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Cancer Research

रोगी प्रोस्टेट कैंसर बोन मेटास्टेसिस नमूनों और उनके ज़ेनोग्राफ्ट से प्राप्त त्रि-आयामी (3 डी) ऑर्गेनॉइड की स्थापना और विश्लेषण

Published: February 3, 2020 doi: 10.3791/60367
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 4, 2,5, 1,2, 1,2
1Department of Urology, University of California, San Diego, 2Moores Cancer Center, University of California, San Diego, 3Department of Medicine, University of California, San Diego, 4Department of Radiation Oncology, University of California, Los Angeles, 5Department of Orthopedic Surgery, University of California, San Diego

Summary

रोगी बीएमपीसी नमूनों और हड्डी मेटास्टैटिक प्रोस्टेट कैंसर के विद्वेष की त्रि-आयामी संस्कृतियां उनके मूल ट्यूमर की कार्यात्मक विषमता को बनाए रखती हैं जिसके परिणामस्वरूप अल्सर, स्फेरॉइड और जटिल, ट्यूमर जैसे ऑर्गेनॉइड होते हैं। यह पांडुलिपि विषम रोगी व्युत्पन्न नमूनों की 3 डी संस्कृति और आईएफसी का उपयोग करके उनके विश्लेषण के लिए एक अनुकूलन रणनीति और प्रोटोकॉल प्रदान करती है।

Abstract

मानव रोगियों के ट्यूमर नमूनों से ऑर्गेनॉइड की त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति और प्रोस्टेट कैंसर के रोगी-व्युत्पन्न विद्वेष (पीडीएक्स) मॉडल, जिसे रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड (पीडीओ) के रूप में जाना जाता है, के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य संसाधन हैं ट्यूमरजीनिस और प्रोस्टेट कैंसर का मेटास्तासिस। उनका मुख्य लाभ यह है कि वे पारंपरिक कोशिका रेखाओं की तुलना में मूल ऊतक की विशिष्ट जीनोमिक और कार्यात्मक विषमता को बनाए रखते हैं जो नहीं करते हैं। इसके अलावा, PDO की 3 डी संस्कृतियों का उपयोग व्यक्तिगत रोगियों पर दवा उपचार के प्रभावों की भविष्यवाणी करने के लिए किया जा सकता है और व्यक्तिगत चिकित्सा की दिशा में एक कदम है। इन फायदों के बावजूद, कुछ समूह नियमित रूप से इस विधि का उपयोग करते हैं क्योंकि विभिन्न रोगी नमूनों के लिए आवश्यक हो सकता है कि PDO संस्कृति की स्थिति के व्यापक अनुकूलन के कारण। हमने पहले दिखाया था कि हमारे प्रोस्टेट कैंसर की हड्डी मेटाटैसिस पीडीएक्स मॉडल, PCSD1, एंटी-एंड्रोजन थेरेपी के लिए दाता रोगी के अस्थि मेटाटैसिस के प्रतिरोध को फिर से तैयार किया गया है। हमने एंटी-एंड्रोजन प्रतिरोध के तंत्र को और अधिक चित्रित करने के लिए PCSD1 3D ऑर्गेनॉइड का उपयोग किया। पीडीएक्स और पीडीओ मॉडल के वर्तमान में प्रकाशित अध्ययनों के अवलोकन के बाद, हम अनुकूलित संस्कृति स्थितियों में गुंबददार या फ्लोटिंग बेसमेंट झिल्ली (जैसे, मातृगेल) क्षेत्रों का उपयोग करके पीडीओ की 3डी संस्कृति के लिए कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। वीवो सिलाई इमेजिंग और हिस्टिलोजी के लिए सेल प्रोसेसिंग में भी वर्णित है। इस प्रोटोकॉल को पश्चिमी दाग, सह-संस्कृति आदि सहित अन्य अनुप्रयोगों के लिए और अनुकूलित किया जा सकता है और इसका उपयोग दवा प्रतिरोध, ट्यूमरजेनेसिस, मेटास्टैसिस और चिकित्सीय से संबंधित 3डी सुसंस्कृत डीडीओ की विशेषताओं का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

त्रि-आयामी सुसंस्कृत ऑर्गेनॉइड ने वीवो आर्किटेक्चर, सेलुलर कार्यक्षमता और उनके मूल ऊतकों के आनुवंशिक हस्ताक्षर1,2,3,4,5के आनुवंशिक हस्ताक्षर में अपनी क्षमता के लिए ध्यान आकर्षित किया है। सबसे महत्वपूर्ण बात, रोगी ट्यूमर ऊतकों या रोगी व्युत्पन्न विद्वेष (पीडीएक्स) मॉडल से स्थापित 3 डी ऑर्गेनॉइड ट्यूमरजनी पर सेलुलर सिग्नलिंग के तंत्र को समझने औरप्रत्येक कोशिका जनसंख्या6,7,8,9,10,12,13पर दवा उपचार के प्रभाव ों को निर्धारित करने के लिए अमूल्य अवसर प्रदान करते हैं। ड्रोस्ट एट अल5 ने मानव और माउस प्रोस्टेट ऑर्गेनॉइड की स्थापना के लिए एक मानक प्रोटोकॉल विकसित किया, जिसे यूरोलॉजी के क्षेत्र में व्यापक रूप से अपनाया गया है। इसके अलावा, 3डी ऑर्गेनॉइड के आगे लक्षण वर्णन और ट्यूमरिजन और मेटाटैसिस4,12,14,15के विस्तृत तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण प्रयास समर्पित किए गए हैं। 3डी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों के लिए पहले से स्थापित और व्यापक रूप से स्वीकार्य प्रोटोकॉल के अलावा, हम यहां अनुकूलित संस्कृति स्थितियों में तीन अलग-अलग डोमिंग विधियों का उपयोग करके PDO की 3D संस्कृति के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

इस पांडुलिपि में, 3 डी ऑर्गेनॉइड को बोन मेटास्टैटिक प्रोस्टेट कैंसर (बीएमपीसी) के एक पूर्व वीवो मॉडल के रूप में स्थापित किया गया था। इन संस्कृतियों के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाएं प्रोस्टेट कैंसर सैन डिएगो (पीसीएसडी) श्रृंखला से आई थीं और रोगी प्रोस्टेट कैंसर बोन मेटास्टैटिक ट्यूमर ऊतकों (PCSD18 और PCSD22) या रोगी व्युत्पन्न विद्वेष (पीडीएक्स) ट्यूमर मॉडल (PCSD1, PCSD13, और PCSD17 नाम के नमूने) से सीधे प्राप्त की गई थीं। क्योंकि प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं के सहज अस्थि मेटाटैसिस आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल16में दुर्लभ है, हम पुरुष Rag2 में मानव ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष अंतर-femoral (IF) इंजेक्शन का इस्तेमालकिया-//-चूहोंहड्डी मेटास्टैटिक प्रोस्टेट कैंसर17के PDX मॉडल स्थापित करने के लिए ।

एक बार विषम रोगी ट्यूमर कोशिकाओं या रोगी व्युत्पन्न विद्वेष से 3 डी ऑर्गेनॉइड स्थापित किए जाने के बाद, प्रोस्टेट ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में उनकी पहचान की पुष्टि करना और 3डी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों में उनके फेनोटाइप को निर्धारित करना आवश्यक है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस केमिस्ट्री (आईएफसी) प्रत्येक कोशिका में सीटू में प्रोटीन अभिव्यक्ति के दृश्य की अनुमति देता है, जो अक्सर विशिष्ट सेल आबादी2,4के लिए संभावित कार्यों का संकेत देता है। सामान्य तौर पर, ऊतकों और कोशिकाओं सहित अधिकांश नमूनों के लिए आईएफसी प्रोटोकॉल सरल और पूरी तरह से अनुकूलित हैं। हालांकि, सेल घनत्व और ऑर्गेनॉइड की संख्या पारंपरिक संस्कृति की तुलना में काफी कम हो सकती है। इसलिए, ऑर्गेनॉइड के लिए आईएफसी प्रोटोकॉल के लिए नमूनों में सभी ऑर्गेनॉइड के लिए पैराफिन में उचित प्रसंस्करण और एम्बेडिंग सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त कदम ों की आवश्यकता होती है। हम एक अगारोज प्री-एम्बेडिंग प्रक्रिया और स्लाइड पर अनुभागित ऑर्गेनॉइड के स्थान को लेबल करने के लिए सुझावों का वर्णन करते हैं जो ऑर्गेनॉइड पर आईएफसी की सफलता दर को बढ़ाता है, खासकर जब ऑर्गेनॉइड के नमूनों में वांछित की तुलना में कम सेल घनत्व होता है।

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Protocol

यह अध्ययन यूनिवर्सिटी ऑफ कैलिफोर्निया सैन डिएगो (यूसीएसडी) इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (आईआरबी) के गाइड में सिफारिशों के मुताबिक सख्ती से किया गया था । आईआरबी #090401 अनुसंधान प्रयोजनों के लिए रोगियों से सर्जिकल नमूना एकत्र करने के लिए यूसीएसडी संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) से अनुमोदन प्राप्त हुआ था। प्रत्येक रोगी से एक सूचित सहमति प्राप्त की गई थी और फीमर में एक पैथोलॉजिकल फ्रैक्चर की आर्थोपेडिक मरम्मत से एक शल्य चिकित्सा हड्डी प्रोस्टेट कैंसर मेटास्तासिस नमूना प्राप्त किया गया था। कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय सैन डिएगो (UCSD) पशु कल्याण और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) #S10298 प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी के तहत पशु प्रोटोकॉल प्रदर्शन किया गया । यांत्रिक रूप से और एंजाइमैटिक रूप से विसोसिएटेड रोगी ट्यूमर ऊतक की कोशिकाओं को 6 से 8 सप्ताह पुराने पुरुष Rag2में अंतर-femorally इंजेक्शन दिया गयाथा-/-;,सी-/-चूहों के रूप में पहलेवर्णित 17। Xenograft ट्यूमर की मात्रा वीवो बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम और कैलिपर माप में एक का उपयोग कर निर्धारित किया गया था। 2.0 सेमी तक ट्यूमर के विकास पर (आईएसीयूसी द्वारा अनुमोदित अधिकतम स्वीकार्य आकार), ट्यूमर को 3 डी ऑर्गेनॉइड स्थापना के लिए काटा गया था।

नोट: चित्रा 1 प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के प्रत्येक चरण के लिए 3डी ऑर्गेनॉइड और एक प्रोटोकॉल नंबर स्थापित करने के लिए कार्यप्रवाह दिखाता है।

1. रोगी व्युत्पन्न विद्वेष (पीडीएक्स) ट्यूमर ऊतकों की प्रसंस्करण

नोट: यह एक विद्वेष माउस मॉडल से प्राप्त ट्यूमर के लिए ऑर्गेनॉइड स्थापना के लिए एक प्रारंभिक कदम है। यह प्रोटोकॉल ड्रोस्ट एट अल5 द्वारा पिछले प्रकाशन से अनुकूलित किया गया है और हमने मीडिया की स्थिति को संशोधित किया है ताकि ऑर्गेनोइड मीडिया को सीरम पूरकता शामिल की जा सके।

  1. नीचे वर्णित ट्यूमर के नमूने को संसाधित करें।
    1. कीमा ट्यूमर के नमूने 1-3 मिमी3 आकार के टुकड़े करने के लिए और कमरे के तापमान पर 45 मिमी के लिए सेल विसोशन समाधान के 10 मिलीग्राम के साथ नमूनों को पचाने।
    2. पाचन समाप्त करने के लिए, नमूनों में डीएमईएम पूर्ण मीडिया के 20 mL जोड़ें।
    3. 70 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से निलंबन को फ़िल्टर करें। 70 माइक्रोन सेल छलनी के शीर्ष पर किसी भी बचे हुए ऊतक को पुश करने के लिए बाँझ प्लंजर फ्लैंज का उपयोग करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    5. सेल पैलेट को ताजा adDMEM पूरा मीडिया के साथ तीन बार धोएं। टेबल 3में सुझाए गए मीडिया की मात्रा के साथ धोने और पुनर्संकन के लिए मीडिया की मात्रा से मेल खाते हैं । उदाहरण के लिए, 24 अच्छी तरह से प्लेट संस्कृति की स्थिति के लिए, धोने के लिए मात्रा 500 μL होनी चाहिए।
      नोट: जैसा कि तालिका 3में दिखाया गया है, प्रोटोकॉल विभिन्न संस्कृति शर्तों पर लागू होता है।
    6. ट्राइपैन ब्लू डाई और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके अंतिम सेल की गिनती निर्धारित करें।
    7. सेल मायने रखता है प्राप्त करने के बाद, 2 x 106 ट्यूमर कोशिकाओं प्रति PBS में 2% FBS के 80 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
    8. माउस सेल कमी कॉकटेल प्रति 2 x 106 ट्यूमर कोशिकाओं के 20 μL जोड़ें। 2-8 डिग्री सेल्सियस पर 15 सीन के लिए अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
    9. 2 x 106 ट्यूमर कोशिकाओं प्रति पीबीएस बफर में 2% एफबीएस के साथ 500 μL के लिए मात्रा समायोजित करें।
      नोट: सेल निलंबन के 2.5 मिलील में 1 x 107 ट्यूमर कोशिकाओं को एक एलएस कॉलम पर संसाधित किया जा सकता है।
    10. चुंबकीय स्तंभ विभाजक पर एलएस कॉलम लोड और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा करने के लिए नीचे एक रैक पर एक 15 mL शंकु ट्यूब जगह है ।
    11. पीबीएस बफर में 2% एफबीएस के 3 mL के साथ प्रत्येक कॉलम कुल्ला। वॉश फ्लो-थ्रू के साथ शंकुई ट्यूब को त्यागें और एक नया, बाँझ 15 मीटर शंकुई ट्यूब से बदलें।
    12. कॉलम पर सेल निलंबन (1 x 107 ट्यूमर कोशिकाओं के 2.5 mL तक) जोड़ें। प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए कि मानव ट्यूमर कोशिकाओं के साथ समृद्ध हो जाएगा ।
    13. पीबीएस बफर में 2% एफबीएस के 1 mL के साथ कॉलम को दो बार धोएं।
      नोट: कॉलम खाली होते ही वॉश स्टेप्स करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, हवा के बुलबुले बनाने से बचने की कोशिश करें।
  2. अलीकोट वांछित संस्कृति(तालिका 3)के लिए 1.5 मिलील ट्यूब पर सेल निलंबन की उचित मात्रा।
  3. सेंट्रलाइज 1.5 एमएल ट्यूब 300 x ग्राम पर और 4 डिग्री सेल्सियस 5 मिन के लिए।
  4. ध्यान से हटा एंकरिंग करें और फेंक दें।

2. रोगी प्राथमिक ट्यूमर ऊतकों की प्रसंस्करण

नोट: यह ऑर्गेनोइड स्थापना के लिए एक प्रारंभिक कदम है।

  1. माउस सेल की कमी प्रक्रिया को छोड़कर चरण 1 का पालन करें, जो रोगी प्राथमिक ट्यूमर ऊतकों के प्रसंस्करण के लिए आवश्यक नहीं है।

3. प्लेट पर एक संलग्न गोल गुंबद बनाना

नोट: यह पांडुलिपि सेल पैलेट और बेसमेंट झिल्ली (जैसे, मैट्रीगेल) के मिश्रण से गुंबद बनाने के तीन तरीकों का वर्णन करती है जैसा कि चित्रा 1 और चित्रा 2में दिखाया गया है। चरण 2-4 में, तहखाने झिल्ली के ठोसकरण को रोकने के लिए कोशिकाओं और तहखाने झिल्ली को बर्फ पर रखा जाना चाहिए।

  1. 24 अच्छी प्लेट सेट(टेबल 3)के लिए तहखाने झिल्ली (जैसे, 40 माइक्रोन) की उचित मात्रा में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें।
  2. यह सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें कि कोशिकाओं को तहखाने झिल्ली में अच्छी तरह से निलंबित कर दिया जाता है।
  3. पूर्व गर्म ऊतक संस्कृति प्लेट के केंद्र में सेल-बेसमेंट झिल्ली मिश्रण (और वैकल्पिक 10 माइक्रोन ऑफ एडडीएमईएम पूर्ण मीडिया) की उचित मात्रा(टेबल 3)पिपेट करें।
  4. प्लेट को उलटा और तुरंत प्लेट को 15 मिन के लिए 5% सीओ2,37 डिग्री सेल्सियस पर सेट सीओ2 सेल कल्चर इनक्यूबेटर में उल्टा रखें। यह तहखाने झिल्ली जमना करने की अनुमति देते हुए प्लेट के नीचे बसने और पालन करने से कोशिकाओं को रोकता है।
  5. प्रत्येक कुएं में 10 माइक्रोएम वाई-27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड युक्त पूर्व-गर्म माध्यम की उपयुक्त मात्रा(तालिका 3)पिपेट करें।
  6. प्लेट को सही दिशा में सीओ2 सेल कल्चर इनक्यूबेटर (5% सीओ2,37 डिग्री सेल्सियस) के अंदर रखें।
  7. हर 3-4 दिन में मीडिया बदलें। 5-7 दिनों के बाद, संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए 10 माइक्रोएम वाई-27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड के बिना संस्कृति माध्यम का उपयोग करें।

4. प्लेट पर एक संलग्न गोल गुंबद से एक अस्थायी गुंबद बनाना

  1. चरण 3.7 के बाद, एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करके गुंबद को अलग करें।

