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Genetics

एक जीन नॉकआउट का परिचय सीधे Trypanosoma cruzi के Amastigote चरण में CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग

Published: July 31, 2019 doi: 10.3791/59962
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)

Summary

यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए Trypanosoma cruzi के extracellular amastigote में एक जीन नॉकआउट परिचय, CRISPR / विकास phenotype या तो axenic amastigote संस्कृति की सेल गिनती द्वारा या मेजबान सेल आक्रमण के बाद intracellular amastigotes के प्रसार के द्वारा पीछा किया जा सकता है.

Abstract

ट्रिपैनोसोमा क्रूजी एक रोगजनक प्रोटोज़ोअन परजीवी है जो मुख्य रूप से लैटिन अमेरिका में चागास रोग का कारण बनता है। टी Cruziके खिलाफ एक उपन्यास दवा लक्ष्य की पहचान करने के लिए, यह परजीवी के स्तनधारी चरण में लक्ष्य जीन की अनिवार्यता को मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है, amastigote. टी Cruzi के Amastigotes मेजबान सेल के अंदर दोहराने; इस प्रकार, यह अन्य विकासात्मक चरणों के माध्यम से जाने के बिना एक नॉकआउट प्रयोग का संचालन करने के लिए मुश्किल है। हाल ही में, हमारे समूह में एक विकास की स्थिति है जिसमें amastigote अप करने के लिए अपने amastigote की तरह गुणों को खोने के बिना 10 दिनों के लिए axenically दोहराने कर सकते हैं की सूचना दी. इस लौकिक अक्षीय amastigote संस्कृति का उपयोग करके, हम सफलतापूर्वक जीन knockouts कारण और amastigote चरण में विशेष रूप से उनके phenotypes का विश्लेषण करने के लिए Cas9-expressing amastigote में सीधे GRNAs शुरू की. इस रिपोर्ट में, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए इन विट्रो व्युत्पन्न extracellular amastigotes में उत्पादन, और एक CRISPR/Cas9-मध्यस्थ नॉकआउट प्रयोग में axenic संस्कृति का उपयोग करने के लिए. नॉकआउट amastigotes के विकास phenotype या तो कुल्हाड़ी संस्कृति के सेल मायने रखता है द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, या मेजबान सेल आक्रमण के बाद intracellular amastigote की प्रतिकृति द्वारा. इस विधि परजीवी चरण भेदभाव सामान्य रूप से एक ट्रांसजेनिक या एक नॉकआउट amastigote उत्पादन में शामिल नजरअंदाज कर दिया। अस्थायी अक्षीय अमास्टिगोटसंस्कृति का उपयोग टी क्रुजी में चरण-विशिष्ट अध्ययनों की प्रयोगात्मक स्वतंत्रता का विस्तार करने की क्षमता है।

Introduction

Trypanosoma cruzi Chagas रोग है, जो मुख्य रूप से लैटिन अमेरिका1में प्रचलित है का कारक एजेंट है. टी क्रुजी की विशिष्ट जीवन चक्र अवस्थाहोती है क्योंकि यह कीट सदिश और स्तनधारी मेजबान2के बीच यात्रा करती है . टी Cruzi एक रक्त चूसने triatomine बग के midgut में एक epimastigote के रूप में प्रतिकृति और एक संक्रामक मेटासाइक्लिक trypomastigote में एक मानव या पशु मेजबान पर जमा किया जा रहा से पहले अपने हिंदगुट में differentiates. एक बार trypomastigote काटने साइट के माध्यम से या एक श्लेष्म झिल्ली के माध्यम से मेजबान शरीर में हो जाता है, परजीवी एक मेजबान सेल पर आक्रमण और एक flagella-कम दौर फार्म में बदल एक amastigote कहा जाता है. amastigote मेजबान सेल के भीतर प्रतिकृति और अंत में trypomastigote में differentiates, जो मेजबान सेल से बाहर फट और एक और मेजबान सेल को संक्रमित करने के लिए रक्त प्रवाह में प्रवेश करती है.

वर्तमान में उपलब्ध रसायन चिकित्सा एजेंटों, बेंजनिडाज़ोल और nifurtimox के बाद से, प्रतिकूल दुष्प्रभाव का कारण है और रोगकेपुराने चरण में अप्रभावी हैं 3, यह टी cruzi के खिलाफ उपन्यास दवा लक्ष्यों की पहचान करने के लिए एक महान ब्याज की है। हाल के वर्षों में, CRISPR/Cas9 प्रणाली प्रभावी ढंग से टी Cruziमें जीन नॉकआउट प्रदर्शन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है, या तो अलग या एकल प्लाज्मिड (एस) के transfection द्वारा gRNA और Cas94युक्त , Cas9 की स्थिर अभिव्यक्ति और बाद में GRNA5,6,7 या लिप्यंतर टेम्पलेट का परिचय gRNA8, या पूर्व गठित GRNA/Cas9 RNP परिसर7,9के इलेक्ट्रोपोट्रेशन द्वारा . इस तकनीकी प्रगति उच्च Chagas रोग में दवा लक्ष्य अनुसंधान में तेजी लाने के लिए प्रत्याशित है.

दवा के विकास के साथ आगे बढ़ने के लिए, यह टी Cruziके amastigote में दवा उम्मीदवार यौगिकों के लक्ष्य जीन या प्रभावकारिता की अनिवार्यता को मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह स्तनधारी मेजबान में परजीवी की प्रतिकृति चरण है. हालांकि, यह एक चुनौतीपूर्ण काम है, क्योंकि amastigotes सीधे एक अवरोधक मेजबान सेल की उपस्थिति के कारण हेरफेर नहीं किया जा सकता है. लीशमैनियामें , टी क्रुजीके निकट से संबंधित प्रोटोजोअन परजीवी , एक अक्षीय अमास्टिगोटे पुलिंग विधि विकसित की गई थी और इसका उपयोग औषध जांच परख10,11,12में किया गया है, 13. यद्यपि अक्षीय अमास्टिगोट्स और इंट्रासेल्यूलर एमैस्टिगोट्स14के बीच यौगिकों के प्रति संवेदनशीलता में कुछ विसंगतियां हैं , फिर भी अक्षीय संस्कृति को बनाए रखने की क्षमता का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान प्रयोगात्मक उपकरण प्रदान करता है लेशमैनिया15,16के नैदानिक रूप से प्रासंगिक अवस्था के बुनियादी जीव विज्ञान . टी cruziके मामले में , स्वाभाविक रूप से होने वाली extracellular amastigotes (EA)17 की उपस्थिति के बारे में साहित्य और ईए17,18,19 तारीख वापस करने के लिए इन विट्रो उत्पादन में दशकों पहले. इसके अलावा, ईए एक संक्रामक क्षमता है करने के लिए जाना जाता है20,हालांकि trypomastigote की तुलना में कम है, और amastigote मेजबान आक्रमण के तंत्र हाल के वर्षों में स्पष्ट किया गया है (Bonfim-Melo एट अल द्वारा की समीक्षा की.21). हालांकि, Leishmaniaके विपरीत, ईए टी cruziमें एक प्रयोगात्मक उपकरण के रूप में उपयोग नहीं किया गया था, मुख्य रूप से क्योंकि ईए एक अनिवार्य intracellular परजीवी के रूप में माना गया था, और इस तरह के रूप में नहीं माना गया था "प्रतिज्ञेय रूप" एक व्यावहारिक में भावना.

हाल ही में, हमारे समूह के लिए एक अस्थायी अक्षीय संस्कृति 22 के रूप में टी cruzi के ईए का उपयोग करने का प्रस्ताव22. टी Cruzi Tulahuen तनाव के Amastigotes बड़ी गिरावट या amastigote की तरह गुणों के नुकसान के बिना 10 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर LIT माध्यम में मेजबान कोशिकाओं से मुक्त प्रतिकृति कर सकते हैं. मेजबान मुक्त विकास अवधि के दौरान, ईए सफलतापूर्वक पारंपरिक इलेक्ट्रोपोट्रेशन द्वारा exogenous जीन अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया गया था, trypanocidal यौगिकों के साथ दवा अनुमापन परख, और CRISPR/Cas9-मध्यस्थ नॉकआउट विकास phenotype निगरानी के बाद. इस रिपोर्ट में, हम विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए इन विट्रो व्युत्पन्न ईए में उत्पादन और नॉकआउट प्रयोगों में axenic amastigote का उपयोग करें.

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Protocol

नोट: संपूर्ण प्रायोगिक प्रवाह का अवलोकन चित्र 1में दर्शाया गया है।

Figure 1
चित्र 1: EA का उपयोग करके नॉकआउट प्रयोग का अवलोकन. ऊतक संस्कृति व्युत्पन्न trypomastigotes काटा जाता है और EA में विभेदित gRNA electroporation द्वारा Cas9-expressing amastigotes में transfected है, और नॉकआउट amastigote के विकास phenotype या तो कुल्हाड़ी प्रतिकृति द्वारा या द्वारा मूल्यांकन किया जाता है मेजबान सेल आक्रमण के बाद intracellular प्रतिकृति. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

1. परजीवी संस्कृति की तैयारी

  1. Trypanosoma cruzi के Tulahuen तनाव इस रिपोर्ट में प्रयोग किया जाता है. LIT माध्यम में टी cruzi के epimastigotes बनाए रखें (10% FCS, पूरक तालिका 1देखें ). टोपी को सुरक्षित रूप से बंद करें और संस्कृति फ्लास्क को 28 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. टी cruzi कि Cas9 endonuclease बंदरगाह के एक ट्रांसजेनिक तनाव उत्पन्न. अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के उदाहरण जिनमें Cas9 कोडिंग अनुक्रम और G418 (neor) चयन मार्कर शामिल हैं, लैंडर एट अल4 और पेंग एट अल में पाया जा सकता है।
    1. सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध किट का उपयोग करते हुए, विद्युत-प्रत्यय द्वारा उपरोक्त प्लाज्मिड को एपेमास्टिगोटमें ट्रांसफेक्ट करें। 1 cuvette के लिए, नीचे स्पिन 2 x 107 कोशिकाओं, supernatant त्यागें, और प्रदान की पूरक समाधान युक्त electroporation बफर के 100 डिग्री सेल्सियस के साथ resuspend.
      नोट: इलेक्ट्रोपोरेशन बफर EM बफर24 (3:1 cytomix25 और फॉस्फेट-सुक्रोज बफर का मिश्रण) के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
    2. 20-40 ग्राम प्लाज्मिड जोड़ें और मिश्रण को 2 मिमी अंतराल इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट में स्थानांतरित करें। पल्स को इलेक्ट्रोपोरेशन डिवाइस के साथ लागू करें (सामग्री की तालिकादेखें), X-14 प्रोग्राम26का उपयोग करते हुए .
    3. LIT माध्यम (10% FCS) के 5 एमएल युक्त एक टी-25 फ्लास्क में cuvette सामग्री स्थानांतरण। फ्लास्क को 24 ज के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. G418 को 250 ग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता में जोड़ें और 28 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन जारी रखें। गैर-ट्रांसफेक्टेड एपेमस्तिकों को मारने में लगभग 1 सप्ताह का समय लगता है। एक बार G418 प्रतिरोधी आबादी ठीक करने के लिए शुरू होता है, संतृप्ति से बचने के लिए और मृत कोशिकाओं को पतला करने के लिए एक सप्ताह में एक या दो बार संस्कृति पारित. एक स्थिर सेल लाइन की स्थापना आमतौर पर 4 सप्ताह के कुल लेता है.
      नोट: यदि Cas9 की गठन अभिव्यक्ति सेल5के लिए एक बोझ है , तो Amastin जीन के 3 'UTR तुरंत Cas9 खुला पढ़ने फ्रेम27के नीचे का संयोजन द्वारा amastigote चरण के लिए विशिष्ट अभिव्यक्ति बनाओ . amastigote-विशिष्ट Cas9 अभिव्यक्ति प्लाज्मिड का विस्तृत विवरण Takagi एट अल में पाया जा सकता है.
  3. Cas9-expressing टी Cruzi और स्तनधारी मेजबान कोशिकाओं के एक मेजबान परजीवी सह संस्कृति की स्थापना. इस रिपोर्ट में, एक मेजबान के रूप में 3T3-स्विस Albino फाइब्रोब्लास्ट सेल का उपयोग करें।
    1. विभेद टी cruzi epimastigotes मेटासाइक्लिक trypomastigotes में. एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर के लिए epimastigote संस्कृति के सेल घनत्व का निर्धारण और 2,100 x पर 15 मिनट के लिए centrifugation द्वारा 5 x 107 कोशिकाओं को इकट्ठा। सुपरनेंट को त्यागें और कोशिकाओं को आरपीएमआई माध्यम के 10 एमएल के साथ पुन: निलंबित करें। परजीवी को 1 सप्ताह 28 केलिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें .
    2. RPMI माध्यम में मेटासाइक्लिक trypomastigotes लीजिए. ध्यान से फ्लास्क झुकाव और नीचे की सतह का पालन परजीवी परेशान किए बिना समाधान बाहर पाइप. एक शंकु ट्यूब और 2,100 x ग्राम पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रण करने के लिए माध्यम स्थानांतरण। सुपरनेंट को त्याग ें और DMEM के 5 एमएल (10% FCS) के साथ परजीवी को फिर से निलंबित करें।
      नोट: परजीवी जनसंख्या मेटासाइक्लिक ट्राइपोमास्टिगोटीज, एपिमास्टिगोटीज और कुछ मध्यवर्ती रूपों का मिश्रण है। हालांकि आवश्यक नहीं है, आप DEAE आयन विनिमय क्रोमैटोग्राफी29द्वारा trypomastigote को अलग कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, epimastigotes सक्रिय सीरम के साथ परजीवी incubating द्वारा समाप्त किया जा सकता है उन्हें lysis30पूरक करने के लिए विषय .
    3. बीज 3T3-स्विस Albino फाइब्रोब्लास्ट सेल करने के लिए 60-70% संगम, या के बारे में 1.7-2.0 x 106 कोशिकाओं DMEM के 5 एमएल में (10% FCS) टी-25 संस्कृति फ्लास्क में. विकास माध्यम निकालें और कदम से परजीवी मिश्रण लागू 1.3.2. संक्रमण स्थापित करने के लिए एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 एच के लिए इनक्यूबेट।
    4. DMEM (10% FCS) दो बार के साथ सह संस्कृति धोने से मेजबान 3T3 कोशिकाओं के बाहर शेष परजीवी निकालें.
    5. एक बार सह संस्कृति संतृप्त है, मार्ग amastigote trypsinization द्वारा संक्रमित मेजबान कोशिकाओं. माध्यम को प्रेरित करें और पीबीएस के साथ एक बार संस्कृति को कुल्ला करें। पूरी संस्कृति की सतह को कवर करने के लिए 0.05% ट्रिप्सिन समाधान का 1 एमएल लागू करें, और कमरे के तापमान पर कुछ मिनट के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि संलग्न मेजबान कोशिकाएं ढीली न हो जाएँ। कोशिकाओं पर DMEM (10% FCS) के 3 एमएल फ्लशिंग द्वारा फ्लास्क सतह से कोशिकाओं को अलग करें।
    6. अलग-अलग होस्ट कोशिकाओं को शंकु नली में स्थानांतरित करें, और 300 x ग्राम पर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रण। सुपरनेंट को प्रेरित करें और कोशिकाओं को 3 एमएल ताजा डीएमईएम (10% एफसीएस) के साथ पुन: निलंबित करें। यह चरण शेष epimastigotes को खत्म करने में मदद करता है. DMEM के 9 एमएल (10% एफसीएस) युक्त एक साफ टी 75 फ्लास्क में सभी स्थानांतरण। जब तक trypomastigote संस्कृति supernatant में जारी है culturing जारी रखें.
    7. सप्ताह में दो बार ट्रिप्सिनाइजेशन के साथ गुजरते हुए सह-संस्कृति को बनाए रखें। एक बार मेजबान आबादी के 70-80% संक्रमित हो जाते हैं, नियमित रूप से 5:1 के अनुपात में uninfected मेजबान 3T3 कोशिकाओं को जोड़ने (कैरीओवर: ताजा), ताकि संस्कृति गिरावट से बचने के लिए. यदि मेजबान कोशिकाओं और टी क्रुजी के बीच संतुलन को ठीक से बनाए रखा जाता है तो ट्राइपोमैस्टिगोटे लगातार प्रवेश करते हैं।

2. ईए में ट्राइपोमास्टिगोट्स का अंतर

  1. इस प्रयोग से पहले दिन, मेजबान परजीवी सह संस्कृति के विकास के माध्यम को हटाने और ताजा DMEM जोड़ें (10% FCS) दूर ईए और trypomastigotes कि पहले से ही पिछले दिनों में मेजबान कोशिकाओं से जारी किया गया था धोने के लिए. नियमित प्रयोगों के लिए कम से कम दो टी-75 फ्लास्क की आवश्यकता होती है जो कि सह-संस्कृति के लिए होती है।
  2. एक शंकु ट्यूब में संस्कृति supernatant इकट्ठा करने के लिए ताजा उभरा trypomastigotes फसल. गुणवत्ता के लिए एक माइक्रोस्कोप (10x या 20x उद्देश्य लेंस) के तहत नमूने की जाँच करें. यदि मेजबान सेल मलबे है, संक्षेप में नमूना centrifuge और एक नई ट्यूब में supernatant हस्तांतरण. यदि ईएएस की महत्वपूर्ण संख्या है, तो निम्न स्विम-आउट प्रक्रिया द्वारा trypomastigotes को अलग करें।
    1. trypomastigotes और amastigotes के मिश्रण के मिश्रण को 15 मिनट के लिए 2,100 x ग्राम पर स्पिन करें। अधिकांश सुपरनेंट को छोड़ दें, ट्यूब में मध्यम के 0.5-1.0 एमएल को छोड़ दें।
      नोट: वॉल्यूम को कम करना वैकल्पिक है, लेकिन यह निम्न चरण को आसान बनाता है।
    2. 1-2 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गोली को इनक्यूबेट करें, जिससे सक्रिय ट्राइपोमास्टिगोट्स को गोली से बाहर निकलने की अनुमति मिल जाती है (चित्र 2)।
    3. सुपरनेटेंट को एक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ट्राइपोमास्टिगोट्स को स्थानांतरित करें।
  3. ट्राइपोमैस्टिगोट्स को इकट्ठा करने के लिए 2,100 x ग्राम पर 15 मिनट के लिए शंकु नली को सेंट्रीफ्यूज करें। यदि ऊपर तैरना प्रक्रिया प्रदर्शन किया गया था, तो trypomastigot गोली के लिए 2 मिनट के लिए 1.5 एमएल ट्यूब अपकेंद्रण 4,000 x ग्राम पर. महादलित को त्याग दें।
  4. DMEM के 5 एमएल के साथ गोली को फिर से निलंबित 20 एम एम एम एम एम एम (पीएच 5.0) के साथ बफर, 0.4% बीएसए19के साथ पूरक . परजीवी को टी-25 कल्चर फ्लास्क में स्थानांतरित करें। टोपी ढीला छोड़ दो. कोशिका घनत्व 1 x 107 कोशिकाओं/एमएल के आसपास या उससे नीचे होना चाहिए, क्योंकि अतिसंतृप्ति कोशिका मृत्यु की संभावना को बढ़ाता है।
    नोट: DMEM का रंग पीला होना चाहिए, नारंगी नहीं. यदि मूल DMEM उच्च बफरिंग क्षमता थी, 20 M MES (pH 5.0) पीएच कम करने के लिए पर्याप्त नहीं है. उस मामले में एचसीएल के अतिरिक्त माध्यम का पीएच समायोजित किया जाना चाहिए। अम्लीय माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है, लेकिन अब से 1 महीने.
  5. एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति फ्लास्क को इनक्यूबेट करें। लगभग 95% परजीवी 24 ज के बाद अमास्टिगोटी में अंतर करते हैं।

