Summary
Tredimensionella kulturer av patienten BMPC exemplar och xenografts av ben ögonbevarande prostatacancer upprätthålla funktionella heterogenitet av deras ursprungliga tumörer som resulterar i cystor, sfäroider och komplexa, tumör-liknande organoider. Detta manuskript ger en optimeringsstrategi och protokoll för 3D-kultur av heterogena patient härledda prover och deras analys med IFC.
Abstract
Tredimensionell (3D) kultur av organoider från tumörexemplar av mänskliga patienter och tålmodiga xenograft (PDX) modeller av prostatacancer, kallad patient-härledda organoider (SUB), är en ovärderlig resurs för att studera mekanismen för tumorigenes och metastasering av prostatacancer. Deras främsta fördel är att de upprätthåller den distinkta genomiska och funktionella heterogeniteten hos den ursprungliga vävnaden jämfört med konventionella cellinjer som inte gör det. Dessutom kan 3D-kulturer av SUB användas för att förutsäga effekterna av läkemedelsbehandling på enskilda patienter och är ett steg mot personlig medicin. Trots dessa fördelar använder få grupper rutinmässigt denna metod delvis på grund av den omfattande optimering av SUB-kulturförhållanden som kan krävas för olika patientprover. Vi har tidigare visat att vår prostatacancer ben metastasering PDX modell, PCSD1, sammanfattade motståndet hos givaren patientens ben metastasering till antiandrogen terapi. Vi använde PCSD1 3D organoider för att karakterisera ytterligare mekanismerna för antiandrogen resistens. Efter en översikt över för närvarande publicerade studier av PDX- och SUB-modeller beskriver vi ett steg-för-steg-protokoll för 3D-kultur av SUB med hjälp av välvda eller flytande källare membran (t.ex. Matrigel) sfärer i optimerade kulturförhållanden. In vivo stygn avbildning och cellbearbetning för histologi beskrivs också. Detta protokoll kan optimeras ytterligare för andra tillämpningar, inklusive västra blot, co-kultur, etc. och kan användas för att utforska egenskaper hos 3D odlade SUB avser läkemedelsresistens, tumorigenesis, metastasering och terapi.
Introduction
Tredimensionella odlade organoider har uppmärksammat sin potential att sammanfatta in vivo arkitektur, cellulärfunktionalitet och genetisk signatur av deras ursprungliga vävnader1,2,3,4,5. Viktigast av allt, 3D organoider som fastställts från patienten tumör vävnader eller patienten härledda xenograft (PDX) modeller ger ovärderliga möjligheter att förstå mekanismer för cellulärsignalering på tumorigenesis och att bestämma effekterna av läkemedelsbehandling på varje cell population6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 utvecklat ett standardprotokoll för inrättande av mänskliga och mus prostata organoider, som har antagits allmänt inom urinologi. Dessutom har betydande ansträngningar ägnats åt ytterligare karakterisering av 3D-organoider och att förstå de detaljerade mekanismerna för tumorigenesis och metastasering4,12,14,15. Förutom det tidigare etablerade och allmänt accepterade protokollet för 3D-organoider kulturer, beskriver vi här ett steg-för-steg-protokoll för 3D-kulturen i SUB med hjälp av tre olika doming metoder i optimerade kulturförhållanden.
I detta manuskript etablerades 3D-organoider som en ex vivo-modell av metastaserad prostatacancer (BMPC). De celler som används för dessa kulturer kom från Prostatacancer San Diego (PCSD) serien och härrördirekt från patienten prostatacancer ben ögonbevarande tumörvävnader (PCSD18 och PCSD22) eller patienten härrör xenograft (PDX) tumör modeller (prover som heter PCSD1, PCSD13 och PCSD17). Eftersom spontana benmetastaser av prostatacancerceller är sällsyntagtiskti genetiskt modifierade musmodeller 16 använde vi direkt intrafemoral (IF) injektion av mänskliga tumörceller i manliga Rag2-/-γc-/- möss för att fastställa PDX-modellerna av benmetastaserad prostatacancer17.
När 3D organoider är etablerade från heterogena patienten tumörceller eller patienten härrör xenografts, är det viktigt att bekräfta sin identitet som prostata tumörceller och att bestämma deras fenotyper i 3D organoid kulturer. Immunofluorescenskemi (IFC) möjliggör visualisering av proteinuttryck på plats i varje cell, vilket ofta anger de potentiella funktionerna för specifika cellpopulationer2,4. I allmänhet är IFC-protokoll för en stor majoritet av prover, inklusive vävnader och celler enkla och helt optimerade. Emellertid, celltätheten och antalet organoider kan vara betydligt lägre än den konventionella kulturen. Därför kräver IFC-protokollet för organoider ytterligare åtgärder för att säkerställa korrekt bearbetning och inbäddning i paraffin för alla organoider i proverna. Vi beskriver ytterligare steg för en agarose pre-inbäddning process och tips för att märka platsen för sektionerade organoider på bilden som ökar framgången för IFC på organoider särskilt när proverna av organoider har lägre celltäthet än önskat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie genomfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i guiden för University of California San Diego (UCSD) Institutional Review Board (IRB). IRB #090401 Godkännande mottogs från UCSD Institutional Review Board (IRB) för att samla in kirurgiskt prov från patienter för forskningsändamål. Ett informerat samtycke erhölls från varje patient och ett kirurgiskt ben prostatacancer metastasering exemplar erhölls från ortopediska reparation av en patologisk fraktur i lårbenet. Djurprotokoll utfördes under University of California San Diego (UCSD) djurskydd och institutionella Animal Care and Use Committee (IACUC) godkänt protokoll #S10298. Celler från mekaniskt och enzymatiskt dissociated patient tumörvävnad injicerades intrafemorally i 6 till 8 veckor gamla manliga Rag2-/-;γc-/- möss som tidigare beskrivits17. Xenograft tumör volym fastställdes med hjälp av en in vivo bioluminescens imaging system och caliper mätningar. Vid tumörtillväxt upp till 2,0 cm (den maximala tillåtna storleken godkänd av IACUC), tumören skördades för 3D organoider anläggning.
Figur 1 visar arbetsflödet för att upprätta 3D-organoider och ett protokollnummer för varje steg i försöksprocedurerna.
1. Bearbetning av patienter som härlett xenograft (PDX) tumörvävnader
OBS: Detta är ett första steg för organoid anläggning för en tumör som härrör från en xenograft mus modell. Detta protokoll är anpassat från en tidigare publikation av Drost et al.5 och vi har ändrat medievillkoren för att inkludera serum tillskott till organoid media.
- Bearbeta tumörexemplaret enligt beskrivningen nedan.
- Färs tumörprover till 1-3 mm3 stora bitar och smälta proverna med 10 ml celldissociationlösning i 45 min vid rumstemperatur.
- Om du vill avsluta matsmältningen lägger du till 20 ml DMEM-komplett auten i exemplen.
- Filtrera fjädringen genom en 70 μm cellsil. Använd en steril kolvfläns för att trycka på eventuell överblivna vävnad på toppen av 70 μm cellsil.
- Centrifug vid 300 x g i 5 min vid 4 °C.
- Tvätta cellpelleten tre gånger med färska adDMEM kompletta media. Matcha volymen av media för tvätt och resuspension med den volym media som föreslås i tabell 3. Till exempel, för en 24 väl platta kultur villkor, bör volymen för tvätten vara 500 μL.
Obs! Som framgår av tabell 3är protokollet tillämpligt på olika kulturförhållanden. - Bestäm slutliga cellantal med trypanblått färgämne och en hemocytometer.
- Efter att ha fått cellantal, åter avbryta cellpellet i 80 μL av 2% FBS i PBS per 2 x 106 tumörceller.
- Tillsätt 20 μL av Muscellutarmning Cocktail per 2 x 106 tumörceller. Blanda väl och inkubera i 15 min vid 2-8 °C.
- Justera volymen till 500 μL med 2% FBS i PBS buffert per 2 x 106 tumörceller.
OBS: Upp till 1 x 107 tumörceller i 2,5 ml cellsuspension kan bearbetas på en LS kolumn. - Ladda LS-kolumnerna på den magnetiska kolonnavskiljaren och placera ett koniskt 15 ml-rör på ett rack under för att samla in genomströmningen.
- Skölj varje kolumn med 3 ml 2% FBS i PBS buffert. Kassera koniska röret med tvättflödet och byt ut med ett nytt, sterilt koniskt rör på 15 ml.
- Tillsätt cellsuspensionen (upp till 2,5 ml 1 x 107 tumörceller) på kolonnen. Samla genomströmning som kommer att vara berikad med mänskliga tumörceller.
- Tvätta kolonnen två gånger med 1 ml 2% FBS i PBS buffert.
Det är viktigt att utföra tvättsteg så snart kolumnen är tom. Försök också att undvika att bilda luftbubblor.
- Aliquot lämplig volym cellupphängning till ett 1,5 ml-rör för önskad kultur inrättas(tabell 3).
- Centrifug röret 1,5 ml vid 300 x g och 4 °C i 5 min.
- Ta försiktigt bort och kassera supernatanten.
2. Bearbetning av patientens primära tumörvävnader
OBS: Detta är ett första steg för organoid anläggning.
- Följ alla steg 1 utom muscellutarmningsprocessen, vilket inte är nödvändigt för bearbetning av patientens primära tumörvävnader.
3. Bilda en fäst rund kupol på plattan
OBS: Detta manuskript beskriver tre sätt att göra en kupol från en blandning av cellpelleten och källarmembranet (t.ex. Matrigel) enligt figur 1 och figur 2. I steg 2-4 bör cellerna och källarmembranet hållas på is för att förhindra stelning av källarmembranet.
- Omför cellpelleten i lämplig volym av källarmembran (t.ex. 40 μL) för en 24-brunnsplatta (tabell 3).
- Pipette upp och ner försiktigt för att säkerställa att cellerna åter suspenderas väl i källaren membranet.
- Pipette lämplig volym (tabell 3) av cell-källare membran blandningen (och valfri 10 μL adDMEM komplett media) i mitten av den förvärmda vävnad kultur plattan.
- Invertera plattan och placera omedelbart plattan upp och ner i CO 2-cellkulturinkubatoren inställd på 5% CO2, 37 °C i 15 min. Detta förhindrar att cellerna bosätter sig och följer plattanbotten samtidigt som källarmembranet kan stelna.
- Pipette lämplig volym (tabell 3) av förvärmt medium som innehåller 10 μM Y-27632 dihydroklorid i varje brunn.
- Placera plattan höger sida upp inuti CO2 cell kultur inkubator (5% CO2,37 °C).
- Byt media var 3-4 dagar. Efter 5-7 dagar, använd odlingsmedium utan 10 μM Y-27632 dihydroklorid för att upprätthålla kulturerna.
4. Bilda en flytande kupol från en fäst rund kupol på plattan
- Efter steg 3.7, lossa kupolen med hjälp av en cell skrapa.
5. Bilda flytande pärlor
OBS: Detta protokoll heter som flytande pärlor eftersom blandningen av källare membran, media och organoider ser ut som pärlor.
- Skär en 2 tums x 4 tums bit paraffin film.
- Placera paraffinfilmen på toppen av divoterna i ett tomt tip-holdingrack från en 1000 μL plastpipettspetslåda.
- Tryck försiktigt ner på paraffin filmen för att spåra divots med hjälp av en handske pekfinger men utan att bryta igenom paraffin filmen.
- Spraya paraffinfilmen med 70% etanol och slå på UV-lampan i cellkulturhuven för att sterilisera den beredda paraffinfilmen i minst 30 min.
- Förbered en blandning av celler och 20 μl av källarmembran. Sådd densitet kan vara 50.000 - 250.000 celler per kupol.
- Pipette blandningen av celler bearbetas från steg 1 eller 2, och 20 μL av källaren membran i form av divot bildas i den beredda paraffin film.
- Resuspend cellpelleten i källaren membran och pipettcellen fjädring i beredda paraffin filmade divots.
- Placera stelnade pärlor och paraffin film i en 6-brunntallrik. En brunn i en 6-brunnsplatta kan passa upp till 5 pärlor.
