Design af en biokompatibel Drug-Eluting tracheal stent i mus med Laryngotracheal stenose

Summary

Laryngotracheal stenose resultater fra patologisk ar deposition, der kritisk indsnævrer trakeal luftvejene og mangler effektive medicinske behandlinger. Ved hjælp af en PLLA-PCL (70% poly-L-lactide og 30% polycaprolactone) stent som et lokalt lægemiddel fremføringssystem, kan potentielle terapier, der tager sigte på at nedsætte ar-spredningen i luftrøret, undersøgt.

Abstract

Laryngotracheal stenose (LTS) er en patologisk forsnævring af subglottis og luftrør, der fører til extrathoracic obstruktion og signifikant kortåndethed. LTS resultater fra slimhinde skade fra et fremmedlegeme i luftrøret, fører til vævsskade og en lokal inflammatorisk respons, der går skævt, fører til aflejring af patologisk arvæv. Behandling for LTS er kirurgisk på grund af manglen på effektive medicinske terapier. Formålet med denne metode er at konstruere en biokompatibel stent, der kan miniaturiserede at placere i mus med LTS. Vi påviste, at en PLLA-PCL (70% poly-L-lactide og 30% polycaprolactone) konstruere havde optimal Biomekanisk styrke, var biokompatibel, praktisk anvendelig til en in vivo placering stent, og i stand til at eluere stof. Denne metode giver et lægemiddel levering system til afprøvning af forskellige immunmodulerende agenter til lokalt hæmme inflammation og reducere luftvejs fibrose. Fremstilling af stenter tager 28 − 30 h og kan gengives nemt, giver mulighed for eksperimenter med store kohorter. Her inkorporerede vi lægemidlet Rapamycin i stent for at teste dets effektivitet i at reducere fibrose og kollagen deposition. Resultaterne afslørede, at PLLA-PCL-telte viste pålidelig Rapamycin-frigivelse, var mekanisk stabile under fysiologiske forhold og var biokompatible, hvilket inducerende lille inflammatorisk respons i luftrøret. Desuden reducerede Rapamycin-eluting plla-PCL-stenter ardannelse i luftrøret in vivo.

Introduction

Laryngotracheal stenose (LTS) er en patologisk indsnævring af luftrøret oftest på grund af iatrogen Post-intubation skade. Kombinationen af bakteriel kolonisering, fremmedlegeme respons på en trakeostomi eller endotracheal tubus tube, og patient-specifikke faktorer fører til en afvigende inflammatorisk respons. Denne Maladaptive immunrespons fører til aflejring af kollagen i luftrøret, hvilket resulterer i luminale indsnævring af luftrør og efterfølgende stenose^1,2. Som Aktuel behandling for denne sygdom er primært kirurgisk, udvikle en alternativ medicinsk baseret behandling paradigme rettet mod de afvigende inflammatoriske og profibrotiske veje, der fører til overdreven kollagen deposition er blevet undersøgt. Rapamycin, som hæmmer mTOR signalering kompleks, har vist sig at have Immunsuppressive virkninger samt en robust antifibroblast effekt. Men, når Rapamycin er systemisk administreret, almindelige bivirkninger (f. eks hyperlipidæmi, anæmi, trombocytopeni) kan udtales³. Formålet med vores metodologi er at udvikle et køretøj til lokal lægemiddel levering, der er praktisk muligt til brug i luftvejene, som ville mindske disse systemiske virkninger. Vores vurderinger fokuserer på at undersøge det lokale immunrespons på lægemiddel leverings konstruktionen samt dets evne til at hæmme fibroblast funktion og ændre det lokale immun mikromiljø. Sygdomsspecifikke resultater omfatter in vivo-testning, der evaluerer markører for fibrose.

Biologisk nedbrydelige stoffer, der elueret, er blevet anvendt i dyre sygdomsmodeller i flere organ systemer, herunder luftvejene⁴. Til håndtering af luftvejs stenose eller kollaps har tidligere undersøgelser brugt stof belagt silikone og nikkelbaserede stenter⁵. En PLLA-PCL-konstruktion blev valgt til denne særlige metode på grund af stoffets elueringsprofil og mekaniske styrke under fysiologiske forhold over en periode på 3 uger, hvilket er blevet påvist i tidligere offentliggjorte undersøgelser⁶. PLLA-PCL er også et biokompatibelt og biologisk nedbrydeligt materiale, der allerede er godkendt af FDA⁴. Biokompatible stenter elutering af Cisplatin og MMC er blevet undersøgt i store dyremodeller som kaniner og hunde. I disse dyremodeller blev stenter imidlertid ikke anbragt i en dyre sygdomsmodel og blev implanteret transcervically. Denne undersøgelse giver en unik metode til vurdering af en biokompatibel Drug-eluting stent placeret transorally i en musemodel af luftvejs skader og laryngotracheal stenose. En biokompatibel stent, der elutter en immunmodulerende lægemiddel lokalt og kan miniaturiserede for undersøgelse i en murine model er værdifuld for Translationel præklinisk forskning. Tidligere forsøg på stent udnyttelse med andre materielle konstruktioner genereret robuste fremmedlegeme svar forværret den underliggende inflammation, der skelner LTS⁷. Denne metode, til vores viden, er den første af sin art til at studere immunmodulerende og anti fibrotiske virkninger af en stent-baserede Drug delivery system i en murine model af LTS. Den murine model selv giver flere fordele for at studere virkningerne af en immunmodulerende stof på luftrøret. Genetisk modificerede mus og eksperimentelle kohorter af raske og syge mus kan undersøgt, hvilket kan føre til eksperimentel reproducerbarhed og forbedre omkostningseffektiviteten. Desuden efterligner leveringen af stenten transorally i muse luftrøret klinisk levering af en sådan stent hos mennesker, hvilket yderligere fremhæver den translationelle fordel ved denne metode. Endelig, den relative lethed, hvormed PLLA-PCL stent med stoffet kan produceres giver mulighed for modifikationer til at levere alternative lægemidler behandlinger med henblik på at reducere ardannelse i luftrøret.

Protocol

Bemærk: alle metoder, der er beskrevet her, blev godkendt af Johns Hopkins University Animal Care og use Committee (MO12M354).

1. klargøring af Rapamycin i PLLA-PCL

1. Forbered to hætteglas (med hætter) på 70:30 PLLA-PCL-polymer opløsninger (iboende viskositet 1,3 − 1,8 DL/G; Tabel over materialer) med et hætteglas, der indeholder 1,0% Rapamycin og den anden uden Rapamycin.
   1. Lav en 1,0% Rapamycin-indeholdende polymeropløsning ved at tilføje 6 mg Rapamycin til 600 mg af 70:30 PLLA-PCL i et hætteglas.
   2. Til polymeropløsning uden Rapamycin (kontrol) tilsættes kun 600 mg af 70:30 PLLA-PCL til hætteglasset.
2. Tilsæt 6 mL dichlormethan til hvert hætteglas under en stinkhætte.
   Forsigtig: dichlormethan er et ætsende materiale, og der bør kun anvendes glas pipetter. Passende sikkerhedsforanstaltninger omfatter personlig øjenbeskyttelse og handsker.
3. Tilsæt 120 μL glycerol til hvert hætteglas (til 2% glycerolopløsning).
   Bemærk: tilsætning af glycerol giver mulighed for øget fleksibilitet og nedsat stivhed i stent-konstruktionen.
4. Sæt hætteglassene på igen, og lad 70:30 PLLA-PCL med og uden Rapamycin opløse og homogenisere i 6 − 12 timer.
   Bemærk: hætteglas kan også placeres på en roterende ryste platform for hurtigere opløsning.

2. testning af Rapamycin-eluering

1. 1 mL 70:30 PLLA-PCL-opløsning, der indeholder 1% Rapamycin, afpipetteres i en Glaspetri skål.
   Bemærk: dette volumen på 70:30 PLLA-PCL-opløsning indeholdende 1% Rapamycin vil indeholde 120 μg Rapamycin og repræsenterer den totale mængde Rapamycin i hver konstruktion. Alternative volumener og koncentrationer kan anvendes.
2. Lad 70:30 PLLA-PCL med 1% Rapamycin hærde til en flad skive i glas Petri skålen.
3. Når det er hærdet, Placer disken i 2 mL fosfat-bufferet saltvand (PBS, pH 7,4) og Inkuber i et 37 °C kammer.
4. Saml og Udskift PBS (2 mL) hver 24 h og brug indsamlet PBS til højtydende væskekromatografi (HPLC) analyse af Rapamycin indhold.
5. Brug en Autosampler og en C₁₈ 4,6 cm x 250 mm HPLC-søjle til at køreprøver gennem Autosampler injektoren sammen med serielle fortyndinger af Rapamycin for at skabe en kalibreret standardkurve. Kør hver prøve i tre eksemplarer.
   Bemærk: serielle fortyndinger af Rapamycin, der skal testes, omfatter 10%, 1%, 0,1% og 0,01%.
6. Brug en mobil fase af HPLC-kvalitet vand og acetonitril med 10/90 volumen/volumen med en strømningshastighed på 2,0 mL/min. Indstil absorbans under HPLC for Rapamycin til 280 Nm.
   Bemærk: figur 1 viser elueringsopløsningen af Rapamycin over en 14-dages periode.

3. oprettelse af Rapamycin-eluting PLLA-PCL murine luftveje stenter

Bemærk: Udfør trin 3.2 − 3.9 ved hjælp af sterile materialer og steril teknik for at undgå kontaminering, der ville påvirke in vivo og in vitro applikationer.

1. Forbered PLLA-PCL-opløsninger, der indeholder Rapamycin, som beskrevet i punkt 1.
2. Brug en glas-Pasteur-pipette med en gummi ballon til at anvende 1 mL PLLA-PCL-opløsning indeholdende 1% Rapamycin på den venøse kanyle på et 22 G fluorholdig ethylenpropylen baseret angiocatheter (tabel over materialer). Hold angiocatheter i den ene hånd, og brug glas pipetten til at droppe PLLA-PCL-opløsningen på angiocatheter. Drej langsomt angiocatheter for at sikre en homogen dækning af angiocatheter med PLLA-PCL-opløsningen.
   Bemærk: for det første vil PLLA-PCL-opløsningen være tynd, men da dichlormethan fordamper under påføring på angiocatheter, vil opløsningen blive mere viskøs for at forme på angiocatheter. Det er gavnligt at dreje angiocatheter kontinuerligt under applikationen. Dette trin skal gøres langsomt og omhyggeligt for at sikre en konsekvent tykkelse af stent.
3. Prop den støbte angiocatheter med spidsen af angiocatheter vender nedad og Hilt på kanten af en Glaspetri skål til tørring.
4. Lad stenter tørre i 24 timer i en vakuum hætte ved stuetemperatur (figur 2a).
5. Fjern stent-konstruktionen fra det underliggende angiocatheter ved forsigtigt at dreje det underliggende kateter frit og skubbe det ud af den støbte stent (figur 2B).
6. Kontrollér stent for eventuelle defekter, der måtte have resulteret i støbnings processen. Hvis en defekt i den støbt stent er til stede, skal den kasseres.
7. Trim hver ende af den støbt stent med fin lige saks, så kanterne er aksiale.
8. Ved hjælp af fin straight saks skæres 3 mm aksiale segmenter af støbt stent til brug i en musemodel af LTS (figur 2C).
   Bemærk: ca. 8 stenter kan laves fra en støbt angiocatheter, med hver 3 mm stent indeholdende 120 μg Rapamycin.
9. Læg 3 mm stent på et nyt 22 venøs kateter til brug i en musemodel af LTS (figur 1).

4. laryngotracheal stenose induktion i mus

1. Forud for udførelse in vivo mus undersøgelser indhente godkendelse fra Udvalget for dyrepasning og brug.
2. Anæstetize en 9-ugers gammel mandlig C57BL/6 ved at give en intraperitoneal injektion af ketamin (80 − 100 mg/kg) og xylazin (5 − 10 mg/kg).
   Bemærk: andre stammer af mus kan udskiftes, men det anbefales, at musene vejer mellem 20 − 27 g.
3. Randomiserer mus til en eksperimentel gruppe (kemo mekanisk skade med en placering af en 1% Rapamycin-indeholdende PLLA-PCL stent) og to kontrolgrupper: 1) chemomekanisk skade med placeringen af en PLLA-PCL stent, 2) kemo omekanisk skade uden placering af en stent.
4. Placer en mus på en kirurgisk platform i en liggende position. Brug en lille løkke af tråd fastgjort til toppen af platformen for at forlænge den cervikale rygsøjlen ved at looping det omkring de centrale fortænder.
5. Fastgør hænderne og benene på musen til bordet ved hjælp af 2 tommer stykker tape. Knib muse pote for at sikre, at det har haft tilstrækkelig anæstesi.
6. Det kirurgiske sted er derefter prepped. Den overliggende pels skal fjernes, og huden skal rengøres (alternerende jod eller chlorhexidin scrub med alkohol eller fortyndet huddesinfektions middel) tre gange. Området skal være draperet og sterile handsker bæres. De steriliserede instrumenter bør lægges på en steril overflade, når de ikke er i brug.
7. Lav en 1,5 cm midterlinje lodret snit i halsen af musen ved hjælp af fine buede iris saks. Opdel den overliggende thymus og lateralize de to resulterende lapper for at visualisere luftrøret. Opdel de overliggende sternohyoid og sternothyroid (REM) muskler på den overlegne fastgørelse bilateralt.
   Bemærk: hele laryngotracheal komplekset bør være helt eksponeret efter dette.
8. Passere en 22 G angiocatheter transorally gennem strubehovedet ind i luftrøret. Brug små tang til at lægge pres på den forreste strubehovedet af musen for at hjælpe med den korrekte placering af angiocatheter. Visualiser det hvide angiocatheter gennem luftrør for at sikre korrekt placering (ikke-esophageal).
   Bemærk: musen luftrør er ekstremt tynd og den hvide angiocatheter vil blive visualiseret gennem gennemskinnelige luftrør.
9. Der passerer en bleomycin-belagt trådbørste gennem det indsatte angiocatheter.
10. Træk langsomt angiocatheter ud, så kun trådbørsten forbliver i luftrøret.
11. Påfør modtrykket ved hjælp af fine pincet på luftrør til mekanisk at forstyrre trakeal lumen med trådbørsten.
12. Sæt angiocathometeret ind i luftrøret over trådbørsten.
13. Fjern trådbørsten og genanvend bleomycin.
14. Gentag trin 4.8 − 4.12 i alt 5x. Påfør bleomycin til børsten mellem hver applikation.
    Bemærk: validering og beskrivelse af denne model findes i Hillel et al.⁸.
15. Fjern angiocatheter fra muse luftrør.
    Bemærk: Hvis der ikke skal placeres stent, kan snittet lukkes med vævs lim.