3. ईए का विद्युतीकरण

  1. इलेक्ट्रोपोट्रेशन के लिए gRNA तैयार करें। यह इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा किया जा सकता है, या बस एक निर्माता से सिंथेटिक आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड खरीद कर के द्वारा किया जा सकता है। इस रिपोर्ट में, एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजीज, इंक से crRNA और tracrRNA का उपयोग किया जाता है।
  2. 2,100 x ग्राम पर 15 मिनट के लिए EAs की संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करें। महादलित को त्याग दें।
  3. 1 x 108 कोशिकाओं/एमएल के अंतिम सेल घनत्व के लिए पूरक समाधान प्रदान की गई इलेक्ट्रोपोरेशन बफर युक्त के साथ गोली को पुन: निलंबित करें।
    नोट: EM बफर सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध इलेक्ट्रोपोरेशन बफर की तुलना में अधिक सेल मौतों काकारण बनता है; इस प्रकार, यह amastigote transfection के लिए अनुशंसित नहीं है (पूरकचित्र 1)।
  4. अलीकोट 100 डिग्री सेल्सियस पुन: निलंबित परजीवी (1 x 107 कोशिकाओं) में 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों. 5-10 ग्राम gRNA जोड़ें और धीरे पाइपिंग द्वारा मिश्रण.
  5. मिश्रण को 2 मिमी अंतराल इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट में स्थानांतरित करें। X-14 प्रोग्राम का उपयोग करके, इलेक्ट्रोपोट्रेशन डिवाइस के साथ पल्स लागू करें।
  6. एक टी-25 फ्लास्क में cuvette सामग्री स्थानांतरण पूर्व-वार्म्ड LIT माध्यम (10% FCS) के 5 एमएल युक्त। टोपी को ढीला छोड़ दें और फ्लास्क को 5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  7. या तो axenic culturing के निरंतरता द्वारा सेल विकास की निगरानी (अनुभाग 4) या मेजबान सेल संक्रमण के बाद intracellular amastigotes के रूप में (अनुभाग 5).

4. Axenic Amastigotes के रूप में नॉकआउट कोशिकाओं के विकास की निगरानी

  1. EAs संस्कृति माध्यम के तल पर बसा है, तो धीरे से उन्हें समाधान में resuspend करने के लिए फ्लास्क हिला. पाइपिंग द्वारा फ्लास्क सतह को धोने में मदद करता है, क्योंकि कुछ कोशिकाओं को फ्लास्क का पालन किया जाता है।
  2. एमिडियम आयोडाइड (पीआई) विलयन का 1 डिग्री एल मिलाएं (20 ग्राम/एमएल) के साथ 20 डिग्री सेल्सियस अमास्टिगोटे संस्कृति का।
    नोट: आवश्यक से अधिक समय के लिए इनक्यूबेटर के बाहर संस्कृति फ्लास्क न छोड़ें। तापमान उन कारकों में से एक है जो अक्षीय प्रसार22को सक्षम बनाता है।
  3. हेमोसाइटोमीटर पर नमूना लागू करें और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें। पीआई क्षतिग्रस्त कोशिका झिल्ली के लिए permeant है, लेकिन जीवित कोशिकाओं से बाहर रखा गया है. पीआई (पूर्व/एम 570 एनएम/602 एनएम) द्वारा दागी नहीं हैं कि व्यवहार्य amastigotes की संख्या की गणना।