5. फ्लोटिंग मोतियों का निर्माण

नोट: तहखाने झिल्ली, मीडिया, और ऑर्गेनॉइड के मिश्रण के बाद से इस प्रोटोकॉल को फ्लोटिंग मोतियों का नाम दिया गया है।

  1. पैराफिन फिल्म का 2 इंच x 4 इंच का टुकड़ा काट लें।
  2. पैराफिन फिल्म को 1000 माइक्रोन प्लास्टिक पिपेट टिप बॉक्स से एक खाली टिप-होल्डिंग रैक के डिवोट के शीर्ष पर रखें।
  3. धीरे पैराफिन फिल्म पर नीचे प्रेस करने के लिए एक दस्ताने सूचकांक उंगली का उपयोग कर divots का पता लगाने लेकिन पैराफिन फिल्म के माध्यम से तोड़ने के बिना ।
  4. 70% इथेनॉल के साथ पैराफिन फिल्म स्प्रे और सेल संस्कृति हुड में यूवी लैंप चालू करने के लिए तैयार पैराफिन फिल्म को कम से कम 30 मिन के लिए निष्फल करें।
  5. कोशिकाओं और तहखाने झिल्ली के 20 μL का मिश्रण तैयार करें। सीडिंग घनत्व प्रति गुंबद 50,000 - 250,000 कोशिकाएं हो सकती हैं।
  6. चरण 1 या 2 से संसाधित कोशिकाओं के मिश्रण को पिपेट करें, और तैयार पैराफिन फिल्म में गठित डिवोट के मोल्ड में तहखाने झिल्ली का 20 माइक्रोन।
  7. तहखाने झिल्ली में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और तैयार पैराफिन फिल्माए गए डिवोट में सेल निलंबन को पिपेट करें।
  8. जम मोतियों और पैराफिन फिल्म को 6-वेल प्लेट में रखें। एक अच्छी तरह से एक 6 अच्छी तरह से थाली में 5 मोती तक फिट कर सकते हैं ।
  9. प्री-वार्म्ड मीडियम का पिपेट 3-5 एमएल जिसमें 10 माइक्रोएम वाई-27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड होता है, जबकि धीरे-धीरे पैराफिन फिल्म के मोतियों को ब्रश करते हैं।
    नोट: न्यूनतम मात्रा के रूप में, 3 मिलीएल की सिफारिश की जाती है। प्रति अच्छी तरह से अधिकतम मोतियों (एन =5) के लिए, मध्यम के 5 मिलील की सिफारिश की जाती है।
  10. प्लेट को सीओ2 इनक्यूबेटर (5% सीओ2,37 डिग्री सेल्सियस) के अंदर रखें।
  11. हर 3-4 दिन में ऑर्गेनॉइड मीडिया बदलें। 5-7 दिनों के बाद, संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए 10 माइक्रोएम वाई-27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड के बिना संस्कृति माध्यम का उपयोग करें।

6. वीवो ऑर्गेनॉइड इमेज में माइक्रोस्कोप8 का उपयोग करके सिलाई

नोट: कुछ माइक्रोस्कोप सेल प्लेट (किनारे की दीवार) के बाहरी परिधि तक पहुंचने में असमर्थ हैं; इसलिए, हम छवि सिलाई करते समय कोशिका प्लेट की परिधि के करीब कुओं का उपयोग करने का सुझाव देते हैं।

  1. सेल कल्चर प्लेट को कीसेंस माइक्रोस्कोप में प्लेट होल्डर में ऊपर की स्थिति में रखें।
  2. लेंस को लक्ष्य गुंबद के केंद्र पर रखें।
  3. फ्रेम की संख्या का चयन करके स्वचालित सिलाई प्रक्रिया स्थापित करें। उदाहरण के लिए, 9 छवियों या कुल 25 छवियों को उत्पन्न करने के लिए 3 x 3 या 5 x 5 चुना जा सकता है।
  4. इमेजिंग प्रक्रिया शुरू करने के लिए कैप्चर बटन दबाएं।
  5. छवि दर्शक सॉफ्टवेयर खोलें और चरण 4 द्वारा ली गई छवियों के एक समूह को लोड करें।
  6. इमेज स्टिचिंग पर क्लिक करें हाई-रेजोल्यूशन सिले हुए इमेज बनाने के लिए।
    नोट: कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने के लिए धारावाहिक 9 या 25 छवियों पर कब्जा करना या तो मैनुअल या स्वचालित सेट अप द्वारा किया जा सकता है।

7. हिटोलॉजी के लिए ऑर्गेनोइड प्रोसेसिंग: अगारोज स्पिन डाउन विधि

नोट: यह प्रोटोकॉल Vlachogiannis एट अल7द्वारा पिछले प्रकाशन से अनुकूलित है । हमने ऑर्गनॉइड की सभी आबादी को सफलतापूर्वक एम्बेड करने के लिए अगारोज एम्बेडिंग से जुड़े एक कदम को जोड़ा है ।

  1. मौजूदा मीडिया को कुएं से हटा दें। तहखाने झिल्ली गुंबदों को एस्पिरेट न करने के लिए सावधान रहें।
  2. चरण 1 से हटाए गए मीडिया की मात्रा के बराबर (चरण 1 से हटाए गए मीडिया की मात्रा के बराबर) सेल रिकवरी समाधान की मात्रा जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. एक पिपेट का उपयोग करके तहखाने झिल्ली गुंबद को उखाड़ फेंकना और एक पिपेट टिप का उपयोग करके तहखाने झिल्ली गुंबद को कुचलना। 1.5 मिलील ट्यूब में अलग-अलग गुंबद और सेल रिकवरी समाधान एकत्र करें।
  4. 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
  5. अधिनेता (सेल रिकवरी सॉल्यूशन) निकालें। अंतिम पैलेटिंग चरण में ऑर्गनॉइड की उपस्थिति की पुष्टि होने पर अंत तक सभी सुपरनेटेंट को अलग-अलग ट्यूबों में सहेजें।
  6. ठंडे पीबीएस की वांछित मात्रा(टेबल 3)जोड़ें और धीरे-धीरे गोली को परेशान करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  7. 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
  8. अधिस्थान (पीबीएस) निकालें।
  9. एक मिलान मात्रा में गोली ठीक (जैसे, 24 अच्छी तरह से थाली संस्कृति की स्थिति से एक गोली के लिए 500 μL, टेबल 3)कमरे के तापमान पर 60 min के लिए 4% पीएफए की।
  10. निर्धारण के बाद, 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
  11. अधिस्थान (पीएफए) निकालें।
  12. मिलान की मात्रा के साथ धोएं (उदाहरण के लिए, 24 अच्छी तरह से प्लेट संस्कृति की स्थिति से एक गोली के लिए 500 माइक्रोन, पीबीएस के टेबल 3)और 300 x g पर अपकेंद्री और 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
  13. गर्म अगारोज (पीबीएस में 2% अगारोज) तैयार करें।
    नोट: यहां, जमे हुए वर्गों के लिए सेल छर्रों प्रोटोकॉल 7 में आगे कदम के बिना सीधे OCT परिसर के २०० μL में निलंबित किया जा सकता है ।
  14. अगारोज (पीबीएस में 2%) के 200 माइक्रोन में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें।
    1. agarose जोड़ने के तुरंत बाद, धीरे से 1.5 मिलीग्राम ट्यूब की दीवार से सेल गोली अलग 25 जी सुई 1 mL सिरिंज से जुड़ी का उपयोग कर । जैसा कि चित्रा 3में दिखाया गया है, यदि सेल पैलेट शारीरिक रूप से 1.5 मिलीएल ट्यूब की दीवार से अलग नहीं है, तो अगारोज एम्बेडिंग प्रक्रिया के दौरान सेल पैलेट के सभी या हिस्से को खोने का खतरा है।
  15. जब तक पीबीएस में 2% agarose पूरी तरह से जम गया है रुको।
  16. 1.5 मिलीग्राम ट्यूब से 1.5 मिलीग्राम सिरिंज से जुड़ी 25 जी सुई का उपयोग करके जम अगारोज ब्लॉक को अलग करें।
  17. सेल पैलेट युक्त अलग अगारोज ब्लॉक को एक नए 1.5 एमएल ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
  18. 70% EtOH के साथ ट्यूब भरें और ऊतक निर्जलीकरण और पैराफिन एम्बेडिंग के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल का उपयोग करआगे बढ़ें।

8. ऑर्गनॉइड की हिस्टोलॉजी और इम्यूनोफ्लोरेसेंट साइटोकेमिस्ट्री (आईएफसी)

  1. हिटोलॉजी या आईएफसी के लिए स्लाइड (एस) का चयन करें।
  2. धुंधला प्रक्रिया शुरू करने से पहले, पता लगाएं कि कोशिकाएं स्लाइड पर कहां स्थित हैं और मार्कर का उपयोग करके स्लाइड पर कोशिकाओं के चारों ओर एक चक्र खींचें।
  3. स्लाइड के किनारे या बोर्डर के चारों ओर परिधि खींचें और जहां हलकों को अपने स्थानों को रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोगशाला नोटबुक में स्लाइड पर स्थित हैं।
  4. वांछित धुंधला प्रदर्शन करें।
    नोट: इस प्रक्रिया के दौरान, चिह्नित सर्कल गायब हो जाते हैं क्योंकि नियमित निर्माता रसायनों के लिए प्रतिरोधी नहीं होता है। यहां तक कि कुछ हिटोलॉजी स्थायी मार्कर धुंधला प्रक्रिया के दौरान मिट सकता है।
  5. धुंधला प्रक्रिया के बाद, स्लाइड पर कोशिकाओं के स्थानों को खोजने के लिए प्रयोगशाला नोटबुक में ड्राइंग पर स्लाइड रखें।

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Representative Results

3डी ऑर्गेनॉइड सफलतापूर्वक हड्डी मेटास्टैटिक प्रोस्टेट कैंसर (बीएमपीसी) के एक रोगी व्युत्पन्न विद्वेष (पीडीएक्स) मॉडल के साथ-साथ सीधे रोगी हड्डी मेटास्टैटिक प्रोस्टेट कैंसर ऊतक(चित्रा 4)से स्थापित किए गए थे। संक्षेप में, बीएमपीसी के हमारे PDX मॉडल अंतर-femoral (IF) पुरुष Rag2 में ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन द्वारा स्थापित किया गयाथा-/-सी/-चूहों और फिर PDX ट्यूमर काटा और संसाधित के रूप में इस पांडुलिपि में वर्णित है । जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है, पीसीएसडी श्रृंखला से पीडीएक्स ट्यूमर ऊतकों के परिणामस्वरूप 3डी ऑर्गेनॉइड अंतर फेनोटाइप के साथ होते हैं जो इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके बनने वाले अल्सर, स्फेरॉइड और उच्च जटिलता ऑर्गेनॉइड के रूप में प्रकट होते हैं।

25 उच्च संकल्प 10x आवर्धन छवियों से एक सिले छवि तहखाने झिल्ली और ऑर्गेनोइड(चित्र 5)का एक पूरा गुंबद दिखाया । इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, किसी के पास कोशिकाओं या सेल समूहों को सॉर्ट करने का विकल्प होता है जो एक निश्चित आकार से बड़े होते हैं या मैन्युअल रूप से स्फेरॉइड या अल्सर का चयन करते हैं।

ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों के एम्बेड करने के लिए कदम और स्लाइड पर अनुभागित ऑर्गेनॉइड के स्थान को लेबल करने के टिप्स ऑर्गनॉइड पर आईएफसी प्रदर्शन करने की सफलता को बढ़ाते हैं, खासकर जब ऑर्गेनॉइड के नमूनों में वांछित की तुलना में कम सेल घनत्व होता है। चित्रा 6 साइटोकेराटिन 5 (सीके5, बेसल एपिथेलियल सेल मार्कर), साइटोकेराटिन 8 (सीके 8, ल्यूमिनल एपिथेलियल सेल मार्कर) और डीपीआई को लक्षित करने वाले ऑर्गेनॉइड के 5 माइक्रोन मोटी पैराफिन सेक्शन पर आईएफसी का एक उदाहरण दिखाता है।

Figure 1
चित्रा 1: 3 डी सुसंस्कृत ऑर्गेनॉइड के लिए स्थापना और लक्षण वर्णन या तो रोगी ट्यूमर ऊतकों या रोगी व्युत्पन्न विद्वेष (पीडीएक्स) ट्यूमर ऊतकों से प्राप्त होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सेल छर्रों और तहखाने झिल्ली का मिश्रण बनाने के लिए तरीके। एक संलग्न गुंबद(ए),एक अस्थायी गुंबद(ख)और फ्लोटिंग मोतियों(सी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सफल अगारोज एम्बेडिंग के लिए एक महत्वपूर्ण कदम। 1.5 मिलीएल ट्यूब की दीवार से सेल पैलेट को अलग करने की प्रक्रिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: पीसीएसडी पीडीएक्स ट्यूमर की एक श्रृंखला से ऑर्गनॉइड के अंतर फेनोटाइप, जिसमें एकल कोशिकाएं, अल्सर, स्फेरॉइड और उच्च जटिलता ऑर्गेनॉइड शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: कुल 25 उच्च संकल्प छवियों से एक कच्ची सिले छवि का उदाहरण और कोशिकाओं की संख्या की गिनती या कोशिकाओं के क्षेत्र को मापने के लिए अनुवर्ती विश्लेषण के लिए इसके आवेदन/ कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: छवि दिखा CK5 और CK8 IFC दाग PCSD1 ऑर्गनॉइड (पैराफिन अनुभाग की 5 μm मोटाई) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

स्टॉक कंपोनेंट अंतिम एकाग्रता Vol (एमएल) 500 मिलीलीटर समाधान के लिए आवश्यक
1000 एमएम हेप्स 10 एमएम 5
200 एमएम ग्लूटामैक्स 2 एमएम 5
100x पेन-स्ट्रीप 1x 5
adDMEM/F12 +/+/+ 485

तालिका 1: adDMEM/F12 +/+/+ तैयारी । इस तालिका को पहले ड्रोस्ट एट अल5द्वारा प्रकाशित किया गया है ।

स्टॉक कंपोनेंट अंतिम एकाग्रता 50 mL समाधान के लिए Vol (μL) की जरूरत Vol (μL) 25 mL समाधान के लिए आवश्यक
50x B27 50x पतला 1000 500
500 एमएम एन-एसिटाइलसिस्टीन 1.25 एमएम 125 62.5
0.5 मिलीग्राम/एमएल ईजीएफ 5 एनजी/एमएल 0.5 0.3
100 यूजी/एमएल नोगिन 100 एनजी/एमएल 50 25
आर-स्पोंडिन 1 10% वातानुकूलित माध्यम 5000 2500
5 एमएम A83-01 500 एनएम 5 2.5
0.1 मिलीग्राम/mL FGF10 10 एनजी/एमएल 5 2.5
50 μg/mL FGF2 5 एनजी/एमएल 5 2.5
10 एमएम प्रोस्टाग्लैंडिन E2 1 माइक्रोन 5 2.5
1M निकोटिनमाइड 10 एमएम 500 250
30 एमएम SB202190 10 माइक्रोन 16.7 8.4
एफबीएस 10% 5000 2500
1 माइक्रोन डीएचटी 1 एनएम 50 25
adDMEM/F12 +/+/+ 50 मिलीलीटर तक लाओ 25 लाख तक लाओ
100 एमएम वाई-27632 डिहाइड्रोक्लोराइड 10 माइक्रोन 5 2.5

तालिका 2: सी/एस ह्यूमन मीडिया + 10% एफबीएस के लिए घटक। इस तालिका को पहले ड्रोस्ट एट अल5द्वारा प्रकाशित किया गया है ।

संस्कृति प्लेट सीडिंग घनत्व (कोशिकाएं) बेसमेंट झिल्ली मात्रा (μL) मध्यम (μL)
48 अच्छी तरह से 25,000-50,000 20 250
24 अच्छी तरह से 50,000-250,000 40 500
6 अच्छी तरह से 50,000-250,000 40 2,000

तालिका 3: सीडिंग घनत्व, तहखाने झिल्ली की मात्रा, और एक गुंबद के लिए मध्यम मात्रा की आवश्यकता है। इस तालिका को ड्रोस्ट एट अल5द्वारा पिछले प्रकाशन से संशोधित किया गया है।

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Discussion

रोगी हड्डी मेटाटैसिस प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं से प्राप्त 3 डी ऑर्गेनॉइड अभी भी अपेक्षाकृत दुर्लभ हैं। यहां, हम बीएमपीसी के सफलतापूर्वक स्थापित धारावाहिक 3डी रोगी व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड (पीडीओ) के लिए रणनीतियों और आगे अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, आईएफसी और आईएचसी विश्लेषण के लिए कम सेल घनत्व वाले नमूनों में ऑर्गेनॉइड को सुरक्षित करने के लिए प्रोटोकॉल वर्णित हैं। पुटी, स्फेरॉइड और अधिक जटिल ऑर्गेनॉइड के रूप में अंतर फेनोटाइप इंगित करता है कि यह प्रोटोकॉल संस्कृति की स्थिति प्रदान करता है जो रोगियों में विषम ट्यूमर सेल आबादी को उनके सेलुलर फेनोटाइप और संरचना को बनाए रखने की अनुमति देता है। इस प्रकार, यहां वर्णित संस्कृति की स्थिति, जिसे ड्रोस्ट एट अल से अनुकूलित किया गया था।5 एफबीएस सीरम पूरकता के साथ संशोधित किया गया था, रोगी बीएमपीसी-व्युत्पन्न कोशिकाओं की संस्कृतियों के लिए इष्टतम दिखाया गया है ताकि वे अपने अंतर-विषय और अंतर-विषय विषमता (तैयारी में पांडुलिपि) को बनाए रखें।

हमारा अनुकूलित प्रोटोकॉल 3डी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए प्राथमिक या पीडीएक्स ट्यूमर ऊतकों से सीमित प्रारंभिक सामग्री से कई अंत बिंदुओं के साथ एक प्रयोगात्मक सेट अप के लिए व्यावहारिक है। सामान्य तौर पर, रोगी प्राथमिक ट्यूमर ऊतकों से 3 डी ऑर्गेनॉइड की स्थापना पीडीएक्स ट्यूमर ऊतकों से 3 डी ऑर्गेनॉइड की स्थापना की तुलना में कम सफल होती है। इसलिए, पीडीएक्स ट्यूमर की तुलना में रोगी प्राथमिक ट्यूमर ऊतकों से 3डी ऑर्गेनॉइड की स्थापना के लिए कोशिकाओं का उच्च सीडिंग घनत्व (चार गुना अधिक) रखने की सिफारिश की जाती है। ट्यूमर ऊतक प्रसंस्करण के दौरान सेल यील्ड बढ़ाने के लिए एक विधि फिर से छलनी के माध्यम से फ़िल्टर सेल निलंबन पारित करके 70 माइक्रोन सेल छलनी के शीर्ष पर किसी भी ट्यूमर ऊतक बचे हुए को ठीक करना है।

3डी ऑर्गेनॉइड कल्चर बनाने के लिए तीन अलग-अलग तरीकों(चित्रा 2)का उपयोग किया जा सकता है और अनुवर्ती अंत बिंदु विश्लेषण के आधार पर आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि कोई 3डी ऑर्गेनॉइड स्थापित करने के बाद सिले हुए चित्रों की इच्छा रखता है, तो एक संलग्न गुंबद की अत्यधिक सिफारिश की जाती है क्योंकि छवि सिलाई प्रक्रिया के लिए वांछित संख्या छवियों (या तो 9 या 25) प्राप्त करने के लिए सूक्ष्म उद्देश्य के धारावाहिक आंदोलन की आवश्यकता होती है। इस प्रक्रिया के परिणामस्वरूप सेल कल्चर प्लेट के धारक को एक सूक्ष्म कंपन होता है। दोनों प्रकार के फ्लोटिंग गुंबद छवि प्राप्त करते समय कंपन के कारण स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ेंगे। इसके अलावा, दोनों प्रकार के फ्लोटिंग गुंबदों को आसानी से एक अच्छी तरह से दूसरे में स्थानांतरित किया जा सकता है, जिससे उन्हें 3डी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों और अलग कुओं में अनुयायी कोशिकाओं की स्थापना के बाद अनुयायी कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति के लिए उपयुक्त बना दिया जा सकता है। संलग्न गुंबद और संलग्न होने से जारी फ्लोटिंग गुंबद को 10 सप्ताह तक ऑर्गेनॉइड बनाए रखने के लिए दिखाया गया है। दिलचस्प बात यह है कि फ्लोटिंग मोतियों की विधि से एक फ्लोटिंग गुंबद को 4 महीने तक ऑर्गेनॉइड बनाए रखने के लिए दिखाया गया है। हमारे प्रोटोकॉल में शुरू किए गए तहखाने झिल्ली क्षेत्रों का उत्पादन करने के लिए फ्लोटिंग मोतियों की विधि में अधिक कदम और कौशल शामिल हैं लेकिन एक दीर्घकालिक संस्कृति के लिए विचार किया जा सकता है। समानांतर रूप से, विभिन्न ट्यूमर और मेटास्टैसिस से 3 डी ऑर्गेनॉइड की स्थापना के लिए उनके उपयोग के बावजूद, डोमिंग विधि की भूमिका और ऑर्गेनोइड गठन पर तहखाने झिल्ली आकार गहराई से निर्धारित नहीं किया गया है। इस लिहाज से जब अन्य दो तरीके असफल रहे हों तो पैराफिन फिल्म विधि को इस्तेमाल के लिए माना जा सकता है ।

सभी तीन अलग-अलग तरीकों के लिए, यह प्रोटोकॉल मीडिया की कम मात्रा और पुनर्निलंबन प्रक्रिया के लिए बेसमेंट झिल्ली की अधिक मात्रा का उपयोग करने की सिफारिश करता है क्योंकि गुंबद संस्कृति में लंबे समय तक चलेंगे। एक गुंबद मीडिया और तहखाने झिल्ली के 1:4 अनुपात के साथ बनता है। ध्यान दें, यह विधि कोशिका निलंबन को ऊपर और नीचे पाइपकर करते समय बुलबुले के गठन को बढ़ाती है क्योंकि मीडिया की अतिरिक्त मात्रा तहखाने झिल्ली की चिपचिपाहट को दरकिनार नहीं करती है। इसलिए, 1.5 मिलील ट्यूब स्थापित करने की सिफारिश की जाती है ताकि एक 1.5 मीटर ट्यूब में कई गुंबदों के लिए एक सेल पैलेट होने के बजाय प्रत्येक गुंबद पर एक सेल पैलेट हो। ऐसा करने में, एक गुंबद के लिए एक ट्यूब में बुलबुले के गठन से अन्य गुंबदों को क्रमिक रूप से प्रभावित नहीं किया जाएगा। यदि संस्कृति की स्थिति की अवधि पहले अनुकूलित की गई है और इसे कम (एक महीने तक) माना जाता है, तो तहखाने झिल्ली को तहखाने झिल्ली के चिपचिपाहट मुद्दे को दरकिनार करने के लिए अधिक पतला किया जा सकता है। कई कुओं के लिए एक सेल पैलेट रिस्पेंशन को एक ट्यूब में तैयार किया जा सकता है, जो सेल हानि और परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए तहखाने झिल्ली की वांछित मात्रा में मीडिया की उच्च मात्रा का उपयोग कर सकता है।

पाइपिंग प्रक्रिया के दौरान बुलबुला गठन को कम करने के लिए, कोशिकाओं, मीडिया और तहखाने झिल्ली मिश्रण की वास्तविक मात्रा की तुलना में कम मात्रा में पिपेट करें। उदाहरण के लिए, 24 अच्छी प्लेटों के भीतर एक गुंबद के लिए, तहखाने झिल्ली के 40 μL और adDMEM पूरा मीडिया के 10 μL तक सेल गोली के साथ मिलाया जाता है। इस मामले में, बुलबुला गठन को कम करने के लिए पाइप्ट को 50 माइक्रोन के बजाय 40 माइक्रोन लंकेल की मात्रा को संभालने के लिए सेट किया जा सकता है। इस दूसरी विधि के लिए, सेल हानि और परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए कई कुओं के लिए सेल पैलेट रिस्पेंशन को एक ट्यूब में तैयार किया जा सकता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तहखाने झिल्ली की तरल स्थिति अक्सर चर होती है। इसलिए, डोमिंग प्रक्रिया के लिए तहखाने झिल्ली के नए बैचों का परीक्षण करने की आवश्यकता है। यदि तहखाने झिल्ली सामान्य से अधिक चिपचिपा है, तो सेल पैलेट और तहखाने झिल्ली के मिश्रण को पतला करने के लिए अतिरिक्त 10 μL adDMEM पूर्ण मीडिया (चरण 1 में लिखा विवरण) जोड़ा जा सकता है।

यहां, हम वांछित प्रक्रियाओं को सफलतापूर्वक पूरा करने के लिए विस्तृत सुझावों के साथ सुसंस्कृत 3 डी ऑर्गेनॉइड को स्थापित करने, छवि और प्रक्रिया करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हमारी पांडुलिपि में पेश किए गए 3डी ऑर्गेनॉइड के लिए संस्कृति मीडिया विशेष रूप से प्रोस्टेट-व्युत्पन्न कोशिकाओं के लिए है। हालांकि, हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित अन्य विवरण विभिन्न प्रकार के ट्यूमर ऊतकों और मेटास्टैटिक साइटों पर लागू होते हैं।

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Disclosures

सांघी ली और क्रिस्टीना एएम जैमीसन जोव मेथड्स कलेक्शन के गेस्ट एडिटर हैं ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को लियो और ऐनी अल्बर्ट चैरिटेबल फाउंडेशन और जेएम फाउंडेशन ने समर्थन दिया था। हम कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय सैन डिएगो मूर्स कैंसर सेंटर के सदस्यों, डॉ जिंग यांग और डॉ Kay टी येंग हमें उनके माइक्रोटोम और रांदल फ्रेंच, तकनीकी विशेषज्ञता के लिए सर्जरी विभाग के उपयोग की अनुमति के लिए शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Pipettman Gilson F123602
1 mL Syringe BD Syringe 329654
1.5 mL tube Spectrum Lab Products 941-11326-ATP083
25G Needle BD PrecisionGlide Needle 305122
4% Paraformaldehyde (PFA) Alfa Aesar J61899
70% Ethanol (EtOH) VWR BDH1164-4LP
A83-01 Tocris Bioscience 2939
Accumax Innovative Cell Technologies, Inc. AM105
adDMEM Life Technologies 12634010
Agarose Lonza 50000
Antibody -for Cytokeratin 5 Biolegend 905901
Antibody for Cytokeratin 8 Biolegend 904801
B27 Life Technologies 17504044
Bioluminescence imaging system, IVIS 200 Perkin Elmer Inc IVIS 200
Cell Culture Plate - 24 well Costar 3524
Cell Culture Plate - 48 well Costar 3548
Cell Culture Plate - 6 well Costar 3516
Cell Dissociation Solution, Accumax Innovative Cell Technologies, Inc. AM105
Cell Recovery Solution Corning 354253
Cell Scraper Sarstedt 83.180
Cell Strainer Falcon (Corning) 352350
CO2 incubator Fisher Scientific 3546
DAPI Vector Vectashield H-1200
DHT Sigma-Aldrich D-073-1ML
dPBS Corning/Cellgro 21-031-CV
EGF PeproTech AF-100-15
FBS Gemini Bio-Products 100-106
FGF10 PeproTech 100-26
FGF2 PeproTech 100-18B
Forceps Denville Scientific S728696
Glutamax Gibco 35050-061
HEPES Gibco 15630-080
LS Columns Miltenyi 130-0420401
Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator Miltenyi 130-090-976
Marker VWR 52877-355
Matrigel (Growth Factor Reduced) Mediatech Inc. (Corning) 356231
Matrigel (High Concentration) BD (Fisher Scientific) CB354248
Microscope Imaging Software, Keyence BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software)
Microscope, Keyence BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)
Mouse Cell Depletion Kit Miltenyi 130-104-694
N-Acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-5G
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636-100G
Noggin PeproTech 120-10C
OCT Compound Tissue-Tek 4583
Parafilm American National Can N/A
Pen-Strep Mediatech Inc. (Corning) 30-002-CI-1
Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) Fisherbrand Redi-Tip 21-197-85
Plunger (from 3 mL syringe) BD Syringe 309657
Prostaglandin E2 Tocris Bioscience 2296
R-Spondin 1 Trevigen 3710-001-01
SB2021190 Sigma-Aldrich S7076-25MG
Small Table Top Centrifuge ThermoFisher Scientific 75002426
Water Bath Fisher Sci 2320
Y-27632 Dihydrochloride Abmole Bioscience M1817

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References

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Lee, S., Burner, D. N., Mendoza, T.… More

Lee, S., Burner, D. N., Mendoza, T. R., Muldong, M. T., Arreola, C., Wu, C. N., Cacalano, N. A., Kulidjian, A. A., Kane, C. J., Jamieson, C. A. M. Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts. J. Vis. Exp. (156), e60367, doi:10.3791/60367 (2020).

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