5. transoral PLLA-PCL-stent placering i mus

1. Læg en 3 mm støbt stent på et tomt 22 G angiocatheter (figur 3A).
   Bemærk: stent skal hvile 5 mm fra spidsen af angiocatheter.
2. Tegn en tynd sort lodret linje på den 3 mm støbt stent.
   Bemærk: denne linje giver mulighed for forbedret visualisering af stent i luftrøret.
3. Transorally intubate musen med angiocatheter, der er blevet forudindlæst med stent.
4. Visualisere stent på angiocatheter i luftrøret gennem det transcerviske snit (figur 3B).
   Bemærk: luftrøret er meget tyndt, så det sorte farvestof på stent skal visualiseres gennem luftrøret. Brug denne til at bekræfte korrekt trakeal placering.
5. Hold stenten på plads ved at gribe luftrøret gennem det transcerviske snit med fine pincet.
6. Fjern angiocatheter transorally, mens du bevarer et greb om stenten med fine pincet.
   Bemærk: det er ekstremt vigtigt ikke at anvende for meget kraft til stent for ikke at knuse lumen, når angiocatheter fjernes. Der kræves dog tilstrækkelig kraft til at sikre, at stent ikke fjernes med angiocatheter. En 0,8 mm sialendoskop kan bruges til at visualisere placering og placering af stent i luftrøret.
7. Luk den transcervikal indsnit med væv lim.
8. Lad hver mus til at komme sig til sin oprindelige aktivitetsniveau, før du placerer den tilbage i sit bur.

6. histologisk forberedelse af prøver

1. Bedøve mus med inhaleret anæstesi og ofrer mus med livmoderhals dislokation pr. dyre protokol efter 7, 14 eller 21 dage.
   Bemærk: på baggrund af undersøgelsens kronicitet kan der anvendes forskellige tidsintervaller (f. eks. 28, 30 dage osv.).
2. Placer en mus på Operations platformen som beskrevet i trin 4,4 og 4,5.
3. Genåbne halsen indsnit på musen ved hjælp af fine buede iris saks.
4. Udsæt luftrøret pr. trin 4,6.
5. Del det distale luftrør under niveauet af stent ved hjælp af fin buet iris saks.
6. Del det proksimale luftrør under strubehovedet og over stenten ved hjælp af fin buet iris saks.
   Bemærk: det er vigtigt at opdele den distale luftrør først for at forhindre luftrøret i at trække sig ind i thorax.
7. Adskil det opdelte luftrør fra spiserøret bagtil og fjern luftrøret fra musen.
   Bemærk: stents vil stadig blive opbevaret i muse luftrør.
8. Fjern stent fra luftrør og Fix i 10% formalin for 24 h.
9. Indkapsle formalin-faste mus luftrøret prøver i paraffin med den distale ende orienteret overlegent, så aksiale nedskæringer af luftrøret kan foretages i næste trin.
10. Skær 5 μm sektioner af paraffin-indlejret mus luftrøret ved hjælp af en mikrotom.
    Bemærk: prøverne skal skæres aksialt fra det distale luftrør.
11. Der opnås en 5 μm repræsentativ sektion hver 250 μm langs prøvens længde.
12. Komplet H & E plet på hver repræsentativ sektion.
    1. Deparaffinize diasene ved at placere i xylen 2x pr. slide i 3 min.
    2. Placer diasene i 100% ethanol i 2 min, 95% ethanol i 2 min, og 70% ethanol i 2 min at rehydrere.
    3. Vask slides med rindende ledningsvand i 2 min.
    4. Plette gliderne i hematoxylinlegemer i 3 − 5 minutter.
    5. Vask slides med rindende ledningsvand i 5 min.
    6. Placer diasene i 1% syre alkohol i 1 min.
    7. Vask slides med rindende ledningsvand i 1 min.
    8. Skyl i 0,2% ammoniak vand i 30 s.
    9. Skyl slidene i rindende ledningsvand i 5 min. dip i 95% ethanol 10x.
    10. Eosin pletter ved at placere slide i eosin phloxin for 30 s.
    11. Dehydrat slidene ved at placere i 95% ethanol i 5 min, efterfulgt af absolut ethanol 2x i 5 min.
    12. Placer i xylen 2x i 5 min.
    13. Monter diasene med xylen-baseret monterings medium.
13. Mål tykkelsen af lamina propria som beskrevet i Hillel et al.⁸.

7. stent biokompatibilitet in vivo

1. Forbered vævs sektioner som i trin 6.1 − 6.4. Du må ikke fjerne stent fra disse trakeal sektioner for at visualisere ændringer i inflammation i forhold til placeringen af stent i lumen af luftrøret.
   1. For at bestemme den akutte fremmedlegeme respons på stent, observere makrofag og T celle aktivitet ved hjælp af CD3 og F4/80 markører.
      Bemærk: andre markører kan også bruges til at bestemme akut inflammatorisk reaktion på stent.
   2. Få 5 μm skære sektioner af paraffin-indlejret luftrør på kommercielt tilgængelige hydrofile plus slides (tabel over materialer). Placer to sektioner på hvert dias.
      Bemærk: disse sektioner skal være fra et område af luftrøret, hvor PLLA-PCL-stenten blev anbragt.
2. Placer diasene i xylen 2x i 5 min. hver.
3. Placer slides i 100% ethanol 2x for 3 min hver.
4. Placer diasene i 95% ethanol i 1 min.
5. Placer diasene i et histologisk farvnings stativ, så de nedsænkes i antigen søgnings bufferen (tabel over materialer) og derefter placeres i en vegetabilsk damper med kogende vand i 20 min.
6. Fjern farvnings stativerne fra dampen, og kassér antigen søgnings bufferen.
7. Udskift bufferen med 1 mL PBS.
8. Placer diasene i en våd farvnings boks i 1 min.
9. Kassér PBS og Inkuber gliderne med Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) med 10% FBS i 30 minutter.
10. Kassér DMEM og tilsæt en blanding af to primære antistoffer, der er opvokset i forskellige arter. Dæk slides med paraffin film og Inkuber natten over ved 4 °C i et mørkt rum.
    Bemærk: i denne protokol blev kanin anti-CD3 og rat anti-F4/80 (tabel over materialer) anvendt.
11. Vask slides i PBS 3x i 5 min.
12. Inkubér gliderne med sekundære antistoffer, som er specifikke for de primære antistof arter (tabel over materialer) fortyndet i DMEM med 10% FBS for 0,5 − 1 h ved stuetemperatur i mørke.
13. Vask diasene i PBS 3x i 5 minutter i mørket.
14. Monter diasene på dæksedler med en dråbe af monterings medium med 4 ' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Opbevar gliderne i mørket ved enten 20 °C eller 4 °C.
15. Observere de farvede slides på en laser Scan confokale mikroskop og fotografi.
16. Kvantificere det samlede antal celler, som farvninger med DAPI, og antistoffer af interesse for sammenligning med uskadet luftrør.

8. mus luftrøret kvantitativ Gen ekspression analyse

1. Saml muse luftrøret som beskrevet i trin 6.1 − 6.7 og fjern stent.
   Bemærk: høstede muse tracheas kan opbevares i en-80 °C fryser i op til 2 år.
2. Udtørring af det trakeal væv, der høstes i trin 8,1 ved hjælp af finsaks og yderligere homogeniserer ved hjælp af en perle fræser homogenisator med 1,4 mm keramiske perler (tabel over materialer) som en del af et kommercielt tilgængeligt kolonne baseret RNA-ekstraktions Kit (tabel over materialer).
   Bemærk: Bead Mill homogenisator indstillinger = 1 40 s cyklus ved 6 m/s.
3. Uddrag RNA fra trakeal lysat ved hjælp af en kolonne-baseret udvinding og rensning Kit (tabel over materialer) efter producentens anvisninger.
4. Kvantificere RNA fra hver prøve ved hjælp af et spektrofotometer (tabel over materialer).
   Bemærk: RNA-renhed vurderes ved hjælp af 260/230 nm-forholdet med en ren RNA-prøve aflæsning 2,0.
5. Opret komplementær DNA fra ekstraheret RNA ved hjælp af reverse transkriptase (tabel over materialer) og en termo cycler med følgende indstillinger: 5 min ved 25 °c (priming), 46 °c i 30 min (reverse transkriptionen), og derefter 95 °c i 1 min (inaktivering af reverse transkriptase).
6. Supplerende DNA-prøver fortyndes med RNase frit vand til en koncentration på 10 − 25 ng/mL til brug i kvantitativ real-time PCR.
7. 1 μL af komplementært DNA (10 − 25 ng/mL) blandes med 10 μL af en PCR mastermix (tabel over materialer), 8 μl DDH₂O og 0,5 μl af 10 μM fremadgående og omvendte primere for det gen af interesse i en brønd af en 96-brønd PCR plade (tabel over materialer).
   Bemærk: det totale rumfang i hver brønd skal være 20 μL. Hver brønd på 96 brønd pladen bør kun indeholde én prøve og et gen af interesse.
8. Gentag trin 8.1 – 8,7 for alle gener af interesse, og Kør hver prøve for hvert gen i tre eksemplarer.
   Bemærk: de gen-specifikke fremad-og omvendte primere (tabel over materialer) for kollagen 1, kollagen 3, og reference genet β-actin er almindeligt anvendt til at undersøge markører for fibrose.
9. Placer 96 brønd pladen på den kvantitative PCR-maskine i realtid, og start følgende protokol: denaturere ved 95 °C i 15 s og anneal og Forlæng ved 60 °C for 60 s for 40 cyklusser.
10. Normalisere cyklus tærskelværdi (CT) for genprodukt påvisning af hvert gen af interesse (GOI) til CT-værdien for reference genet β-actin for alle prøver for at opnå et ΔCT for hver GOI. Sammenlign derefter ΔCT-værdierne for hver GOI for behandlede og ubehandlede prøver for at generere et ΔΔCT.
    Bemærk: cyklus tærsklen er punktet på forstærknings kurven, når en forudbestemt mængde genprodukt er til stede (ΔRn). ΔRn-værdien for hver reaktion skal bestemmes for hvert gen af interesse og bør falde på den lineære del af forstærknings kurven.
    NOTE: ΔCT = CT (GOI) – CT (reference genet); ΔΔCT = ΔCT (behandlet) – ΔCT (ubehandlet).
11. Den relative ændring i genekspression mellem behandlede og ubehandlede prøver beregnes som et udtryk for fold ændring ved beregning af 2^ΔδCT.

Representative Results

Den bionedbrydelige PLLA-PCL-stentkonstruktion med Rapamycin anvendt i dette studie var i stand til at eluere Rapamycin på en konsistent og forudsigelig måde under fysiologiske forhold (figur 1). Figur 2 viser plla-PCL-stenten omkring en 22 G angiocatheter til brug i en murine-model af LTS. For at afgøre, om virkningerne af Rapamycin eluering i luftrøret er effektive i formildende fibrose, kan de målte ændringer i Fibrosis-relateret genekspression og markører for akut inflammation vurderes ved hjælp af genekspressions analyse, flowcytometri, immunofluorescens og ELISA. Der er påvist en vellykket placering af en miniaturiseret stent i musens luftrør ved hjælp af den ovenfor beskrevne metode. En skematisk metode er vist i figur 3. Figur 4 viser den miniaturiserede, biokompatible stent in situ i luftrøret, som indikeret af den sorte markør på stenten, som visualiseres gennem det gennemskinnelige muse luftrør. Ved indledende eksperimenter var det nyttigt at bruge et 0,8 mm sialendoskop til at bekræfte placeringen af stent i luftrøret. Efter 21 dage, at bekræfte, at den transorale placering af stent var virkningsfulde og stent ikke migrere fra sin oprindeligt placerede position, halsen indsnit blev genåbnet for at bestemme placeringen af stent. Som vist i figur 4Bviste den sorte farve markør for stenten, at stent fastholdt sin position i luftrøret. Resektion af luftrøret efter 21 dages behandling med stent er vist i figur 4C.

Repræsentative billeder af biokompatibilitets test ved hjælp af immunfluorescent farvning for markører for akut og kronisk inflammation er vist i figur 5. Dette viste, at PLLA-PCL-stentkonstruktionen (uden Rapamycin) ikke var immunoreaktiv som bestemt af det minimale antal immunceller, der er til stede efter placeringen. Det er vigtigt at bemærke, at der i denne metode blev anvendt normale, uforskadet tracheas, og en PLLA-PCL-stent uden Rapamycin var placeret til at bestemme det inflammatoriske respons på selve konstruktionen.

Dernæst for at afgøre, om Rapamycin-eluting PLLA-PCL stent var effektiv til at afbøde ar, vi tidligere påvist genekspression ændringer i markører for akut inflammation og fibrose⁶. Specifikt, der er en 90,3 fold reduktion (SEM ± 26,0; n = 4; p < 0,01) reduktion i col1a1 på dag 4 samt de akutte INFLAMMATORISKE markører inf-γ, CD11b, ARG-1 og Il-1b⁶. Selv om forskellene i fold ændring for nogle gener ikke var signifikant, er det muligt, at med en større kohorte af mus, kunne betydning opnås. For at afgøre, om der var ændringer i luftrøret på grund af lægemiddel eluering Histologisk, eller om der var ændringer i luftrøret på grund af radial kraftanstrengelse af stent, vi viste, at der var et fald i bredden af lamina propria i disse tracheas behandlet med Rapamycin-eluering stenter i forhold til dem uden Rapamycin-eluting stenter⁶.

Figur 1: Rapamycin PLLA-PCL-eluering. PLLA-PCL-konstruktionen, der indeholder 1% Rapamycin, udviste en konsistent og forudsigelig frigivelse af Rapamycin over en 14-dages periode. Data punkter repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM for eluering af prøven (n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: stent Casting. A) plla-PCL-opløsningen fik lov til at tørre omkring en 22 G angiocatheter. (B) stødet blev derefter fjernet fra angiocatheter. (C) stents blev skåret til 3 mm længder til brug i musemodel⁶. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Transoral stent placering i mus. (A) stent blev lastet på et tomt angiocatheter og placeret transorally ind i luftrøret. B) den sorte farvemarkering på stenten kan ses gennem et transcervikal snit for at bekræfte dens position i muse luftrør. C) repræsentativ tegning af stent in situ i den sygdomsramte mus luftrøret⁶. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: in situ-billeder af stent. (A-B) Stent med sort farvestof markeringer kan ses in situ i murine Trachea. C) et billede af stenten og murine laryngotracheal komplekset efter høst ved 21 dage⁶. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: stent biokompatibilitet. Immunofluorescent farvning for F4/80 (makrofager, rød chromophore) og CD3 (grøn chromophore, T-lymfocytter) på dag 4 afslørede minimale inflammatoriske celler i (A) uforskadet luftrør og (B) LUFTRØR med plla-PCL stent. Dette står i kontrast til (C) en skadet luftrør, med en fortykket lamina propria og tilstedeværelsen af talrige celler med positiv F4/80 og CD3 farvning⁶. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

De mest kritiske trin for vellykket konstruktion og anvendelse af en Drug-eluting stent in vivo er 1) bestemmelse af den optimale plla-PCL ratio for den ønskelige Drug elueringsrate, 2) bestemmelse af passende koncentration af lægemiddel, der skal eluppes, 3) støbning af stenter omkring angiocatheter til in vivo-brug og 4) transorally levere stenten til musene efter LTS-induktion uden at forårsage dødelig luftvejsobstruktion.

Mens der er flere metoder til levering af lægemidler ved hjælp af stenter i dyremodeller af luftvejssygdomme, udvikling af en biokompatibel stent stand til Drug levering i en syg murine model er en første. Ved udviklingen af denne metode til lægemiddel levering blev der foretaget flere ændringer af metoden. Det var vigtigt at bestemme den passende PLLA-PCL sammensætning til fremstilling af stenter, der var mekanisk stive nok til at blive placeret i luftrøret og til at forblive i luftrøret trods fysiologiske sekreter. En 70:30 sammensætning af plla-PCL blev besluttet for stent konstruktion med en angiocatheter støbning, fordi det kunne med held elueres Rapamycin i en forudsigelig natur, placeres på en sikker og pålidelig måde i vores musemodel, og ikke nedbrydes i fysiologiske Betingelser. En vanskelig og potentielt producent-afhængige del af denne metode er støbning af stent omkring angiocatheters. I første omgang blev 22 G-angiocometre anbragt inde i spidsen af en glas pipette i konstruktionen af in vivo-stents, og polymer opløsningen blev hældt i rummet mellem angiokatheter og glas pipetten og dannede en støbt af rummet mellem. Men væggen af stenter som følge af denne metode ofte var for tynde og var ikke i stand til at være pålideligt placeret i luftrøret. En begrænsning af den nuværende metode til støbning stenter på angiocatheter er afhængigheden af producenten for konsistens, og behovet for omhyggelig opmærksomhed på detaljer for at sikre homogenitet i stent produktion. Muligheden for varians i tykkelsen mellem støbt stenter skal behandles i fremtidige undersøgelser. Med yderligere undersøgelser, håber vi at designe en støbeform til en 22 G angiocatheter omgivet af et andet glas eller ikke-ætsende materiale, således at afstanden mellem angiocatheter og glasset indkapsling er 50 μm, som vi fast besluttet på at være en passende vægtykkelse af stent for nem placering i luftrøret.

Der er flere fordele ved at bruge en biokompatibel stent til at studere Drug levering til det berørte Trachea. Samlet set, stenter sammensat af metal eller silikone, der er blevet belagt med en polymer, der indeholder lægemidlet har vist sig at producere granulering væv og yderligere inflammatorisk respons på en allerede arret del af luftrøret. Denne metode, som afhører brugen af en stent fremstillet udelukkende af biomateriale, der er biokompatible og også frigiver et immunmodulerende lægemiddel på en pålidelig måde er fordelagtig. PLLA-PCL stent er også påvist at være biokompatibel i murine-modellen og fremkalder ikke et akut inflammatorisk respons. Ved at studere lægemidler, der kan bekæmpe fibrose, er det gavnligt at bruge en stent, som udelukkende består af biokompatibelt materiale såsom PLLA-PCL som beskrevet i denne metode.

Fordelen og lethed ved at bruge denne metode til at konstruere brugbare stenter er, at sammensætningen af PLLA-PCL kan varieres, hvilket giver mulighed for forskelle i frigivelse profiler for stoffet blandet i sammensætningen. Tidligere undersøgelser af PLLA-PCL-materialet viser, at variation i PLLA-PCL-blandinger kan føre til større nedbrydning af materialet, hvilket giver mulighed for hurtigere frigivelse af stoffer⁹. Desuden, ved hjælp af denne metode til at konstruere stenter, der kan placeres i mus er fordelagtigt, da de fleste stent undersøgelser for luftvejssygdomme blev udført i større dyr^10,11,12. Brugen af en musemodel, der kan ændres til forskellige sygdoms paradigmer og giver mulighed for testning af narkotika-eluting stent i en syg tilstand er ideel. Afprøvning af Drug-eluting stent i en syg tilstand og være i stand til at sammenligne sin effektivitet til dem i dyr uden sygdom giver mulighed for større eksperimentel rigor. Denne metode viser også, hvordan en Drug-eluting stent for luftvejene kan placeres transorally, i modsætning til tidligere undersøgelser, hvor stenter blev implanteret kirurgisk.

Denne undersøgelse viser en meget anvendelig platform for stent udvikling og testning i en lille dyremodel. Andre faktorer til brug hos mennesker skal dog overvejes. I betragtning af den faste og stive karakter af stent det sandsynligvis ikke kan placeres gennem en kanaliseret fleksibel bronskopisk område, men skal placeres transorally med direkte laryngoskopi og stiv bronskopi. Ideelt, stent ville blive placeret efter ballon dilatation af luftvejene til at hjælpe med at afbøde restenose. Fra den potentielle patientsikkerhed, er potentialet for stent at migrere en stor bekymring, da det potentielt kunne føre til livstruende luftvejs kompromittering. Sekundært kan der også tages hensyn til muligheden for stent obstruktion sekundært til ophobning af slim eller blod. Yderligere testning og udvikling er nødvendig for at minimere disse risici.

Fremtidige undersøgelser kan udnytte denne metode til at teste forskellige lægemidler i PLLA-PCL Blend til at forstå yderligere, hvordan forskellige Immunsuppressive behandlinger kan afbøde ardannelse i luftrøret. Da sådanne stenter kan placeres i mus, kan det også testes at bruge en større kohorte af mus eller mus med genetiske modifikationer til ardannelse af gener. Fremtidige eksperimenter kan også omfatte forståelse af ændringer i luftrøret, der kan opstå efter kronisk implantation af stent (3 – 6 måneder), og ændringerne i lumen af luftrøret samt genekspression profiler af inflammatoriske markører og fibrose Markører.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. For stent
22-gauge angiocatheter	Jelco	4050
Dichloromethane	Sigma Aldrich	270997-100ML
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5	Available from other vendors as well.
PDLGA	Sigma Aldrich	739955-5G
PLLA-PCL (70 : 30)	Evonik Industries AG	65053
Rapamycin	LC Laboratories	R-5000
2. Animal surgery
Wire brush	Mill-Rose Company	320101
3. For immunohistochemistry staining
Antigen retrival buffer	Abcam	ab93678	Available from other vendors as well; acidic pH needed
DAPI	Cell Signaling	8961S
DMEM	ThermoFisher Scientific	11965-092	Available from other vendors as well.
FBS (Fetal Bovine Serum)	MilliporeSigma	F4135-500ML
Goat anti-rabbit-488 antibody	Lif technology	a11008
Goat anti-rat-633 antibody	Lif technology	a21094
Hydrophilic plus slide	BSB7028
PBS	ThermoFisher Scientific	100-10023	Available from other vendors as well.
Rabbit anti-CD3 antibody	Abcam	ab5690
Rat antiF4/80 antibody	Biolengend	123101
Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope	Zeiss
4. For quantative PCR
0.5mm glass beads	OMNI International	19-645
Bead Mill Homoginizer	OMNI International
Gene Specific Forward/Reverse Primers	Genomic Resources Core Facility
Nanodrop 2000 spectrophotometer	Thermo Scientific
Power SYBR Green Mastermix	Life Technologies	4367659
RNeasy mini kit	Qiagen	80404
StepOnePlus Real Time PCR system	Life Technologies