Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

הקמה וניתוח של תלת מימדי (3D) אורגנואידים נגזר החולה סרטן הערמונית העצם גרורות דגימות ושתלי Xenografts להם

Published: February 3, 2020 doi: 10.3791/60367
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 4, 2,5, 1,2, 1,2
1Department of Urology, University of California, San Diego, 2Moores Cancer Center, University of California, San Diego, 3Department of Medicine, University of California, San Diego, 4Department of Radiation Oncology, University of California, Los Angeles, 5Department of Orthopedic Surgery, University of California, San Diego

Summary

תרבויות תלת ממדיות של החולה BMPC דגימות ו xenografts של סרטן הערמונית גרורתי העצם לשמור על טרוגניות תפקודית של גידולים המקורי שלהם וכתוצאה מכך ציסטות, spheroids ו מורכבים, גידול כמו אורגנואידים. כתב יד זה מספק אסטרטגיה מיטוב ופרוטוקול לתרבות תלת-ממדית של מטופלים הטרוגנית דגימות נגזרות והניתוח שלהם באמצעות IFC.

Abstract

תלת מימדי (3d) תרבות של אורגנואידים מתוך דגימות הגידול של חולים אנושיים והמטופל נגזר מבע (pdx) מודלים של סרטן הערמונית, המכונה מטופל נגזר החולה (pdo), הם משאב לא יסולא בפז ללמוד את המנגנון של טווריגנזה וגרורה של סרטן הערמונית. היתרון העיקרי שלהם הוא שהם לשמור על גנומית ייחודי ופונקציונלי טרוגניות של רקמת המקורי לעומת קווי תאים קונבנציונליים כי לא. יתר על כן, התרבויות 3D של PDO יכול לשמש כדי לנבא את ההשפעות של טיפול בסמים על חולים בודדים הם צעד לקראת הרפואה אישית. למרות היתרונות הללו, קבוצות מעטות משתמשות בשיטה זו באופן שגרתי במסגרת המיטוב הנרחב של תנאי התרבות PDO העשויים להידרש לדגימות מטופלים שונים. בעבר הדגמנו כי סרטן הערמונית שלנו עצם גרורות PDX מודל, PCSD1, לכידה ההתנגדות של גרורות העצם של המטופל תורם לטיפול אנטי אנדרוגן. השתמשנו PCSD1 3D אורגנואידים כדי לאפיין עוד את המנגנונים של אנטי אנדרוגן התנגדות. בעקבות סקירה של מחקרים שפורסמו כעת של PDX ו-PDO מודלים, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור תרבות תלת-ממד של PDO באמצעות ממברנה כיפה או צפה מרתף (g., מטריצות) ספירות בתנאים התרבותיים אופטימיזציה. ב vivo תפר הדמיה ועיבוד תאים עבור היסטולוגיה מתוארים גם. פרוטוקול זה יכול להיות אופטימיזציה נוספת עבור יישומים אחרים, כולל אבן חשופה מערבית, שיתוף תרבות, וכו ' והוא יכול לשמש כדי לחקור את המאפיינים של PDO תרבותי תלת-ממד המתייחס התנגדות לסמים, tuמוריגנזה, גרורות ו therapeutics.

Introduction

האורגנואידים התלת-ממדיים משכו תשומת לב ליכולתם ללכוד את הvivo באדריכלות, הפונקציונליות התאית והחתימה הגנטית של הרקמות המקוריות שלהם1,2,3,4,5. החשוב ביותר, 3d אורגנואידים הוקמה מרקמות סרטן החולה או המטופל נגזר מבע (pdx) מודלים לספק הזדמנויות לא יסולא בפז להבין מנגנונים של איתות סלולרי על טומגנזה וכדי לקבוע את ההשפעות של טיפול בסמים על כל אוכלוסייה תא6,7,8,9,10,11,12,13. דרוסט ואח '5 פיתח פרוטוקול סטנדרטי להקמת אורגנואידים של האדם והעכבר, אשר אומצה באופן נרחב בתחום של אורולוגיה. בנוסף, מאמץ משמעותי הוקדש לאפיון נוסף של 3d אורגנואידים ולהבין את המנגנונים המפורטים של tuמוריגנזה ו גרורות4,12,14,15. בנוסף לפרוטוקול שהוקם בעבר ומקובל ביותר עבור תרבויות 3D אורגנואידים, אנו מתארים כאן פרוטוקול צעד אחר צעד עבור תרבות תלת-ממד של PDO באמצעות שלוש שיטות שונות doming בתנאי תרבות אופטימיזציה.

בכתב יד זה, 3D אורגנואידים הוקמו כמודל vivo ex של סרטן הערמונית גרורתי העצם (BMPC). התאים המשמשים עבור תרבויות אלה הגיעו מסרטן הערמונית סן דייגו (pcsd) סדרה ונגזר ישירות החולה סרטן הערמונית העצם גרורות רקמות גידולים (PCSD18 ו PCSD22) או החולה נגזר מבע (pdx) מודלים סרטניים (דגימות בשם PCSD1, PCSD13, ו PCSD17). מכיוון גרורות עצם ספונטנית של תאים סרטניים בערמונית נדיר במודלים מהונדסים גנטית העכבר16, השתמשנו ישירה הירך (IF) הזרקה של תאים סרטניים האדם לתוך זכר Rag2-/-γc- עכברים להקמת מודלים pdx של סרטן הערמונית גרורתי עצם17.

ברגע שאורגנואיד 3D הוקמו תאים סרטניים הטרוגנית החולה או המטופל נגזר xenografts, זה חיוני כדי לאשר את זהותם כמו תאים סרטניים בערמונית כדי לקבוע פנוטיפים שלהם בתרבויות 3D אורגאיד. אימונולובורנציה כימיה (IFC) מאפשר הדמיה של ביטוי החלבון באתרו בכל תא, לעתים קרובות מציין את הפונקציות הפוטנציאליות עבור אוכלוסיות תאים ספציפיות2,4. באופן כללי, פרוטוקולים IFC עבור רוב המכריע של דגימות כולל רקמות ותאים פשוטים וממוטבים לחלוטין. עם זאת, צפיפות התא ומספר האורגנואידים יכולים להיות נמוכים באופן משמעותי מזו של התרבות המקובלת. לכן, פרוטוקול IFC עבור אורגנואידים דורש צעדים נוספים כדי להבטיח עיבוד תקין והטבעה של פרפין עבור כל אורגנואידים בדגימות. אנו מתארים שלבים נוספים עבור תהליך הטמעה מראש וטיפים כדי לתייג את המיקום של האורגנואידים מנות בשקופית המגביר את שיעור ההצלחה של IFC על אורגנואידים במיוחד כאשר דגימות של האורגנואידים יש צפיפות תא נמוכה יותר מאשר הרצוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה נעשה בהתאמה קפדנית עם ההמלצות במדריך עבור אוניברסיטת קליפורניה סן דייגו (UCSD) סקירה מוסדית (IRB). IRB #090401 אישור התקבל מהלוח סקירה מוסדית UCSD (IRB) כדי לאסוף דגימה כירורגית מחולים למטרות מחקר. הסכמה מושכלת הושגה מכל מטופל ובעל עצם ניתוח סרטן הערמונית גרורות התקבל תיקון אורתופדית של שבר פתולוגי בעצם הירך. פרוטוקולי בעלי חיים בוצעו תחת אוניברסיטת קליפורניה סן דייגו (UCSD) בעלי חיים רווחה מוסדית טיפול בעלי חיים והוועדה השימוש (IACUC) שאושרו פרוטוקול #S10298. תאים מתוך רקמת הסרטן של החולה מכנית ואנזימטי היתה פנים-מוסרית הוזרק לתוך 6 עד 8 גברים בן שבוע Rag2-/-γc-/- עכברים כפי שתוארה בעבר17. נפח גידול xenograft נקבע באמצעות מערכת הדמיה vivo biלומינסנציה ו קליבר מדידות. עם גידול גידול של עד 2.0 ס מ (הגודל המקסימלי המותר אושרה על ידי IACUC), הגידול נקצרו עבור מוסד אורגנואידים תלת-ממד.

הערה: איור 1 מציג את זרימת העבודה עבור יצירת אורגנואידים תלת-ממדיים ומספר פרוטוקול עבור כל שלב של ההליכים הניסיוניים.

1. עיבוד של רקמות נגזרות מבע (pdx) החולה

הערה: זהו צעד התחלתי עבור הממסד אורגאיד עבור הגידול שנגזר דגם העכבר מבע. פרוטוקול זה מותאם מפרסום קודם על-ידי Drost ואח '5 ושמנו את תנאי המדיה כוללים תוספי סרום למדיה ארגונית.

  1. לעבד את הדגימה הגידול כפי שמתואר להלן.
    1. הומי הגידול דגימות כדי 1-3 mm3 חתיכות בגודל לעכל את הדגימות עם 10 מ ל של פתרון דיסוציאציה של תא עבור 45 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. כדי לסיים את העיכול, הוסף 20 מ ל של המדיה המלאה של DMEM לדגימות.
    3. לסנן את ההשעיה דרך מסננת תא 70 יקרומטר. השתמש בבוכנה סטרילית כדי לדחוף כל שאריות הרקמה בחלק העליון של 70 יקרומטר תא מסננת.
    4. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
    5. שטוף את הגלולה הסלולרית שלוש פעמים עם מדיה חדשה מלאה. התאם את נפח המדיה לכביסה והשעיה מחדש עם נפח המדיה המוצע בטבלה 3. לדוגמה, עבור המצב התרבותי של 24 הצלחות, נפח הכביסה צריך להיות 500 μL.
      הערה: כפי שמוצג בטבלה 3, הפרוטוקול חל על תנאי תרבות שונים.
    6. קבע ספירת תאים סופיים באמצעות הצבע הכחול של טריקון ומכשיר הומוטומטר.
    7. לאחר קבלת ספירות תאים, להשעות מחדש את הגלולה תא ב 80 μL של 2% FBS ב PBS לכל 2 x 106 תאים סרטניים.
    8. הוסף 20 μL של תא העכבר מחסור קוקטייל לכל 2 x 106 תאים סרטניים. מערבבים היטב ומשלבים במשך 15 דקות ב 2-8 ° c.
    9. כוונן את אמצעי האחסון ל-500 μL עם 2% FBS במאגר PBS לכל 2 x 106 תאי גידול.
      הערה: עד 1 x 107 תאים סרטניים ב 2.5 מ ל של השעיית תא ניתן לעבד על עמודה LS אחת.
    10. טען את עמודות ה-LS על מפריד העמודות המגנטי והניחו צינורית חרוט של 15 מ ל בארון מתחת כדי לאסוף את הזרימה.
    11. לשטוף כל עמודה עם 3 מ ל של 2% FBS במאגר PBS. השמט את צינורית החרוט עם השטיפה והחלף בצינור האוורור החדש והסטרילי של 15 מ"ל.
    12. הוסף את ההשעיה התא (עד 2.5 mL של 1 x 107 תאים סרטניים) על העמודה. לאסוף זרימה-דרך כי יהיה מועשר בתאי הגידול האנושיים.
    13. שטוף את העמודה פעמיים עם 1 מ ל של 2% FBS במאגר PBS.
      הערה: חשוב לבצע שטיפת שלבים ברגע שהעמודה ריקה. כמו כן, נסה להימנע מיצירת בועות אוויר.
  2. מחלק את הנפח המתאים של השעיית התא לצינור 1.5 mL עבור התרבות הרצויה להגדיר (שולחן 3).
  3. צנטריפוגה את שפופרת 1.5 mL ב 300 x g ו 4 ° צ' עבור 5 דקות.
  4. הסר והשמט בזהירות את הסופרנטאנט.

2. עיבוד של רקמות החולה העיקרי הסרטן

הערה: זהו צעד התחלתי עבור מוסד אורגנואיד.

  1. בצע את כל שלב 1 למעט את התהליך המחסור של תא העכבר, אשר אינו נחוץ לעיבוד רקמות הגידול העיקרי של המטופל.

3. יצירת כיפה עגולה צמודה על הצלחת

הערה: כתב יד זה מתאר שלוש דרכים ליצור כיפה מתערובת של הגלולה התא ואת קרום המרתף (למשל, מטריצות) כפי שמוצג באיור 1 ואיור 2. בשלבים 2-4, את התאים ואת קרום המרתף יש לשמור על הקרח כדי למנוע מיצוק של קרום המרתף.

  1. השהה מחדש את הגלולה בתא בנפח המתאים של קרום המרתף (g., 40 μL) עבור צלחת 24 להגדיר למעלה (שולחן 3).
  2. פיפטה למעלה ולמטה בעדינות כדי לוודא שהתאים מושעים מחדש היטב בקרום המרתף.
  3. פיפטה את הכרך המתאים (שולחן 3) של תערובת קרום התא מרתף (ו אופציונלי 10 μl של המדיה המלאה) לתוך מרכז של לוחית טרום העור רקמות רקמה.
  4. להפוך את הצלחת ומיד למקם את הצלחת הפוך בחממה2 התרבות תאים להגדיר ב 5% co2, 37 ° c עבור 15 דקות. זה מונע מתאים להתיישב ולדבוק לוחית התחתונה תוך התרת קרום המרתף כדי לגבש.
  5. פיפטה את הכרך המתאים (שולחן 3) של מדיום מחומם מראש המכיל 10 Μm Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון לתוך כל באר.
  6. מניחים את הצלחת בצד ימין בתוך חממה2 התרבות תאים (5% co2, 37 ° c).
  7. . להחליף את התקשורת כל 3-4 יום לאחר 5-7 ימים, השתמש במדיום תרבות ללא 10 μM Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון כדי לשמור על התרבויות.

4. יצירת כיפה צפה מכיפה עגולה צמודה על הצלחת

  1. לאחר שלב 3.7, לנתק את הכיפה באמצעות מגרד התא.

5. יוצרים חרוזים צף

הערה: פרוטוקול זה נקרא חרוזים צף מאז התערובת של קרום המרתף, מדיה, ו אורגנואידים נראים כמו חרוזים.

  1. חותכים 2 אינץ ' x 4 אינץ פיסת הסרט פרפין.
  2. מניחים את הסרט פרפין על החלק העליון של גושים של מתלה החזקת הקצה ריק מ-1000 μl צנרת פלסטיק מתוך תיבת טיפ.
  3. בעדינות ללחוץ על הסרט פרפין כדי לעקוב אחר גושים באמצעות האצבע באמצעות המדד כפפה, אבל בלי לפרוץ את הסרט פרפין.
  4. רסס את הסרט פרפין עם 70% אתנול ולהפעיל את מנורת UV במכסה התרבות התא כדי לעקר את הסרט פרפין מוכן לפחות 30 דקות.
  5. להכין תערובת של תאים 20 μL של קרום המרתף. צפיפות הזריעה יכולה להיות 50,000-250,000 תאים לכל כיפה.
  6. פיפטה את התערובת של תאים מעובד משלב 1 או 2, ו 20 μl של קרום המרתף לתוך התבנית של דיבוט נוצר בסרט פרפין מוכן.
  7. השהה מחדש את הגלולה התא בקרום המרתף ואת הצינורות ההשעיה התא בתוך הכנת הפרפין שצולמו divots.
  8. מניחים את החרוזים המוצק ואת הסרט פרפין לצלחת 6-היטב. אחד טוב בצלחת 6-היטב יכול להכיל עד 5 חרוזים.
  9. פיפטה 3-5 mL של מדיום טרום מחומם המכיל 10 μM Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון לתוך כל טוב תוך צחצוח בעדינות חרוזים מתוך הסרט פרפין.
    הערה: כאמצעי אחסון מינימלי, מומלץ לעשות שלושה מ"ל. עבור מספר מירבי של חרוזים (N = 5) לבאר, 5 מ ל בינוני מומלץ.
  10. מניחים את הצלחת בתוך אינקובטור CO2 (5% co2, 37 ° c).
  11. שנה את המדיה של האורגנואיד כל 3-4 ימים. לאחר 5-7 ימים, השתמש במדיום תרבות ללא 10 μM Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון כדי לשמור על התרבויות.

6. בתפרים תמונה vivo אורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ8

הערה: מיקרוסקופים מסוימים אינם יכולים להגיע להיקף החיצוני של לוחית התא (קיר קצה); לכן, אנו מציעים באמצעות הבארות קרוב היקף לוחית הטלפון כאשר התמונה תפרים.

  1. מניחים את צלחת תרבות התא בתנוחה כלפי מעלה לתוך מחזיק הצלחת במיקרוסקופ Keyence.
  2. מניחים את העדשה על מרכז כיפת היעד.
  3. הגדר את תהליך התפירה האוטומטי על-ידי בחירת מספר המסגרות. לדוגמאות, 3 x 3 או 5 x 5 ניתן לבחור כדי ליצור 9 תמונות או 25 סך כל התמונות.
  4. לחץ על לחצן הלכידה כדי ליזום תהליך הדמיה.
  5. פתח את תוכנת מציג התמונות וטען קבוצה של תמונות שצולמו בשלב 4.
  6. לחץ על תפירת תמונות כדי ליצור תמונה ברזולוציה גבוהה בתפירה.
    הערה: ניתן לבצע לכידה של 9 או 25 תמונות טוריות באמצעות הגדרת ידנית או אוטומטית כדי למקד את התאים.

7. עיבוד אורגנואיד עבור היסטולוגיה: שיטת הספין למטה

הערה: פרוטוקול זה מותאם מפרסום קודם על ידי ולכוגיאניס ואח '7. הוספנו צעד מעורב agarose הטבעה כדי להטביע בהצלחה את כל האוכלוסיות של אורגנואידים.

  1. הסר את המדיה הקיימת מתוך הבאר. להיזהר לא לאכול את הכיפות קרום המרתף.
  2. הוסף שווה (שווה לאמצעי האחסון של המדיה שהוסרו משלב 1) של פתרון שחזור התאים והדגירה עבור 60 דקות ב-4 ° c.
  3. לחסל את כיפת קרום המרתף באמצעות פיפטה ולמחוץ את הכיפה קרום המרתף באמצעות טיפ pipet. לאסוף את כיפת הנתק ואת פתרון שחזור התא בצינור 1.5 mL.
  4. צנטריפוגה ב 300 x g ו 4 ° צ' עבור 5 דקות.
  5. הסר את הסופרנטנט (פתרון שחזור תאים). שמור את כל הסופרנטנים בצינורות נפרדים עד הסוף כאשר הנוכחות של האורגנואידים מאושר בשלב הפלטינג הסופי.
  6. הוסף את אמצעי האחסון הרצוי (שולחן 3) של PBS קר ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי להפריע מכנית גלולה.
  7. צנטריפוגה ב 300 x g ו 4 ° צ' עבור 5 דקות.
  8. הסר את הסופרנטנט (PBS).
  9. לתקן את הגלולה בכרך בהתאמה (למשל, 500 μL עבור גלולה אחת מ 24 מצב התרבות צלחת הבאר, שולחן 3) של 4% התחתית עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. בעקבות קיבעון, צנטריפוגה ב 300 x g ו 4 ° צ' עבור 5 דקות.
  11. הסר את הסופרנטנט (בליגת העל).
  12. לשטוף עם נפח מתאימים (למשל, 500 μL עבור גלולה אחת מ 24 מצב התרבות צלחת הבאר, שולחן 3) של PBS ו צנטריפוגה ב 300 x g ו 4 ° צ' עבור 5 דקות.
  13. הכינו מעלה חם (2% צמח ב-PBS).
    הערה: כאן, כדורי תא עבור מקטעים קפואים יכול להיות מחדש ישירות מושעה ב 200 μL של מתחם OCT ללא שלבים נוספים בפרוטוקול 7.
  14. להשעות מחדש את הגלולה תא ב 200 μL של agarose (2% ב PBS).
    1. מיד לאחר הוספת agarose, לנתק בעדינות את הגלולה התא מהקיר של שפופרת 1.5 mL באמצעות מחט 25 גרם מוצמד 1 מזרק mL. כפי שמוצג באיור 3, אם הגלולה תא אינה מנותקת פיזית מהקיר של שפופרת 1.5 mL, אז יש סיכון לאבד את כל או חלק של הגלולה התא במהלך תהליך הטבעה agarose.
  15. חכה עד ששני% האחוזים בערוץ הPBS. יהיה מתחזק לגמרי
  16. נתק את הבלוק המתחזק מצינור 1.5 mL באמצעות מחט של 25 גרם המצורפת מזרק 1 mL.
  17. להעביר את הבלוק agarose הפרטי המכיל את הגלולה התא לצינור 1.5 mL חדש.
  18. ממלאים את הצינור עם 70% אטוח ולהמשיך הלאה באמצעות פרוטוקול קונבנציונאלי להתייבשות רקמות ו פרפין הטבעה.

8. היסטולוגיה ומאימונולואוציטוכימיה (IFC) של אורגנואידים

  1. בחר את השקופיות עבור היסטולוגיה או IFC.
  2. לפני שתחיל את תהליך ההכתמים, גלה היכן התאים ממוקמים בשקופית וצייר עיגול סביב התאים בשקופית באמצעות סמן.
  3. צייר את המערכת סביב הקצה או הגבול של השקופית וכאשר עיגולים ממוקמים בשקופית במחברת מעבדה כדי לתעד את מיקומם.
  4. בצע כתמים רצויים.
    הערה: במהלך תהליך זה, מסומנים עיגולים נעלמים מאז הבורא הרגיל אינו חסין לכימיקלים. אפילו כמה סמנים קבועים היסטולוגיה ניתן למחוק במהלך תהליך הצביעת.
  5. לאחר תהליך הצביעת, הצב את השקופית על הציור במחברת המעבדה כדי לאתר את מיקומי התאים בשקופית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אורגנואידים 3d הוקמו בהצלחה מן החולה נגזר מבע (pdx) מודל של סרטן הערמונית גרורתי העצם (bmpc), כמו גם ישירות מרקמת סרטן הערמונית גרורתית העצם (איור 4). בקצרה, מודלים pdx שלנו של bmpc הוקמו על ידי פנים הירך (IF) הזרקה של תאים סרטניים לתוך Rag2 זכר-/- c-/- עכברים ולאחר מכן הגידולים pdx נקצרו ועובדו כמתואר בכתב יד זה. כפי שמוצג באיור 4, ברקמות הגידול pdx מן הסדרה pcsd הביא אורגנואידים 3d עם פנוטיפים דיפרנציאלי כי התבטא כמו ציסטות, spheroids ומורכבות גבוהה יותר אורגנואידים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה.

תמונה תפור מ 25 תמונות ברזולוציה גבוהה 10x הגדלת הראה כיפת שלמה של קרום המרתף ואורגנואידים (איור 5). באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, לאחד יש את האפשרות למיין את התאים או אשכולות התא כי הם גדולים יותר מגודל מסוים או לבחור ידנית spheroids או ציסטות.

השלבים עבור הטבעה של התרבויות האורגנואיד והטיפים כדי לתייג את המיקום של אורגנואידים מנות בשקופית להגדיל את ההצלחה של ביצוע IFC על האורגנואידים במיוחד כאשר דגימות של האורגנואידים יש צפיפות תא נמוכה יותר מאשר הרצוי. איור 6 מראה דוגמה של IFC על מקטע פרפין בעובי של 5 יקרומטר של מיקוד של אורגנואידים המיקוד 5 (CK5, תא האפיתל בסיס הסמן), ציטוקרטין 8 (CK8, מסמן תא אפיתל לומיאל) ו dapi.

Figure 1
איור 1: הקמת ואפיון של אורגנואידים תלת-ממדיים שמקורם ברקמות הסרטן החולה או החולה הנגזר מבע (pdx) רקמות הגידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מתודולוגיות ליצירת תערובת של כדורי תא וקרום מרתף. כיפה צמודה (א), כיפה צפה (ב) וחרוזים צפים (c). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: צעד מפתח עבור הטבעה מוצלחת של agarose. תהליך לנתק את הגלולה תא מהקיר של צינור 1.5 mL. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: פנוטיפים הדיפרנציאלי של אורגנואידים מסדרה של גידולים PCSD PDX, הכולל תאים בודדים, ציסטות, spheroids ומורכבות יותר אורגנואידים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: דוגמה לתמונה בעלת התפר הגולמי מסכום כולל של 25 תמונות ברזולוציה גבוהה ויישומו עבור ניתוח מעקב כדי לספור את מספר התאים או למדוד את האזור של תאים/אשכולות תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: התמונה המציגה CK5 ו CK8 IFC מוכתם PCSD1 אורגנואידים (5 יקרומטר עובי של פרפין בסעיף). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

רכיב מניות ריכוז סופי Vol (mL) נדרש עבור פתרון 500 mL
1000 מ"מ הופס 10 ממ ' מיכל 5
200 מ"מ גלוטמקס 2 ממ ' מיכל 5
100x עט-דלקת 1x מיכל 5
הגברת/F12 +/+/+ 485

טבלה 1: הוספה/F12 +/+/+ הכנה. הטבלה הזאת פורסמה בעבר על ידי דרוסט ואח '5.

רכיב מניות ריכוז סופי Vol (μL) נדרש עבור פתרון 50 mL Vol (μL) דרוש עבור 25 מ"ל פתרון
50x B27 50x מדולל 1000 500
500 מ"מ N-Acetylcysteine 1.25 ממ ' 125 62.5
0.5 מ"ג/mL EGF 5 ng/mL 0.5 0.3
100 מ. י. 100 ng/mL 50 25
R-החתן 1 10% בינוני ממוזג 5000 2500
5 מ"מ A83-01 500 nM מיכל 5 2.5
0.1 mg/mL FGF10 10 ng/mL מיכל 5 2.5
50 μg/mL FGF2 5 ng/mL מיכל 5 2.5
10 מ"מ פרוגלנדין E2 1 μM מיכל 5 2.5
1M ניטינאמיד 10 ממ ' 500 250
30 מ"מ SB202190 10 μM 16.7 8.4
מיכל הפבס 10 5000 2500
1 μM DHT 1 מיכל 50 25
הגברת/F12 +/+/+ הגדל עד 50 מ ל הגדל עד 25 מ ל
100 מ"מ Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון 10 μM מיכל 5 2.5

טבלה 2: רכיבים עבור מדיית האדם C/S + 10% FBS. הטבלה הזאת פורסמה בעבר על ידי דרוסט ואח '5.

הלוח התרבותי זריעת צפיפות (תאים) אמצעי אחסון ממברנה מרתף (μL) בינונית (μL)
48 הכול טוב 25000-50,000 20 250
24 היטב 50,000-250000 40 500
6 היטב 50,000-250000 40 2,000

שולחן 3: זריעת צפיפות, נפח מרתף האחסון, נפח בינוני הדרושים עבור כיפת אחד. טבלה זו משתנה מפרסום קודם על-ידי Drost et al.5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אורגנואידים תלת-ממדיים שנגזר מעצם החולה גרורות בתאי סרטן הערמונית הם עדיין נדירים יחסית. כאן, אנו מתארים אסטרטגיות אופטימיזציה נוספת הפרוטוקול להקים בהצלחה החולה 3D סדרתי המטופל הנגזר (PDOs) של BMPC. בנוסף, הפרוטוקולים מתוארים כדי לאבטח את האורגנואידים בדגימות עם צפיפות תאים נמוכה יותר עבור IFC ו-IHC ניתוח. פנוטיפים הדיפרנציאלי בצורה של ציסטה, spheroids ואורגנואידים מורכבים יותר לציין כי פרוטוקול זה מספק תנאי התרבות המאפשר הטרוגונאוס הגידול אוכלוסיות תאים בחולים כדי לשמור על שלהם פנוטיפ הסלולר מבנה. כך, התנאים התרבותיים המתוארים כאן, אשר הותאמו מ Drost ואח '5 שונה עם תוספי סרום fbs, הוכח להיות אופטימלי עבור התרבויות של החולה BMPC התאים הנגזרים כגון שהם שומרים על הפנים שלהם בתוך הנושא טרוגניות (כתב יד בהכנה).

הפרוטוקול הממוטב שלנו הוא מעשי עבור ניסיוני להגדיר עם נקודות קצה מרובות מחומר התחלתי מוגבלת של רקמות ראשיות או PDX הגידול כדי להגדיר תרבויות 3D אורגנואידים. באופן כללי, הקמתה של אורגנואידים תלת-ממד מרקמות הסרטן העיקרי המטופל הוא פחות מוצלח מאשר הקמתה של אורגנואידים 3D מרקמות הגידול PDX. לכן, מומלץ להיות צפיפות הזריעה גבוהה יותר (עד ארבע פעמים גבוה יותר) של תאים להקמת אורגנואידים 3D מרקמות החולה הראשי המטופל מאשר מגידולים PDX). שיטה אחת כדי להגדיל את תפוקת התאים במהלך עיבוד רקמת הגידול היא לשחזר את כל רקמת הגידול שאריות בחלק העליון של 70 יקרומטר תא מסננת על ידי העברת ההשעיה התא מסוננים דרך מסננת שוב.

ניתן להשתמש בשלוש שיטות שונות כדי ליצור תרבות ארגונית תלת-ממדית (איור 2) ולהתאים אותה בקלות בהתאם לניתוח נקודת הקצה של המעקב. לדוגמה, אם אחד רוצה לקבל את התמונות תפור לאחר הקמת אורגנואידים 3D, כיפת מצורף מומלץ מאוד מאז תהליך תפירת התמונה דורש תנועה טורית של מטרה מיקרוסקופית לרכוש את המספר הרצוי של תמונות (או 9 או 25). תהליך זה מביא רטט עדין למחזיק של צלחת תרבות התא. שני הסוגים של הכיפה הצפה יזוזו בחופשיות עקב הרטט תוך כדי רכישת התמונה. בנוסף, שני הסוגים של כיפות צף ניתן להעביר בקלות מאחד היטב למשנהו, מה שהופך אותם מתאים שיתוף התרבות עם תאים חסיד לאחר הגדרת תרבויות 3D אורגנואיד ותאים חסיד בבארות נפרדות. הכיפה המצורפת והכיפה הצפה שוחרר מלהיות מחוברים הוכחו לשמור על אורגנואידים עד 10 שבועות. מעניין, כיפת צף מן השיטה חרוזים צף הוכח לשמור על אורגנואידים עד 4 חודשים. שיטת חרוזים צף לייצר כדורים קרום המרתף הציג בפרוטוקול שלנו כרוך יותר שלבים ומיומנויות אבל יכול להיחשב לתרבות ארוכת טווח. במקביל, למרות השימוש שלהם להקמת אורגנואידים תלת-ממד מגידולים שונים גרורות, התפקיד של השיטה doming ואת צורת קרום המרתף על היווצרות אורגנואידים לא היה נחוש עמוקות. במובן זה, שיטת הסרט פרפין יכול להיחשב לשימוש כאשר שתי השיטות האחרות לא הצליחו.

עבור כל שלוש השיטות השונות, פרוטוקול זה ממליץ להשתמש בנפח נמוך יותר של מדיה וכמות גבוהה יותר של קרום המרתף לתהליך ההשעיה, כי הכיפות יימשך עוד יותר בתרבות. כיפה נוצרת עם יחס 1:4 של קרום התקשורת והמרתף. של הערה, שיטה זו מגבירה את היווצרות בועות בזמן ללטף את התא הבולם למעלה ולמטה מאז נפח נוסף של התקשורת אינו מעקוף את צמיגות של קרום המרתף. לכן, מומלץ להגדיר 1.5 mL צינורות כגון כי יש גלולה אחת תא לכל כיפה במקום שיש אחד הגלולה התא עבור מספר כיפות בצינור אחד 1.5 mL. בפעולה זו, היווצרות בועות בצינור אחד עבור כיפה אחת לא תשפיע באופן סדרתי על כיפות אחרות. אם משך המצב של התרבות כבר אופטימיזציה והוא ידוע להיות קצר (עד חודש), קרום המרתף יכול להיות מדולל יותר כדי לעקוף את בעיית צמיגות של קרום המרתף. גלולה תא מחדש עבור בארות מספר יכול להיות מוכן בצינור אחד, ניצול נפח גבוה יותר של מדיה לנפח הרצוי של קרום המרתף כדי למזער את אובדן התאים והשונות.

כדי למזער את היווצרות הבועות במהלך תהליך הליטוף, הפיפטה הוא נפח נמוך יותר מאשר נפח בפועל של התאים, התקשורת וממברנה המרתף תערובת. לדוגמה, עבור כיפת בתוך 24 לוחות הבאר, 40 μL של קרום המרתף ועד 10 μL של המדיה המלאה של הכלי מעורבבים עם הגלולה התא. במקרה זה, את הפיפטה ניתן להגדיר להתמודד עם נפח של 40 μL במקום 50 μL תוך כדי ליטוף למעלה ולמטה כדי למזער את היווצרות בועה. עבור שיטה זו השנייה, את הגלולה התא מחדש עבור בארות מספר יכול להיות מוכן בצינור אחד כדי למזער את אובדן התאים והשונות. המצב הנוזלי של קרום מרתף זמין מסחרית הוא לעתים קרובות משתנה. לכן, קבוצות חדשות של קרום המרתף צריך להיבדק עבור תהליך העיבוד. אם קרום המרתף הוא צמיגי יותר מהרגיל, ולאחר מכן עד 10 μL של המדיה המלאה של הוספה (פרטים כתובים בשלב 1) ניתן להוסיף כדי לדלל את התערובת של הגלולה התא ואת קרום המרתף.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי ליצור, התמונה ואת תהליך תרבותי 3D אורגאיד עם טיפים מפורטים להשלמת מוצלחת של ההליכים הרצויים. מדיית תרבות לאורגנואידים תלת ממדית שהוצגה בכתב היד שלנו היא במיוחד לתאים שמקורם בערמונית. עם זאת, פרטים אחרים המתוארים בפרוטוקול שלנו חלים על סוגים שונים של רקמות הגידול ואתרים גרורתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המלון הינו עורכי האורח של אוסף שיטות יופיטר.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי קרן מזל אריה ואן אלברט וקרן JM. אנו מודים לאוניברסיטה של קליפורניה בסן דייגו מורס מרכז הסרטן חברי, ד ר. ג'ינג יאנג וד ר קיי ט. י. המאפשר לנו להשתמש במיקרוטומה שלהם ובצרפתית רנדל, המחלקה לכירורגיה למומחיות טכנית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Pipettman Gilson F123602
1 mL Syringe BD Syringe 329654
1.5 mL tube Spectrum Lab Products 941-11326-ATP083
25G Needle BD PrecisionGlide Needle 305122
4% Paraformaldehyde (PFA) Alfa Aesar J61899
70% Ethanol (EtOH) VWR BDH1164-4LP
A83-01 Tocris Bioscience 2939
Accumax Innovative Cell Technologies, Inc. AM105
adDMEM Life Technologies 12634010
Agarose Lonza 50000
Antibody -for Cytokeratin 5 Biolegend 905901
Antibody for Cytokeratin 8 Biolegend 904801
B27 Life Technologies 17504044
Bioluminescence imaging system, IVIS 200 Perkin Elmer Inc IVIS 200
Cell Culture Plate - 24 well Costar 3524
Cell Culture Plate - 48 well Costar 3548
Cell Culture Plate - 6 well Costar 3516
Cell Dissociation Solution, Accumax Innovative Cell Technologies, Inc. AM105
Cell Recovery Solution Corning 354253
Cell Scraper Sarstedt 83.180
Cell Strainer Falcon (Corning) 352350
CO2 incubator Fisher Scientific 3546
DAPI Vector Vectashield H-1200
DHT Sigma-Aldrich D-073-1ML
dPBS Corning/Cellgro 21-031-CV
EGF PeproTech AF-100-15
FBS Gemini Bio-Products 100-106
FGF10 PeproTech 100-26
FGF2 PeproTech 100-18B
Forceps Denville Scientific S728696
Glutamax Gibco 35050-061
HEPES Gibco 15630-080
LS Columns Miltenyi 130-0420401
Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator Miltenyi 130-090-976
Marker VWR 52877-355
Matrigel (Growth Factor Reduced) Mediatech Inc. (Corning) 356231
Matrigel (High Concentration) BD (Fisher Scientific) CB354248
Microscope Imaging Software, Keyence BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software)
Microscope, Keyence BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)
Mouse Cell Depletion Kit Miltenyi 130-104-694
N-Acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-5G
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636-100G
Noggin PeproTech 120-10C
OCT Compound Tissue-Tek 4583
Parafilm American National Can N/A
Pen-Strep Mediatech Inc. (Corning) 30-002-CI-1
Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) Fisherbrand Redi-Tip 21-197-85
Plunger (from 3 mL syringe) BD Syringe 309657
Prostaglandin E2 Tocris Bioscience 2296
R-Spondin 1 Trevigen 3710-001-01
SB2021190 Sigma-Aldrich S7076-25MG
Small Table Top Centrifuge ThermoFisher Scientific 75002426
Water Bath Fisher Sci 2320
Y-27632 Dihydrochloride Abmole Bioscience M1817

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  2. Tushir, J. S., et al. Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).
  3. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  4. McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture. Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).
  5. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  6. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  7. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  8. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  9. Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model. Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).
  10. Beshiri, M. L., et al. A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening. Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).
  11. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
  12. Lee, S. H., et al. Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  13. Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
  14. Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach. Development. 144 (6), 998-1007 (2017).
  15. Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
  16. Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
  17. Godebu, E., et al. PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche. Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).
  18. Keyence Fluorescence Microscope. , Keyence Corporation. Available from: https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/ (2019).

Tags

החודש ביופיטר סוגיה 156 החולה הנגזר אורגנואידים (PDO) ספין למטה שיטות סרטן הערמונית גרורתי (BMPC) ב הדמיה תפר Vivo Immunofluorescence ציטוכימיה (IFC)
הקמה וניתוח של תלת מימדי (3D) אורגנואידים נגזר החולה סרטן הערמונית העצם גרורות דגימות ושתלי Xenografts להם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, S., Burner, D. N., Mendoza, T.… More

Lee, S., Burner, D. N., Mendoza, T. R., Muldong, M. T., Arreola, C., Wu, C. N., Cacalano, N. A., Kulidjian, A. A., Kane, C. J., Jamieson, C. A. M. Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts. J. Vis. Exp. (156), e60367, doi:10.3791/60367 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter