Summary
Laryngotracheal 협착증은 기관 기도를 비판적으로 좁히고 효과적인 의학 치료가 결여되는 병리학적인 흉터 침착에서 유래합니다. PLLA-PCL (70% 폴리-L-락티드 및 30% 폴리카프롤락톤) 스텐트를 국소 약물 전달 시스템으로 사용하여, 기관내 흉터 증식을 감소시키는 것을 목표로 하는 잠재적치료법을 연구할 수 있다.
Abstract
후두 척막증 (LTS)은 외인성 방해및 호흡곤란으로 이어지는 기관및 기관의 병리학적 협착입니다. LTS는 기관에서 이물질에서 점막 손상으로 인해 조직 손상및 병리학 적 흉터 조직의 침착으로 이어지는 국소 염증 반응을 초래합니다. LTS에 대한 치료는 효과적인 의료 치료의 부족으로 인해 수술이다. 이 방법의 목적은 LTS를 사용하여 마우스에 배치하기 위해 소형화 될 수있는 생체 적합성 스텐트를 구성하는 것입니다. 우리는 PLLA-PCL (70 % 폴리 L-락티드 및 30 % 폴리 카프로 롤락톤) 구성이 최적의 생체 역학 적 강도를 가지고 있으며 생체 적합성, 생체 내 배치 스텐트에 대한 실용성 및 용출 약물을 할 수 있음을 입증했습니다. 이 방법은 염증을 국소적으로 억제하고 기도 섬유증을 감소시키기 위해 다양한 면역 조절제를 테스트하기 위한 약물 전달 시스템을 제공한다. 스텐트를 제조하는 데는 28-30h가 소요되며 쉽게 재현할 수 있으므로 대형 코호트를 실험할 수 있습니다. 여기에서 우리는 섬유증과 콜라겐 침착을 감소시키는 그것의 효력을 시험하기 위하여 스텐트의 안에 약 rapamycin를 통합했습니다. 결과는 PLLA-PCL 텐트가 신뢰할 수 있는 라파마이신 방출을 보여주었고, 생리학적 조건에서 기계적으로 안정되었으며, 생체 적합성이 있었으며, 기관에서 염증 반응을 거의 유도하지 않는 것으로 나타났습니다. 또한, 라파마이신 용출 PLLA-PCL 스텐트는 생체 내 기관에서 흉터 형성을 감소시켰습니다.
Introduction
후두 절제 (LTS)는 자궁 내 외 삽관 손상으로 인해 기관의 병리학 적 협착이 가장 빈번합니다. 세균성 식민지화의 조합, 기관 절제술 또는 내시경 관에 대한 이물질 반응 및 환자 별 요인은 비정상적인 염증 반응으로 이어집니다. 이러한 부적응 면역 반응은 기관내 의 콜라겐 침착으로 이어지며, 기관 및 후속 협착의 발광 을 초래합니다1,2. 이 질병에 대한 현재의 치료는 주로 외과적이기 때문에, 과도한 콜라겐 침착으로 이어지는 비정상적인 염증 및 성섬유성 경로를 대상으로 하는 대체 의학 기반 치료 패러다임을 개발하는 것이 연구되고 있다. MTOR 신호 복합체를 억제하는 라파마이신은 면역 억제 효과뿐만 아니라 강력한 항섬유아세포 효과가 있는 것으로 나타났습니다. 그러나 라파마이신이 체계적으로 투여되면 일반적인 부작용(예를 들어, 고지혈증, 빈혈, 혈소판 감소증)이 발음될 수있다 3. 우리의 방법론의 목적은 이러한 전신 효과를 줄이는 기도에서 사용하기 위해 실용적 인 국소 약물 전달을위한 차량을 개발하는 것입니다. 우리의 평가는 섬유아세포 기능을 억제하고 국소 면역 미세 환경을 변경하는 능력뿐만 아니라 약물 전달 구조에 대한 국소 면역 반응을 조사하는 데 중점을 둡니다. 질병 특정 결과는 섬유증의 마커를 평가하는 생체 내 시험을 포함합니다.
생분해성 약물 용출 스텐트는 기도4를포함한 여러 장기 시스템에서 질병의 동물 모델에서 사용되어 왔다. 기도 협착 또는 붕괴의 관리를 위해, 이전 조사는 약물 코팅 실리콘 및 니켈 기지를 둔 스텐트를사용했습니다 5. PLLA-PCL 시공은 3주 동안의 생리학적 조건에서의 약물 용출 프로파일 및 기계적 강도 때문에 이 특정 방법에 대해 선택되었으며, 이는 이전 발표된 연구에서 입증된6. PLLA-PCL은 또한 FDA4에의해 이미 승인 된 생체 적합성 및 생분해성 물질입니다. 시스플라틴과 MMC를 용출하는 생체 적합성 스텐트는 토끼와 개와 같은 대형 동물 모델에서 연구되었습니다. 그러나, 이러한 동물 모델에서, 스텐트는 질병의 동물 모델에 배치되지 않았고, 뇌전적으로 이식되었다. 본 연구는 기도 손상 및 후두 골착증의 마우스 모델에 횡단적으로 배치된 생체 적합성 약물 용출 스텐트를 평가하기 위한 독특한 방법을 제공한다. 면역 조절 약물을 국소적으로 용해시키고 뮤린 모델에서 연구를 위해 소형화 할 수있는 생체 적합성 스텐트는 번역 전 임상 연구에 유용합니다. 다른 재료 구성과 스텐트 활용에 대한 이전의 시도는 LTS7을구별하는 근본적인 염증을 악화시키는 강력한 이물질 반응을 생성했습니다. 이 방법론은, 우리의 지식에, LTS의 murine 모형에 있는 스텐트 기지를 둔 약 납품 시스템의 면역 조절 및 항섬유성 효력을 공부하는 그것의 종류의 첫번째입니다. 뮤린 모델 자체는 기관에 면역 조절 약물의 효과를 연구하기위한 몇 가지 장점을 제공합니다. 유전자 변형 마우스와 건강하고 병에 걸린 마우스의 실험 집단을 연구 할 수 있습니다, 이는 실험 재현으로 이어질 비용 효율성을 향상시킬 수 있습니다. 더욱이, 마우스 기관으로 스텐트를 횡단적으로 전달하는 것은 인간에서 그러한 스텐트의 임상 적 전달을 모방하여, 이 방법의 번역적 이점을 더욱 강조한다. 마지막으로, 약물과 PLLA-PCL 스텐트가 생성 될 수있는 상대적 용이성은 기관에서 흉터 형성을 감소시키기위한 대체 약물 요법을 제공하기 위해 수정을 허용합니다.
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Protocol
참고 : 여기에 설명 된 모든 방법은 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용위원회 (MO12M354)에 의해 승인되었습니다.
1. PLLA-PCL에서 라파마이신의 준비
- 70:30 PLLA-PCL 폴리머 용액(고유점도 1.3−1.8 DL/G)의 두 개의 유리 바이알(캡)을 준비합니다. 재료 표) 1.0% 라파마이신을 함유한 유리병과 라파마이신이 없는 다른 바이알이 있습니다.
- 유리 병에 600 mg의 70:30 PLLA-PCL에 6 mg의 라파마이신을 첨가하여 폴리머 용액을 함유하는 1.0% 라파마이신을 만듭니다.
- 라파마이신(제어)이 없는 폴리머 용액의 경우 유리 바이알에 70:30 PLLA-PCL 600 mg만 추가하십시오.
- 연기 후드 아래에 각 유리 병에 6 mL의 디클로로메탄을 추가하십시오.
주의: 디클로로메탄은 부식성 물질이며 유리 파이펫만 사용해야 합니다. 적절한 안전 예방 조치에는 개인 눈 보호 및 장갑이 포함됩니다. - 각 유리 병(2% 글리세롤 용액의 경우)에 120 μL의 글리세롤을 추가합니다.
참고: 글리세롤을 첨가하면 스텐트 구성물의 유연성이 향상되고 강성이 감소합니다. - 유리 바이알을 요약하고 라파마이신이 있고 없는 70:30 PLLA-PCL을 6-12시간 동안 용해및 균질화할 수 있습니다.
참고: 유리 바이알은 회전식 흔들림 플랫폼에 배치하여 더 빠른 용해를 할 수 있습니다.
2. 라파마이신 용출 테스트
- 파이펫 1 mL 70:30 PLLA-PCL 용액을 1% 라파마이신을 함유한 유리 페트리 접시.
참고 : 1 % 라파 마이신을 함유 한 70 :30 PLLA-PCL 용액의이 볼륨은 120 μg의 라파마이신을 포함하고 각 구문에서 라파마이신의 총량을 나타냅니다. 대체 부피를 사용할 수 있습니다. - 70:30 PLLA-PCL에 1% 라파마이신을 넣고 유리 페트리 접시의 평평한 디스크로 굳힙히 발라주세요.
- 일단 경화되면, 인산완충식염수(PBS, pH 7.4)의 2 mL에 디스크를 놓고 37°C 챔버에 배양한다.
- 24시간마다 PBS(2 mL)를 수집하고 교체하고 라파마이신 함량의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 위해 수집된 PBS를 사용합니다.
- 자동 샘플러와 C18 4.6cm x 250mm HPLC 컬럼을 사용하여 자동 샘플러 인젝터를 통해 샘플을 실행하고 라파마이신의 직렬 희석과 함께 보정된 표준 곡선을 만듭니다. 각 샘플을 세 배로 실행합니다.
참고: 시험할 라파마이신의 직렬 희석은 10%, 1%, 0.1%, 및 0.01%를 포함한다. - 2.0 mL/min의 유량으로 10/90 부피/부피의 HPLC 급수 및 아세토니트릴의 이면 단계를 사용하십시오. 라파마이신을 280nm로 HPLC 동안 흡광도를 설정합니다.
참고: 그림 1은 14일 동안 라파마이신의 용출을 보여줍니다.
3. 라파마이신 용출 PLLA-PCL 뮤린 기도 스텐트 생성
참고: 생체 내 및 시험관 내 응용 분야에 영향을 줄 수 있는 오염을 방지하기 위해 멸균 재료 및 멸균 기술을 사용하여 3.2−3.9 단계를 수행합니다.
- 섹션 1에 설명된 대로 라파마이신을 함유하는 PLLA-PCL 용액을 준비한다.
- 고무 풍선이있는 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 1 % 라파 마이신을 함유 한 PLLA-PCL 용액 1 mL을 22 G 불소 에틸렌 프로필렌 계 항옥세이터(재료 표)의정맥 캐뉼라에 적용합니다. 한 손에 협심증을 잡고 유리 파이펫을 사용하여 PLLA-PCL 용액을 angiocatheter에 떨어 뜨립니다. PLLA-PCL 용액으로 협심증의 균일 한 커버리지를 보장하기 위해 협심증을 천천히 회전시다.
참고 : 처음에는 PLLA-PCL 용액이 얇지만 디클로로메탄이 협심증에 적용되는 동안 증발함에 따라 용액은 협심증에 성형하는 데 더 점성이 있게됩니다. 응용 프로그램 동안 지속적으로 angiocatheter를 돌리는 것이 유익합니다. 이 단계는 스텐트의 일관된 두께를 보장하기 위해 천천히 세심하게 수행해야합니다. - 성형 된 angiocatheter를 아래쪽을 향하고 건조를위해 유리 페트리 접시의 가장자리에 힐트로 소품.
- 스텐트가 실온에서 진공 후드에서 24시간 동안 건조되도록하십시오(그림 2A).
- 기본 카테터를 부드럽게 비틀고 성형 된 스텐트에서 미끄러져 나오십시오(그림 2B).
- 주조 과정에서 발생할 수 있는 결함이 있는지 스텐트를 둘레에 확인하십시오. 주조 된 스텐트의 결함이 있으면 폐기하십시오.
- 주조 된 스텐트의 각 끝을 미세한 직선 가위로 다듬어 가장자리가 축이 되도록 합니다.
- 미세 한 직선 가위를 사용 하 여 LTS의 마우스 모델에 사용 하기 위해 캐스트 스텐트의 3 mm 축 세그먼트를 잘라(그림 2C).
참고: 약 8개의 스텐트는 1개의 주조된 협심증으로 만들 수 있으며, 각 3mm 스텐트는 120 μg의 라파마이신을 함유하고 있습니다. - LTS의 마우스 모델에 사용하기 위해 3mm 스텐트를 새로운 22 정맥 카테터에 로드합니다(그림1).
4. 쥐의 후생협성 협착증 유도
- 생체 내 마우스 연구를 수행하기 전에 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 얻습니다.
- 케타민 (80-100 mg /kg)과 자일라진 (5-10 mg / kg)의 복강 내 주사를 제공하여 9 주 된 남성 C57BL / 6을 마취하십시오.
참고 : 마우스의 다른 균주는 대체 될 수 있지만, 마우스 무게가 20-27g 사이에있는 것이 좋습니다. - 실험군(1% 라파마이신 함유 PLLA-PCL 스텐트의 배치와 함께 화학기계적 상해) 및 2개의 대조군으로 마우스를 무작위화한다: 1) PLLA-PCL 스텐트의 배치와 함께 화학기계적 상해, 2) 화학기계적 손상 없이 스텐트의 배치.
- 수술 플랫폼에 마우스를 놓습니다. 플랫폼 상단에 부착 된 작은 스레드 루프를 사용하여 중앙 절개 주위를 반복하여 자궁 경부 척추를 확장하십시오.
- 2인치 테이프를 사용하여 마우스의 손과 다리를 테이블에 부착합니다. 적절한 마취가 있었는지 확인하기 위해 마우스 발을 꼬집습니다.
- 수술 부위는 그런 다음 준비됩니다. 오버리 퍼를 제거하고 피부를 세 번 청소해야합니다 (알코올 또는 희석 된 피부 소독제로 요오드 또는 클로르헨시딘 스크럽을 번갈아 가며) 세 번. 이 부위는 드레이프해야 하며 멸균 장갑을 착용해야 합니다. 멸균 된 기기는 사용하지 않을 때 멸균 표면에 놓아야합니다.
- 미세한 곡선 의 홍채 가위를 사용하여 마우스의 목에 1.5cm 미드 라인 수직 절개를합니다. 겹쳐진 흉선과 두 개의 결과 로브를 측면화하여 기관을 시각화합니다. 겹치 있는 스테노하이드와 스테노갑상선(스트랩) 근육을 양면으로 우월한 부착체로 나눕니다.
참고 : 전체 후두 골라 힐 복합체는이 후에 완전히 노출되어야합니다. - 후두를 통해 22 G angiocatheter를 횡단적으로 통과하여 기관으로 들어갑니다. 작은 집게를 사용하여 마우스의 전방 후두에 압력을 가하여 협심증의 올바른 배치를 돕습니다. 기관을 통해 흰색 협심증을 시각화하여 올바른 배치 (비 식도)를 보장합니다.
참고 : 마우스 기관은 매우 얇고 흰색 angiocatheter는 반투명 기관을 통해 시각화됩니다. - 삽입된 angiocatheter를 통해 블로마이신 코팅 와이어 브러시를 전달합니다.
- 와이어 브러시만 기관에 남아 있도록 천천히 angiocatheter를 철회하십시오.
- 기관에 미세 한 집게를 사용하여 카운터 압력을 적용하여 와이어 브러시로 기관 내강을 기계적으로 방해하십시오.
- 와이어 브러시 위에 기관에 협심증을 다시 삽입합니다.
- 와이어 브러쉬를 제거하고 블로마이신을 다시 바하십시오.
- 4.8-4.12단계를 총 5회 반복합니다. 각 응용 프로그램 사이에 브러쉬에 블로마이신을 바하십시오.
참고 : 이 모델의 유효성 검사 및 설명은 Hillel 등8에서찾을 수 있습니다. - 마우스 기관에서 협심증을 제거합니다.
참고: 스텐트를 배치할 필요가 없는 경우 조직 접착제로 절개를 닫을 수 있습니다.
5. 마우스에 있는 경구 PLLA-PCL 스텐트 배치
- 빈 22 G angiocatheter에 3mm 캐스팅 스텐트 하나를로드(그림 3A).
참고 : 스텐트는 협심증의 끝에서 5mm 를 쉬어야합니다. - 3mm 주조 스텐트에 얇은 검은색 수직 선을 그립니다.
참고 : 이 라인은 기관에 스텐트의 개선 시각화를 할 수 있습니다. - 스텐트와 함께 미리 로드된 협심증으로 마우스를 장과하게 삽관합니다.
- 경막 절개를 통해 기관내 의 협심증에 스텐트를 시각화(그림 3B).
참고 : 기관은 매우 얇아서 스텐트의 검은 색 염료가 기관을 통해 시각화 될 수 있습니다. 올바른 기관 배치를 확인하려면 이 방법을 사용합니다. - 미세 한 집게와 경막 절개를 통해 기관을 잡고 장소에 스텐트를 개최.
- 미세 한 집게로 스텐트의 그립을 유지하면서 협심증을 경시로 제거하십시오.
참고 : 협심증을 제거 할 때 루멘을 분쇄하지 않도록 스텐트에 너무 많은 힘을 가하지 않는 것이 매우 중요합니다. 그러나 스텐트가 협심증으로 제거되지 않도록 충분한 힘이 필요합니다. 0.8 mm sialendoscope는 기관에 있는 스텐트의 위치 그리고 배치를 구상하기 위하여 이용될 수 있습니다. - 조직 접착제로 경막 절개를 닫습니다.
- 각 마우스를 케이지에 다시 배치하기 전에 원래 활동 수준으로 복구할 수 있도록 합니다.
6. 시료의 역학적 준비
- 7, 14, 또는 21 일 후에 동물 프로토콜 당 자궁 경관 탈구를 가진 흡입한 마취제및 희생 마우스를 가진 마우스를 마취합니다.
참고: 연구의 만성에 기초하여, 다른 시간 간격(예를 들면, 28, 30 일 등)을 사용할 수 있다. - 4.4 단계 및 4.5 단계에 설명된 대로 수술 플랫폼에 마우스를 놓습니다.
- 미세한 곡선 홍채 가위를 사용하여 마우스의 목 절개를 다시 엽니다.
- 단계 당 기관을 노출 4.6.
- 미세한 곡선 홍채 가위를 사용하여 말단 기관을 스텐트의 수준 이하로 나눕니다.
- 후두 아래와 미세한 곡선 홍채 가위를 사용하여 스텐트 위에 근위 기관을 나눕니다.
참고: 먼저 말단 기관을 나누어 기관관이 흉부로 후퇴하는 것을 방지하는 것이 중요합니다. - 분할된 기관을 식도 에서 후경으로 분리하고 마우스에서 기관을 제거합니다.
참고: 스텐트는 마우스 기관 내에 계속 유지됩니다. - 기관에서 스텐트를 제거하고 24 시간 동안 10 % 포르말린에 고정하십시오.
- 파라핀에 포름포르말린 고정 마우스 기관표본을 파라핀에 포함시키는 것은 다음 단계에서 기관의 축 컷이 이루어질 수 있도록 우수하게 지향된 말단을 가진다.
- 마이크로토메를 사용하여 파라핀 내장 마우스 기관의 5 μm 절편을 자른다.
참고: 표본은 말단 기관에서 시작하여 축으로 절단되어야 합니다. - 시편 길이를 따라 250 μm마다 5 μm 대표 섹션을 구합니다.
- 각 대표 섹션에 H&E 얼룩을 완료하십시오.
- 슬라이드당 2x를 3분 동안 자일렌에 넣음으로써 슬라이드를 분리합니다.
- 슬라이드를 2분 동안 100% 에탄올, 2분 동안 95% 에탄올, 2분 동안 70% 에탄올에 놓고 재수화합니다.
- 흐르는 수돗물로 슬라이드를 2 분 동안 씻으십시오.
- 3-5 분 동안 헤마톡실린에 슬라이드를 얼룩.
- 흐르는 수돗물로 슬라이드를 5 분 동안 씻으십시오.
- 슬라이드를 1% 산성 알코올에 1분 동안 놓습니다.
- 슬라이드를 흐르는 수돗물로 1 분 동안 씻으십시오.
- 30s에 대한 0.2 % 암모니아 물로 헹구다.
- 흐르는 수돗물로 슬라이드를 5분 간 헹구고 95% 에탄올 10배로 담급감합니다.
- 30s에 대한 에신 플록신에 슬라이드를 배치하여 얼룩을 eosin.
- 슬라이드를 95% 에탄올에 5분 동안 넣고 5분 동안 절대 에탄올 2x로 탈수합니다.
- 자일렌 2x를 5분 동안 두드리기.
- 자일렌 기반 마운팅 매체로 슬라이드를 장착합니다.
- Hillel 등8에설명된 대로 라미나 프로피리아의 두께를 측정합니다.
7. 생체 내 스텐트 생체 적합성
- 단계 6.1-6.4에서와 같이 조직 절편을 준비하십시오. 기관 내의 스텐트 위치에 대한 염증의 변화를 시각화하기 위해 이러한 기관 섹션에서 스텐트를 제거하지 마십시오.
- 스텐트에 대한 급성 이물질 반응을 확인하려면 CD3 및 F4/80 마커를 사용하여 대식세포 및 T 세포 활성을 관찰합니다.
참고: 그밖 마커는 또한 스텐트에 심각한 선동적인 반응을 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. - 시판되는 친수성 플러스슬라이드(재료 표)에서파라핀 내장 형 기관의 5 μm 컷 섹션을 가져옵니다. 각 슬라이드에 두 개의 섹션을 배치합니다.
참고: 이러한 섹션은 PLLA-PCL 스텐트가 배치된 기관 의 영역에서 유의해야 합니다.
- 스텐트에 대한 급성 이물질 반응을 확인하려면 CD3 및 F4/80 마커를 사용하여 대식세포 및 T 세포 활성을 관찰합니다.
- 슬라이드를 자일렌 2x에 각각 5분 동안 놓습니다.
- 슬라이드를 100% 에탄올 2x에 각각 3분 동안 놓습니다.
- 슬라이드를 95% 에탄올에 1분 동안 놓습니다.
- 슬라이드를 조직학 염색 랙에 놓고 항원 회수 완충제(재료표)에담근 다음 끓는 물로 채소 증기선에 20분 동안 놓습니다.
- 증기선에서 염색 랙을 제거하고 항원 회수 버퍼를 폐기합니다.
- 버퍼를 PBS의 1mL로 바꿉습니다.
- 슬라이드를 젖은 염색 상자에 1 분 동안 놓습니다.
- PBS를 버리고 30 분 동안 10 % FBS로 덜베코의 수정 된 독수리 매체 (DMEM)로 슬라이드를 인큐베이션하십시오.
- DMEM을 폐기하고 다른 종에서 제기 된 두 가지 기본 항체의 혼합물을 추가합니다. 슬라이드를 파라핀 필름으로 덮고 어두운 방에서 4°C에서 밤새 배양합니다.
참고 : 이 프로토콜에서 토끼 안티 CD3 및 쥐 안티 F4 / 80(재료표)가사용되었다. - 슬라이드를 PBS 3x로 5분 동안 세척합니다.
- 1차 항체 종에 특이적인 이차 항체로 슬라이드를 배양(재료표)하여DMEM에서 10% FBS로 0.5−1시간 동안 어둠 속에서 실온에서 배양한다.
- 슬라이드를 PBS 3x로 어두운 환경에서 5분 동안 씻습니다.
- 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 장착 매체의 방울과 커버 립에 슬라이드를 장착합니다. 슬라이드를 20°C 또는 4°C에서 어둠 속에서 보관합니다.
- 레이저 스캔 공초점 현미경 및 사진에 스테인드 슬라이드를 관찰합니다.
- DAPI로 염색하는 세포의 총 개수와 관심 있는 항체를 비물질 기관과 비교하여 정량화합니다.
8. 마우스 기관 정량 유전자 발현 분석
- 단계 6.1-6.7에 설명된 대로 마우스 기관을 수집하고 스텐트를 제거합니다.
참고: 수확된 마우스 기관도는 -80°C 냉동실에 최대 2년 동안 보관할 수 있습니다. - 8.1단계에서 수확된 기관 조직을 미세가위를 이용하여 추가로 균질화하고 1.4 mm 세라믹 비드(표)를 이용하여균질화하여 시판되는 컬럼 계 열기반 RNA 추출 키트(표의 재료)를사용한다.
참고 : 비드 밀 균질화 설정 = 6m / s에서 하나의 40 s 주기. - 기둥 기반 추출 및 정제 키트(재료 표)를사용 하 여 기관 용 해에서 RNA를 추출 하는 제조 업체의 지시에 따라.
- 분광광도계(물자 표)를 사용하여 각 샘플에서RNA를정량화합니다.
참고: RNA 순도는 순수 RNA 샘플 판독 2.0과 함께 260/230 nm 비율을 사용하여 평가됩니다. - 역전사(재료표)와열사이클러를 사용하여 추출된 RNA로부터 상보성 DNA를 생성합니다: 25°C에서 5분(프라이밍), 46°C에서 30분(역전사), 1분 동안 95°C(역전사의 불활성화).
- 상보적인 DNA 샘플을 RNase 자유물로 희석하여 정량적 실시간 PCR에 사용하기 위해 10-25 ng/mL의 농도로 희석합니다.
- 상보DNA(10-25 ng/mL)의 1μL을 PCR 마스터믹스(재료표)10 μL과 혼합하여 ddH2O의 8 μL과 10 μM의 0.5 μL을 전진시키고 96웰 PCR플레이트(재료표)의한 웰에서 관심 있는 유전자에 대해 역프리머를 혼합한다.
참고: 각 우물의 총 부피는 20 μL이어야 합니다. 96 웰 플레이트의 각 웰은 하나의 샘플과 하나의 관심 유전자를 포함해야합니다. - 관심있는 모든 유전자에 대해 8.1-8.7 단계를 반복하고 삼중 유전자에 대한 각 샘플을 실행합니다.
참고: 콜라겐 1, 콜라겐 3 및 기준 유전자 β-액틴에 대한 유전자 특이적 전방 및 역프라이머(표의 재료)는섬유증의 마커를 조사하기 위해 일반적으로 사용된다. - 96웰 플레이트를 실시간 정량적 PCR 기계위에 놓고 다음 프로토콜을 시작합니다: 15s 및 어닐에 대해 95°C에서 변성하고 40사이클 동안 60°C에서 60°C로 연장합니다.
- 각 GOI에 대한 ΔCT를 획득하기 위해 모든 시료에 대한 기준 유전자 β-액틴에 대한 CT 값으로 관심 있는 각 유전자(GOI)의 유전자 생성물 검출을 위한 주기 임계값(CT)을 정상화한다. 그런 다음 처리 및 처리되지 않은 샘플에 대해 각 GOI에 대한 ΔCT 값을 비교하여 ΔΔCT를 생성합니다.
참고: 주기 임계값은 소정의 양의 유전자 생성물이 존재하는 경우 증폭 곡선의 지점입니다(ΔRn). 각 반응에 대한 ΔRn 값은 관심 있는 각 유전자에 대해 결정되어야 하며 증폭 곡선의 선형 부분에 가을이되어야 합니다.
참고 : ΔCT = CT (GOI) – CT (참조 유전자); ΔΔCT = ΔCT (처리) – ΔCT (처리되지 않은). - 2ΔΔCT를계산하여 접기 변화의 식으로 처리된 샘플과 처리되지 않은 샘플 간의 유전자 발현의 상대적 변화를 계산합니다.
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Representative Results
본 연구에 사용된 라파마이신을 적재한 생분해성 PLLA-PCL 스텐트 생성물은 생리학적 조건에서 일관되고 예측 가능한 방식으로 라파마이신을 용출할 수있었다(도 1). 도 2는 LTS의 뮤린 모델에서 사용하기 위해 22 G angiocatheter 주위에 캐스팅된 PLLA-PCL 스텐트를 나타낸다. 기관에서 라파마이신 용출의 효과가 섬유증 감쇠에 효과적인지 확인하기 위해, 급성 염증의 섬유증 관련 유전자 발현 및 마커의 측정 된 변화는 유전자 발현 분석, 유세포 분석, 면역 형광 및 ELISA를 통해 평가 될 수있다. 전술한 방법을 사용하여 마우스의 기관내로 소형화된 스텐트를 성공적으로 배치하는 것이 입증되었다. 이 방법의 개략적인 그림은 그림 3에나와 있습니다. 도 4는 스텐트의 검은 마커에 의해 지시된 바와 같이 기관 내의 좌체에서 소형 생체 적합성 스텐트를 나타내며, 이는 반투명 마우스 기관을 통해 시각화된다. 초기 실험에서, 0.8 mm sialendoscope를 사용하여 기관에 스텐트의 배치를 확인하는 것이 도움이되었습니다. 21 일 후, 스텐트의 경구 배치가 효과적이고 스텐트가 원래 배치 된 위치에서 이동하지 않았는지 확인하기 위해 목 절개를 다시 열어 스텐트의 배치를 결정했습니다. 도 4B에도시된 바와 같이, 스텐트의 검정염소 마커는 스텐트가 기관에서 의 위치를 유지하는 것을 보여주었다. 스텐트로 치료 한 후 21 일 후 기관 절제술은 도 4C에나타내있습니다.
급성 및 만성 염증의 마커에 대한 면역 형광 염색을 이용한 생체 적합성 테스트의 대표적인 이미지는 그림 5에나와 있습니다. 이는 PLLA-PCL 스텐트 생성물(라파마이신 없이)이 배치 후 존재하는 최소한 수의 면역 세포에 의해 결정된 바와 같이 면역반응성이 아님을 입증하였다. 이 방법에서는 정상적인 손상되지 않은 기관을 사용하고 라파마이신이없는 PLLA-PCL 스텐트를 배치하여 구성자체에 대한 염증 반응을 결정하는 것이 중요합니다.
다음으로, 라파마이신 용출 PLLA-PCL 스텐트가 흉터 완화에 효과적인지 여부를 확인하기 위해, 우리는 이전에 급성 염증 및 섬유증의 마커에서 유전자 발현 변화를입증하였다 6. 구체적으로, 90.3배 감소(SEM±26.0; n=4; p< 0.01) 4일째에 col1a1의 감소뿐만 아니라 급성 염증 마커INF-γ, CD11b, Arg-1, 및 IL-1B6. 몇몇 유전자를 위한 접기 변경에 있는 다름이 중요하지 않더라도, 마우스의 더 중대한 코호트를 가진, 중요성이 달성될 수 있었다는 것을 가능합니다. 약물 용출 조직학적으로 인해 기관에 변화가 있었는지 또는 스텐트에 의한 방사형 힘 운동으로 인해 기관에 변화가 있었는지 여부를 확인하기 위해 라파마이신 용출 스텐트로 처리 된 기관에서 라미나 프로피아의 폭이 감소한 것을입증했습니다.
그림 1: 라파마이신 PLLA-PCL 용출. 1% 라파마이신을 함유하는 PLLA-PCL 구성체는 14일 동안 일관되고 예측 가능한 라파마이신 방출을 입증하였다. 데이터 포인트는 샘플링된 용출의 평균 ± SEM을 나타낸다(n=3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 스텐트 주조. (a)PLLA-PCL 용액을 22 G angiocatheter 주위로 건조하도록 하였다. (B)캐스트를 angiocatheter에서 제거하였다. (C)스텐트는 마우스 모델6에서사용하기 위해 3mm 길이로 절단하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 마우스의 경구 스텐트 삽입. (A)스텐트를 빈 협심증에 적재하고 기관에 횡단적으로 배치하였다. (B)스텐트에 검은 색 염료 표시는 마우스 기관에서의 위치를 확인하기 위해 경막 절개를 통해 볼 수 있습니다. (C)병이 있는 마우스 기관에 있는 스텐트의 대표적인 도면6. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 스텐트의 시트 이미지. (A-B) 검은 색 염료 표시가있는 스텐트는 뮤린 기관에 있는 그(것)들에서 보일 수 있습니다. (C)21일6일에수확한 후 스텐트와 뮤린 후유배 복합체의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 스텐트 생체 적합성. F4/80(대식세포, 적색 염색체) 및 CD3(녹색 염색체, T-림프구)에 대한 면역형광 염색은 4일째에(A)부상을 입지 않은 기관 및(B)PLLA-PCL 스텐트가 있는 기관에서 최소한의 염증 세포를 밝혀냈습니다. 이는(C)부상당한 기관, 두꺼워진 라미나 프로피아 및 양성 F4/80 및 CD3 염색6을가진 수많은 세포의 존재와 대조된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
생체 내에서 약물 용출 스텐트를 성공적으로 생성하고 사용하기 위한 가장 중요한 단계는 1) 바람직한 약물 용출 속도에 대한 최적의 PLLA-PCL 비율을 결정하고, 2) 용출될 약물의 적절한 농도를 결정하는 것, 3) 스텐트를 성형하는 것입니다. 생체 내 사용을 위한 angiocatheter 의 주위에, 및 4) 치명적인 기도 방해를 일으키지 않고 LTS 유도 후에 마우스로 스텐트를 장전하게 전달한다.
기도 질환의 동물 모델에서 스텐트를 사용하여 약물을 전달하는 몇 가지 방법이 있지만, 병들린 뮤린 모델에서 약물 전달이 가능한 생체 적합성 스텐트의 개발이 첫 번째입니다. 약물 전달을 위한 이 방법을 개발할 때, 이 방법에 대한 몇 가지 변형이 이루어졌다. 생리적 분비에도 불구하고 기관에 배치될 수 있을 정도로 기계적으로 단단한 스텐트를 만들기 위한 적절한 PLLA-PCL 조성물을 결정하는 것이 중요했습니다. PLLA-PCL의 70:30 조성물은 난치산테터 성형을 통해 라파마이신을 전형적으로 성공적으로 용출하고 마우스 모델에서 안전하고 신뢰할 수 있는 방식으로 배치할 수 있으며 생리학적으로 저하되지 않기로 결정되었습니다. 조건. 이 방법의 어렵고 잠재적으로 제조업체 의존적 부분은 angiocatheters 주위에 스텐트를 성형하는 것입니다. 처음에, 생체 내 스텐트를 시공할 때, 22 G angiocatheters는 유리 파이펫의 끝 안쪽에 배치되었고, 폴리머 용액은 앙지카테터와 유리 파이펫 사이의 공간에 부어, 사이의 공간의 캐스트를 형성한다. 그러나, 이 방법으로 인한 스텐트의 벽은 종종 너무 얇아서 기관에 안정적으로 배치할 수 없었습니다. angiocatheter에 스텐트를 성형하는 현재 방법의 한계는 일관성을 위해 제조 업체에 의존하고, 스텐트 생산의 균질성을 보장하기 위해 세부 사항에 세심한주의의 필요성이다. 캐스트된 스텐트 사이의 두께 차이 가능성은 향후 연구에서 해결되어야 합니다. 추가 연구를 통해, 우리는 협심증자와 유리 포위 사이의 공간이 50 μm, 우리는 스텐트의 적절한 벽 두께로 결정되도록 다른 유리 또는 비 부식성 재료로 둘러싸인 22 G angiocatheter에 대한 금형을 설계할 수 있기를 바랍니다. 기관에 쉽게 배치할 수 있습니다.
영향 받은 기관에 약 납품을 공부하기 위하여 생체 적합성 스텐트를 사용하기에 몇몇 이득이 있습니다. 전반적으로, 약물을 함유하는 중합체로 코팅된 금속 또는 실리콘으로 구성된 스텐트는 기관의 이미 상처입은 부분에 대한 과립 조직 및 추가의 염증 반응을 생성하는 것으로 나타났다. 생체적합성이 있는 생체재료로 만들어진 스텐트의 사용을 심문하고 또한 신뢰할 수 있는 방식으로 면역조절약물을 방출하는 방법이 유리하다. PLLA-PCL 스텐트는 또한 뮤린 모델에서 생체 적합성이 있는 것으로 나타났으며 급성 염증 반응을 유도하지 않는다. 섬유증에 대항할 수 있는 약물을 연구할 때, 이 방법에 기재된 바와 같이 PLLA-PCL과 같은 생체 적합성 물질로 완전히 구성된 스텐트를 사용하는 것이 유익하다.
사용 가능한 스텐트를 구성하기 위해 이 방법을 사용하는 이점 및 용이성은 PLLA-PCL의 조성이 다양할 수 있다는 것입니다. PLLA-PCL 재료의 이전 연구는 PLLA-PCL 블렌드의 변화가 물질의 더 큰 열화를 초래할 수 있음을 보여 주며, 더 빠른 약물 방출9를허용합니다. 더욱이, 이 방법을 이용하여 마우스에 배치할 수 있는 스텐트를 시공하는 것이 유리하며, 기도 질환에 대한 대부분의 스텐트 연구는 큰 동물10,11,12에서수행되었다. 다른 질병 패러다임을 위해 변형될 수 있고 병들한 상태에서 약물 용출 스텐트의 테스트를 허용할 수 있는 마우스 모델의 사용은 이상적이다. 병에 걸린 상태에서 약물 용출 스텐트를 테스트하고 질병이없는 동물의 효능을 비교할 수 있다는 것은 더 큰 실험적 엄격함을 허용합니다. 이 방법은 또한 스텐트가 외과적으로 이식된 이전 연구와 는 달리 기도에 대한 약물 용출 스텐트를 횡단적으로 배치할 수 있는 방법을 보여줍니다.
이 연구는 작은 동물 모델에서 스텐트 개발 및 테스트를 위한 매우 사용 가능한 플랫폼을 보여줍니다. 그러나, 인간의 주제에 사용 하기 위해 다른 요소를 고려 해야 합니다. 스텐트의 단단하고 단단한 성격을 감안할 때 그것은 가능성이 채널유연한 기관지 내포를 통해 배치 될 수 없습니다하지만 직접 후두 경검사 및 경직기관지 내시경과 횡단 배치해야합니다. 이상적으로, 스텐트는 restenosis를 완화하는 것을 돕도록 기도의 풍선 팽창 후에 두어질 것입니다. 환자 안전의 전망에서, 스텐트가 이동하는 가능성은 잠재적으로 생명을 위협하는 기도 타협으로 이끌어 낼 수 있기 때문에 큰 관심사입니다. 둘째, 점액이나 혈액의 축적에 이차 스텐트 방해에 대한 가능성도 고려해야합니다. 이러한 위험을 최소화하기 위해서는 추가적인 테스트와 개발이 필요합니다.
미래 연구는 다른 면역 억제 처리가 기관에 있는 흉터 대형을 완화할 수 있는 방법을 더 이해하기 위하여 PLLA-PCL 혼합에 있는 다른 약을 시험하기 위하여 이 방법을 이용해서 이용하실 수 있습니다. 이러한 스텐트는 마우스에 배치될 수 있기 때문에, 흉터 형성 유전자에 대한 유전자 변형을 가진 더 큰 마우스 또는 마우스 의 코호트를 사용하여 또한 시험될 수 있다. 향후 실험은 또한 스텐트의 만성 이식 후 발생할 수있는 기관에 대한 변경 (3-6 개월) 및 기관내강자뿐만 아니라 염증 성 마커 및 섬유증의 유전자 발현 프로필에 대한 변화를 이해하는 것을 포함 할 수 있습니다. 마커.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
수상 번호 1K23DC014082 및 1R21DC017225 (알렉산더 힐렐)에서 건강의 국립 연구소의 청각 장애 및 기타 통신 장애에 대한 국립 연구소. 이 연구는 또한 재정적으로 삼과 학회와 외과 의사의 미국 대학 (알렉산더 힐렐), 미국 의학 협회 재단, 시카고, 일리노이 (Madhavi Duvvuri) 및 T32 NIDCD 교육 보조금 (케빈 모츠)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
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