5. Intracellular Amastigotes के रूप में नॉकआउट कोशिकाओं के विकास की निगरानी

  1. DMEM (10% FCS) के साथ एक 12 अच्छी तरह से थाली में बीज मेजबान 3T3 कोशिकाओं. 70-80% संगम, या के बारे में 3 x 105 कोशिकाओं को अच्छी तरह से सेल घनत्व समायोजित करें.
    नोट: चूंकि amastigotes गतिशील नहीं हैं, मेजबान कोशिकाओं द्वारा विकास की सतह के अधिकांश को कवर संक्रमण दक्षता में सुधार.
  2. इलेक्ट्रोपोट्रेशन के एक दिन बाद सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा चरण 3.6 से नॉकआउट amastigotes लीजिए। supernatant छोड़ें, और DMEM के 2 एमएल (10% FCS) के साथ परजीवी resuspend.
  3. मेजबान सेल संस्कृति से माध्यम निकालें और resuspended amastigotes लागू होते हैं. संक्रमण की गुणा 20 या अधिक होनी चाहिए। 2 दिनों के लिए 5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें ताकि amastigotes को संक्रमण स्थापित करने की अनुमति मिल सके।
    नोट: संक्रमण की अवधि 1 दिन हो सकती है, उद्देश्य के आधार पर।
  4. दूर धो EAs DMEM (10% FCS) के साथ दो बार मेजबान कोशिकाओं के बाहर बने रहे.
  5. मेजबान परजीवी सह-संस्कृति के लिए ताजा DMEM (10% एफसीएस) जोड़ें और अतिरिक्त 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन जारी रखें।
  6. संक्रमण दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए, मेजबान कोशिकाओं और इंट्रासेल्यूलर अमास्टिगोटके के नाभिक की कल्पना करें।
    नोट:     न्यूक्ली संतृप्त सह-संस्कृति में ओवरलैप हो जाते हैं। निर्धारण और धुंधला करने से पहले कम सेल घनत्व (जैसे 1:5 कमजोर पड़ने) पर कोशिकाओं को फिर से चढ़ाना नाभिक को और अधिक आसानी से गिनने में मदद करता है।
    1. संस्कृति माध्यम निकालें और कोशिकाओं को ठीक करने के लिए पीबीएस में 10% फॉर्मेलिन समाधान का 1 एमएल लागू करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    2. फॉर्मलिन समाधान को 1 एमएल पीबीएस के साथ बदलें जिसमें 1 ग्राम/एमएल होचस्ट 33342 और 0.1% ट्राइटन एक्स-100 शामिल हैं। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    3. Hoechst समाधान निकालें और पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं कुल्ला. ताजा पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें.
  7. प्रतिस्थी प्रतिदर्शी सूक्ष्मदर्शी के अंतर्गत प्रेक्षण कीजिए तथापरास कोशिका नाभिकों की पहचान कीजिए जो छोटे परजीवी नाभिकों से संबद्ध हैं (चित्र 4)। मेजबान कोशिकाओं है कि अधिक से अधिक 2 amastigotes संक्रमित के रूप में माना जाना चाहिए, गैर उत्पादक प्रारंभिक संक्रमण या unwashed EAs शामिल करने के लिए नहीं.

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Representative Results

तैरना बाहर प्रक्रिया से trypomastigotes के अलगाव

तैरना बाहर प्रक्रिया से पुराने EAs दूषित से ताजा trypomastigotes फसल के लिए, सेल छर्रों कम से कम के लिए incubated की जरूरत है 1 ज. से अधिक के लिए छर्रों incubating काफी समाधान में तैराकी trypomastigotes की संख्या में वृद्धि नहीं करता है ( चित्र 2ख) । इस विशेष प्रयोग में, प्रारंभिक मिश्रण में trypomastigote का प्रतिशत 38% था, और तैरना के बाद प्रतिशत किसी भी समय अंक पर 98% से ऊपर था. confluent सह संस्कृति के दो टी-75 फ्लास्क से, हम नियमित रूप से इस तैरना बाहर प्रोटोकॉल द्वारा शुद्ध trypomastigote के 3-4 x 107 कोशिकाओं को प्राप्त करते हैं।

कुल्हाड़ी संस्कृति के रूप में नॉकआउट amastigote के विकास की निगरानी

टी cruziके अन्य विकास ात्मक चरणों के विपरीत, flagellar-कम amastigotes व्यावहारिक रूप से स्थिर हैं. इस प्रकार, पीआई के साथ दाग मृत लोगों से जीना amastigotes भेद करने में मदद करता है. पीआई बरकरार कोशिका झिल्ली के लिए अपारगम्य है लेकिन आसानी से मृत कोशिकाओं में प्रवेश करती है (चित्र 3क) . Amastigotes आवश्यक जीन के खिलाफ GRNA के साथ transfected, TcCGM1 (TcCLB.511807.80), नियंत्रण समूह है कि प्राप्त GRNA T. cruzi जीनोम के लिए समजात नहीं प्राप्त करने के लिए तुलना एक महत्वपूर्ण वृद्धि दोष दिखाया (चित्र 3B).

इंट्रासेल्यूलर एमैस्टिगोट्स के रूप में नॉकआउट परजीवी की वृद्धि निगरानी

अमास्टिगोटे चरण में लक्ष्य जीन की अनिवार्यता को नॉकआउट टी क्रुजी के विकास फीनोटाइप के मूल्यांकन द्वारा इंट्रासेल्यूलर ऐमास्टिगोट के रूप में भी प्रदर्शित किया जा सकता है (चित्र 4)। मेजबान नाभिक ोंका जो छोटे टी क्रूज़ी नाभिकों से संबद्ध है, नियंत्रण समूह की तुलना में TcCGM1-KO समूह में काफी कम था।

एक चरण-विशिष्ट जीन के नॉकआउट amastigote और trypomastigote चरणों में phenotypic अंतर का कारण बनता है

परांजपेर छड़ घटक PAR1 अत्यधिक trypomastigote चरण में व्यक्त किया जाता है, लेकिन टी Cruzi22,31के amastigote चरण में downregulated है. वास्तव में, TcPAR1 के विरुद्ध gRNA के transfection (TcCLB.506755.20) काफी कुल्हाड़ी culturing के 4 दिनों के बाद ईए के विकास को प्रभावित नहीं किया (चित्र 5B). मेजबान सेल आक्रमण के बाद gRNA transfection भी पता चला है कि TcPAR1-KO intracellular amastigotes के विकास को बाधित नहीं करता है, संक्रमित मेजबान कोशिकाओं के अंश के संदर्भ में 4 दिनों के बाद संक्रमण (चित्र 5C) . व्यक्तिगत मेजबान कोशिका के भीतर परजीवी की संख्या नॉकआउट से प्रभावित नहीं हुई, या तो (पूरक चित्र 2)। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि T.cPAR1 टी cruzi के amastigote चरण में आवश्यक नहीं है.

हालांकि, trypomastigotes की संख्या 5 दिनों के बाद संक्रमण पर मेजबान कोशिकाओं से बाहर उभरा TcPAR1-KO सह संस्कृति में काफी कम था, नियंत्रण सह संस्कृति की तुलना (चित्र 5D) . इसके अलावा, परिक्रमन से पहले मेजबान 3T3 सेल के भीतर विभेदित trypomastigotes नियंत्रण समूह में काफी सक्रिय दिखाई दिया (पूरक मूवी 1) लेकिन TcPAR1-KO समूह में सुस्त लग रहा था (पूरक सिनेमा 2). इन परिणामों का सुझाव है कि TcPAR1 टी cruziके trypomastigote चरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, शायद गतिशीलता प्रदान करने के लिए उत्सर्जन में मदद, amastigote चरण में अपनी गैर अनिवार्यता के बावजूद.

Figure 2
चित्र 2: स्विम-आउट प्रक्रिया द्वारा ट्राइपोमास्टिगोटे का पृथक्कारता। (क) प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। ट्राइपोमास्टिगोट की लाल उपस्थिति। (ख) संकेतित समय बिंदुओं पर गोली से बाहर निकलने वाले ट्राइपोमास्टिगोट्स की संख्या। प्रारंभिक छर्रों में कुल 3 x 107 परजीवी थे, जिनमें से 38% ट्राइपोमास्टिगोट्स थे और बाकी एमास्टिगोट्स थे। प्रयोग त्रिफला में किए गए थे और माध्य मान (जेडएसडी) प्लॉट किए जाते हैं। समाधान में trypomastigotes की शुद्धता किसी भी समय अंक पर 98% से ऊपर था. (ग) तैरना प्रक्रिया (बाएं) से पहले परजीवी की माइक्रोस्कोपी छवियों, एक गोली (मध्य) से बाहर निकल तेहप करने वाले ट्राइपोमास्टिगोट्स और 1 एच के बाद एक गोली (दाएं) में शेष परजीवी। स्केल बार्स ] 10 $m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: अक्षीय अमास्टिगोट की वृद्धि निगरानी। (ए) प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) बहिष्करण परख। उज्ज्वल क्षेत्र में एक हेमोसाइटोमीटर पर ईए की माइक्रोस्कोपी छवियों (बाएं), फ्लोरोसेंट चैनल (मध्य), और मढ़ा छवि (दाएं)। पीला तीर पीआई से सना हुआ मृत कोशिकाओं को इंगित करता है। स्केल बार ] 20 डिग्री मी. (बी) टीसीजीएम1 (खुले सर्कल) के खिलाफ GRNAs के साथ transfection के बाद Cas9-expressing amastigotes की सेल गिनती और टी cruzi जीनोम (बंद चक्र) के लिए कोई homology के साथ नियंत्रण GRNA. इलेक्ट्रोपोरेशन ट्राइलिकेट्स में किए गए थे, और मतलब मूल्यों (जेडएसडी) साजिश रची जाती है। (* *p और lt; 0.01 वेल्च के टी-परीक्षण द्वारा). यह आंकड़ा Takagi एट अल से संशोधित किया गया है22कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Figure 4
चित्र 4: मेजबान आक्रमण के बाद नॉकआउट amastigotes की वृद्धि. (क) ए.सी.सी.एम.डी.ए.1 और नियंत्रण जीआरएनए के विरुद्ध जीआरएनए के साथ ट्रांसफेक्टेड एमास्टिगोट्स के इंट्रासेल्यूलर प्रतिकृति के बाद मेजबान-परजीवी सह-संस्कृति का परमाणु अभिरंजन। gRNA-transfected EAs 3T3 कोशिकाओं पर लागू किया गया 1 दिन के बाद electroporation और 2 दिनों के लिए मेजबान कोशिकाओं को संक्रमित करने की अनुमति दी. मेजबान कोशिकाओं के बाहर शेष Amastigotes बह गए थे, और मेजबान परजीवी सह संस्कृति एक अतिरिक्त 2 दिनों के लिए incubated किया गया था. स्केल बार $ 20 डिग्री मी. यह आंकड़ा Takagi एट अल सेसंशोधित किया गया है22 (बी ) मेजबान 3T3 नियंत्रण amastigotes (काला बार) और TcCGM1-KO amastigotes (ग्रे बार) से संक्रमित कोशिकाओं का प्रतिशत. तीन संक्रमण प्रयोगों का मतलब (जेडएसडी) प्लॉट किया जाता है (*पी एंड एलटी; 0.01, वेल्च का टी-टेस्ट)। यह आंकड़ा Takagi एट अल से संशोधित किया गया है22कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Figure 5
चित्र 5: नॉकआउट amastigote और विभेदित trypomastigote के बीच Phenotypic अंतर. (क) प्रायोगिक समय-सीमा का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (B) सेल नियंत्रण amastigotes (काला बार) और TcPAR1-KO amastigotes (ग्रे बार) के लिए 4 दिनों के बाद transfection पर axenic amastigote की गिनती. तीन इलेक्ट्रोपोट्रेशन प्रयोगों के माध्य मान (जेडएसडी) प्लॉट किए गए हैं (n.s.: महत्वपूर्ण नहीं, मान-व्हिटनी यू परीक्षण)। (ग) संक्रमित मेजबान 3T3 कोशिकाओं का प्रतिशत 4 दिनों के बाद संक्रमण पर नियंत्रण amastigote (काला बार) और TcPAR1-KO amastigote (ग्रे बार) द्वारा. तीन संस्कृति कुओं के मतलब मूल्यों (जेडएसडी) साजिश रची हैं (एन.एस.: महत्वपूर्ण नहीं, मान-Whitney यू परीक्षण). (घ) नियंत्रण सह-संस्कृति (काली पट्टी) और टी.सी.ए.ओसह-संस्कृति (ग्रे बार) के लिए संक्रमण के बाद 5 दिनों में संस्कृति माध्यम में जारी ट्राइपोमास्टिगोट की संख्या। तीन संस्कृति कुओं के मतलब मूल्यों (जेडएसडी) साजिश रची हैं (*पी और 0.05, मान-Whitney यू परीक्षण). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: LIT माध्यम की संरचना. LIT माध्यम ATCC 1029 के अनुसार तैयार किया गया था, disodium हाइड्रोजन फॉस्फेट की मात्रा को छोड़कर. तालिका डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: अमास्टिगोट सेल व्यवहार्यता पर इलेक्ट्रोपोरेशन बफर का प्रभाव। ईए इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था या तो इलेक्ट्रोपोर्नेशन बफर में या EM बफर में। Amastigote 24 एच के बाद पीआई के साथ दाग था जीने और मृत amastigotes की संख्या गिनती करने के लिए. प्रत्येक समूह में और किसी पल्स समूह में मृत कोशिकाओं का प्रतिशत प्लॉट किया जाता है। तीन इलेक्ट्रोपोट्रेशन प्रयोगों का माध्य (जेडएसडी) दिखाए जाते हैं (*p और 0.05, n.s.: महत्वपूर्ण नहीं, Kruskal-Wallis परीक्षण). कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए.

पूरक चित्र 2: परमाणु दाग TcPAR1-KO के माइक्रोस्कोपी छवियों और नियंत्रण intracellular amastigotes. मेजबान 3T3 कोशिकाओं और transfected amastigotes के सह-संस्कृति तय की गई और 4 दिनों के बाद संक्रमण पर दाग. स्केल बार: 20 डिग्री मी. कृपया आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 3: Cas9-एक्सप्रैक्शिंग एपिमास्टिगोटी की वृद्धि phenotype. जंगली टाइप epimastigotes (WT) की सेल मायने रखता है, epimastigotes कि गठन Cas9-EGFP (Cas9-EGFP) व्यक्त करता है, और epimastigotes कि amastigote-विशिष्ट 3'-UTR (Cas9-EGFP-AmaUTR) के विनियमन के तहत Cas9-EGFP व्यक्त करता है लॉग पैमाने में साजिश रची जाती है. Epimastigotes LIT माध्यम (10% FCS) में 28 डिग्री सेल्सियस पर खेती की गई थी। परजीवी कोशिका घनत्व को दिन 0 पर 1 x 106 कोशिकाओं/ संचयी सेल गिनती सेल घनत्व कुल कमजोर पड़ने कारक से गुणा के रूप में गणना कर रहे हैं. तीन संस्कृति फ्लास्क का मतलब (जेडएसडी) दिखाया गया है (*p और lt;0.05, n.s.: महत्वपूर्ण नहीं, Kruskal-Wallis परीक्षण). कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए.

पूरक मूवी 1: नियंत्रण सह संस्कृति के माइक्रोस्कोपी वीडियो छवि. trypomastigotes की संख्या और सक्रियता है कि नियंत्रण amastigotes से विभेदित है. 5 दिनों के बाद संक्रमण पर वीडियो छवि दिखाया गया है.  फिल्म डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक मूवी 2: TcPAR1-KO सह संस्कृति की माइक्रोस्कोपी वीडियो छवि. Trypomastigotes की संख्या और सक्रियता जो TcPAR1-Komastigotes से विभेदित है. 5 दिनों के बाद संक्रमण पर वीडियो छवि दिखाया गया है. फिल्म डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हमने दिखा दिया है कि टी Cruzi amastigotes की axnic संस्कृति CRISPR/Cas9-मध्यस्थ जीन नॉकआउट में उपयोग किया जा सकता है, gRNA सीधे Cas9-expressing EA में electroporating द्वारा. इस तरह, विशेष रूप से amastigote चरण में लक्ष्य जीन की अनिवार्यता अन्य विकासात्मक चरणों के माध्यम से जाने के बिना मूल्यांकन किया जा सकता है.

amastigote transfection का एक और लाभकारी पहलू लक्ष्य जीन की एक बड़ी संख्या के लिए परीक्षण में सुविधा है. एक बार Cas9-expressing टी Cruzi और मेजबान स्तनधारी सेल की सह संस्कृति की स्थापना की है, यह केवल कुछ ही दिनों के लिए ईए और transfect gRNA में ऊतक व्युत्पन्न trypomastigotes को बदलने के लिए नॉकआउट amastigotes प्राप्त करने के लिए लेता है. gRNA केवल सामग्री है कि प्रत्येक लक्ष्य जीन के अनुरूप होने की जरूरत है, लेकिन सिंथेटिक gRNA निर्माताओं की संख्या से उपलब्ध है, तो यह बस खरीदा जा सकता है. लक्ष्य जीनों की अवस्था विशिष्ट अनिवार्यता का विश्लेषण करने का एक वैकल्पिक तरीका यह होगा कि एक प्रेरक नॉकआउट प्रणाली32स्थापित की जाए . उस मामले में, प्लाज्मिड का निर्माण प्रत्येक लक्ष्य जीन के लिए किया जाना चाहिए और एपिमैस्टिगोटे चरण में परजीवी को ट्रांसफेक्टेंट्स के दवा चयन की अनुमति देने के लिए ट्रांसफेक्टेड किया जाना चाहिए, क्योंकि प्लाज्मिड की ट्रांसफेक्शन दक्षता gRNA की तुलना में बहुत कम है (और lt;15% प्लास्मिड के लिए 26 के रूप में माना जाता है कि gRNA22के लिए 96%). चयनित transfectants मेटासाइक्लिक trypomastigotes में विभेदित किया जाना चाहिए मेजबान कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए अंत में intracellular amastigote में एक नॉकआउट प्रेरित. इस पूरी प्रक्रिया में 1-2 महीने लगेंगे।

इस रिपोर्ट में, हम एक हीमोसाइटोमीटर के साथ सेल घनत्व परिमाणित करने के लिए axenic amastigote संस्कृति में मृत कोशिकाओं भेद करने के लिए पीआई का इस्तेमाल किया। वैकल्पिक रूप से, इस तरह के resazurin व्यवहार्यता परख के रूप में चयापचय परख जीवित amastigotes की संख्या का अनुमान लगाने के लिए नियोजित किया जा सकता है, जो अधिक एक उच्च थ्रूपुट प्रारूप के लिए अनुकूल है. हमारे हाथों में, 1 x 105 amastigotes प्रति अच्छी तरह से पर्याप्त redox गतिविधि उपज एक resazurin परख द्वारा पता लगाया जा करने के लिए 5 ज ऊष्मायन के बाद.

एक Cas9-एक्सप्रेशन सेल लाइन की स्थापना का एक दोष संभावित सेलुलर बोझ और Cas9 overexpression5,33के कारण गैर विशिष्ट दरार है. ऐसी कई रिपोर्टें हैं जिनसे पता चलता है कि कैस9 की गठनात्मक अभिव्यक्ति का टी क्रुजी4,6,7,8की विकास दर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता . हालांकि, एक उदाहरण में5 और भी हमारे हाथों में, Cas9-expressing परजीवी wildtype की तुलना में धीमी वृद्धि दिखाई. इस मुद्दे को दूर करने के लिए, हम amastigote-विशिष्ट 3'-UTR Cas9 की अभिव्यक्ति को amastigote चरण22तक सीमित करने के लिए कार्यरत हैं। Cas9 खुला पढ़ने फ्रेम करने के लिए amastin 3'-UTR का संयोजन ट्रांसजेनिक परजीवी की प्रतिकृति दर बहाल (पूरक चित्रा 3), जिससे मजबूत मेजबान परजीवी सह संस्कृति का उत्पादन लगातार इन विट्रो के लिए trypomastigotes की आपूर्ति करने के लिए अमास्टिगोजेनेसिस। हाल ही में, अन्य समूहों ने यह प्रदर्शित किया है कि gRNA/Cas9 आरएनपी परिसर को वाइल्डटाइप परजीवी से शुरू करने से टी क्रुजी7,9 में जीनोम संपादन हो सकताहै। इस विधि परजीवी9के लिए एक कम तनावपूर्ण दृष्टिकोण के रूप में पता लगाया जाना चाहिए , स्तनधारी कोशिकाओं में अध्ययन के बाद से पता चलता है कि RNP के उपयोग अवांछित बंद लक्ष्य जीनोम संपादन कम कर देता है, Cas9 प्रोटीन34की कम आधा जीवन के कारण .

प्रोटोकॉल के लिए एक अन्य वैकल्पिक संशोधन समजात पुनर्संयोजन के लिए एक टेम्पलेट के रूप में दाता डीएनए के सह-परिवर्तन होगा। यह सूचित किया गया है कि दाता डीएनए जिसमें क्लीवेज साइट के ऊपर और नीचे की ओर समजात दृश्यों को शामिल किया गया है, या तो डबल-स्ट्रेंड्ड डीएनए4,5,8,35 या एकल-स्ट्रेंड के रूप में ओलिगोन्यूक्लिओटाइड7,9, Cas9 न्यूक्लेस के कारण डबल-स्लैड ब्रेक की मरम्मत प्रक्रिया की सुविधा प्रदान करता है। हालांकि कुछ रिपोर्टों से संकेत मिलता है कि microhomology मध्यस्थता अंत दाता टेम्पलेट के बिना शामिल होने दरार की मरम्मत और एक विलोपन उत्परिवर्तन5परिचय कर सकते हैं , उत्परिवर्तन साइट के लिए परिभाषित अनुक्रम का परिचय फिर भी पुष्टि करने में मदद करता है सफल जीनोम संपादन, क्योंकि यह कुछ मामलों में जीन नॉकआउट के डीएनए सबूत दिखाने के लिए मुश्किल है, भले ही लक्ष्य प्रोटीन में कमी और phenotypic परिणाम का सुझाव है कि लक्ष्य जीन उत्परिवर्तित किया गया था4.

Cas9/gRNA RNP transfection और एक दाता डीएनए के सह-परिवर्तन प्रोटोकॉल के विवरण को सरल बनाने के लिए और ईए की तैयारी और उसके बाद कुल्हाड़ी संस्कृति के उपयोग पर ध्यान केंद्रित करने के लिए इस रिपोर्ट में प्रदर्शन नहीं कर रहे हैं। यदि एक उन प्रयोगों को करने के लिए चाहता है, यह बस electroporation के घटकों की जगह द्वारा किया जा सकता है.

एक प्रयोगात्मक उपकरण के रूप में टी Cruzi के ईए का उपयोग करने की हमारी विधि संभावित मंच विशिष्ट अध्ययन की एक किस्म सक्षम बनाता है, प्लाज्मिड transfection और दवा प्रभावकारिता परीक्षण22द्वारा क्षणिक जीन अभिव्यक्ति सहित. हालांकि, इस दृष्टिकोण की प्रभावशीलता केवल Tulahuen तनाव में इस प्रकार अब तक परीक्षण किया गया है. चूंकि टी Cruzi के उपभेदों काफी विविध रहे हैं, अन्य उपभेदों के लिए इस प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता की जांच की जानी चाहिए.

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Disclosures

लेखकों के हित का कोई टकराव का खुलासा नहीं है.

Acknowledgments

यह कार्य जेएसपीएस काकेनही अनुदान संख्या 18K15141 को वाई.टी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20% formalin solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 068-03863 fixing cells
25 cm2 double seal cap culture flask AGC Techno Glass 3100-025
75 cm2 double seal cap culture flask AGC Techno Glass 3110-075
All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X710
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for Control) IDT custom made target sequence = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcCGM1) IDT custom made target sequence = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcPAR1) IDT custom made target sequence = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA IDT 1072532 to anneal with crRNA
Amaxa Nucleofector device LONZA AAN-1001 electroporation
Basic Parasite Nucleofector Kit 2 LONZA VMI-1021 electroporation
BSA Sigma-Aldrich A3294 component of the medium for in vitro amastigogenesis
Burker-Turk disposable hemocytometer Watson 177-212C cell counting
Coster 12-well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3513
DMEM FUJIFILM Wako Pure Chemical 044-29765 culture medium
Fetal bovine serum, Defined Hyclone SH30070.03 heat-inactivate before use
G-418 Sulfate Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 077-06433 selection of transformant
Hemin chloride Sigma-Aldrich H-5533 component of LIT medium
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570 staining of nuclei
Liver infusion broth, Difco Becton Dickinson 226920 component of LIT medium
MES FUJIFILM Wako Pure Chemical 349-01623 component of the medium for in vitro amastigogenesis
PBS (–) FUJIFILM Wako Pure Chemical 166-23555
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4864-10ML staining of dead cells
RPMI 1646 Sigma-Aldrich R8758 medium for metacyclogenesis

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References

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जेनेटिक्स अंक 149 CRISPR/Cas9 जीन नॉकआउट चरण-विशिष्ट Trypanosoma cruzi,Chagas रोग kinetoplastid परजीवी दवा लक्ष्य अक्षीय संस्कृति amastigote
एक जीन नॉकआउट का परिचय सीधे <em>Trypanosoma cruzi</em> के Amastigote चरण में CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग
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Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K., Takagi, Y. Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (149), e59962, doi:10.3791/59962 (2019).

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