Summary
Laryngotracheal stenose resultater fra patologisk arr deponering som kritisk begrenser tracheal luftveiene og mangler effektiv medisinsk behandling. Ved hjelp av en PLLA-PCL (70% Poly-L-laktid og 30% polycaprolactone) stent som et lokalt medikament leveringssystem, kan potensielle terapier som tar sikte på å redusere arr spredning i luftrøret bli studert.
Abstract
Laryngotracheal stenose (LTS) er en patologisk innsnevring av subglottis og luftrøret som fører til extrathoracic obstruksjon og betydelig kortpustethet. LTS resultater fra slimhinne skade fra et fremmedlegeme i luftrøret, noe som fører til vevskader og en lokal inflammatorisk respons som går galt, fører til deponering av patologisk arr vev. Behandling for LTS er kirurgisk på grunn av mangel på effektiv medisinsk behandling. Hensikten med denne metoden er å konstruere en biokompatible stent som kan være miniatyriserte å plassere i mus med LTS. Vi viste at en PLLA-PCL (70% Poly-L-laktid og 30% polycaprolactone) konstruere hadde optimal Biomekaniske styrke, var biokompatible, praktisk mulig for en in vivo plassering stent, og i stand til tent narkotika. Denne metoden gir et medikamentlevering system for å teste ulike immunmodulerende agenter til lokalt hemme betennelser og redusere luftveiene fibrose. Fremstilling av stents tar 28 − 30 timer og kan enkelt gjengis, noe som åpner for eksperimenter med store kohorter. Her har vi innarbeidet stoffet Rapamycin innenfor stent å teste sin effektivitet i å redusere fibrose og kollagen deponering. Resultatene avslørte at PLLA-PCL-telt viste pålitelig Rapamycin utgivelse, var mekanisk stabile i fysiologiske forhold, og var biokompatible og inducing lite inflammatorisk respons i luftrøret. Videre har Rapamycin-tent PLLA-PCL-stents redusert arrdannelse i luftrøret in vivo.
Introduction
Laryngotracheal stenose (LTS) er en patologisk innsnevring av luftrøret oftest på grunn av iatrogenic etter intubering Kader. Kombinasjonen av bakteriell kolonisering, fremmedlegeme respons på en trakeostomi eller endotrakeal tube, og pasientspesifikke faktorer fører til en avvikende inflammatorisk respons. Denne mistilpasset immunresponsen fører til deponering av kollagen i luftrøret, noe som resulterer i luminal innsnevring av luftrøret og påfølgende stenose1,2. Som dagens behandling for denne sykdommen er primært kirurgisk, utvikle et alternativ medisinsk-basert behandling paradigme rettet mot avvikende inflammatoriske og profibrotic trasé som fører til overdreven kollagen deponering har blitt studert. Rapamycin, som hemmer mTOR signalering kompleks, har vist å ha immunsuppressiv effekter, samt en robust antifibroblast effekt. Men når Rapamycin er systemisk administreres, vanlige bivirkninger (f. eks, hyperlipidemi, anemi, trombocytopeni) kan uttales3. Hensikten med vår metodikk er å utvikle et redskap for lokal narkotika levering praktisk mulig for bruk i luftveiene som vil minske disse systemiske effektene. Våre vurderinger fokus på å undersøke den lokale immunresponsen til stoffet levering konstruere så vel som sin evne til å hemme Fibroblast funksjon og endre den lokale immun mikromiljøet. Sykdomsspesifikke utfall inkluderer in vivo testing som evaluerer markører for fibrose.
Biologisk nedbrytbart narkotika-tent stents har blitt brukt i dyremodeller av sykdom i flere organsystemer, inkludert luftveiene4. For håndtering av luftveis stenose eller kollaps, tidligere undersøkelser har brukt stoff-belagt silikon og nikkel-baserte stents5. En PLLA-PCL-konstruksjon ble valgt for denne spesielle metoden på grunn av sin narkotika eluering profil og mekaniske styrke i fysiologiske forhold over en periode på 3 uker, som har blitt demonstrert i tidligere publiserte studier6. PLLA-PCL er også et biokompatible og biologisk nedbrytbart materiale som allerede er godkjent av FDA4. Biokompatible stents tent Cisplatin og MMC har blitt studert i store dyremodeller som kaniner og hunder. Imidlertid, inne disse dyr modeller, stents var ikke oppstilt inne en dyr modell av sykdommen og var implantert transcervically. Denne studien gir en unik metode for å vurdere en biokompatible narkotika-tent stent plassert transoralt i en mus modell av luftveis skade og laryngotracheal stenose. En biokompatible stent som elutes et immunmodulerende stoff lokalt og kan bli miniatyriserte for studier i en murine modell er verdifullt for translational prekliniske forskning. Tidligere forsøk på stent utnyttelse med andre materielle konstruksjoner generert robuste utenlandske kroppen responser forverre den underliggende betennelsen som skiller LTS7. Denne metodikken, til vår kunnskap, er den første i sitt slag for å studere immunmodulerende og antifibrotic virkningene av et stent legemiddel leveringssystem i en murine modell av LTS. Den murine modellen selv tilbyr flere fordeler for å studere virkningene av et immunmodulerende stoff på luftrøret. Genmodifiserte mus og eksperimentelle kohorter av friske og syke mus kan bli studert, som kan føre til eksperimentell reproduserbarhet og bedre kostnadseffektivitet. Dessuten, leveringen av stent transoralt inn i musen luftrøret etterligner klinisk leveranse av slik en stent inne human, hvilke fremme høydepunkt det translational fordel av denne metoden. Til slutt, den relative letthet som PLLA-PCL stent med stoffet kan produseres tillater modifikasjoner for å levere alternative medikament terapi sikte på å redusere arrdannelse i luftrøret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: alle metoder beskrevet her ble godkjent av Johns Hopkins University Animal Care og use Committee (MO12M354).
1. utarbeidelse av Rapamycin i PLLA-PCL
- Forbered to hetteglass (med caps) av 70:30 PLLA-PCL polymer løsninger (iboende viskositet 1.3 − 1,8 DL/G; Tabell med materialer) løsninger, med ett hetteglass som inneholder 1,0% Rapamycin og den andre uten Rapamycin.
- Lag en 1,0% Rapamycin som inneholder polymer løsning ved å tilsette 6 mg Rapamycin til 600 mg 70:30 PLLA-PCL i et hetteglass.
- For polymer løsning uten Rapamycin (kontroll), bare tilsett 600 mg 70:30 PLLA-PCL til hetteglasset.
- Tilsett 6 mL diklormetan i hvert hetteglass under en avtrekks hette.
FORSIKTIG: diklormetan er et etsende materiale, og det skal bare brukes glass pipetter. Egnede sikkerhetsforanstaltninger inkluderer personlig øyebeskyttelse og hansker. - Tilsett 120 μL av glyserol til hvert hetteglass (for 2% glyserol løsning).
Merk: tilsetning av glyserol gir økt fleksibilitet og redusert stivhet i stent konstruksjon. - Oppsummering av hetteglassene i glass og la 70:30 PLLA-PCL med og uten Rapamycin for å oppløse og homogenisere i 6 − 12 timer.
Merk: hetteglass kan også plasseres på en roterende risting plattform for raskere oppløsning.
2. Rapamycin eluering testing
- Pipette 1 mL 70:30 PLLA-PCL løsning som inneholder 1% Rapamycin i et glass Petri parabolen.
Merk: dette volumet av 70:30 PLLA-PCL-løsning som inneholder 1% Rapamycin vil inneholde 120 mikrogram Rapamycin og representerer den totale mengden Rapamycin i hver konstruksjon. Alternative volumer og konsentrasjoner kan brukes. - Tillat 70:30 PLLA-PCL med 1% Rapamycin å herde inn i en flat disk i glasset Petri parabolen.
- Når herdet, plasser disken i 2 mL fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7,4) og ruge i en 37 ° c kammer.
- Samle og erstatte PBS (2 mL) hver 24 h og bruke innsamlet PBS for høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) analyse av Rapamycin innhold.
- Bruk en autosampler og en C18 4,6 cm x 250 mm HPLC-kolonne for å kjøre prøver gjennom autosampler injeksjonsbruk sammen med serie fortynninger av Rapamycin for å skape en kalibrert standard kurve. Kjør hvert utvalg i tre eksemplarer.
Merk: Serial fortynninger av Rapamycin som skal testes inkluderer 10%, 1%, 0,1%, og 0,01%. - Bruk en mobil fase av HPLC grade vann og acetonitril med 10/90 volum/volum med en strømningshastighet på 2,0 mL/min. Angi absorbansen under HPLC for Rapamycin til 280 NM.
Merk: figur 1 viser eluering av Rapamycin over en 14-dagers periode.
3. opprettelse av Rapamycin-tent PLLA-PCL murine luftveis stents
Merk: Utfør trinn 3.2 − 3,9 ved hjelp av sterile materialer og steril teknikk for å unngå kontaminering som påvirker in vivo-og in vitro-applikasjoner.
- Klargjør PLLA-PCL-løsninger som inneholder Rapamycin som beskrevet i avsnitt 1.
- Bruke et glass Pasteur pipette med en gummi ballong, Påfør 1 mL PLLA-PCL løsning som inneholder 1% Rapamycin på venøs kanyle av en 22 G fluoriserte etylen propylenglykol basert angiocatheter (tabell av materialer). Hold angiocatheter i den ene hånden og bruk glass pipette for å slippe PLLA-PCL-løsningen på angiocatheter. Roter langsomt angiocatheter for å sikre en homogen dekning av angiocatheter med PLLA-PCL-løsningen.
Merk: i begynnelsen vil PLLA-PCL-løsningen være tynn, men når diklormetan fordamper under påføring på angiocatheter, vil oppløsningen bli mer tyktflytende for å forme den på angiocatheter. Kontinuerlig snu angiocatheter under programmet er gunstig. Dette trinnet må gjøres langsomt og omhyggelig for å sikre den konsekvente tykkelsen på stent. - Rekvisitt støpte angiocatheter med spissen av angiocatheter vendt nedover og Hilt på kanten av et glass Petri parabolen for tørking.
- La stents tørke i 24 timer i en vakuum hette ved romtemperatur (figur 2a).
- Fjern stent konstruere fra den underliggende angiocatheter ved å forsiktig vri det underliggende kateteret gratis og skyve den ut av støpte stent (figur 2B).
- Sjekk stent circumferentially for eventuelle defekter som kan ha resultert i løpet av støping prosessen. Hvis en defekt i støpt stent er til stede, kast den.
- Trim hver ende av støpt stent med fin rett saks slik at kantene er aksial.
- Ved hjelp av fin rett saks, kuttet 3 mm aksial segmenter av støpt stent for bruk i en mus modell av LTS (figur 2C).
Merk: omtrent 8 stents kan lages av en støpt angiocatheter, med hver 3 mm stent inneholdende 120 mikrogram Rapamycin. - Legg 3 mm stent på et nytt 22 venekateter for bruk i en musemodell av LTS (figur 1).
4. Laryngotracheal stenose induksjon hos mus
- Før gjennomfører in vivo mus studier innhente godkjenning fra Animal Care og use Committee.
- Bedøve en 9-ukers gammel mannlig C57BL/6 ved å gi en intraperitoneal injeksjon av ketamin (80 − 100 mg/kg) og xylazine (5 − 10 mg/kg).
Merk: andre typer mus kan byttes ut, men det anbefales at mus vekten er mellom 20 − 27 g. - Tilfeldig mus inn i en eksperimentell gruppe (chemomechanical Kader med en plassering av en 1% Rapamycin-inneholdende PLLA-PCL-stent) og to kontroll grupper: 1) chemomechanical Kader med plasseringen av en PLLA-PCL-stent, 2) chemomechanical Kader uten plassering av en stent.
- Plasser en mus på en kirurgisk plattform i en liggende posisjon. Bruk en liten løkke av tråden festet til toppen av plattformen for å forlenge cervical ryggraden ved looping den rundt den sentrale fortenner.
- Fest hendene og bena på musen til bordet ved hjelp av 2 tomme biter av tape. Knip musen labben for å sikre at den har hatt tilstrekkelig anestesi.
- Operasjonsstedet er så klar. Den overliggende pels bør fjernes og huden bør rengjøres (alternerende jod eller klorheksidin skrubb med alkohol eller fortynnet hud desinfeksjonsmiddel) tre ganger. Området bør være drapert og sterile hansker bæres. De sterilisert instrumentene skal legges på en steril overflate når den ikke er i bruk.
- Lag en 1,5 cm midtlinjen vertikalt snitt i nakken på musen ved hjelp av fine buede Iris saks. Del de overliggende thymus og lateralize de to resulterende fliker for å visualisere luftrøret. Del de overliggende sternohyoidus og sternothyroideus (stropp) musklene på den overlegne feste bilateralt.
Merk: hele laryngotracheal komplekset skal være helt eksponert etter dette. - Passere en 22 G angiocatheter transoralt gjennom strupen inn i luftrøret. Bruk små tang for å legge press på den fremre strupen på musen for å bistå i riktig plassering av angiocatheter. Visualiser den hvite angiocatheter gjennom luftrøret for å sikre riktig plassering (ikke-esophageal).
Merk: musen luftrøret er ekstremt tynt, og den hvite angiocatheter vil bli visualisere gjennom gjennomskinnelig luftrøret. - Passere en bleomycin-belagt wire pensel gjennom den innsatte angiocatheter.
- Trekk langsomt ut angiocatheter slik at bare wire børsten forblir i luftrøret.
- Påfør mot trykk ved hjelp av fin tang på luftrøret til mekanisk forstyrre tracheal lumen med wire børsten.
- Sett angiocatheter inn i luftrøret over wire børsten.
- Fjern wire børsten og påfør bleomycin på nytt.
- Gjenta trinn 4.8 − 4.12 totalt 5x. Påfør bleomycin på børsten mellom hvert program.
Merk: validering og beskrivelse av denne modellen finnes i Hillel et al.8. - Fjern angiocatheter fra muse røret.
Merk: Hvis ingen stent skal plasseres, kan snittet lukkes med vev lim.
5. Transoral PLLA-PCL stent plassering i mus
- Legg en 3 mm støpt stent på en tom 22 G angiocatheter (Figur 3A).
Merk: stent skal hvile 5 mm fra tuppen av angiocatheter. - Tegn en tynn, svart vertikal linje på 3 mm støpt stent.
Merk: denne linjen gir bedre visualisering av stent i luftrøret. - Transoralt intubere musen med angiocatheter som er forhåndslastet med stent.
- Visualiser stent på angiocatheter i luftrøret gjennom det transcervikal snittet (fig.3B).
Merk: luftrøret er svært tynt, slik at det svarte fargestoffet på stent skal kunne visualisere gjennom luftrøret. Bruk dette til å bekrefte riktig tracheal plassering. - Hold stent på plass ved å gripe luftrøret gjennom transcervikal innsnitt med fin tang.
- Fjern angiocatheter transoralt samtidig som du opprettholder grepet på stent med den fine Tangen.
Merk: det er svært viktig å ikke påføre for mye kraft på stent for å ikke knuse lumen når angiocatheter er fjernet. Det er imidlertid nødvendig med tilstrekkelig kraft for å sikre at stent ikke fjernes med angiocatheter. En 0,8 mm sialendoscope kan brukes til å visualisere plasseringen og plasseringen av stent i luftrøret. - Lukk transcervikal snitt med vev lim.
- Tillate hver musen å komme seg å dens original aktivitet plan flate tidligere sted den rygg inne dens bur.
6. histologic utarbeidelse av prøver
- Bedøve mus med inhalert bedøvelse og offer mus med cervical forvridning per dyr protokoll etter 7, 14, eller 21 dager.
Merk: basert på kronisitet av studien, kan ulike tidsintervaller brukes (f. eks, 28, 30 dager, etc.). - Plasser en mus på den kirurgiske plattformen som beskrevet i trinn 4,4 og 4,5.
- Åpne halsen innsnitt på musen ved hjelp av fine buede Iris saks.
- Utsett luftrøret per trinn 4,6.
- Del det klare luftrøret under nivået av stent ved hjelp av fine buede Iris saks.
- Del proksimale luftrøret under strupen og over stent ved hjelp av fine buede Iris saks.
Merk: det er viktig å dele det første luftrøret først for å hindre at luftrøret trekke inn i thorax. - Skill det delte luftrøret fra spiserøret posteriort og fjern luftrøret fra musen.
Merk: stents vil fortsatt bli beholdt i muse røret. - Fjern stent fra luftrøret og fest i 10% formalin for 24 h.
- Bygg inn formalin-faste mus luftrør prøver i parafin med den like enden orientert superiorly slik at aksial kutt av luftrøret kan gjøres i neste trinn.
- Skjær 5 μm deler av parafin-embedded mus luftrøret ved hjelp av en mikrotomen.
Merk: prøvene skal kuttes aksialt fra det første luftrøret. - Skaff en representativ seksjon på 5 μm hver 250 μm langs lengden av prøven.
- Fullfør H & E flekk på hver representative seksjon.
- Deparaffinize lysbildene ved å plassere i xylen 2x per lysbilde i 3 min.
- Plasser lysbildene i 100% etanol i 2 min, 95% etanol for 2 min, og 70% etanol i 2 min til rehydrate.
- Vask lysbildene med rennende vann fra springen i 2 min.
- Flekker på lysbildene i hematoksylin i 3 − 5 min.
- Vask lysbildene med rennende vann fra springen i 5 min.
- Plasser lysbildene i 1% syre alkohol i 1 min.
- Vask lysbildene med rennende vann fra springen i 1 min.
- Skyll i 0,2% ammoniakk vann i 30 s.
- Skyll lysbildene i rennende vann fra springen i 5 min. dypp i 95% etanol 10x.
- Eosin flekken ved å plassere skyve i Eosin phloxine for 30 s.
- Tørke lysbildene ved å plassere i 95% etanol i 5 min, etterfulgt av absolutt etanol 2x i 5 min.
- Plasser i xylen 2x i 5 min.
- Monter lysbildene med xylen-basert festemiddel.
- Mål tykkelsen på lamina propria som beskrevet i Hillel et al.8.
7. stent biokompatibilitet in vivo
- Klargjør vevs deler som i trinn 6.1 − 6.4. Ikke Fjern stent fra disse tracheal seksjoner for å visualisere endringene i betennelse i forhold til plasseringen av stent innenfor lumen av luftrøret.
- For å bestemme akutt fremmedlegeme respons på stent, observere macrophage og T celle aktivitet ved hjelp CD3 og F4/80 markører.
Merk: andre markører kan også brukes til å bestemme akutt inflammatorisk reaksjon på stent. - Få tak i 5 μm snitt av parafin-innebygd luftrør på kommersielt tilgjengelige hydrofile pluss slides (tabell av materialer). Plasser to inndelinger på hvert lysbilde.
Merk: disse seksjonene skal være fra et område av luftrøret der PLLA-PCL-stent ble plassert.
- For å bestemme akutt fremmedlegeme respons på stent, observere macrophage og T celle aktivitet ved hjelp CD3 og F4/80 markører.
- Plasser lysbildene i xylen 2x for 5 min hver.
- Plasser lysbildene i 100% etanol 2x for 3 min hver.
- Plasser lysbildene i 95% etanol i 1 min.
- Plasser lysbildene i en histologi farging rack slik at de er nedsenket i antigen gjenfinning buffer (tabell av materialer) og deretter plassere i en grønnsak dampbåten med kokende vann i 20 min.
- Fjern farge stativene fra dampbåten og kast bufferen for henting av antigen.
- Bytt ut bufferen med 1 mL PBS.
- Plasser lysbildene i en våt farge boks i 1 min.
- Kast PBS og ruge lysbildene med Dulbecco ' s modifiserte Eagle medium (DMEM) med 10% FBS i 30 min.
- Kast DMEM og tilsett en blanding av to primære antistoffer som er reist i forskjellige arter. Dekk lysbildene med para fin film og ruge over natten ved 4 ° c i et mørkt rom.
Merk: i denne protokollen kanin anti-CD3 og rotte anti-F4/80 (tabell av materialer) ble brukt. - Vask lysbildene i PBS 3x i 5 minutter.
- Ruge lysbildene med sekundære antistoffer som er spesifikke for de primære antistoff artene (tabell av materialer) FORTYNNET i DMEM med 10% FBS for 0,5 − 1 t ved romtemperatur i mørket.
- Vask lysbildene i PBS 3x i 5 minutter i mørket.
- Monter lysbildene på coverslips med en dråpe festemiddel med 4 ' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Oppbevar lysbildene i mørket ved enten 20 ° c eller 4 ° c.
- Observer de fargede lysbildene på en laser Scan konfokalmikroskopi mikroskop og fotografi.
- Kvantifisere det totale antall celler flekker med DAPI og antistoffer av interesse for sammenligning med uskadet luftrøret.
8. mus luftrør kvantitativ genuttrykk analyse
- Samle muse luftrøret som beskrevet i trinn 6.1 − 6,7 og fjern stent.
Merk: høstet muse tracheas kan oppbevares i en-80 ° c fryser i opptil 2 år. - Desiccate det tracheal vevet høstes i trinn 8,1 ved hjelp av fin saks og videre homogenisere ved hjelp av en perle mølle homogenisator med 1,4 mm keramiske perler (tabell av materialer) som en del av et kommersielt tilgjengelig kolonne-baserte RNA Extraction Kit (tabell av materialer).
Merk: perle mølle homogenisator innstillinger = 1 40 s syklus ved 6 m/s. - Pakk ut RNA fra tracheal-lysat ved hjelp av et Kol onne BAS ert avsugs-og rensesett (tabell av materialer) som følger produsentens anvisninger.
- Kvantifisere RNA fra hver prøve ved hjelp av en spektrofotometer (tabell av materialer).
Merk: RNA-renhet vurderes ved hjelp av 260/230 NM-forholdet med en ren RNA-prøve som leser 2,0. - Lag utfyllende DNA fra ekstrahert RNA ved hjelp av revers transkriptase (tabell av materialer) og en thermocycler med følgende innstillinger: 5 min ved 25 ° c (grunning), 46 ° c i 30 min (omvendt transkripsjon), og deretter 95 ° c i 1 min (deaktivering av revers transkriptase).
- Fortynne komplementære DNA-prøver med RNase fritt vann til en konsentrasjon på 10 − 25 ng/mL for bruk i kvantitativ sann tids PCR.
- Bland 1 μL av det komplementære DNA (10 − 25 ng/mL) med 10 μL av en PCR-mastermix (tabell av materialer), 8 ΜL av ddH2O og 0,5 μL av 10 μM fremover og omvendt primere for genet av interesse i en brønn av en 96-brønn PCR plate (tabell av materialer).
Merk: det totale volumet i hver brønn skal være 20 μL. Hver brønn på 96 brønn platen skal bare inneholde én prøve og ett gen av interesse. - Gjenta trinn 8.1 – 8.7 for alle gener av interesse og Kjør hver prøve for hvert gen i tre eksemplarer.
Merk: Gen-spesifikke fremover og revers primere (tabell av materialer) for kollagen 1, kollagen 3, og referanse gen β-utgangen brukes ofte til å undersøke markører for fibrose. - Plasser 96 brønn platen på den kvantitative PCR-maskinen i sanntid og start følgende protokoll: denaturere ved 95 ° c i 15 s og anneal og Utvid ved 60 ° c for 60 s for 40 sykluser.
- Normalisere syklusen terskelverdi (CT) for genet produkt deteksjon av hvert gen av interesse (GOI) til CT-verdi for referanse gen β-utgangen for alle prøver å få en ΔCT for hver GOI. Sammenlign deretter ΔCT-verdiene for hver GOI for behandlede og ubehandlede prøver for å generere en ΔΔCT.
Merk: syklus terskelen er punktet på forsterknings kurven når en forhåndsbestemt mengde gen produkt er til stede (ΔRn). ΔRn-verdien for hver reaksjon bør fastsettes for hvert gen av interesse og bør falle på den lineære delen av forsterknings kurven.
Merk: ΔCT = CT (GOI) – CT (referanse gen); ΔΔCT = ΔCT (behandlet) – ΔCT (ubehandlet). - Beregn den relative endringen i genuttrykk mellom behandlede og ubehandlede prøver som et uttrykk for fold endring ved å beregne 2ΔΔCT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den biologisk nedbrytbare PLLA-PCL-stent konstruere lastet med Rapamycin som ble brukt i denne studien var i stand til å tent Rapamycin på en konsistent og forutsigbar måte i fysiologiske forhold (figur 1). Figur 2 viser PLLA-PCL-stent som er støpt rundt en 22 G angiocatheter for bruk i en murine modell av LTS. For å avgjøre om effekten av Rapamycin eluering i luftrøret er effektiv i demping fibrose, kan målte endringer i fibrose-relaterte genuttrykk og markører for akutt betennelse vurderes gjennom genuttrykk analyse, flyt flowcytometri, immunofluorescence og ELISA. Vellykket plassering av en miniatyriserte stent inn i luftrøret på musen ved hjelp av metoden beskrevet ovenfor har blitt demonstrert. En skjematisk fremstilling av metoden er vist i Figur 3. Figur 4 viser miniatyriserte biokompatible stent in situ i luftrøret som indikert av den svarte markøren på stent, som er vist gjennom den gjennomsiktige muse luftrøret. I innledende eksperimenter, ved hjelp av en 0,8 mm sialendoscope for å bekrefte plasseringen av stent i luftrøret var nyttig. Etter 21 dager, for å bekrefte at den transoral plasseringen av stent var effektiv og stent ikke migrere fra opprinnelig plassert posisjon, halsen snittet ble gjenåpnet for å bestemme plasseringen av stent. Som vist i Figur 4B, viste den svarte fargestoff merket på stent stent opprettholdt sin posisjon i luftrøret. Reseksjon av luftrøret etter 21 dagers behandling med stent er vist i Figur 4C.
Representative bilder av biokompatibilitet testing med immunofluorescent farging for markører for akutt og kronisk betennelse er vist i figur 5. Dette demonstrerte at PLLA-PCL-stent konstruksjon (uten Rapamycin) ikke ble immunoreactive som bestemt av minimalt antall immunceller til stede etter plassering. Det er viktig å merke seg at i denne metoden, normal uskadet tracheas ble brukt og en PLLA-PCL stent uten Rapamycin ble plassert for å bestemme den inflammatoriske responsen til konstruere seg selv.
Deretter, for å finne ut om den Rapamycin-tent PLLA-PCL-stent var effektiv i begrensende arr, har vi tidligere demonstrert genuttrykk endringer i markører for akutt betennelse og fibrose6. Nærmere bestemt er det en 90,3 fold reduksjon (SEM ± 26,0; n = 4; p < 0,01) reduksjon i col1a1 på dag 4, samt akutte INFLAMMATORISKE markører inf-γ, CD11b, ARG-1, og Il-1B6. Selv om forskjellene i fold endring for noen gener ikke var signifikant, er det mulig at med en større kohort av mus, kan betydningen oppnås. Å avgjøre om det var endringer i luftrøret på grunn av narkotika eluering histologisk, eller om det var endringer i luftrøret på grunn av radial kraftanstrengelse av stent, viste vi at det var en nedgang i bredden av lamina propria i de tracheas behandlet med Rapamycin-tent stents sammenlignet med de uten Rapamycin-tent stents6.
Figur 1: RAPAMYCIN PLLA-PCL-eluering. PLLA-PCL-konstruksjonen som inneholder 1% Rapamycin, viste en konsistent og forutsigbar utgivelse av Rapamycin over en periode på 14 dager. Data punkter representerer gjennomsnittet ± SEM av samplet eluering (n = 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: stent støping. (A) PLLA-PCL-løsningen ble tillatt å tørke rundt en 22 G angiocatheter. (B) kastet ble deretter fjernet fra angiocatheter. (C) stents ble kuttet til 3 mm lengder for bruk i musen modell6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Transoral stent plassering i mus. (A) stent ble lastet inn i en tom angiocatheter og plassert transoralt i luftrøret. (B) den svarte fargestoff merkingen på stent kan ses gjennom et transcervikal snitt for å bekrefte sin posisjon i musen luftrøret. (C) representative tegning av stent in situ i den syke musen luftrøret6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: in situ-bilder av stent. (A-B) Stent med sorte fargestoff markeringer kan sees på in situ i det murine luftrøret. (C) et bilde av stent og murine laryngotracheal komplekse etter innhøsting på 21 dager6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: stent biokompatibilitet. Immunofluorescent farging for F4/80 (makrofager, rød kromoforen) og CD3 (grønn kromoforen, T-lymfocytter) på dag 4 avslørte minimale inflammatoriske celler i (A) uskadet luftrøret og (B) luftrøret med PLLA-PCL-stent. Dette kontraster med (C) en skadet luftrøret, med en fortykket lamina propria og tilstedeværelsen av mange celler med positive F4/80 og CD3 farging6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trinnene for vellykket bygging og bruk av et medikament-tent stent in vivo er 1) å bestemme den optimale PLLA-PCL-forholdet for ønskelig medikament eluering rate, 2) å bestemme den aktuelle konsentrasjonen av stoffet å være eluert, 3) molding stents rundt angiocatheter for in vivo-bruk, og 4) transoralt å levere stent til musene etter at LTS-induksjon uten å forårsake hindring av dødelig luftveier.
Mens det er flere metoder for narkotika levering bruker stents i dyremodeller av luftveis sykdom, utvikling av en biokompatible stent i stand til narkotika levering i en syk murine modell er en første. I utviklingen av denne metoden for narkotika levering, ble det gjort flere endringer i metoden. Det var viktig å bestemme riktig PLLA-PCL sammensetning for å lage stents som var mekanisk stive nok til å bli plassert i luftrøret og å forbli i luftrøret til tross for fysiologiske sekreter. En 70:30 sammensetningen av PLLA-PCL ble besluttet for stent konstruksjon med en angiocatheter molding fordi det kunne lykkes eluere Rapamycin i en forutsigbare natur, bli plassert på en trygg og pålitelig måte i vår musemodell, og ikke brytes ned i fysiologiske Forhold. En vanskelig og potensielt produsent avhengig del av denne metoden er molding stent rundt angiocatheters. I utgangspunktet, i konstruere in vivo stents, 22 G angiocatheters ble plassert inne i spissen av et glass pipette og polymer løsningen ble strømmet inn i rommet mellom angiocatheter og glasset pipette, danner en støpt av mellomrommet mellom. Men veggen av stents som følge av denne metoden ofte var for tynne og var ikke i stand til å være pålitelig plassert i luftrøret. En begrensning av den aktuelle metoden for molding stents på angiocatheter er avhengigheten av produsenten for konsistens, og behovet for omhyggelig oppmerksomhet på detaljer for å sikre homogenitet i stent produksjon. Potensialet for variasjon i tykkelse mellom støpt stents må tas opp i fremtidige studier. Med videre studier, håper vi å designe en mold for en 22 G angiocatheter omgitt av et annet glass eller korrosive materiale slik at mellomrommet mellom angiocatheter og glass encasing er 50 μm, som vi besluttet å være en tilstrekkelig veggtykkelse av stent for enkel plassering i luftrøret.
Det er flere fordeler ved å bruke en biokompatible stent for å studere legemiddellevering til det berørte luftrøret. Overall, stents sammensatt av metall eller silikon som har vært belagt med en polymer som inneholder stoffet har vist å produsere granulering vev og ytterligere inflammatorisk respons til en allerede arret del av luftrøret. Denne metoden, som interrogates bruk av en stent laget utelukkende av biomaterialet som er biokompatible og også utgivelser et immunmodulerende legemiddel på en pålitelig måte er fordelaktig. PLLA-PCL-stent er også vist å være biokompatible i murine modellen og gir ikke ut en akutt inflammatorisk respons. I å studere medikamenter som kan bekjempe fibrose, ved hjelp av en stent utelukkende sammensatt av biokompatible materiale som PLLA-PCL som beskrevet i denne metoden er gunstig.
Fordelen og enkel å bruke denne metoden for å konstruere brukbare stents er at sammensetningen av PLLA-PCL kan varieres, noe som åpner for forskjeller i Release profiler for stoffet blandes i sammensetningen. Tidligere studier av PLLA-PCL-materialet viser at variasjon i PLLA-PCL-blandinger kan føre til større nedbrytning av materialet, noe som åpner for raskere legemiddel frigivelse9. Videre, ved hjelp av denne metoden for å konstruere stents som kan plasseres i mus er fordelaktig, som de fleste stent studier for luftveis sykdom ble gjort i større dyr10,11,12. Bruk av en mus modell som kan endres for ulike sykdoms paradigmer og tillate testing av stoffet-tent stent i en syk tilstand er ideelt. Testing av narkotika-tent stent i en syk tilstand og å kunne sammenligne sin effekt til de i dyr uten sykdom gjør det mulig for større eksperimentell rigor. Denne metoden viser også hvordan en medikament-tent stent for luftveiene kan plasseres transoralt, i motsetning til tidligere studier der stents ble implantert kirurgisk.
Denne studien demonstrerer en svært brukbar plattform for stent utvikling og testing i en liten dyr modell. Imidlertid må andre faktorer for bruk i menneskelige vurderes. Gitt den faste og stive natur stent det sannsynlig ikke kan plasseres gjennom en ledet fleksibel bronkoskop, men må plasseres transoralt med direkte laryngoskopi og stive bronkoskopi. Ideelt sett vil stent bli plassert etter ballong utvidelse av luftveiene for å redusere restenosis. Fra potensielle av pasientens sikkerhet, potensialet for stent å migrere er en stor bekymring som det kan potensielt føre til livstruende luftveiene kompromiss. Sekundært, potensialet for stent obstruksjon sekundært til akkumulering av slim eller blod må også vurderes. Videre testing og utvikling er nødvendig for å minimere disse risikoene.
Fremtidige studier kan benytte denne metoden for å teste ulike medikamenter i PLLA-PCL blanding for å forstå videre hvordan ulike immunsuppressiv behandlinger kan redusere arrdannelse i luftrøret. Fordi slike stents kan plasseres i mus, kan bruk av en større kohort av mus eller mus med genetiske modifikasjoner til arr-forming gener også testes. Fremtidige eksperimenter kan også omfatte å forstå endringene i luftrøret som kan forekomme etter kronisk implantation av stent (3 – 6 måneder) og endringer i lumen på luftrøret, samt gen uttrykks profilene til inflammatoriske markører og fibrose Markører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
National Institute på døvhet og andre kommunikasjons forstyrrelser av National Institutes of Health under prisen tall 1K23DC014082 og 1R21DC017225 (Alexander Hillel). Denne studien ble også økonomisk støttet av Triological Society og American College of kirurger (Alexander Hillel), American Medical Association Foundation, Chicago, IL (Madhavi Duvvuri) og en T32 NIDCD trening stipend (Kevin Motz).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
- Minnigerode, B., Richter, H. G. Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood. Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).
- Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).
- Kaplan, M. J., et al. Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis. Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).
- Kalra, A., et al. New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions. Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14 (2017).
- Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies. Chest. 144 (1), 193-199 (2013).
- Duvvuri, M., et al. Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis. Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).
- Mugru, S. D., Colt, H. G. Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse. Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).
- Hillel, A. T., et al. An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis. JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).
- Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles. AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).
- Wang, T., et al. Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model. Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).
- Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents. Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10 (2015).
- Robey, T. C., et al. Use of internal bioabsorbable PLGA "finger-type" stents in a rabbit tracheal reconstruction model. Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).
