Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Vi presenterer en Gene knockout direkte inn i Amastigote Stage av Trypanosoma cruzi bruker CRISPR/Cas9 system

Published: July 31, 2019 doi: 10.3791/59962
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)

Summary

Her beskriver vi en protokoll for å innføre et gen knockout inn i ekstracellulære amastigote av Trypanosoma cruzi, ved hjelp av CRISPR/Cas9 systemet. Veksten fenotype kan følges opp enten ved celle telling av axenic amastigote kultur eller ved spredning av intracellulære amastigotes etter verten celle invasjon.

Abstract

Trypanosoma cruzi er en patogene protozoan parasitt som forårsaker Chagas ' sykdom hovedsakelig i Latin-Amerika. For å identifisere en roman medikament mål mot T. cruzi, er det viktig å validere essentiality av målet genet i pattedyr stadium av parasitten, amastigote. Amastigotes av T. cruzi replikere inne i verten cellen; Dermed er det vanskelig å gjennomføre et knockout eksperiment uten å gå gjennom andre utviklingstrinn. I den seneste tid, våre gruppe rapportere en oppblomstringen forfatning i hvilket det amastigote kanne duplisere axenically for til 10 dager uten mister dens amastigote-like eiendom. Ved å bruke denne timelige axenic amastigote kulturen introduserte vi med hell gRNAs direkte inn i Cas9-uttrykker amastigote for å forårsake gen Knockouts og analysert deres fenotyper utelukkende i amastigote fasen. I denne rapporten beskriver vi en detaljert protokoll for å produsere in vitro avledet ekstracellulære amastigotes, og å utnytte den axenic kulturen i et CRISPR/Cas9-mediert knockout eksperiment. Veksten fenotype av knockout amastigotes kan evalueres enten av celle tellinger av axenic kulturen, eller ved replikering av intracellulære amastigote etter vert celle invasjon. Denne metoden omgår parasitten scenen differensiering normalt involvert i å produsere en transgene eller en knockout amastigote. Utnyttelse av den timelige axenic amastigote kulturen har potensiale til å utvide den eksperimentelle friheten til scene spesifikke studier i T. cruzi.

Introduction

Trypanosoma cruzi er den utløsende Agent for Chagas ' sykdom, som er utbredt hovedsakelig i Latin-Amerika1. T. cruzi har særegne livssyklus faser som det reiser mellom en insekt vektor og en pattedyr vert2. T. cruzi replikerer idet en epimastigote inne midttarm av en blod-amme triatomine tege og skiller i en infeksjon metacyclic trypomastigote i sin baktarm tidligere tilværelse deponert opp på en human eller dyr vert. Når trypomastigote kommer inn i verts kroppen gjennom bite stedet eller gjennom en slimhinnen, invaderer parasitten en vert celle og forvandles til en flagella-mindre rund form kalt en amastigote. Amastigote replikerer innenfor verten cellen og til slutt skiller inn i trypomastigote, som sprekker ut av verten cellen og går inn i blodstrømmen å infisere en annen vert celle.

Siden tiden tilgjengelig kjemoterapeutiske agenter, benznidazole og nifurtimox, forårsake ugunstige bivirkninger og er ineffektive i den kroniske fasen av sykdommen3, er det av stor interesse å identifisere romanen narkotika mål mot T. cruzi. I de senere årene har CRISPR/Cas9 systemet blitt et kraftig verktøy for å effektivt utføre gen knockout i T. cruzi, enten ved transfeksjoner av separate eller enkelt plasmider (er) som inneholder GRNA og Cas94, av stabilt uttrykk for Cas9 og påfølgende innføring av gRNA5,6,7 eller transkripsjon mal av gRNA8, eller ved electroporation av pre-formet gRNA/Cas9 RNP kompleks7,9. Denne teknologiske utviklingen er svært forventet å akselerere stoffet målet forskning i Chagas ' sykdom.

For å fortsette med stoffet utvikling, er det avgjørende å validere essentiality av målet genet eller effekten av stoffet kandidat forbindelser i amastigote av T. cruzi, som det er replikering stadium av parasitten i pattedyr verten. Dette er imidlertid en utfordrende oppgave, fordi amastigotes ikke kan manipuleres direkte på grunn av tilstedeværelsen av en obstruktiv verts celle. I Leishmania, en nært beslektet protozoan parasitt til T. cruzi, en axenic amastigote dyrking metoden ble utviklet og har blitt benyttet i narkotika screening analyser10,11,12, 13. selv om det er noen avvik i mottakelighet for forbindelser mellom axenic amastigotes og intracellulære amastigotes14, evnen til å opprettholde axenic kulturen likevel gir verdifulle eksperimentelle verktøy for å studere grunnleggende biologi av klinisk relevant stadium av Leishmania. I tilfelle av T. cruzi, litteratur om tilstedeværelsen av naturlig forekommende ekstracellulære amastigotes (EA)17 og in vitro produksjon av EA17,18,19 dato tilbake til ti år siden. I tillegg er EA kjent for å ha en smittsom evne20, riktignok mindre enn trypomastigote, og mekanismen for amastigote verts invasjon har blitt belyst de siste årene (gjennomgått av Bonfim-Melo et al.21). Men i motsetning Leishmania, hadde EA ikke blitt utnyttet som et eksperimentelt verktøy i T. cruzi, først og fremst fordi EA hadde blitt betraktet som en forplikte intracellulære parasitt, og dermed ikke hadde blitt betraktet som "replicative form" i en praktisk Følelse.

Nylig foreslo vår gruppe å bruke EA av T. cruzi som en timelig axenic kultur22. Amastigotes av T. cruzi Tulahuen belastning kan gjenskape fri for verts celler i lit medium ved 37 ° c i opptil 10 dager uten større forringelse eller tap av amastigote egenskaper. Under verts fri vekstperioden ble EA med hell utnyttet for eksogene genuttrykk ved konvensjonell electroporation, legemiddel titrering analysen med trypanocidal forbindelser, og CRISPR/Cas9-mediert knockout etterfulgt av vekst fenotype overvåking. I denne rapporten beskriver vi den detaljerte protokollen for å produsere in vitro-avledet EA og å utnytte axenic amastigote i knockout-eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: En oversikt over hele den eksperimentelle flyten er avbildet i figur 1.

Figure 1
Figur 1: oversikt over knockout-eksperimentet med EA. Vev kultur-avledet trypomastigotes høstes og differensiert i EA. gRNA er transfekterte inn Cas9-uttrykker amastigotes av electroporation, og vekst fenotype av knockout amastigote er evaluert enten ved axenic replikering eller ved intracellulære replikering etter verten celle invasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1. parasitt kultur forberedelser

  1. Tulahuen stamme av Trypanosoma cruzi brukes gjennom denne rapporten. Oppretthold epimastigotes av T. cruzi i lit-medium (10% FCS, se supplerende tabell 1). Lukk hetten godt og oppbevar kultur flasken ved 28 ° c.
  2. Generer en transgene stamme av T. cruzi som havner i Cas9-endonuclease. Eksempler på uttrykks plasmider som inneholder Cas9 kodings sekvens og G418 (neor), finner du i lander et al.4 og Peng et al.5
    1. Transfect ovenfor plasmider i epimastigote av electroporation, ved hjelp av Kit oppført i tabellen av materialer. For 1 Cuvette, snurr ned 2 x 107 celler, kast supernatanten og resuspend med 100 μL av electroporation buffer som inneholder den med følgende supplement løsningen.
      Merk: Den electroporation buffer kan erstattes med EM buffer24 (3:1 blanding av cytomix25 og fosfat-sukrose buffer).
    2. Tilsett 20-40 mikrogram plasmider og Overfør blandingen til et 2 mm gap electroporation Cuvette. Påfør pulsen med en electroporation enhet (se tabell over materialer), ved hjelp av X-14-programmet26.
    3. Overfør Cuvette innhold til en T-25 kolbe som inneholder 5 mL LIT medium (10% FCS). Ruge flasken ved 28 ° c i 24 timer.
    4. Legg G418 til en endelig konsentrasjon på 250 μg/mL og Fortsett inkubasjons ved 28 ° c. Det tar ca 1 uke å drepe av ikke-transfekterte epimastigotes. Når G418-resistente befolkningen begynner å komme seg, passasje kulturen en eller to ganger i uken for å unngå metning og å fortynne ut de døde cellene. Etablering av en stabil cellelinje tar vanligvis totalt 4 uker.
      Merk: Hvis konstituerende uttrykk for Cas9 er en byrde for cellen5, gjør uttrykket spesifikt for det amastigote stadiet ved å bøye 3 '-UTR av amastin genet umiddelbart nedstrøms for Cas9 åpne lese RAM men27. Den detaljerte beskrivelsen av det amastigote-spesifikke Cas9-uttrykket plasmider finnes i Takagi et al.22
  3. Etablere en vert-parasitt co-kulturen i Cas9-uttrykker T. cruzi og pattedyr vert celler. I denne rapporten, kan du bruke 3T3-sveitsiske albino Fibroblast celle som en vert.
    1. Skille T. cruzi epimastigotes inn metacyclic trypomastigotes. Bestem celle tettheten av epimastigote kulturen ved hjelp av en hemocytometer og samle 5 x 107 celler ved sentrifugering i 15 min ved 2 100 x g. Kast supernatanten og resuspend cellene med 10 mL RPMI medium. Ruge parasitten ved 28 ° c i 1 uke28.
    2. Samle metacyclic trypomastigotes i RPMI medium. Forsiktig vippe flasken og Pipet ut løsningen uten å forstyrre parasitter levd opp til bunnen overflaten. Overfør mediet til et konisk rør og sentrifuger i 15 min ved 2 100 x g. Kast supernatanten og resuspend parasitten med 5 mL DMEM (10% FCS).
      Merk: Parasitten befolkningen er en blanding av metacyclic trypomastigotes, epimastigotes, og noen mellomliggende former. Selv om det ikke er nødvendig, kan du isolere trypomastigote ved DEAE ion Exchange kromatografi29. Alternativt kan epimastigotes elimineres ved å incubating parasitter med aktivt serum for å utsette dem for å utfylle lyse,30.
    3. Seed 3T3-Swiss albino Fibroblast celle til 60-70% confluency, eller om 1.7-2,0 x 106 celler i 5 ml DMEM (10% FCS) i T-25 kultur kolbe. Fjern vekstmedium og påfør parasitten blandingen fra trinn 1.3.2. Ruge for 24 h ved 37 ° c under 5% CO2 i en fuktet inkubator for å etablere infeksjon.
    4. Fjern parasitter gjenværende utenfor verten 3T3 cellene ved å vaske co-kulturen med DMEM (10% FCS) to ganger.
    5. Når co-kulturen er mettet, passasje amastigote vert celler ved trypsinization. Aspirer mediet og skyll kulturen en gang med PBS. Påfør 1 mL 0,05% Trypsin løsning for å dekke hele kultur overflaten, og ruge i noen minutter ved romtemperatur inntil de vedlagte verts cellene løsner. Løsne cellene fra kolbe overflaten ved å skylle 3 mL DMEM (10% FCS) over cellene.
    6. Overfør frittliggende verts celler i et konisk rør, og sentrifuger for 3 min ved 300 x g. Aspirer supernatanten og resuspend cellene med 3 mL fersk DMEM (10% FCS). Dette trinnet bidrar til å eliminere gjenværende epimastigotes. Overfør alle til en ren T-75 kolbe som inneholder 9 mL DMEM (10% FCS). Fortsett dyrking til trypomastigote slippes ut i kultur supernatanten.
    7. Opprettholde co-kulturen ved passaging med trypsinization to ganger i uken. Når 70-80% av verten befolkningen blir smittet, regelmessig legge infisert vert 3T3 celler på forholdet 5:1 (carryover: frisk), for å unngå kultur forverring. Trypomastigote egresses kontinuerlig Hvis balansen mellom verts celler og T. cruzi er riktig vedlikeholdt.

2. differensiering av Trypomastigotes inn i EA

  1. På dagen før dette eksperimentet, fjerne veksten mediet vert-parasitt co-kultur og legge friske DMEM (10% FCS) å vaske bort EA og trypomastigotes som allerede hadde blitt løslatt fra verten cellene i tidligere dager. Regelmessige eksperimenter krever minst to T-75 flasker av confluent co-kultur.
  2. Samle kultur supernatanten i et konisk rør for å høste Fersk dukket trypomastigotes. Sjekk prøven under et mikroskop (10x eller 20x objektiv objektiv) for kvaliteten. Hvis det er vert celle rusk, kort sentrifuger prøven og overføre supernatanten til et nytt rør. Hvis det er betydelig antall EAs, isolere trypomastigotes ved følgende svømme-out prosedyre.
    1. Snurr ned blandingen av trypomastigotes og amastigotes i 15 min ved 2 100 x g. Kast det meste av supernatanten, og etterlater 0,5-1,0 mL medium i røret.
      Merk: å redusere volumet er valgfritt, men det gjør følgende trinn enklere.
    2. Ruge pellet ved 37 ° c for 1-2 h, slik at aktiv trypomastigotes å svømme ut av pellet (figur 2).
    3. Overfør supernatanten som inneholder trypomastigotes, til en 1,5 mL mikrosentrifugen slange.
  3. Sentrifuger det koniske røret i 15 minutter ved 2 100 x g for å samle inn trypomastigotes. Hvis svømme-out prosedyren ble utført ovenfor, sentrifuge 1,5 mL rør for 2 min ved 4 000 x g til pellet trypomastigote. Kast supernatanten.
  4. Resuspend pellet med 5 mL DMEM bufret med 20 mM MES (pH 5,0), supplert med 0,4% BSA19. Overfør parasitten til en T-25 kultur kolbe. La hetten være løs. Celle tettheten må være rundt eller under 1 x 107 celler/ml, siden oversaturation øker sjansen for celle død.
    Merk: Fargen på DMEM må være gul, ikke oransje. Hvis den opprinnelige DMEM hadde høy buffer kapasitet, er 20 mM MES (pH 5,0) ikke nok til å senke pH-verdien. PH i mediet må justeres ved tilsetning av HCl i så fall. Det Sure mediet kan oppbevares ved 4 ° c, men ikke lenger enn 1 måned.
  5. Ruge kulturen kolbe på 37 ° c under 5% CO2 i en fuktet inkubator. Rundt 95% av parasitter differensiere til amastigotes etter 24 h.

3. electroporation av EA

  1. Forbered gRNA for electroporation. Dette kan gjøres ved in vitro transkripsjon, eller bare ved å kjøpe syntetisk RNA oligonukleotider fra en produsent. I denne rapporten brukes crRNA og tracrRNA fra Integrated DNA Technologies, Inc..
  2. Sentrifuger kulturen i EAs for 15 min ved 2 100 x g. Kast supernatanten.
  3. Resuspend pellet med electroporation buffer som inneholder gitt supplement løsning til den endelige celle tettheten på 1 x 108 celler/ml.
    Merk: EM buffer forårsaker flere celle dødsfall i forhold til electroporation buffer som er oppført i tabell av materialer; Derfor er det ikke anbefalt for amastigote transfeksjoner (supplerende figur 1).
  4. Alikvot 100 μL av resuspendert parasitter (1 x 107 celler) i 1,5 ml mikrosentrifugen rør. Tilsett 5-10 mikrogram gRNA og bland forsiktig av pipettering.
  5. Overfør blandingen til en 2 mm gap electroporation Cuvette. Bruk pulsen med den electroporation enheten ved hjelp av X-14-programmet.
  6. Overfør Cuvette innhold til en T-25 kolbe som inneholder 5 mL pre-varmet LIT medium (10% FCS). La hetten være løs og ruge flasken ved 37 ° c under 5% CO2.
  7. Overvåk celleveksten enten ved fortsettelse av axenic dyrking (del 4) eller som intracellulære amastigotes etter verts celle infeksjon (avsnitt 5).

4. overvåking veksten av knockout celler som axenic Amastigotes

  1. EAs bosette seg på bunnen av kulturen medium, så forsiktig riste flasken for å resuspend dem inn i løsningen. Vasking av kolbe overflaten ved pipettering hjelper, som noen celler er levd opp til flasken.
  2. Bland 1 μL av propidium iodide (PI) oppløsning (20 μg/mL) med 20 μL av amastigote kultur.
    Merk: Ikke la kultur flasken utenfor inkubator lenger enn nødvendig. Temperatur er en av faktorene som muliggjør axenic spredning22.
  3. Påfør prøven på hemocytometer og Observer under et fluorescens mikroskop. PI er permeant til skadet celle membran, men er utelukket fra levende celler. Count antall levedyktige amastigotes som ikke er farget av PI (ex/EM 570 NM/602 NM).

5. overvåking veksten av knockout celler som intracellulære Amastigotes

  1. Seed vert 3T3 celler i en 12-brønn plate med DMEM (10% FCS). Juster celle tettheten til 70-80% confluency, eller om lag 3 x 105 celler per brønn.
    Merk: Siden amastigotes ikke er aktive, dekker det meste av veksten overflaten av verten cellene forbedrer smitte effektivitet.
  2. Samle knockout amastigotes fra trinn 3,6 ved sentrifugering en dag etter electroporation. Kast supernatanten, og resuspend parasitten med 2 mL DMEM (10% FCS).
  3. Fjern medium fra verten celle kulturen og bruke resuspendert amastigotes. Mangfold av infeksjon bør være 20 eller høyere. Ruge platen ved 37 ° c under 5% CO2 for 2 dager for å tillate amastigotes å etablere infeksjon.
    Merk: Infeksjons perioden kan være 1 dag, avhengig av formålet.
  4. Vask unna EAs forble utenfor verts cellene to ganger med DMEM (10% FCS).
  5. Legg frisk DMEM (10% FCS) til verten-parasitt co-kultur og fortsette inkubasjons ved 37 ° c for ytterligere 2 dager.
  6. For å evaluere infeksjons effektivitet, visualisere kjerner av verts cellene og intracellulære amastigote.
    Merk:     kjerner pleier å være overlappende i mettet co-kultur. Re-plating cellene ved lavere celle tetthet (for eksempel 1:5 fortynning) før fiksering og farging bidrar til å telle kjerner lettere.
    1. Fjern kultur medium og påfør 1 mL av 10% formalin løsning i PBS å fikse cellene. Ruge i 10 minutter ved romtemperatur.
    2. Bytt ut den formalin løsningen med 1 mL PBS som inneholder 1 μg/mL Hoechst 33342 og 0,1% Triton X-100. Ruge i 5 minutter ved romtemperatur.
    3. Fjern Hoechst løsningen og skyll cellene en gang med PBS. Tilsett 1 mL fersk PBS.
  7. Observer under fluorescens mikroskop og identifisere verts cellekjerner som er forbundet med mindre parasitt kjerner (Figur 4). Vert celler som inneholder mer enn 2 amastigotes bør betraktes som smittet, for ikke å inkludere nonproductive innledende infeksjon eller uvaskede EAs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering av trypomastigotes ved svømme-ut prosedyren

Å høste frisk trypomastigotes fra forurense gamle EAs av svømme-ut fremgangsmåte, cellen pellets nød å bli inkubert det vil si for 1 h. incubating det pellets om mere enn 2 h er ikke viktig forhøye antallet av trypomastigotes svømmer inne oppløsningen ( Figur 2b). I dette eksperimentet var prosentandelen av trypomastigote i den første blandingen 38%, og prosenten etter at svømme-out var over 98% på et gitt tidspunkt poeng. Fra to T-75 flasker av confluent co-kultur, vi rutinemessig få 3-4 x 107 celler av ren trypomastigote av denne svømme-ut protokollen.

Vekst overvåkning av knockout amastigote som axenic kultur

I motsetning til andre utviklingsmessige stadier av T. cruzi, flagellar-less amastigotes er praktisk talt statisk. Således, flekk med PI hjelper å skjelne bo amastigotes fra død seg. PI er UGJENNOMTRENGELIG til intakt celle membran, men lett penetrerer døde celler (figur 3a). Amastigotes transfekterte med gRNA mot essensielle genet, TcCGM1 (TcCLB. 511807.80), viste en betydelig vekst defekt sammenlignet med kontrollgruppen som fikk gRNA ikke homologe til T. Cruzi Genova (figur 3b).

Vekst overvåkning av knockout parasitter som intracellulære amastigotes

Essentiality av målet genet i amastigote stadiet kan også bli demonstrert ved evaluering av veksten fenotype av knockout T. cruzi som intracellulære Amastigote (Figur 4). Andelen av verts kjerner som er forbundet med mindre T. cruzi kjerner, var signifikant lavere i TcCGM1-ko-gruppen som sammenlignet med kontrollgruppen.

Knockout av et etappe spesifikt gen forårsaker fenotypiske forskjell i amastigote og trypomastigote stadier

Paraflagellar Rod komponent PAR1 er svært uttrykt i trypomastigote scenen, men er downregulated i amastigote stadiet av T. cruzi22,31. Transfeksjoner av gRNA mot TcPAR1 (TcCLB. 506755.20) påvirket faktisk ikke betydelig veksten av EA etter 4 dager med axenic dyrking (figur 5B). gRNA transfeksjoner etterfulgt av verts celle invasjon viste også at TcPAR1-ko ikke hemmer veksten av intracellulære amastigotes, i form av brøkdelen av infiserte verts celler ved 4 dager etter infeksjon (figur 5c). Antallet parasitter i den enkelte verts cellen syntes ikke å bli påvirket av knockout, enten (supplerende figur 2). Disse resultatene tyder på at TcPAR1 ikke er avgjørende i amastigote fasen av T. cruzi.

Men antall trypomastigotes dukket opp av vert celler på 5 dager etter smitte var betydelig lavere i TcPAR1-ko co-kultur, sammenlignet med kontrollen co-kultur (figur 5D). Også differensiert trypomastigotes innen Host 3T3 celle før egression syntes å være ganske aktiv i kontrollgruppen (supplerende Movie 1), men virket svak i TcPAR1-ko gruppe (supplerende filmer 2). Disse resultatene tyder på at TcPAR1 spiller en viktig rolle i trypomastigote stadiet av T. cruzi, antagelig ved å gi motilitet å hjelpe egression, til tross for sin ikke-essentiality i amastigote scenen.

Figure 2
Figur 2: isolering av trypomastigote ved svømme-out prosedyre. (A) skjematisk fremstilling av protokollen. Rød = tilstedeværelse av trypomastigote. (B) antall trypomastigotes som har svømt ut av pellet på angitte tidspunkt punkter. Initial pellets inneholdt totalt 3 x 107 parasitter, 38% av disse var trypomastigotes og resten av dem var amastigotes. Eksperimenter ble utført i tre eksemplarer og gjennomsnittlig verdier (± SD) er plottet. Renheten av trypomastigotes i løsningen var over 98% på et gitt tidspunkt poeng. (C) mikroskopi bilder av parasitter før svømme-out prosedyre (venstre), trypomastigotes som har svømt ut av en pellet (midten), og parasitter igjen i en pellet (høyre) etter 1 h av inkubasjons. Skala bars = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: vekst overvåking av axenic amastigote. (A) Propidium IODIDE (pi) eksklusjon analysen. Mikroskopi bilder av EA på en hemocytometer i lyse felt (venstre), fluorescens kanal (midten), og overlappet bilde (høyre). Gule piler angir PI-farget døde celler. Scale barer = 20 μm. (B) celle telling av Cas9-uttrykker amastigotes etter Transfeksjoner med GRNAs mot TcCGM1 (åpen sirkel) og kontroll GRNA uten homologi til T. cruzi Genova (lukket sirkel). Electroporations ble utført i triplicates, og Mean verdier (± SD) er plottet. (* * p < 0,01 av Welch t-test). Dette tallet er endret fra Takagi et al.22Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: vekst av knockout amastigotes etter verten invasjon. (A) kjernefysiske farging av verten-parasitt co-kultur etter intracellulære replikering av amastigotes transfekterte med GRNAs mot TcCGM1 og kontroll gRNA. gRNA-transfekterte EAs ble brukt på 3T3 celler 1 dag etter electroporation og lov til å infisere vert celler for 2 dager. Amastigotes resterende utenfor verten cellene ble vasket bort, og verten-parasitt co-kulturen var inkubert for ytterligere 2 dager. Vektstenger = 20 μm. Dette tallet er endret fra Takagi et al.22 (B) prosentandel av Host 3T3 celler infisert av kontroll amastigotes (svart linje) og TcCGM1-ko amastigotes (grå linje). Gjennomsnittet (± SD) av tre infeksjons eksperimenter tegnes (* * p < 0,01, Welch t-test). Dette tallet er endret fra Takagi et al.22Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: fenotypiske forskjellen mellom knockout amastigote og differensiert trypomastigote. (A) skjematisk fremstilling av eksperimentell tidslinje. (B) celle tellinger av axenic amastigote på 4 dager etter transfeksjoner for kontroll amastigotes (svart linje) og TcPAR1-ko-amastigotes (grå strek). Mean verdier (± SD) av tre electroporation eksperimenter er plottet (n.s.: ikke signifikant, mann-Whitney U test). (C) prosent av infiserte verten 3T3 celler på 4 dager etter smitte av kontroll amastigote (svart linje) og TcPAR1-ko amastigote (grå linje). Mean verdier (± SD) av tre kultur brønner er plottet (n.s.: ikke signifikant, mann-Whitney U test). (D) antall trypomastigote utgitt i kultur medium på 5 dager etter smitte for kontroll co-kultur (svart bar) og TcPAR1-ko co-kultur (grå bar). Gjennomsnittsverdier (± SD) av tre kultur brønner tegnes (* p < 0,05, mann-Whitney U test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende tabell 1: sammensetning av lit medium. LIT medium ble utarbeidet i henhold til ATCC 1029, med unntak av mengden av Disodium hydrogen fosfat. Vennligst klikk her for å laste ned tabellen.

Supplerende figur 1: effekt av electroporation buffer på amastigote celle levedyktighet. EA ble electroporated enten i electroporation buffer eller i EM buffer. Amastigote ble farget med PI etter 24 h å telle antall levende og døde amastigotes. Prosenter av døde celler i hver gruppe og i ingen puls gruppen er plottet. Gjennomsnittlig (± SD) av tre electroporation eksperimenter vises (* p < 0,05, n.s.: ikke signifikant, Kruskal-Wallis-test). Vennligst klikk her for å laste ned figuren.

Supplerende figur 2: mikroskopi bilder av kjernefysisk-farget TcPAR1-ko og kontroll intracellulære amastigotes. Co-kultur av verten 3T3 celler og transfekterte amastigotes ble fikset og farget på 4 dager etter smitte. Skala barer: 20 μm. Vennligst klikk her for å laste ned figuren.

Supplerende figur 3: vekst fenotype av Cas9-uttrykker epimastigote. Celle tellinger av wildtype epimastigotes (WT), epimastigotes som constitutively uttrykker Cas9-EGFP (Cas9-EGFP), og epimastigotes som uttrykker Cas9-EGFP under regulering av amastigote-spesifikke 3 '-UTR (Cas9-EGFP-AmaUTR) er plottet i loggen skala. Epimastigotes ble dyrket i LIT medium (10% FCS) ved 28 ° c. Parasitt celle tetthet ble justert til 1 x 106 celler/ml på dag 0. Kumulative celle antall beregnes som celle tetthet multiplisert med den totale fortynningsfaktoren. Gjennomsnittlig (± SD) av tre kultur flasker vises (* p < 0,05, n.s.: ikke signifikant, Kruskal-Wallis-test). Vennligst klikk her for å laste ned figuren.

Supplerende film 1: mikroskopi video bilde av kontroll co-kultur. Antall og activeness av trypomastigotes som har differensiert fra kontroll amastigotes. Video bilde på 5 dager etter infeksjon vises.  Vennligst klikk her for å laste ned filmen.

Tilleggs film 2: mikroskopi video bilde av TcPAR1-ko co-kultur. Antall og activeness av trypomastigotes som har differensiert fra TcPAR1-KO amastigotes. Video bilde på 5 dager etter infeksjon vises. Vennligst klikk her for å laste ned filmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi demonstrerte at axenic kulturen i T. cruzi amastigotes kan benyttes i CRISPR/Cas9-mediert gen knockout, ved electroporating gRNA direkte inn Cas9-uttrykker EA. På denne måten kan essentiality av målet genet spesielt i amastigote stadiet evalueres uten å gå gjennom andre utviklingstrinn.

En annen fordelaktig aspekt ved amastigote transfeksjoner er bekvemmeligheten i testing for et stort antall mål gener. Når co-kulturen i Cas9-uttrykker T. cruzi og vert pattedyr celle er etablert, tar det bare noen dager å transformere vevet-avledet TRYPOMASTIGOTES i EA og transfect gRNA å få knockout amastigotes. gRNA er det eneste materialet som må skreddersys til hvert mål gen, men syntetisk gRNA er tilgjengelig fra antall produsenter, så det kan enkelt kjøpes. En alternativ metode for å analysere scenen spesifikke essentiality av målet gener ville være å etablere en induserbart knockout system32. I så fall må plasmider konstrueres for hver mål genet og transfekterte til parasitten i epimastigote stadiet å tillate narkotika valg av transfectants, siden transfeksjoner effektiviteten av plasmider er mye lavere enn for gRNA (< 15% for plasmider 26 som skulle > 96% for gRNA22). Valgte transfectants må skilles i metacyclic trypomastigotes å infisere vert celler til slutt indusere en knockout i intracellulære amastigote. Hele denne prosessen vil ta 1-2 måneder.

I denne rapporten brukte vi PI til å skille mellom døde celler i axenic amastigote kultur for å quantitate celle tettheten med en hemocytometer. Alternativt kan metabolske analyser som resazurin levedyktighet analysen være ansatt for å anslå antall Live amastigotes, som er mer egnet for en høy gjennomstrømming format. I våre hender, 1 x 105 amastigotes per brønn yield tilstrekkelig Redox aktivitet som skal oppdages av en resazurin analysen etter 5 h av inkubasjons.

En ulempe med å etablere en Cas9-uttrykker cellelinje er den potensielle cellulære byrde og ikke-spesifikk kløft på grunn av Cas9 overuttrykte5,33. Det finnes flere rapporter som indikerer at konstituerende uttrykk for Cas9 har ingen effekt på vekstraten til T. cruzi4,6,7,8. Men i en forekomst5 , og også i våre hender, viste Cas9 parasitten langsom vekst sammenlignet med wildtype. For å overkomme dette problemet, brukte vi den amastigote-spesifikke 3 '-UTR for å begrense uttrykket av Cas9 til amastigote etappe22. Bøyning av amastin 3 '-UTR til Cas9 åpne lese ramme gjenopprettet rep like Rings raten av transgene parasitt (supplerende figur 3), og dermed produsere robust vert-parasitt co-kultur å kontinuerlig levere trypomastigotes for in vitro amastigogenesis. Nylig har andre grupper vist at innføringen av gRNA/Cas9 RNP kompleks til wildtype parasitten kan forårsake Genova redigering i T. cruzi7,9. Denne metoden bør utforskes som en mindre stressende tilnærming til parasitten9, siden studier i pattedyrceller antyder at bruk av RNP reduserer uønsket off-Target Genova redigering, på grunn av den korte halveringstiden av Cas9 protein34.

En annen valgfri modifikasjon til protokollen vil være co-transfeksjoner av donor DNA som en mal for homologe rekombinasjon. Det har blitt rapportert at donor-DNA som inneholder homologe sekvenser til oppstrøms og nedstrøms av kløften stedet, i en form av enten dobbel-strandet DNA4,5,8,35 eller single-strandet oligonukleotid7,9, forenkler reparasjonsprosessen av dobbel-strandet pause forårsaket av Cas9 nuklease. Selv om noen rapporter tyder på at microhomology mediert slutt sammenføyning uten donor mal kan reparere kløften og innføre en sletting mutasjon5, bidrar innføring av den definerte sekvensen til mutasjon stedet likevel å bekrefte vellykket Genova redigering, fordi det er vanskelig å vise DNA-bevis for gen knockout i noen tilfeller, selv om målet protein reduksjon og fenotypiske utfallet tyder målet genet var mutert4.

Cas9/gRNA RNP transfeksjoner og co-transfeksjoner av en giver DNA er ikke demonstrert i denne rapporten for å forenkle beskrivelsen av protokollen og å fokusere på utarbeidelse av EA og bruk av axenic kultur etterpå. Hvis man ønsker å utføre disse eksperimentene, kan det gjøres ved å erstatte komponentene i electroporation.

Vår metode for å utnytte EA av T. cruzi som et eksperimentelt verktøy potensielt muliggjør en rekke scene-spesifikke studier, inkludert forbigående genuttrykk ved plasmider transfeksjoner og narkotika effekttest22. Imidlertid har effektiviteten av denne tilnærmingen er testet bare i Tulahuen belastningen så langt. Siden stammer av T. cruzi er ganske mangfoldig, anvendelse av denne protokollen til andre stammer må undersøkes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet delvis av JSP KAKENHI Grant Number 18K15141 til Y.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20% formalin solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 068-03863 fixing cells
25 cm2 double seal cap culture flask AGC Techno Glass 3100-025
75 cm2 double seal cap culture flask AGC Techno Glass 3110-075
All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X710
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for Control) IDT custom made target sequence = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcCGM1) IDT custom made target sequence = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcPAR1) IDT custom made target sequence = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA IDT 1072532 to anneal with crRNA
Amaxa Nucleofector device LONZA AAN-1001 electroporation
Basic Parasite Nucleofector Kit 2 LONZA VMI-1021 electroporation
BSA Sigma-Aldrich A3294 component of the medium for in vitro amastigogenesis
Burker-Turk disposable hemocytometer Watson 177-212C cell counting
Coster 12-well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3513
DMEM FUJIFILM Wako Pure Chemical 044-29765 culture medium
Fetal bovine serum, Defined Hyclone SH30070.03 heat-inactivate before use
G-418 Sulfate Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 077-06433 selection of transformant
Hemin chloride Sigma-Aldrich H-5533 component of LIT medium
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570 staining of nuclei
Liver infusion broth, Difco Becton Dickinson 226920 component of LIT medium
MES FUJIFILM Wako Pure Chemical 349-01623 component of the medium for in vitro amastigogenesis
PBS (–) FUJIFILM Wako Pure Chemical 166-23555
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4864-10ML staining of dead cells
RPMI 1646 Sigma-Aldrich R8758 medium for metacyclogenesis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. (WHO) Fact sheet: Chagas disease (American trypanosomiasis). , [updated 2017 Mar; cited 2017 Aug], at http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/ (2017).
  2. Clayton, J. Chagas disease 101. Nature. 465 (n7301_supp), S4-S5 (2010).
  3. Apt, W. Current and developing therapeutic agents in the treatment of Chagas disease. Drug Design, Development and Therapy. 4, 243-253 (2010).
  4. Lander, N., Li, Z. H. H., Niyogi, S., Docampo, R. CRISPR/Cas9-induced disruption of paraflagellar rod protein 1 and 2 genes in Trypanosoma cruzi reveals their role in flagellar attachment. mBio. 6 (4), e01012 (2015).
  5. Peng, D., Kurup, S. P., Yao, P. Y., Minning, T. A., Tarleton, R. L. CRISPR-Cas9-mediated single-gene and gene family disruption in Trypanosoma cruzi. mBio. 6 (1), e02097-e02114 (2015).
  6. Romagnoli, B. A. A., Picchi, G. F. A., Hiraiwa, P. M., Borges, B. S., Alves, L. R., Goldenberg, S. Improvements in the CRISPR/Cas9 system for high efficiency gene disruption in Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 178, 190-195 (2018).
  7. Burle-Caldas, G. A., Soares-Simões, M., Lemos-Pechnicki, L., DaRocha, W. D., Teixeira, S. M. R. Assessment of two CRISPR-Cas9 genome editing protocols for rapid generation of Trypanosoma cruzi gene knockout mutants. International Journal for Parasitology. 48 (8), 591-596 (2018).
  8. Costa, F. C. Expanding the toolbox for Trypanosoma cruzi: A parasite line incorporating a bioluminescence-fluorescence dual reporter and streamlined CRISPR/Cas9 functionality for rapid in vivo localisation and phenotyping. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), e0006388 (2018).
  9. Soares Medeiros, L. C. High-Efficiency Genome Editing in Protozoan Parasites Using CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins. mBio. 8 (6), (2017).
  10. Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An axenic amastigote system for drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (4), 818-822 (1997).
  11. Bates, P. A. Axenic culture of Leishmania amastigotes. Parasitology Today. 9 (4), 143-146 (1993).
  12. Ravinder, R., Bhaskar, B., Gangwar, S., Goyal, N. Development of luciferase expressing Leishmania donovani axenic amastigotes as primary model for in vitro screening of antileishmanial compounds. Current Microbiology. 65 (6), 696-700 (2012).
  13. Nühs, A. Development and Validation of a Novel Leishmania donovani Screening Cascade for High-Throughput Screening Using a Novel Axenic Assay with High Predictivity of Leishmanicidal Intracellular Activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), 1-17 (2015).
  14. De Rycker, M. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
  15. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  16. Pescher, P., Blisnick, T., Bastin, P., Späth, G. F. Quantitative proteome profiling informs on phenotypic traits that adapt Leishmania donovani for axenic and intracellular proliferation. Cellular Microbiology. 13 (7), 978-991 (2011).
  17. Andrews, N. W., Hong, K. S. U., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Stage-specific surface antigens expressed during the morphogenesis of vertebrate forms of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 64 (3), 474-484 (1987).
  18. Pan, S. C. Trypanosoma cruzi: intracellular stages grown in a cell-free medium at 37 C. Experimental Parasitology. 45 (2), 215-224 (1978).
  19. Tomlinson, S., Vandekerckhove, F., Frevert, U., Nussenzweig, V. The induction of Trypanosoma cruzi trypomastigote to amastigote transformation by low pH. Parasitology. 110 (05), 547 (1995).
  20. Ley, V., Andrews, N. W., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Amastigotes of Trypanosoma cruzi sustain an infective cycle in mammalian cells. Journal of Experimental Medicine. 168 (0022-1007 (Print)), 649-659 (1988).
  21. Bonfim-Melo, A., Ferreira, E. R., Florentino, P. T. V., Mortara, R. A. Amastigote Synapse: The Tricks of Trypanosoma cruzi Extracellular Amastigotes. Frontiers in Microbiology. 9, 1341 (2018).
  22. Takagi, Y., Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K. Utilization of proliferable extracellular amastigotes for transient gene expression, drug sensitivity assay, and CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in Trypanosoma cruzi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 13 (1), e0007088 (2019).
  23. Fernandes, J. F., Castellani, O. Growth characteristics and chemical composition of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 18 (2), 195-202 (1966).
  24. Oberholzer, M., Lopez, M. A., Ralston, K. S., Hill, K. L. Approaches for Functional Analysis of Flagellar Proteins in African Trypanosomes. Methods in Cell Biology. 93, 21-57 (2009).
  25. van den Hoff, M. J. B., Moorman, A. F. M., Lamers, W. H. Electroporation in ‘intracellular’ buffer increases cell survival. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2902-2902 (1992).
  26. Pacheco-Lugo, L., Díaz-Olmos, Y., Sáenz-García, J., Probst, C. M., DaRocha, W. D. Effective gene delivery to Trypanosoma cruzi epimastigotes through nucleofection. Parasitology International. 66 (3), 236-239 (2017).
  27. Coughlin, B. C., Teixeira, S. M., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Amastin mRNA abundance in Trypanosoma cruzi is controlled by a 3’-untranslated region position-dependent cis-element and an untranslated region-binding protein. The Journal of Biological Chemistry. 275 (16), 12051-1260 (2000).
  28. Shaw, A. K., Kalem, M. C., Zimmer, S. L. Mitochondrial Gene Expression Is Responsive to Starvation Stress and Developmental Transition in Trypanosoma cruzi. mSphere. 1 (2), (2016).
  29. Chao, D., Dusanic, D. G. Comparative studies of the isolation of metacyclic trypomastigotes of Trypanosoma cruzi by DEAE ion exchange chromatography. Zhonghua Minguo wei sheng wu ji mian yi xue za zhi (Chinese Journal of Microbiology and Immunology). 17 (3), 146-152 (1984).
  30. Nogueira, N., Bianco, C., Cohn, Z. Studies on the selective lysis and purification of Trypanosoma cruzi. The Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 224-229 (1975).
  31. Minning, T. A., Weatherly, D. B., Atwood, J., Orlando, R., Tarleton, R. L., Tarleton, R. L. The steady-state transcriptome of the four major life-cycle stages of Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 10, 370 (2009).
  32. Rico, E., Jeacock, L., Kovářová, J., Horn, D. Inducible high-efficiency CRISPR-Cas9-targeted gene editing and precision base editing in African trypanosomes. Scientific Reports. 8 (1), 7960 (2018).
  33. Fu, Y. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
  34. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  35. Chiurillo, M. A., Lander, N., Bertolini, M. S., Storey, M., Vercesi, A. E., Docampo, R. Different roles of mitochondrial calcium uniporter complex subunits in growth and infectivity of Trypanosoma cruzi. mBio. 8 (3), e00574-e00617 (2017).

Tags

Genetikk CRISPR/Cas9 gen knockout Stage-spesifikke Trypanosoma cruzi Chagas sykdom kinetoplastid parasitt narkotika mål axenic kultur amastigote
Vi presenterer en Gene knockout direkte inn i Amastigote Stage av <em>Trypanosoma cruzi</em> bruker CRISPR/Cas9 system
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K.,… More

Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K., Takagi, Y. Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (149), e59962, doi:10.3791/59962 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter