Summary
Denne artikel beskriver en metode til ætsning og analyse af glomerular parietal epitelcelle udvækster af indkapslet glomeruli isoleret fra musennyre. Denne metode kan bruges til at studere veje involveret i parietal epitelcelleproliferation og migration.
Abstract
Parietal epitelcelleaktivering (PEC) er en af de vigtigste faktorer, der er involveret i udvikling og progression af glomerulosklerose. Hæmning af veje, der er involveret i parietal epitelcelleaktivering, kan derfor være et redskab til at dæmpe udviklingen af glomerular sygdomme. Denne artikel beskriver en metode til kultur og analysere parietal epitelcelle udvækst af indkapslet glomeruli isoleret fra musennyre. Efter dissekering isolerede mus nyrer, vævet hakkes, og glomeruli er isoleret ved sieving. Indkapslet glomeruli indsamles, og enkelte glomeruli dyrkes i 6 dage for at opnå glomerular udvækst af parietale epitelceller. I denne periode kan parietal epitelcelleproliferation og migration analyseres ved at bestemme cellenummeret eller overfladearealet af udgroede celler. Denne analyse kan derfor anvendes som et redskab til at undersøge virkningerne af et ændret genekspression i transgene- eller knockout-mus eller virkningerne af kulturbetingelser på parietale epitelcellevækstegenskaber og signalering. Ved hjælp af denne metode, vigtige veje involveret i processen med parietal epitelcelleaktivering og dermed i glomerulosklerose kan undersøges.
Introduction
Glomerular sygdomme er en vigtig gruppe af nyresygdomme og udgør en væsentlig årsag til slutstadiet nyresygdom (ESRD). Desværre er specifikke behandlingsmuligheder begrænsede, og progression til ESRD er uundgåelig. Glomerular sygdomme er defineret ved tilstedeværelsen af glomerular skade og kan grupperes i inflammatoriske og ikke-inflammatoriske sygdomme. Selv om den oprindelige fornærmelse er anderledes, har nylige undersøgelser vist, at en fælles cellulær mekanisme fører til glomerulær epitelcellehyperplasi og i sidste ende til glomerulosklerose i alle glomerular sygdomme, uanset den underliggendeårsag 1,2,3,4.
Konkret blev det vist, at glomerulosclerotic læsioner hovedsageligt består af aktiverede parietale epitelceller5,6. Under fysiologiske forhold, parietal epitelceller er flade quiescent epitelceller, linje Bowman kapsel af glomerulus. Men enhver glomerulær skade enten på grund af genetiske mutationer (f.eks podocyt specifikke eller mitokondrielle cytopatier), betændelse eller hyperfiltrering (f.eks forårsaget af nedsat nyremasse, hypertension, fedme eller diabetisk mellitus) kan udløse aktivering af parietal epitelceller. Aktiverede parietale epitelceller formerer sig og deponerer ekstracellulære matrixer , hvilket resulterer i dannelsen af cellulære halvmåner eller sklerotiske læsioner5,7,8. Progression af disse processer resulterer i tab af nyrefunktion9. Derfor er parietal epitelcelleaktivering en nøglefaktor i udviklingen og progressionen af glomerulosklerose ved både inflammatoriske og ikke-inflammatoriske glomerular sygdomme1,,2,,3,4,10.
De molekylære processer, der mægler parietal epitelcelleaktivering er stadig stort set ukendte. Nylige undersøgelser viser, at aktiverede parietale epitelceller de novo express CD44, en receptor, der er vigtig for aktivering af forskellige veje involveret i cellulær proliferation og migration. Desuden viste hæmning af CD44 sig at hæmme parietal epitelcelleaktivering og dæmpe udviklingen af halvmånedannelse og glomerulosklerose i dyremodeller af inflammatoriske såvel som ikke-inflammatoriske glomerular sygdomme11,12.
Som parietal epitelcelleaktivering er en vigtig aktør for udviklingen af glomerulosklerose og halvmånedannelse, kan hæmning af disse celler bremse udviklingen af glomerular sygdomme. Belysning af de molekylære veje, der driver parietal epitelcelleaktivering, kan føre til udvikling af specifikke terapeutiske indgreb, der dæmper dannelsen af hyperplastiske og glomerulosklerotiske læsioner ved glomerular sygdom.
I eksperimentelle dyremodeller er det ofte vanskeligt at fremlægge dokumentation for en direkte virkning af et ændret genekspression (knock-out-modeller eller transgene musemodeller) eller lægemiddelbehandling på de parietale epitelceller. I en konventionel knock-out mus de observerede in vivo ændringer kan forklares ved direkte ændringer i parietal epitelceller. Men da genekspressionen også ændres i andre celletyper i musen, kan man ikke udelukke indirekte effekter, der er medieret af andre celletyper. Udviklingen af betingede cre-lox-mus, der drives af promotorer, der hovedsagelig er aktive i parietale epitelceller, har i nogle tilfælde givet enløsning på 13. Ikke desto mindre er betingede transgene modeller komplekse, og selv om der bliver flere betingede linjer tilgængelige, er der for mange af de konventionelle knock-out eller transgene muselinjer endnu ikke en betinget erstatning.
At studere de direkte virkninger på parietal epitelceller, vores gruppe har udviklet en ex vivo assay ved hjælp af enkelt indkapslet glomeruli isoleret fra musennyrer til at måle og analysere parietal epitelcelleproliferation og migration. Denne metode vil gøre det muligt for os at bestemme parietale epitelcellespecifikke effekter og finde ansvarlige veje til parietal epitelcelleaktivering og testbehandlingsmuligheder for at hæmme denne aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i henhold til retningslinjerne fra Animal Ethics Committee of the Radboud University Nijmegen.
BEMÆRK: Ubehandlede, sunde vilde mus (WT) mus (n = 4) og cd44-/- (n = 4) mus blev ofret i en alder af 12-16 uger. Der blev anvendt både han- og hunmus. Alle mus var på C57Bl/6 baggrunden.
1. Mus nyre dissektion
- Ofre sunde WT mus eller genetisk ændrede mus ved livmoderhalskræft dislokation.
- Dissekere hele musen nyrer direkte efter at ofre mus. Til dette, udføre en median laparotomi ved hjælp af abdominal saks, skære huden og derefter mavemusklerne. Fjern tarmen og placere den ved siden af musen.
- Befri nyrerne fra at forbinde væv og trække ud i nyrerne ved hjælp af kirurgiske brystfødder, skære nyrearterien, nyrevene og ureter med en saks.
- Fjern nyrekapslerne fra nyrerne ved at holde nyrerne med kirurgiske håndsving og trække kapslen af med et andet par brystfødder.
- Anbes nyrerne i en 6-brønds cellekulturplade (2 nyrer/godt) tilberedt med 2 ml Hanks' afbalancerede saltopløsning (HBSS) pr. brønd og læg dem på is.
2. Isolering af glomeruli fra musennyre
- Overfør nyrerne til en 100 mm petriskål og hakker nyrerne i små stykker af 1−2 mm ved hjælp af to skalpeller. De hakkede nyrestykker skal opbevares vådt ved hjælp af 1−2 ml HBSS.
- Læg de hakkede nyrestykker oven på en 300 μm metalsigte, og tryk nyrerne gennem sigte med et stempel på en 20 ml sprøjte. Skyl derefter gentagne gange sien med HBSS ind imellem, og gennemstrømningen opsames i en ren petriskål ved hjælp af en serologisk pipet. Saml også alt, hvad der er tilbage / klæber til den nederste side af sien ved at skrabe det ud med skalpel og overføre det til den indsamlede flow-through (nyre homogenat).
- Nyrehomogenatet skylles gennem en sigte på 75 μm med HBSS. Gennemstrømningen opsamles og skylles derefter gennem en sigte på 53 μm. Vask begge sier med HBSS for at fjerne alle mindre konstruktioner.
BEMÆRK: I dette trin skylles flow-selv kun, men presses ikke gennem 75 μm og 53 μm sigte. Vask med HBSS er nødvendig for at fjerne snavs og mindre strukturer på sien. Derfor anvendes normalt 200−300 ml HBSS i alt. - Opsaml de nyrestrukturer/-materiale, der forbliver på 75 μm og 53 μm sigte ved at vaske den øverste overflade af sier med Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) suppleret med 20% fosterkalvserum (FCS) og overføre materialet til en 6-brønd ultra-lav fastgørelsesmikroplade.
BEMÆRK: For at vaske den øverste overflade af sien skylles sien i vippet position (>45°) og nyrematerialet op på kanten af sien. Det indsamlede materiale er beriget til indkapslet samt decapsulated glomeruli, viser kun et par rørformede fragmenter. Indkapslet glomeruli er meget klæbrig. For at indsamle enkelte glomeruli er det derfor vigtigt at forhindre glomeruli i at klæbe til overfladen af en petriskål eller brøndplade. For at undgå overholdelse skal du bruge medium med 20% FCS og bruge ultra-lav fastgørelsesplader til dette trin.
3. Ætsning af glomerulær udvækst
- Den ultralave fastgørelsesmikleplade bringes til et omvendt lysmikroskop, og der opsames enkelte indkapslede og/eller dekapsulerede glomeruli med en 20 μL pipette. Undgå at pipettere andre strukturer og snavs. Efter indsamling af en enkelt glomerulus i pipettespidsen tilsættes frisk DMEM-medium uden opsamlet nyremateriale i samme pipettespids til et rumfang på 20 μL.
- Enkelt glomerulus overføres med 20 μL DMEM-mediet til midten af en 24-brønds cellekulturplade og inkuberes i 3 timer ved 37 °C og 5% (v/v) CO2 for at tillade fastgørelse af glomerulus til midten af brønden. Flyt forsigtigt pladen for at undgå flydende af glomerulus til boarders af brønden.
- Efter 3 h inkubation er glomerulus knyttet til brøndens centrum. Der tilsættes omhyggeligt 500 μL endotelbasalbasalmedium (EBM) suppleret med et vækstfaktorsæt indeholdende hydrocortison, human endotelvækstfaktor, hjerneekstrakt og gentamicin sulfat-amphotericin B(materialetabel) og yderligere 5% (v/v) FBS og 1% (v/v) penicillin/streptomycin (pen/strep) til hver brønd.
- Æd den enkelte glomeruli i 6 dage ved 37 °C, 5% (v/v) CO2.
BEMÆRK: Inden for 6 dage dannes udvæksten bestående af parietale epitelceller. Hvis man har til formål at teste virkningerne af specifikke forbindelser eller lægemidler på parietal epitelceller det bør føjes til mediet inden for denne seks-dages periode.
4. Analyse af parietal epitelcelleproliferation
- Analyser den glomerular udvækst efter 6 dage. Tag mikroskopiske billeder ved hjælp af et digitalt omvendt lysmikroskop.
- Brug en billedanalysesoftware (f.eks. ImageJ/FIJI) til at bestemme overfladearealet og diameteren af den glomerular udvækst og antallet af udgroede celler eller udgroning af glomeruli.
- For at bestemme overfladearealet af glomerular udvækst, åbne tif. fil af den glomerular udvækst med skala bar i ImageJ. Tegn en lige linje på skalabjælken, og bestem afstanden i pixel ved at klikke på analysér og mål (f.eks. 1 mm = 460 pixel).
- Bestem skalaen ved at klikke på analyser,indstille skala og skrive den kendte afstand i pixel (f.eks. 460), skriv også den kendte afstand (f.eks. 1) og længdeenheden (f.eks. 1 mm). Klik på ok.
- Find ud af, hvilke resultater der vises i resultattabellen, ved at klikke på analysér og angiv derefter målinger. Hvis du vil bestemme overfladearealet af glomerular udvækst, skal du aktivere indstillingsområdet og vise etiketten. Klik på ok.
- For at bestemme overfladearealet af glomerular udvækst, tegne en frihåndsmarkering omkring den glomerular udvækst. Klik på analysere og derefter måle, vil et resultat tabel poppe op i ImageJ viser overfladearealet af udvækst i den tidligere bestemmede skala (se trin 4.4, f.eks mm2).
5. Karakterisering af den glomerular celle udvækst
BEMÆRK: For at vurdere udvækstens cellulære sammensætning udføres immunofluorescens farvning for cellespecifikke markører på de glomerære udvækster ved t = 6 dage.
- Mediumstømtes forsigtigt, og glomerulien vaskes forsigtigt to gange med fosfatbufferet saltvand (PBS).
- Fikserat i 10 min ved stuetemperatur ved hjælp af 2% (w / v) paraformaldehyd (PFA) suppleret med 4% (w / v) saccharose i PBS og omhyggeligt vaske 2x ved hjælp af PBS.
- Inkuberes med det primære antistof med passende koncentration (Materialetabel),fortyndet i PBS-ovine serumalbumin (BSA) 1% (v/v) i 1 time ved stuetemperatur.
- Antistofopløsningen fjernes, og 3x vaskes omhyggeligt med PBS.
- Inkuberes med sekundært antistof (Materialetabel),fortyndet i PBS-BSA 1% (v/v) i mørke i 45 min ved stuetemperatur.
- Vask omhyggeligt 3x med PBS og montere ved hjælp af 1−2 dråber vandig montering medium med 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) til at visualisere kerner og dække godt med en rund dæksel slip.
- Tag mikroskopiske billeder ved hjælp af et fluorescerende mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et systematisk diagram over metoden til udførsel af den glomerulare udvækstanalyse er vist i figur 1. Figur 2A-D viser glomerular udvækster af indkapslet glomeruli på forskellige tidspunkter som observeret ved hjælp af lys mikroskopi. Udvækster er vist på dag 2, 4 og 6(Figur 2B-D) i kultur efter glomerulus isolation fra musennyre. For at validere, at de udgroede celler er parietale epitelceller, er dekapsulerede glomeruli også blevet isoleret og dyrket i 6 dage som vist i figur 2E,F. Decapsulated glomeruli viste ingen celleudvækst i inkubationstiden inden for 6 dage. I figur 3blev der udført immunfluorescens farvning for forskellige parietale epitelcellemarkører, podocyte specifikke markører samt endotelcellemarkører. Resultaterne validere, at de udgroning celler faktisk er parietal epitelceller. Figur 4 viser udvæksten af isolerede indkapslede glomeruli fra cd44-/- vs WT mus efter 6 dage i kultur. Glomeruli isoleret fra cd44-/- mus viste et nedsat antal outgrowing celler samt et nedsat overfladeareal af glomerular udvækst sammenlignet med glomeruli isoleret fra WT mus, hvilket tyder på en vigtig rolle for CD44 i parietal epitelcelleaktivering som offentliggjort tidligere11. I figur 5er der givet et eksempel, hvor overfladearealet af de udgroede parietale epitelceller bestemmes ved hjælp af ImageJ.
Figur 1: Skematisk oversigt over metoden til at udføre en glomerular udvækst analyse for at analysere parietal epitelcelleproliferation. (1) Nyrer dissekeres fra ofret mus og hakket i små stykker. (2) Nyrevæv presses gennem 300 μm-sien og skylles gennem 75 μm og 53 μm sier. (3) Glomeruli, der forbliver på toppen af sier indsamles ved hjælp af medium + 20% (v / v) FCS og overføres til en ultra-lav fastgørelsesplade. (4) Enkelt glomeruli opsamles ved hjælp af et omvendt lysmikroskop og overføres til 24-brønds kulturplader. (5) Efter inkubation ved 37 °C, 5% (v/v) CO2 i 6 dage, kan kugleformet udvækst analyseres ved hjælp af et digitalt omvendt lysmikroskop. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Glomerulær udvækst af isolerede indkapslet glomeruli fra nyrer dissekeret fra WT mus. Udvæksten af indkapslet glomeruli, der er inkuberet ved 37 °C, vises på forskellige tidspunkter: (A) 0 dage (B) 2 dage (C) 4 dage og (D) 6 dage. Decapsulerede glomeruli blev også isoleret og dyrket ved 37 °C, og mikroskopiske billeder blev taget på (E) dag 0 og (F) dag 6, der ikke viste nogen udgroningsceller. Skalastænger: (A,E,F) 200 μm, (B) 400 μm, (C,D) 1000 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Outgrowing glomerular celler viser udtryk for parietal epitelcelle markør. Immunofluorescens farvning blev udført på dag 6 efter isolering af enkelt indkapslet glomeruli at karakterisere outgrowing epitelceller. Udgroningsceller, der er farvet positive for parietale epitelcellemarkører: (A) CD44, (B) SSeCKS og (C) claudin-1, men viste ikke udtryk for (D) den podocyte-specifikke markør synaptopodin eller (E) den endotelcellespecifikke markør CD31, som udelukkende blev lokaliseret inde i glomerulus. Skalabarer: (A, B,D,E) 100μm, (C) 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Glomerular udvækst er nedsat i glomeruli isoleret fra CD44 knockout mus. Indkapslet glomeruli blev isoleret fra dissekerede nyrer af (A) WT mus og (B) cd44-/- mus. Mikroskopiske billeder blev taget efter 6 dage i kultur ved hjælp af en digital omvendt lys mikroskop. Antallet af outgrowing parietale epitelceller samt overfladearealet af udvækst blev øget i glomeruli fra WT mus sammenlignet med cd44-/- mus, hvilket tyder på en vigtig rolle for CD44 i parietal epitelcelleaktivering. Skala barer: 1000 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Et eksempel på analysen af overfladearealet af den glomerular udvækst som en markør for parietal epitelcelleproliferation ved hjælp af ImageJ (FIJI). (A) Kuglevækst i en indkapslet glomerulus af en WT-mus efter 6 dage i kultur ved 37 °C. (B) For det første er skalaen fast besluttet på at analysere overfladearealet i mm2. Her: 1 mm = 460 pixel. (C) Når skalaen er indstillet, tegnes der en markeringslinje rundt om området for kugleformet udvækst. (D) Dette valgte område kan derefter måles (overfladeareal i dette eksempel = 2,235 mm2). Skala barer: 1000 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af den protokol, der er beskrevet i denne artikel, kan man bruge enkelt indkapslet glomeruli til at evaluere parietal epitelcelleproliferation, som er en konsekvens af parietal epitelcelleaktivering. Denne ex vivo model vil gøre det muligt for os at studere i detaljer de molekylære veje, som er involveret i parietal epitelcelleaktivering. Den beskrevne metode er baseret på det enkle begreb nyredissektion og sigte for at isolere og kultur indkapslet glomeruli og til at sammenligne spredning og / eller migration af parietal epitelceller under forskellige eksperimentelle betingelser. De resultater, der kan analyseres efter 6 dage i kulturen er for eksempel overfladearealet eller diameteren af udvæksten eller antallet af udgroede celler i en enkelt capsulated glomerulus. Et andet program for denne analyse kunne være at studere virkningerne af lægemidler, der inducerer eller hæmmer molekylære veje, der kan være involveret i parietal epitelcelleaktivering.
Immunofluorescens farvning bekræftede, at de udgroede celler efter 6 dage i kulturen er parietale epitelceller, da de farves positive for parietal epitelcellemarkører (CD44, claudin-1, SSeCKS), men ikke udtrykke podocyte-specifikke markør synaptopodin, eller endotelcelle CD31. I overensstemmelse med resultaterne af farvningen kunne der ikke observeres udgroede celler 6 dage efter isolering og dyrkning af enkelt dekapsulated glomeruli, hvilket indikerer, at der er begrænset kontaminering af andre glomerularceller i celleudvæksten inden for denne 6-dages periode. En anden undersøgelse analyserede også glomerular udvækst og viste, at de hurtige prolifererende celler stammer fra den glomerular udvækst er faktisk efterkommer fra parietal epitelceller14.
Farvningsprotokollen, der blev brugt til at analysere de udgroede cellers markørudtryk, kan også tilpasses til at teste andre molekyler af interesse. Immunsindelig foranstaltninger blev udført inde i brøndene på pladerne, hvor glomeruli blev inkuberet i 6 dage. Disse brønde var ikke belagt, men glomeruli fastgjort til brøndene i løbet af de første 2−3 h inkubation. Inkubation på glas skær eller et kammer dias system, som ville resultere i bedre billeddannelse var ikke muligt som glomeruli ikke vedhæfte helt til overfladen og kugleformet udvækst var nedsat. Denne specifikke protokol blev oprettet for nylig for at studere parietal epithelia celle udvækst fra glomeruli af sunde WT og cd44-/- mus11. Ved hjælp af denne metode blev det påvist, at CD44-mangelfulde parietale epitelceller udviser en nedsat spredningshastighed, hvilket også fremgår af figur 4. Denne metode kan også bruges til mus af andre stammer og også til andre genetisk ændrede mus. I en tidligere undersøgelse for eksempel, en sammenlignelig tilgang blev brugt til at analysere virkningerne af glukokortikoide receptor signalering15.
Brugen af denne teknik til at isolere glomeruli fra mus og analysere de cellulære udvækster har mange fordele i retning af brugen af udødeliggjort parietal epitelcellelinjer til analyse af veje involveret i parietal epitelcelleaktivering eller lægemidler, der kan påvirke processen med epitelcelleproliferation. For det første anvendes der i denne metode primærceller, som vokser direkte ud af glomerulus og kun er 6 dage i kulturen. Derfor gennemgik de parietale epitelceller fra kugleformede udvækster færre ændringer i fænotype sammenlignet med udødeliggjorte cellelinjer, som har brug for yderligere vækstpassager for at oprettecellelinjen 16. Desuden kan den metode, der er beskrevet her, bruges til at sammenligne effekten af specifik gen knockout på parietal cellespredning også for veje, der er vanskelige at slå ud i cellelinjer på grund af nedsat cellevækst eller effektiviteten af gen knockout ved hjælp af lyddæmpningsmetoder.
For at tilpasse protokollen til andre dyremodeller eller til humant nyrevæv bør siernes størrelse optimeres for at opnå det bedste resultat. Dette skyldes, at den glomerular størrelse varierer mellem arter og derfor størrelsen af sier, som glomeruli kan indsamles varierer. Det er også vigtigt at isolere intakt indkapslet glomeruli med henblik på denne metode. Derfor bør glomeruli ikke presses, men forsigtigt skylles gennem de mindre sier.
Et andet kritisk skridt i protokollen er indsamlingen af den indkapslede glomeruli efter sieving. Her er det vigtigt at bruge medium med 20% FCS for at undgå fastgørelse af glomeruli til hinanden. Desuden bør opløsningen beriget med glomeruli overføres direkte til ultra-lav vedhæftningsplader, fordi ellers vil glomeruli direkte fastgøres til overfladen af almindelige cellekulturplader og endda til overfladen af plastrør, hvilket gør det vanskeligt at fange og isolere enkelte glomeruli.
Efter indsamling af enkelt indkapslet glomeruli, bør disse dyrkes 3 h i en lille mængde ætsning medium i midten af brønden for at tillade overholdelse. Flydende af glomeruli mod boarder af brøndene bør undgås for at optimere udlæse under billedanalyse.
For at opnå de bedste resultater ved hjælp af den protokol, der er beskrevet her, vil vi anbefale at kultur enkelt glomeruli og udføre udlæse på dag 6. På dette tidspunkt kan der observeres en homogen cellulær udvækst bestående af parietale epitelceller. På et senere tidspunkt bliver glomerulær udvækst fænotypisk heterogent, hvilket indikerer udvækst af andre celletyper. Derfor synes protokollen ikke at være egnet til meget lange inkubationstider. Man skal huske på, at inkubationstider for parietal epitelcelleudvækst kan variere mellem arter eller mellem forskellige musestammer. Derfor bør kulturtiderne testes og optimeres for hver musestamme eller -art. Desuden bør oprindelsen af glomerular udvækst altid valideres ved farvning for parietal epitelcellespecifikke markører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af hollandske Nyre Foundation (tilskud 14A3D104) og Den Nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO VIDI tilskud: 016.156.363).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | Endothelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| chicken-anti-rat Alexa 647 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern Biotech | Mounting medium containing DAPI | |
| Digital inverted light microscope | Westburg, EVOS fl microscope | ||
| donkey-anti-goat Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| donkey-anti-rabbit Alexa 568 | Thermo Fisher | (used concentration 1:200) | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots kit | Lonza | containing hydrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS and BBE | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | ||
| Fetal Calf Serum | Lonza | ||
| Fluorescent microscope | Leica Microsystems GmbH | ||
| goat-anti-synaptopodin | Santa Cruz | Podocyte marker (used concentration 1:200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| petri dish | Sarstedt | size 100 | |
| rabbit-anti-claudin1 | Abcam | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:100) | |
| rabbit-anti-SSeCKS | Roswell Park Comprehensive Cancer Center,Buffalo, NY, USA | kindly provided by Dr. E. Gelman, Parietal epithelial cell marker | |
| rat-anti-CD44 | BD Pharmingen | Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200) | |
| scalpel | Dahlhausen | size 10 | |
| Sieves | Endecotts Ltd | size 300 µm, 75 µm, 53 µm, steel | |
| syringe | BD Plastipak | size: 20 ml | |
| Ultra-Low Attachment Microplates | Corning Costar | 6-well plates |
References
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