- Pipette 3-5 ml förvärmt medium som innehåller 10 μM Y-27632 dihydroklorid i varje brunn medan försiktigt borsta pärlor av paraffin filmen.
Obs! Som en minsta volym rekommenderas 3 ml. För ett maximalt antal pärlor (N= 5) per brunn rekommenderas 5 ml medium. - Placera plattan inuti en CO 2-inkubator (5% CO2, 37 °C).
- Ändra organoid media var 3-4 dagar. Efter 5-7 dagar, använd odlingsmedium utan 10 μM Y-27632 dihydroklorid för att upprätthålla kulturerna.
6. In vivo organoider bildsömmar med mikroskop8
Vissa mikroskop kan inte nå cellplattans yttre omkrets (kantvägg); Därför föreslår vi att du använder brunnarna nära omkretsen av cellplattan vid bildsömmar.
- Placera cellodlingsplattan uppåt i platthållaren i nyckellens mikroskop.
- Placera linsen i mitten av målkupolen.
- Ställ in den automatiska sömmarprocessen genom att välja antal bildrutor. Exempel på exempel kan 3 x 3 eller 5 x 5 väljas för att generera 9 bilder eller 25 bilder totalt.
- Tryck på inspelningsknappen för att initiera bildbehandling.
- Öppna bildvisningsprogrammet och ladda en grupp bilder tagna i steg 4.
- Klicka på Bildsömmar för att skapa en högupplöst sydd bild.
Anmärkningar: Fånga av seriella 9 eller 25 bilder kan utföras antingen genom manuell eller automatisk ställa in för att fokusera cellerna.
7. Organoid bearbetning för histologi: agarose spin down metod
OBS: Detta protokoll är anpassat från en tidigare publikation av Vlachogiannis et al.7. Vi har lagt till ett steg med agarose bädda in för att framgångsrikt bädda in alla populationer av organoider.
- Ta bort befintliga medier från brunnen. Var noga med att inte aspirera källaren membran kupoler.
- Tillsätt en lika (lika med volymen av media som tagits bort från steg 1) volym cellåterställningslösning och inkubera i 60 min vid 4 °C.
- Lossa källaren membran kupolen med hjälp av en pipett och krossa källaren membran kupolen med hjälp av en pipet spets. Samla den dissociated kupolen och cellåterställningslösningen i ett 1,5 ml-rör.
- Centrifug vid 300 x g och 4 °C i 5 min.
- Ta bort supernatant (cellåterställningslösning). Spara alla supernatanter i separata rör fram till slutet när närvaron av organoider bekräftas i det sista pelletarsteget.
- Tillsätt önskad volym (tabell 3) kall PBS och rörförsiktigt upp och ner för att mekaniskt störa pelleten.
- Centrifug vid 300 x g och 4 °C i 5 min.
- Ta bort supernatanten (PBS).
- Fäst pelleten i en matchad volym (t.ex. 500 μL för en pellet från 24-talets brunnsskyddstillstånd, tabell 3) på 4 % PFA i 60 min vid rumstemperatur.
- Efter fixering, centrifug vid 300 x g och 4 °C i 5 min.
- Ta bort supernatanten (PFA).
- Tvätta med matchad volym (t.ex. 500 μL för en pellet från 24-talets odlingstillstånd, tabell 3) för PBS och centrifug vid 300 x g och 4 °C i 5 min.
- Förbered varm agaros (2% agarose i PBS).
OBS: Här kan cellpellets för frysta sektioner tillfälligt upphängas direkt i 200 μl OCT-förening utan ytterligare steg i protokoll 7. - Återsuspendera cellpelleten i 200 μl agaros (2 % i PBS).
- Omedelbart efter att ha tillsatt agaros, lossa försiktigt cellpelleten från väggen på 1,5 ml-röret med hjälp av den 25 G-nål som fästs på 1 ml spruta. Som framgår av figur 3,om cellpelleten inte är fysiskt frikopplad från väggen i 1,5 ml-röret, finns det risk att förlora hela eller delar av cellpelleten under agaroseinbäddningsprocessen.
- Vänta tills 2% agarose i PBS är helt stelnat.
- Lossa det stelnade agarosblocket från 1,5 ml-röret med en 25 G-nål fäst vid 1 ml-sprutan.
- Överför det fristående agaroseblocket som innehåller cellpelleten till ett nytt 1,5 ml-rör.
- Fyll röret med 70% EtOH och fortsätt vidare med det konventionella protokollet för vävnaduttorkning och paraffin inbäddning.
8. Histologi och immunofluorescerande cytokemi (IFC) av organoider
- Markera bilderna för histologi eller IFC.
- Innan du påbörjar färgningsprocessen ska du ta reda på var cellerna finns på bilden och rita en cirkel runt cellerna på bilden med hjälp av en markör.
- Rita omkretsen runt kanten eller styrmannen på bilden och där cirklar finns på bilden i en anteckningsbok för laboratorieinformation för att spela in sina platser.
- Utför önskad färgning.
OBS: Under denna process försvinner markerade cirklar eftersom vanlig tillverkare inte är resistent mot kemikalierna. Även vissa histologi permanenta markörer kan raderas under färgningsprocessen. - Efter färgningsprocessen placerar du bilden över ritningen i laboratorieanteckningsboken för att hitta cellernas placering på bilden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D organoider har framgångsrikt fastställts från en patient som härstammar xenograft (PDX) modell av ben metastaserande prostatacancer (BMPC) samt direkt från patienten ben ögonbevarande prostatacancer vävnad(Figur 4). Kortfattat, våra PDX modeller av BMPC fastställdes genom intra-femorala (IF) injektion av tumörceller i manliga Rag2-/- c-/- möss och sedan PDX tumörer skördades och bearbetas enligt beskrivningen i detta manuskript. Som visas i figur 4,PDX tumörvävnader från PCSD-serien resulterade i 3D organoider med differentiella fenotyper som manifesteras som cystor, sfäroider och högre komplexitet organoider som bildas med hjälp av detta protokoll.
En sydd bild från 25 högupplösta 10x förstoringsbilder visade en hel kupol av källare membran och organoider(figur 5). Med hjälp av bildanalys programvara, har man möjlighet att reda ut celler eller cellkluster som är större än en viss storlek eller att manuellt välja sfäroider eller cystor.
Stegen för agarose inbäddning av organoid kulturer och tips för att märka platsen för sektionerade organoider på bilden öka framgången med att utföra IFC på organoider särskilt när proverna av organoider har en lägre celldensitet än önskat. Figur 6 visar ett exempel på IFC på en 5 μm tjock paraffinsektion av organoider som riktar sig mot cytokeratin 5 (CK5, basal epitelcellmarkör), cytokeratin 8 (CK8, luminal epitelcellmarkör) och DAPI.
Figur 1: Etablering och karakterisering för 3D odlade organoider som härrör antingen från patiententumörvävnader eller patienten härledda xenograft (PDX) tumörvävnader. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Metoder för att bilda en blandning av cellpellets och källarmembran. En fäst kupol (a), en flytande kupol (b) och flytande pärlor (c). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Ett viktigt steg för lyckad agarose inbäddning. En process för att lossa cellpelleten från väggen på 1,5 ml-röret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Differentiella fenotyper av organoider från en serie PCSD PDX tumörer, som omfattar enstaka celler, cystor, sfäroider och högre komplexitet organoider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Exempel på en rå sydd bild från totalt 25 högupplösta bilder och dess tillämpning för en uppföljningsanalys för att räkna antalet celler eller mäta området celler/cellkluster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Bild som visar CK5 och CK8 IFC färgade PCSD1-organoider (5 μm tjocklek paraffinsektion). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lager Komponent | Slutlig koncentration | Vol (ml) som behövs för 500 ml lösning |
| 1000 mM HEPES | 10 mM (på 10 m) | 5 |
| 200 mM Glutamax | 2 mM (mM) | 5 |
| 100x Penna-Strep | 1x (1x) | 5 |
| adDMEM/F12 +/+/+ | 485 |
Tabell 1: adDMEM/F12 +/+/+ Förberedelse. Denna tabell har tidigare publicerats av Drost et al.5.
| Lager Komponent | Slutlig koncentration | Vol (μL) behövs för 50 ml lösning | Vol (μL) som behövs för 25 ml lösning |
| 50x B27 (på 50x) | 50x efterutspädning | 1000 | 500 |
| 500 mM N-acetylcystein | 1,25 mM | 125 | 62.5 |
| 0,5 mg/ml egf | 5 ng/ml | 0.5 | 0.3 |
| 100 ug/mL Noggin | 100 ng/ml | 50 | 25 |
| R-Spondin 1 (På 1860) | 10% konditionerat medium | 5000 | 2500 |
| 5 mM A83-01 | 500 nM (på 1890) | 5 | 2.5 |
| 0,1 mg/ml FGF10 | 10 ng/ml | 5 | 2.5 |
| 50 μg/ml FGF2 | 5 ng/ml | 5 | 2.5 |
| 10 mM Prostaglandin E2 | 1 μM | 5 | 2.5 |
| 1M Nikotinamid | 10 mM (på 10 m) | 500 | 250 |
| 30 mM SB202190 | 10 μM | 16.7 | 8.4 |
| Fbs | 10% | 5000 | 2500 |
| 1 μM DHT | 1 nM (ej en) | 50 | 25 |
| adDMEM/F12 +/+/+ | Ta upp till 50 ml | Ta upp till 25 ml | |
| 100 mM Y-27632 Dihydroklorid | 10 μM | 5 | 2.5 |
Tabell 2: Komponenter för C/S Human Media + 10 % FBS. Denna tabell har tidigare publicerats av Drost et al.5.
| Kultur Platta | Sådd densitet (celler) | Källarmembranvolym (μL) | Medel (μL) |
| 48 väl | 25,000-50,000 | 20 | 250 |
| 24 väl | 50,000-250,000 | 40 | 500 |
| 6 brunnar | 50,000-250,000 | 40 | 2,000 |
Tabell 3: Sådddensitet, källarmembranvolym och medelvolym som behövs för en kupol. Denna tabell ändras från en tidigare publikation av Drost et al.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D organoider som härrör från patienten ben metastasering prostatacancer celler är fortfarande relativt sällsynta. Här beskriver vi strategier och ytterligare optimerade protokoll för att framgångsrikt etablerade seriella 3D-patient härledda organoider (PDOs) av BMPC. Dessutom beskrivs protokoll för att säkra organoiderna i prover med lägre celltäthet för IFC- och IHC-analys. Differentiella fenotyper i form av cysta, sfäroider och mer komplexa organoider visar att detta protokoll ger kulturvillkor som möjliggör heterogonous tumör cell populationer hos patienter att behålla sin cellulära fenotyp och struktur. Således har de kulturförhållanden som beskrivs här, som har anpassats från Drost et al.5 modifierad med FBS serum tillskott, visat sig vara optimalför kulturer patienten BMPC-härledda celler så att de behåller sin intra-subject och inter-subject heterogenitet (manuskript i beredning).
Vårt optimerade protokoll är praktiskt för en experimentell uppsättning med flera slutpunkter från begränsat utgångsmaterial från primära eller PDX tumörvävnader för att ställa in 3D organoider kulturer. I allmänhet är inrättandet av 3D organoider från patienten primära tumörvävnader mindre framgångsrik än inrättandet av 3D organoider från PDX tumörvävnader. Därför rekommenderas att ha en högre sådddensitet (upp till fyra gånger högre) av celler för inrättandet av 3D organoider från patienten primära tumörvävnader än från PDX tumörer). En metod för att öka cellavkastningen under tumörvävnadbearbetning är att återställa eventuell atumorvävnad överblivna på toppen av 70 μm cell sil genom att passera den filtrerade cellsuspensionen genom silen igen.
Tre olika metoder för att bilda en 3D-organoidkultur (figur 2) kan användas och enkelt anpassas beroende på uppföljningsendpointanalysen. Till exempel, om man ville ha sydda bilder efter upprättandet 3D organoider, rekommenderas en bifogad kupol starkt eftersom bildsömnprocessen kräver en seriell förflyttning av mikroskopiskt mål att förvärva önskat antal bilder (antingen 9 eller 25). Denna process resulterar i en subtil vibration till innehavaren av cellkultur plattan. Båda typerna av den flytande kupolen kommer fritt att röra sig på grund av vibrationerna samtidigt som bilden förvärvas. Dessutom kan båda typerna av flytande kupoler enkelt överföras från en brunn till en annan, vilket gör dem lämpliga för samkultur med vidhäftande celler efter inrättandet av 3D organoid kulturer och de vidhäftande cellerna i de separata brunnarna. Den bifogade kupolen och flytande kupol som frigörs från att fästas har visat sig behålla organoider i upp till 10 veckor. Intressant nog har en flytande kupol från den flytande pärlor metoden visat sig behålla organoider i upp till 4 månader. Den flytande pärlor metod för att producera källare membran sfärer som införts i vårt protokoll innebär fler steg och färdigheter, men kan övervägas för en långsiktig kultur. Parallellt, trots deras användning för etablering av 3D organoider från olika tumörer och metastasering, har roll en doming metod och källaren membran form på organoider bildas inte varit djupt fastställt. I den meningen kan paraffinfilmmetoden övervägas för användning när de andra två metoderna har misslyckats.
För alla tre olika metoder rekommenderar detta protokoll att använda en lägre volym av media och en högre volym av källare membran för resuspension processen eftersom kupolerna kommer att pågå längre i kulturen. En kupol bildas med ett 1:4-förhållande av media och källarmembran. Notera, denna metod ökar bildandet av bubblor medan rörledningar cellen suspension upp och ner eftersom den extra volymen av media inte kringgåviskositet av källaren membranet. Därför rekommenderas att sätta upp 1,5 ml rör så att det finns en cell pellet per varje kupol istället för att ha en cell pellet för flera kupoler i en 1,5 mL rör. På så sätt kommer bildandet av bubblor i ett rör för en kupol inte seriellt påverka andra kupoler. Om varaktigheten av kulturtillståndet tidigare har optimerats och är känt för att vara kort (upp till en månad), kan källarmembranet spädas ut mer för att kringgå viskositetfrågan av källarmembranet. En cell pellet resuspension för flera brunnar kan förberedas i ett rör, med hjälp av en högre volym av media till önskad volym av källaren membran för att minimera cellförlust och variabilitet.
För att minimera bubbelbildning under rörledningarsprocessen, pipetten en lägre volym än den faktiska volymen av cellerna, media och källaren membran blandningen. Till exempel, för en kupol inom 24 brunnsplattor, 40 μl av källaren membran och upp till 10 μL adDMEM kompletta medier blandas med cellpelleten. I detta fall kan pipetten ställas in för att hantera en volym på 40 μL istället för 50 μL medan pipettering upp och ner för att minimera bubbelbildningen. För denna andra metod kan cellpelletresuspensionen för flera brunnar beredas i ett rör för att minimera cellförlust och variabilitet. Vätskestatus en kommersiellt tillgänglig källare membran är ofta variabel. Därför måste nya partier av källarmembran testas för domingprocessen. Om källarmembranet är mer trögflytande än vanligt, kan upp till ytterligare 10 μL av färdiga medier (detaljer skrivna i steg 1) läggas till för att späda ut blandningen av cellpellet och källare.
Här presenterar vi ett protokoll för att upprätta, bild och process odlade 3D organoid med detaljerade tips för framgångsrikslutförande av de önskade förfarandena. Kulturmedier för 3D-organoider som introduceras i vårt manuskript är speciellt för prostata-härledda celler. Andra detaljer som beskrivs i vårt protokoll är dock tillämpliga på olika typer av tumörvävnader och metastaserande platser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sanghee Lee och Christina A.M. Jamieson är gästredaktörer för JoVE Methods Collection.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Leo och Anne Albert Charitable Foundation och JM Foundation. Vi tackar University of California San Diego Moores Cancer Center medlemmar, Dr Jing Yang och Dr Kay T. Yeung för att ge oss användning av deras mikrotomi och Randall franska, Institutionen för kirurgi för teknisk expertis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate - 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate - 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate - 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
References
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
- Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
- Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).
- Keyence Fluorescence Microscope. , Keyence Corporation. Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019).
