימוש rnp מפחית בלתי רצוי הגנום היעד עריכה, בשל מחצית החיים קצר של Cas9 חלבון34.

שינוי אופציונלי נוסף לפרוטוקול יהיה השילוב המשותף של הדנ א של התורם כתבנית לצירוף מחדש של הומוולוגי. דווח כי ה-DNA של התורם המכיל רצפי הומוולוגי למעלה ובמורד הזרם של אתר המחשוף, בצורה של דנ א כפול תקוע4,5,8,35 או אחד תקוע לחצו על השעון7,9, מקל על תהליך התיקון של הפסקה כפולה נתקע נגרמת על ידי Cas9 nuclease. למרות דיווחים מסוימים מצביעים על כך microhomology מתווכת הצטרפות ללא תבנית התורם יכול לתקן את המחשוף ולהציג מוטציה מחיקה5, מבוא הרצף המוגדר לאתר מוטציה בכל זאת עוזר לאשר מוצלחת הגנום עריכה, כי קשה להראות את הראיות DNA של נוקאאוט גנטי במקרים מסוימים, אף על פי הפחתת חלבון היעד ואת התוצאה פנוטימית מציע את הגן היעד היה מוטציה4.

Cas9/gRNA RNP מעבר ושיתוף הזיהום של ה-DNA של התורם אינם מפגינים בדו ח זה כדי לפשט את התיאור של הפרוטוקול ולהתמקד על הכנת EA ואת השימוש בתרבות axenic לאחר מכן. אם מישהו רוצה לבצע את הניסויים האלה, זה יכול להיעשות רק על ידי החלפת המרכיבים של אלקטרופורציה.

השיטה שלנו לניצול EA של T. cruzi ככלי ניסיוני פוטנציאלי מאפשר מגוון של מחקרים ספציפיים לבמה, כולל ביטוי גנטי חולף על ידי הפיכת הזיהום באמצעות הניתוח ויעילות התרופה22. עם זאת, האפקטיביות של גישה זו נבדקה רק במאמץ Tulahuen עד כה. מאז זנים של T. cruzi הם די מגוונת, תחולת פרוטוקול זה כדי זנים אחרים חייב להיות נחקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגוד אינטרסים לגלות.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי JSPS KAKENHI גרנט מספר 18K15141 כדי חתיכה

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20% formalin solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 068-03863 fixing cells
25 cm2 double seal cap culture flask AGC Techno Glass 3100-025
75 cm2 double seal cap culture flask AGC Techno Glass 3110-075
All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X710
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for Control) IDT custom made target sequence = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcCGM1) IDT custom made target sequence = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcPAR1) IDT custom made target sequence = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA IDT 1072532 to anneal with crRNA
Amaxa Nucleofector device LONZA AAN-1001 electroporation
Basic Parasite Nucleofector Kit 2 LONZA VMI-1021 electroporation
BSA Sigma-Aldrich A3294 component of the medium for in vitro amastigogenesis
Burker-Turk disposable hemocytometer Watson 177-212C cell counting
Coster 12-well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3513
DMEM FUJIFILM Wako Pure Chemical 044-29765 culture medium
Fetal bovine serum, Defined Hyclone SH30070.03 heat-inactivate before use
G-418 Sulfate Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 077-06433 selection of transformant
Hemin chloride Sigma-Aldrich H-5533 component of LIT medium
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570 staining of nuclei
Liver infusion broth, Difco Becton Dickinson 226920 component of LIT medium
MES FUJIFILM Wako Pure Chemical 349-01623 component of the medium for in vitro amastigogenesis
PBS (–) FUJIFILM Wako Pure Chemical 166-23555
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4864-10ML staining of dead cells
RPMI 1646 Sigma-Aldrich R8758 medium for metacyclogenesis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. (WHO) Fact sheet: Chagas disease (American trypanosomiasis). , [updated 2017 Mar; cited 2017 Aug], at http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/ (2017).
  2. Clayton, J. Chagas disease 101. Nature. 465 (n7301_supp), S4-S5 (2010).
  3. Apt, W. Current and developing therapeutic agents in the treatment of Chagas disease. Drug Design, Development and Therapy. 4, 243-253 (2010).
  4. Lander, N., Li, Z. H. H., Niyogi, S., Docampo, R. CRISPR/Cas9-induced disruption of paraflagellar rod protein 1 and 2 genes in Trypanosoma cruzi reveals their role in flagellar attachment. mBio. 6 (4), e01012 (2015).
  5. Peng, D., Kurup, S. P., Yao, P. Y., Minning, T. A., Tarleton, R. L. CRISPR-Cas9-mediated single-gene and gene family disruption in Trypanosoma cruzi. mBio. 6 (1), e02097-e02114 (2015).
  6. Romagnoli, B. A. A., Picchi, G. F. A., Hiraiwa, P. M., Borges, B. S., Alves, L. R., Goldenberg, S. Improvements in the CRISPR/Cas9 system for high efficiency gene disruption in Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 178, 190-195 (2018).
  7. Burle-Caldas, G. A., Soares-Simões, M., Lemos-Pechnicki, L., DaRocha, W. D., Teixeira, S. M. R. Assessment of two CRISPR-Cas9 genome editing protocols for rapid generation of Trypanosoma cruzi gene knockout mutants. International Journal for Parasitology. 48 (8), 591-596 (2018).
  8. Costa, F. C. Expanding the toolbox for Trypanosoma cruzi: A parasite line incorporating a bioluminescence-fluorescence dual reporter and streamlined CRISPR/Cas9 functionality for rapid in vivo localisation and phenotyping. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), e0006388 (2018).
  9. Soares Medeiros, L. C. High-Efficiency Genome Editing in Protozoan Parasites Using CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins. mBio. 8 (6), (2017).
  10. Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An axenic amastigote system for drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (4), 818-822 (1997).
  11. Bates, P. A. Axenic culture of Leishmania amastigotes. Parasitology Today. 9 (4), 143-146 (1993).
  12. Ravinder, R., Bhaskar, B., Gangwar, S., Goyal, N. Development of luciferase expressing Leishmania donovani axenic amastigotes as primary model for in vitro screening of antileishmanial compounds. Current Microbiology. 65 (6), 696-700 (2012).
  13. Nühs, A. Development and Validation of a Novel Leishmania donovani Screening Cascade for High-Throughput Screening Using a Novel Axenic Assay with High Predictivity of Leishmanicidal Intracellular Activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), 1-17 (2015).
  14. De Rycker, M. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
  15. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  16. Pescher, P., Blisnick, T., Bastin, P., Späth, G. F. Quantitative proteome profiling informs on phenotypic traits that adapt Leishmania donovani for axenic and intracellular proliferation. Cellular Microbiology. 13 (7), 978-991 (2011).
  17. Andrews, N. W., Hong, K. S. U., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Stage-specific surface antigens expressed during the morphogenesis of vertebrate forms of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 64 (3), 474-484 (1987).
  18. Pan, S. C. Trypanosoma cruzi: intracellular stages grown in a cell-free medium at 37 C. Experimental Parasitology. 45 (2), 215-224 (1978).
  19. Tomlinson, S., Vandekerckhove, F., Frevert, U., Nussenzweig, V. The induction of Trypanosoma cruzi trypomastigote to amastigote transformation by low pH. Parasitology. 110 (05), 547 (1995).
  20. Ley, V., Andrews, N. W., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Amastigotes of Trypanosoma cruzi sustain an infective cycle in mammalian cells. Journal of Experimental Medicine. 168 (0022-1007 (Print)), 649-659 (1988).
  21. Bonfim-Melo, A., Ferreira, E. R., Florentino, P. T. V., Mortara, R. A. Amastigote Synapse: The Tricks of Trypanosoma cruzi Extracellular Amastigotes. Frontiers in Microbiology. 9, 1341 (2018).
  22. Takagi, Y., Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K. Utilization of proliferable extracellular amastigotes for transient gene expression, drug sensitivity assay, and CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in Trypanosoma cruzi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 13 (1), e0007088 (2019).
  23. Fernandes, J. F., Castellani, O. Growth characteristics and chemical composition of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 18 (2), 195-202 (1966).
  24. Oberholzer, M., Lopez, M. A., Ralston, K. S., Hill, K. L. Approaches for Functional Analysis of Flagellar Proteins in African Trypanosomes. Methods in Cell Biology. 93, 21-57 (2009).
  25. van den Hoff, M. J. B., Moorman, A. F. M., Lamers, W. H. Electroporation in ‘intracellular’ buffer increases cell survival. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2902-2902 (1992).
  26. Pacheco-Lugo, L., Díaz-Olmos, Y., Sáenz-García, J., Probst, C. M., DaRocha, W. D. Effective gene delivery to Trypanosoma cruzi epimastigotes through nucleofection. Parasitology International. 66 (3), 236-239 (2017).
  27. Coughlin, B. C., Teixeira, S. M., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Amastin mRNA abundance in Trypanosoma cruzi is controlled by a 3’-untranslated region position-dependent cis-element and an untranslated region-binding protein. The Journal of Biological Chemistry. 275 (16), 12051-1260 (2000).
  28. Shaw, A. K., Kalem, M. C., Zimmer, S. L. Mitochondrial Gene Expression Is Responsive to Starvation Stress and Developmental Transition in Trypanosoma cruzi. mSphere. 1 (2), (2016).
  29. Chao, D., Dusanic, D. G. Comparative studies of the isolation of metacyclic trypomastigotes of Trypanosoma cruzi by DEAE ion exchange chromatography. Zhonghua Minguo wei sheng wu ji mian yi xue za zhi (Chinese Journal of Microbiology and Immunology). 17 (3), 146-152 (1984).
  30. Nogueira, N., Bianco, C., Cohn, Z. Studies on the selective lysis and purification of Trypanosoma cruzi. The Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 224-229 (1975).
  31. Minning, T. A., Weatherly, D. B., Atwood, J., Orlando, R., Tarleton, R. L., Tarleton, R. L. The steady-state transcriptome of the four major life-cycle stages of Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 10, 370 (2009).
  32. Rico, E., Jeacock, L., Kovářová, J., Horn, D. Inducible high-efficiency CRISPR-Cas9-targeted gene editing and precision base editing in African trypanosomes. Scientific Reports. 8 (1), 7960 (2018).
  33. Fu, Y. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
  34. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  35. Chiurillo, M. A., Lander, N., Bertolini, M. S., Storey, M., Vercesi, A. E., Docampo, R. Different roles of mitochondrial calcium uniporter complex subunits in growth and infectivity of Trypanosoma cruzi. mBio. 8 (3), e00574-e00617 (2017).

Tags

גנטיקה סוגיה 149 CRISPR/Cas9 הנוקאאוט גנטי הבמה ספציפי טריאנוסומה cruzi מחלה של שגית הטפיל מחלת התרופה מטרת הסמים התרבות axenic amastigote
היכרות גנטית הסתרה ישירות לתוך השלב Amastigote של <em>טריאנוסומה cruzi</em> באמצעות מערכת CRISPR/Cas9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K.,… More

Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K., Takagi, Y. Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (149), e59962, doi:10.3791/59962 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter