Summary
이 문서는 마우스 신장에서 분리된 캡슐화된 사구체 사구류의 구체 정수리 세포 성장을 배양하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 정수리 상피 세포 증식 및 마이그레이션에 관여하는 경로를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
정수리 상피 세포 (PEC) 활성화는 글로메룰로오스 경화증의 개발 및 진행에 관여하는 주요 요인 중 하나입니다. 따라서 정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 통로의 억제는 구엽 질병의 진행을 감쇠하는 도구가 될 수 있습니다. 이 문서에서는 마우스 신장으로부터 분리된 캡슐화된 사구류의 정수리 상피 세포 내 성장을 배양하고 분석하는 방법을 설명합니다. 고립 된 마우스 신장을 해부 한 후, 조직은 다진, 그리고 사구는 체질에 의해 격리된다. 캡슐화된 사구는 수집되고, 단일 사구는 정수리 상피 세포의 구체 배설물 성장을 얻기 위해 6 일 동안 배양된다. 이 기간 동안, 정수리 상피 세포 증식 및 이동은 세포 수 또는 성장하는 세포의 표면적을 결정함으로써 분석될 수 있다. 이 분석은 그러므로 형질 전환기 또는 녹아웃 마우스에 있는 변경한 유전자 발현의 효력 또는 정수리 상피 세포 성장 특성 및 신호에 배양 조건의 효력을 연구하기 위하여 공구로 이용될 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 정수리 상피 세포 활성화 과정에 관여 하고 결과적으로 구체 로메로클로증에서 관련 된 중요 한 경로 연구 될 수 있다.
Introduction
구체 질환은 신장 질환의 중요한 그룹이며 말기 신장 질환 (ESRD)의 주요 원인을 나타냅니다. 불행히도, 특정 치료 옵션은 제한적이며 ESRD로의 진행은 불가피합니다. 구체 질환은 사구체 손상의 존재에 의해 정의되며 염증 성 및 비 염증 성 질환으로 그룹화 될 수 있습니다. 초기 모욕은 다르지만, 최근 연구에 따르면 일반적인 세포 메커니즘은 사구성 상피 세포 증식으로 이어지며 궁극적으로 모든 사구형 질환에서 사구체 경화증으로 이어지며 근본 원인11,2,,3,,4에관계없이.
구체적으로, 구체류경화성 병변은 주로 활성화된 정수리 성 상피 세포5,,6로구성된 것으로 나타났다. 생리학적 조건하에서, 정수리 상피 세포는 구체의 Bowman의 캡슐을 줄 이는 평평한 정지 상피 세포입니다. 그러나, 유전적 돌연변이(예를 들어, 포도세포 특이적 또는 미토콘드리아 세포병리학), 염증 또는 과여과(예를 들어, 신장 질량 감소, 고혈압, 비만 또는 당뇨병 성 멜리터스)으로 인한 모든 구체 손상은 정수리 세포의 활성화를 시작할 수 있다. 활성화된 정수리 상피 세포는 세포 초승달 또는 경화 병변의 형성을 초래하는 세포외 매트릭스를 증식하고 증착하고예금5,,7,,8. 이러한 프로세스의 진행은 신장 기능9의손실을 초래한다. 따라서, 정수리 상피 세포 활성화는 염증성 및 비염증성 구엽기 질환1,,2,,3,,4,,10모두에서 사구체 경화증의 발달 및 진행에 중요한 요소입니다.
정수리 상피 세포 활성화를 중재하는 분자 과정은 여전히 크게 알려지지 않았습니다. 최근 연구에 따르면 활성화된 정수리 상피 세포 드 노보 익스프레스 CD44, 세포 증식 및 마이그레이션에 관여하는 다른 경로의 활성화에 중요한 수용체. 더욱이, CD44의 억제는 정수리 상피 세포 활성화를 억제하고 염증성 뿐만 아니라 비염증성 구엽기질환(11,,12)의동물 모델에서 초승달 형성 및 구종증의 진행을 감쇠시키는 것으로 나타났다.
정수리 상피 세포 활성화는 사구체 경화증과 초승달 형성의 발달을위한 핵심 플레이어이기 때문에, 이 세포의 억제는 사구형 질병의 진행을 감속할 수 있었습니다. 정수리 상피 세포 활성화를 구동 하는 분자 경로의 용해성 구엽 질환에서 초플라스틱 및 구체 성 병 변의 형성을 감쇠 특정 치료 개입의 개발로 이어질 수 있습니다.
실험적인 동물 모델에서는, 정수리 상피 세포에 변경된 유전자 발현(녹아웃 모델 또는 형질전환 마우스 모형) 또는 약물 치료의 직접적인 효력에 대한 증거를 제공하기가 빈번하게 어렵습니다. 기존의 녹아웃 마우스에서 생체 내에서 관찰된 생체 내 변화는 정수리 상피 세포의 직접적인 변화에 의해 설명될 수 있다. 그러나, 유전자 발현은 마우스 내의 다른 세포 유형에서도 변경되기 때문에, 다른 세포 유형에 의해 매개되는 간접적인 효력을 배제할 수 없다. 정수리 상피 세포에서 주로 활성 프로모터에 의해 구동 조건부 cre-lox 마우스의 개발은 어떤 경우에는 용액을 제공하고있다 13. 그럼에도 불구하고 조건부 형질 전환 모델은 복잡하고 더 많은 조건부 라인을 사용할 수 있지만, 기존의 녹아웃 또는 형질전환 마우스 라인의 많은 경우 아직 조건부 대체가 없습니다.
정수리 상피 세포에 대한 직접적인 효과를 연구하기 위해 우리 그룹은 정수리 상피 세포 증식 및 이동을 측정하고 분석하기 위해 마우스 신장에서 분리 된 단일 캡슐형 사구를 사용하여 전 생체 분석기를 개발했습니다. 이 방법은 정수리 상피 세포 특정 효과를 결정하고 정수리 상피 세포 활성화 및 테스트 치료 옵션에 대한 책임있는 경로를 찾을 수 있게 해 주어 이 활성화를 억제할 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 라드부드 대학 니메겐의 동물 윤리위원회의 지침에 따라 수행되었다.
참고: 치료되지 않은 건강한 야생형(WT) 마우스(n=4) 및 cd44/----(n=4) 마우스는 12-16주의 나이에 희생하였다. 남성과 여성 마우스 모두 사용 되었다. 모든 마우스는 C57Bl/6 배경에 있었다.
1. 마우스 신장 해부
- 자궁 경부 탈구에 의해 건강한 WT 마우스 또는 유전적으로 변경된 마우스를 희생하십시오.
- 마우스를 희생한 직후 전체 마우스 신장을 해부합니다. 이를 위해 복부 가위를 사용하여 중앙 복강경 절제술을 수행하여 피부를 절단한 다음 복부 근육을 절단하십시오. 내장을 제거하고 마우스 옆에 놓습니다.
- 조직을 연결에서 신장을 자유롭게하고 외과 적 집게를 사용하여 신장을 당겨, 가위로 신장 동맥, 신장 정맥 및 요관을 절단.
- 외과 용 집게로 신장을 잡고 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 캡슐을 벗어 신장에서 신장 캡슐을 제거하십시오.
- 신장을 6웰 세포 배양 플레이트(신장 2개/웰)에 넣고 잘 정한 2mL의 행크스 균형 잡힌 염액(HBSS)으로 준비하여 얼음 위에 놓습니다.
2. 마우스 신장에서 구두를 분리
- 신장을 100mm 페트리 접시로 옮기고 두 개의 메스를 사용하여 신장을 1-2mm의 작은 조각으로 다진다. 다진 신장 조각을 HBSS 의 1-2 mL를 사용하여 젖은 상태로 유지하십시오.
- 다진 신장 조각을 300 μm 금속 체 위에 놓고 20mL 주사기의 플런저를 사용하여 체를 통해 신장을 누릅니다. HBSS로 체를 반복적으로 헹노려 서학적 파이프를 사용하여 깨끗한 페트리 접시에서 흐름을 수집합니다. 또한 메스로 긁어 내어 체의 바닥에 남아 /스틱 모든 것을 수집하고 수집 된 흐름을 통해 (신장 동종)으로 전송합니다.
- HBSS를 가진 75 μm 체를 통해 신장 균모를 헹구는. 흐름을 수집하고 53 μm 체를 통해이 흐름을 헹신다. HBSS를 사용하여 두 체를 모두 세척하여 모든 작은 구조를 제거합니다.
참고: 이 단계에서흐름은 헹지만 75 μm 및 53 μm 체를 통해 압착되지 않습니다. 체에 파편과 작은 구조를 제거하기 위해 HBSS로 세척이 필요합니다. 따라서 일반적으로 HBSS의 200-300 mL은 총으로 사용된다. - 75 μm 및 53 μm 체에 남아 있는 신장 구조/물질을 덜벡코의 변형된 이글 배지(DMEM)로 체의 상부 표면을 세척하여 20%의 태아 종아리 혈청(FCS)으로 보충하고 물질을 6웰 초저 부착 마이크로플레이트로 옮기는다.
참고: 체의 상부 표면을 세척하려면 체를 기울어진 위치(>45°)로 헹구고 체 가장자리에서 신장 물질을 수집합니다. 수집된 재료는 캡슐화뿐만 아니라 캡슐화된 구체로 메물리로 보강되어 몇 개의 관 부조각만 표시됩니다. 캡슐화된 구성술은 매우 끈적끈적합니다. 따라서 단일 구엽을 수집하려면, 따라서 페트리 접시 또는 웰 플레이트의 표면에 부착 하는 구체를 방지 하는 것이 중요 하다. 준수를 방지하려면 20% FCS가 있는 배지를 사용하고 이 단계에 초저 부착 플레이트를 사용하십시오.
3. 사구형 의 배양
- 초저 부착 마이크로플레이트를 반전된 광 현미경으로 가져와 캡슐화된 단일 캡슐화 및/또는 20μL 파이펫으로 캡슐화된 구광을 수집합니다. 다른 구조물과 파편을 피하십시오. 파이펫 팁에서 단일 구두를 수집한 후 동일한 파이펫 팁에 수집된 신장 물질 없이 신선한 DMEM 배지를 20μL의 부피에 추가합니다.
- 20 μL DMEM 배지를 24웰 세포 배양판의 중심으로 단일 소구체를 전송하고 37°C및 5% (v/v)CO2에서 3시간 동안 배양하여 음의 중앙으로 구생물을 부착할 수 있도록 한다. 음구체의 부동을 피하기 위해 조심스럽게 접시를 이동하여 우물의 보더에게.
- 3 h 의 배양 후, 사구체는 우물의 중앙에 부착됩니다. 하이드로코르티존, 인간 내피 성장 인자, 소 뇌 추출물 및 젠타미신 황산 암포테리신 B(재료의 표)및 추가 5 % (v /v) FBS 및 1 % (v /v) 펜틴 을 포함하는 성장 인자 키트로 보충 된 내피 성 기저형 배지 (EBM)의 500 μL을 조심스럽게 추가합니다.
- 37°C에서 6일간 단일 글로메룰리, 5% (v/v) CO2를배양한다.
참고: 6일 이내에 정수리 상피 세포로 구성된 아웃성장이 형성됩니다. 하나는 정수리 상피 세포에 특정 화합물 또는 약물의 효과 테스트 하는 것을 목표로 하는 경우 이 6 일 기간 내에서 매체에 추가 해야.
4. 정수리 상피 세포 증식 분석
- 6 일 후에 사구배 기재를 분석합니다. 디지털 반전 광 현미경을 사용하여 현미경 이미지를 가져 가라.
- 이미지 분석 소프트웨어(예: ImageJ/FIJI)를 사용하여 포사구배의 표면적 및 직경, 그리고 성장하는 세포 또는 성장형 구체의 수를 결정합니다.
- 사구선 성장의 표면적을 확인하려면 tif를 엽니다. ImageJ의 스케일 바가 있는 구사적 아웃성장 파일. 스케일 표시줄에 직선을 그리고 분석 및 측정(예: 1mm = 460 픽셀)을 클릭하여 픽셀의 거리를 결정합니다.
- 분석,설정 축척 및 픽셀(예: 460)의 알려진 거리를 입력하여 스케일을 결정하고, 알려진 거리(예를 들어, 1) 및 길이 단위(예를 들어, 1mm)를 입력합니다. 확인을 클릭합니다.
- 분석을 클릭한 다음 측정을 설정하여 결과 표에 표시될 결과를 결정합니다. 구체 아웃성장의 표면적을 확인하려면 옵션 영역을 활성화하고 레이블을 표시합니다. 확인을 클릭합니다.
- 사구선 아웃성장의 표면적을 결정하려면, 구체 아웃스링 주위에 프리핸드 선택을 그립니다. 분석을 클릭한 다음 측정하면 결과 테이블이 ImageJ에 표시되어 이전 결정 된 배율에서 아웃 성장의 표면적을 보여 주겠습니다 (예 : 4.4, 예 : mm2참조).
5. 사구 세포 의 특성화
참고: 외성장의 세포 조성을 평가하기 위해, 세포 별 마커에 대한 면역 형광 염색은 t = 6 일에서 구체 아웃스키에서 수행됩니다.
- 배지를 조심스럽게 제거하고 인산염 완충식염(PBS)을 사용하여 두 번 구불구를 부드럽게 씻습니다.
- PBS에서 4%(w/v) 자당으로 보충된 2%(w/v) 파라포름데히드(PFA)를 사용하여 실온에서 10분 동안 고정하고 PBS를 사용하여 2배를 조심스럽게 세척합니다.
- PBS-ovine 세럼 알부민(BSA) 1%(v/v)에서 적절한농도(재료표)를가진 1차 항체를 실내 온도에서 1시간 동안 배양한다.
- 항체 용액을 제거하고 PBS로 3배 조심스럽게 세척하십시오.
- 이차항체(재료표)를가진 배양은 실온에서 45분 동안 어둠 속에서 PBS-BSA 1% (v/v)로 희석된다.
- 신중하게 PBS와 3 배 세척하고 핵을 시각화하고 둥근 커버 슬립으로 잘 커버하는 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 수성 장착 매체의 1-2 방울을 사용하여 마운트.
- 형광 현미경을 사용하여 현미경 이미지를 가져 가라.
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Representative Results
구체 아웃성장 분석법을 수행하는 방법의 체계적인 다이어그램이 도 1에도시된다. 도 2A-D는 광 현미경을 사용하여 관찰된 바와 같이 다른 시점에서 캡슐화된 사구체의 사구체 의 성장을 나타낸다. 외성장은 마우스 신장으로부터 의자간 후 배양에서 2일, 4일 및 6일째(도2B-D)로나타났다. 확장되는 세포가 정수리 상피 세포임을 확인하기 위해, 탈캡슐화된 구엽수는 도 2E, F에도시된 바와 같이 6일 동안 격리되고 배양되었다. 탈캡슐화된 사구는 6일 이내에 잠복기 동안 세포 밖으로 성장을 보이지 않았다. 도 3에서,면역형광 염색은 상이한 정수리 상피 세포 마커, podocyte 특이적 마커 및 내피 세포 마커를 위해 수행되었다. 결과는 성장하는 세포가 실제로 정수리 상피 세포이다는 것을 확인합니다. 도 4는 cd44/---wT 마우스로부터 6일간의 배양 후 분리된 캡슐화된 국물의 성장을 나타낸다. cd44-/-----생쥐로부터 분리된 글로메룰리는 WT 마우스로부터 분리된 사구체에 비해 구체 배설물의 감소된 표면적뿐만 아니라 성장세포의 수가 감소하여이전에발표된 바와 같이 정수리 상피 세포 활성화에서 CD44에 대한 중요한 역할을 시사하였다. 도 5에서,성장중인 정수리 상피 세포의 표면적이 ImageJ를 사용하여 결정되는 예가 주어진다.
도 1: 정수리 상피 세포 증식을 분석하기 위해 구체 아웃성장 분석을 수행하는 방법의 회로도 개요. (1) 신장은 희생된 마우스에서 해부되고 작은 조각으로 다진다. (2) 신장 조직은 300 μm 체를 통해 압착되고 75 μm 및 53 μm 체를 통해 헹구는다. (3) 체 위에 남아 있는 글로메룰리는 중간 + 20% (v/v) FCS를 사용하여 수집되며 초저 부착 판으로 옮겨져 있다. (4) 단일 사구는 반전된 광 현미경을 사용하여 채취되고 24웰 배양판으로 옮겨집니다. (5) 37°C에서 인큐베이션 후, 6일 동안 5% (v/v)CO2, 구사성 내시경을 사용하여 분석할 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: WT 마우스에서 해부된 신장으로부터 분리된 캡슐화된 구체 사구의 생구증. 37°C에서 배양된 캡슐화된 사구의 아웃스레이는 다른 시점에서 나타난다:(A)0일,(B)2일,(C)4일,(D)6일. 탈캡슐화된 사구는 또한 37°C에서 분리및 배양되었고 현미경 이미지는(E)0일 및(F)6일째에 생겨나지 않는 세포가 없는 것으로 나타났습니다. 스케일 바:(A, E,F)200 μm,(B)400 μm,(C, D)1000 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 성장하는 사구세포는 정수리 상피 세포 마커의 발현을 보여준다. 면역형광 염색은 증가하는 상피 세포를 특성화하기 위해 단일 캡슐형 소구류를 격리한 후 6일째에 수행되었다. 외성장 세포는 정수리 상피 세포 마커에 대해 양성 으로 염색하였다:(A)CD44,(B)SSeCKS,(C)클라우렌-1, 그러나(D)podocyte 특이적 마커 시냅토포딘 또는(E)내피세포 특이적 마커 CD31의 발현을 나타내지 않았다. 스케일 바:(A, B, D, E)100μm,(C)50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 구체 대성장은 CD44 녹아웃 마우스로부터 분리된 사구체에서 손상된다. 캡슐화된 사구는(A)WT 마우스 및(B) cd44/--마우스의 해부된 신장으로부터 분리되었다. 현미경 사진은 디지털 반전 빛 현미경을 사용하여 문화에서 6 일 후에 찍은 것입니다. cd44-/----마우스에 비해 WT 마우스로부터 의 소두에 메랄리에서 성장외 상피 세포의 수는 증가- 정수리 상피 세포 활성화에서 CD44에 대한 중요한 역할을 제안. 스케일 바: 1000 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: ImageJ(FIJI)를 이용하여 정수리 상피 세포 증식을 위한 마커로서 사구배기의 표면적 분석의 예. (A)37°C에서 6일간 배양후 WT 마우스의 캡슐화된 사구의 구체가 생후. (B)먼저, 스케일은 mm2의표면적을 분석하기로 결정된다. 여기: 1mm = 460 픽셀. (C)스케일을 설정한 후, 셀로크 아웃스영역 주변에 선택선이 그려집니다. (D)선택한 영역은 다음 측정 할 수 있습니다 (이 예에서 표면적 = 2.235 mm2). 스케일 바: 1000 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 문서에 설명된 프로토콜을 사용하여, 하나는 정수리 상피 세포 활성화의 결과인 정수리 상피 세포 증식을 평가하기 위하여 단 하나 캡슐화된 구체를 사용할 수 있습니다. 이 전 생체 내 모델은 우리가 정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 분자 경로를 자세히 연구 할 수 있게 합니다. 설명된 방법은 신장 해부및 체질의 간단한 개념에 의존하여 탈구를 분리하고 배양하고 상이한 실험 조건 하에서 정수리 상피 세포의 증식 및/또는 이주를 비교한다. 배양6일 후에 분석될 수 있는 결과는, 예를 들면, 표면적 또는 직경또는 단일 캡슐화된 구체의 성장세포의 수입니다. 이 분석에 대 한 또 다른 응용 프로그램 유도 하거나 정 수리 상피 세포 활성화에 관여 될 수 있는 분자 통로 억제 하는 약물의 효과 연구 할 수 있습니다.
면역형광 염색은 6일 후 배양후 성장세포가 정수리성 상피세포(CD44, 클라우딘-1, SSeCKS)에 대해 양성으로 염색되었으나, 포도세포 특이적 마커 시냅토포틴을 발현하지 않았음을 확인하였다. 염색의 결과에 따라, 외래 성장세포는 단일 탈캡슐형 사구의 격리 및 배양 후 6일 후에 관찰될 수 없었으며, 이는 이 6일 기간 내에 세포 에서 다른 구체 세포의 오염이 제한적임을 나타낸다. 또 다른 연구는 또한 구체 전경 을 분석하고 구체 상피 세포(14)에서실제로 후손 인 구체 배기 세포가 있음을 보여 주었다.
성장하는 세포의 마커 발현을 분석하기 위해 사용된 염색 프로토콜은 또한 관심있는 다른 분자를 테스트하기 위하여 적응될 수 있다. 면역스테인링은 6일 동안 구유를 받은 플레이트의 우물 내부에서 수행되었다. 이 우물은 코팅되지 않았지만 첫 번째 2-3 h 인큐베이션 동안 우물에 부착 된 구두를 비운. 알로메룰리가 표면에 완전히 부착되지 않았고 사구성 성장이 손상되었기 때문에 더 나은 이미징을 초래할 챔버 슬라이드 시스템에 대한 배양은 불가능했습니다. 이러한 특정 프로토콜은 건강한 WT 및 cd44/--마우스(11)의 구엽술로부터 의 정수리11상피 세포 아웃성장을 연구하기 위해 최근에 설정되었다. 이 방법을 사용하여, CD44-결핍 정수리 상피 세포가 감소된 증식율을 나타내며, 이는 도 4에서도입증된다. 이 방법은 또한 그밖 긴장의 마우스를 위해 또한 그밖 유전으로 변경된 마우스를 위해 이용될 수 있습니다. 예를 들어, 이전 연구에서는 글루코코르티코이드 수용체 신호15의효과를 분석하기 위해 유사한 접근법을 사용했습니다.
이 기술의 사용은 마우스로부터 구농을 분리하고 세포 외성장을 분석하는 데 많은 장점이 있으며, 상피 세포 활성화 또는 상피 세포 증식 과정에 영향을 미칠 수 있는 약물의 분석을 위한 불멸의 정수리 상피 세포주를 사용하는 쪽으로 많은 장점이 있다. 첫째, 이 방법에서, 1 차 세포는 사구체에서 직접 성장하고 배양에서 단지 6 일 인 사용됩니다. 따라서, 구체 전성장으로부터의 정수리 상피 세포는세포주(16)를만들기 위해 추가적인 성장 통로가 필요한 불멸의 세포주에 비해 표현형의 변화가 적어졌습니다. 더욱이, 여기서 설명된 방법은 침묵 방법을 이용한 유전자 녹아웃의 손상된 세포 성장 또는 효율성 때문에 세포주에서 노크하기 어려운 통로에 대해서도 정수리 세포 증식에 대한 특정 유전자 녹아웃의 효과를 비교하는 데 사용될 수 있다.
프로토콜을 다른 동물 모델이나 인간 신장 조직에 적용하려면 체의 크기가 최상의 결과를 얻기 위해 최적화되어야 합니다. 이는 사구체 크기가 종마다 다르기 때문에 사구를 수집할 수 있는 체의 크기가 다양하기 때문이다. 또한, 본 방법의 목적을 위해 그대로 캡슐화된 구체를 분리하는 것이 중요하다. 따라서, 사구는 누는 것이 아니라 작은 체를 통해 부드럽게 헹구어서는 안된다.
프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 체질 후 캡슐화된 사구를 수집하는 것입니다. 여기서는 20% FCS를 사용하여 서로 에 대한 구두를 부착하지 않도록 배지를 사용하는 것이 중요합니다. 또한, 글로메룰리로 농축된 용액은 초저유착판으로 직접 전달되어야 하는데, 그렇지 않으면, 글로메룰리는 일반 세포 배양판의 표면과 심지어 플라스틱 튜브표면에 직접 부착되어 단일 구슬을 포획하고 분리하기가 어렵기 때문이다.
단일 캡슐화된 구엽을 수집한 후, 이를 준수할 수 있도록 우물 중앙에 소량의 배양 매체로 3h를 배양해야 합니다. 이미지 분석 중에 판독을 최적화하기 위해 우물의 보더쪽으로 구슬을 띄우십시오.
여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 최상의 결과를 얻으려면 단일 글로메룰리 문화권과 6일째 에 판독을 수행하는 것이 좋습니다. 이 시점에서, 정수리 상피 세포로 구성된 균질성 세포 아웃성장을 관찰할 수 있다. 나중에 시점에서, 구사성 아웃성장은 다른 세포 모형의 성장을 나타내는 표현형 이종성 되기 가성입니다. 따라서 프로토콜은 매우 긴 잠복 시간에 적합하지 않은 것으로 보입니다. 하나는 정수리 상피 세포 아웃 성장을위한 잠복기는 종 또는 다른 마우스 긴장 사이에 다를 수 있음을 명심해야합니다. 따라서 배양 시간은 각 마우스 변형 또는 종에 대해 테스트하고 최적화되어야 합니다. 또한, 구체 성장의 기원은 항상 정수리 상피 세포 특정 마커에 대한 염색에 의해 검증되어야한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 네덜란드 신장 재단에 의해 지원 되었다 (보조금 14A3D104) 과학적 연구를 위한 네덜란드 조직 (NWO VIDI 교부금: 016.156.363).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI | |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | ||
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | ||
| Fetal Calf Serum | Lonza | ||
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | ||
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| petri dish | Sarstedt | size 100 | |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) | |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker | |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 | |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel | |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml | |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
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