Summary

Purkinje Sobrevivência celular em culturas organotípicas cerebelares fatia

Published: December 18, 2019
doi:

Summary

As culturas organotípicas da fatia são uma ferramenta poderosa para estudar processos neurodevelopmental ou degenerative/regenerative. Aqui, descrevemos um protocolo que modela a morte do neurodesenvolvimento das células purkinje em culturas de fatias cerebelares do rato. Este método pode beneficiar a pesquisa na descoberta de medicamentos neuroprotetores.

Abstract

A cultura organotípica da fatia é um modelo in vitro poderoso que imite em condições do vivo mais pròxima do que culturas dissociadas da pilha preliminar. No desenvolvimento pós-natal inicial, as células cerebelares de Purkinje são conhecidas por passar por um período vulnerável, durante o qual passam por morte celular programada. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para realizar a cultura de fatiacerebelar organotípica do mouse durante este momento crítico. As fatias são ainda mais rotuladas para avaliar a sobrevivência celular de Purkinje e a eficácia de tratamentos neuroprotetores. Este método pode ser extremamente valioso para a tela para novas moléculas neuroativas.

Introduction

A modelagem in vitro é uma ferramenta essencial na pesquisa biomédica. Ele permite que os investigadores para estudar e controlar rigorosamente mecanismos específicos em tipos de células restritas, ou em sistemas isolados / órgãos. A cultura organotípica da fatia é uma técnica in vitro amplamente utilizada, especial no campo da neurociência1. O método foi estabelecido pela primeira vez por Gähwiler, que cultou fatias cerebrais usando a técnica de tubo de rolo2,e mais tarde modificado por Yamamoto et al., que introduziu o uso de uma membrana microporosa para realizar culturas de fatias corticais3. Em comparação com as culturas celulares primárias, as culturas organotípicas apresentam a vantagem de preservar a citoarquitetura do tecido, bem como as conexões células-células nativas no plano da seção de tecido.

As fatias organotípicas foram cultivadas a partir de muitas partes do sistema nervoso central, como o hipocampo4,córtex5,estriado6,cerebelo4,7,e medula espinhal8,9,entre outros. Eles foram provados para ser uma ferramenta poderosa na descoberta de drogas estudos10. Os efeitos das moléculas neuroativas podem ser avaliados de muitas maneiras: sobrevivência e neurodegeneração usando imunomanchas e bioquímica, formação de circuito neuronal ou interrupção usando eletrofisiologia e imagem viva.

O objetivo deste trabalho é descrever um método simples para realizar a cultura cerebellar organotypic da fatia, que é sabida para ser um modelo relevante para imitar o desenvolvimento cerebellar in vitro. Particularmente, nós focalizamos no estudo da morte desenvolvente da pilha de Purkinje. In vivo, as células de Purkinje passam por apoptose durante a primeira semana pós-natal, atingindo o pico no dia pós-natal 3 (P3)11. O mesmo padrão é observado na cultura cerebellar fatia, com neurônios Purkinje morrendo por apoptose quando cerebella são retirados de animais entre P1 e P8, com um pico de P34,12. O uso das culturas organotípicas de fatiacerebelares permitiu identificar várias moléculas neuroprotetoras7,13,bem como compreender parte dos mecanismos envolvidos nesta morte celular programada14,15,16. Aqui, descrevemos um protocolo baseado no estudo de Stoppini et al.17 no hipocampo, e adaptado ao cerebelo por Dusart et al.4 Inclui dissecação rápida e corte de cerebella pós-natal; cortar a cultura em uma inserção da cultura celular contendo uma membrana microporosa, com ou sem tratamento neuroprotetor; e imunofluorescência manchando para avaliar a sobrevivência neuronal.

Protocol

Todos os experimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com o comitê de Estudos em Animais da Northwestern University. 1. Preparação antes das culturas organotípicas de fatiacerebelares Em uma capa de cultura celular pulverizada com 70% de etanol de antemão, prepare 200 mL de meio de cultura em um filtro de vácuo de 250 mL mL ligado a um receptor de garrafa estéril. Adicione 100 mL de Basal Medium Eagle (BME), 50 mL de Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 50 mL de…

Representative Results

Como mostrado na Figura 4,este protocolo produz culturas organotípicas de fatiacerebelares nas quais a sobrevivência celular de Purkinje pode ser avaliada após as etapas de imunofluorescência e aquisição de imagem. As células purkinje foram rotuladas com uma combinação de anticorpos anticalbindin d-28K (diluição 1/200) e anti-rato Alexa594 (diluição 1/300). A costura da imagem foi feita automaticamente pelo software da aquisição do microscópio (NIS-Elementos) para obter um re…

Discussion

A cultura cerebellar da fatia é uma ferramenta poderosa para estudar a morte programada da pilha de Purkinje durante o desenvolvimento postnatal. Esta técnica pode ser usada para selecionar rapidamente moléculas candidatas para seu potencial neuroprotetor. A principal vantagem é que a configuração é simples e muito rentável, e requer apenas um investimento modesto em equipamentos (um vibratome pode custar até 3 vezes mais do que um helicóptero de tecido). Além disso, 10 a 15 fatias saudáveis podem ser geradas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O trabalho de imagem foi realizado no Northwestern University Center for Advanced Microscopy generosamente apoiado pela NCI CCSG P30 CA060553 concedida ao Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Agradecemos a Sean McDermott por sua assistência técnica e apoio, e Maya Epstein para as ilustrações desenhadas à mão mostrado na Figura 1.

Materials

Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody ThermoFisher scientific A21203
Basal Medium Eagle (BME) ThermoFisher scientific 21010046
Biosafety cabinet Class II, Type A2 NuAire NU-540-400
Bovine serum albumin Millipore Sigma A2153
Brush
anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) Abcam ab82812
CO2 Incubator NuAire NU-5700
Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates Fisher Scientific 07-200-83
Coverslips, 22 x 50 mm Fisher Scientific 12-545-E
Dressing forceps, straight Harvard Apparatus 72-8949
Double edge blades Fisher Scientific 50949411
Ethanol 200 proof Decon Labs, Inc 2701
Eye Scissors, straight Harvard Apparatus 72-8428
Fine forceps Fisher Scientific 16-100-127
L-Glutamine 100X ThermoFisher scientific 25030149
Glucose solution ThermoFisher scientific A2494001
Hanks’ Balanced Salt Solution ThermoFisher scientific 14025092
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Fisher Scientific H21492
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin ThermoFisher scientific 26050088
ImageJ
McIlwain Tissue Chopper Fisher Scientific NC9914528
Microprobes Fisher Scientific 08-850
Millicell Cell Culture Inserts Millipore Sigma PICM0RG50
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL ThermoFisher scientific 168-0045
Nikon A1R confocal laser microscope system Nikon
NIS-Elements Imaging Software Nikon
Paraformaldehyde Acros Organics 41678-0010
Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher scientific P10144
Operating Scissors, straight Harvard Apparatus 72-8403
Orbital shaker Belly Dancer IBI Scientific BDRLS0003
Prism 8 GraphPad
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring Fisher Scientific FB012921
Tissue culture plate, 24 well Falcon/Corning 353047
Transfer pipettes, sterile ThermoFisher scientific 13-711-21
Triton X-100 ThermoFisher scientific BP151-500

References

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Cite This Article
Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures. J. Vis. Exp. (154), e60353, doi:10.3791/60353 (2019).

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