Organotypiske skive kulturer er et kraftfuldt værktøj til at studere neuroudviklingsmæssige eller degenerative/regenerative processer. Her beskriver vi en protokol, der modeller den neuroudviklingsmæssige død af Purkinje celler i mus cerebellar skive kulturer. Denne metode kan gavne forskning i neuroprotektive Drug Discovery.
Organotypiske skive kultur er en kraftfuld in vitro-model, der efterligner in vivo betingelser tættere end dissocierede primære cellekulturer. I den tidlige postnatal udvikling, cerebellar Purkinje celler er kendt for at gå gennem en sårbar periode, hvor de gennemgår programmeret celledød. Her giver vi en detaljeret protokol til at udføre mus organotypic cerebellar skive kultur i denne kritiske tid. Udsnittene er yderligere mærket for at vurdere Purkinje-cellens overlevelse og effekten af neuroprotektive behandlinger. Denne metode kan være yderst værdifuld at screene for nye Neuro aktive molekyler.
In vitro modellering er et vigtigt redskab i biomedicinsk forskning. Det giver forskerne mulighed for at studere og stramt kontrollere specifikke mekanismer i begrænset celletyper, eller i isolerede systemer/organer. Organotypiske skive kultur er en meget anvendt in vitro-teknik, især inden for neurovidenskab1. Metoden blev først etableret af Gähwiler, der dyrkede hjerne skiver ved hjælp af valse røret Technique2, og senere modificeret af Yamamoto et al., der introducerede brugen af en Mikroporøs membran til at udføre kortikale skive kulturer3. Sammenlignet med primære cellekulturer, organotypiske skive kulturer præsentere fordelen ved at bevare den cytoarkitektur af vævet, samt indfødte celle-celleforbindelser i flyet af vævs sektionen.
Organotypiske skiver er blevet dyrket fra mange dele af det centrale nervesystem, såsom hippocampus4, cortex5, striatum6, cerebellum4,7, og rygmarven8,9, blandt andre. De har vist sig at være et kraftfuldt værktøj i Drug Discovery undersøgelser10. Virkningerne af Neuro aktive molekyler kan vurderes på mange måder: overlevelse og neurodegeneration ved hjælp af immun farvning og biokemiske analyser, neuronal kredsløb dannelse, eller afbrydelse ved hjælp af Elektrofysiologi og Live-imaging.
Målet med dette arbejde er at beskrive en simpel metode til at udføre organotypiske cerebellar skive kultur, som er kendt for at være en relevant model til at efterligne cerebellare udvikling in vitro. Især fokuserede vi på studiet af Purkinje Cell udviklingsmæssige død. In vivo gennemgår Purkinje celler apoptose i løbet af den første postnatale uge og toppede på postnatale dag 3 (P3)11. Det samme mønster er observeret i cerebellare skive kultur, med Purkinje neuroner dør af apoptose, når cerebella er taget fra dyr mellem P1 og P8, med et højdepunkt på P34,12. Brugen af den organotypiske cerebellare skive kulturer har gjort det muligt at identificere flere neuroprotektive molekyler7,13, samt forståelse en del af de mekanismer, der er involveret i denne programmerede celledød14,15,16. Her beskriver vi en protokol baseret på studiet af Stoppini et al.17 i hippocampus og tilpasset cerebellum af Dusart et al.4 det omfatter hurtig dissektion og hakning af postnatal cerebella; udskæring af kulturen på en cellekultur indsats, der indeholder en Mikroporøs membran, med eller uden neuroprotektive behandling; og immunofluorescens farvning for at vurdere neuronal overlevelse.
Cerebellar skive kultur er et kraftfuldt værktøj til at studere programmeret Purkinje celledød under postnatal udvikling. Denne teknik kan bruges til hurtigt at screene kandidat molekyler for deres neuroprotektive potentiale. Den største fordel er, at opsætningen er enkel og meget omkostningseffektiv, og kræver kun en beskeden investering i udstyr (en vibratome kan koste op til 3 gange mere end en vævs chopper). Desuden kan 10 til 15 sunde skiver genereres fra en mus pup, giver mulighed for forskellige analyser, d…
The authors have nothing to disclose.
Imaging arbejde blev udført på Northwestern University Center for Advanced Microscopy generøst støttet af NCI CCSG P30 CA060553 tildelt Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Vi takker Sean McDermott for hans tekniske assistance og støtte, og Maya Epstein for de håndtegnede illustrationer, der er vist i figur 1.
Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
Brush | |||
anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
ImageJ | |||
McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
Prism 8 | GraphPad | ||
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |