Summary
喉頭気管狭窄は、気管気道を重大に狭くし、効果的な医療療法を欠く病理学的瘢痕沈着から生じる。PLLA-PCL(70%ポリL-ラクチドおよび30%ポリカプロラクトン)ステントを局所薬物送達システムとして用いて、気管内の瘢痕増殖を減少させることを目的とした潜在的な治療法を検討することができる。
Abstract
喉頭気管狭窄(LTS)は、胸外閉塞および著しい息切れにつながる下耳筋炎および気管の病理学的狭窄である。LTSは気管内の異物からの粘膜損傷の結果、組織損傷および局所炎症反応を引き起こし、病理学的瘢痕組織の沈着につながる。LTSの治療は、効果的な医療療法の欠如のために外科的です。この方法の目的は、LTSを有するマウスに配置するために小型化することができる生体適合性ステントを構築することです。PLLA-PCL(70%ポリL-ラクチドおよび30%ポリカプロラクトン)コンストラクトは、最適な生体力学的強度を有し、生体適合性があり、生体内配置ステントに対して実用的であり、薬物を溶出することができることを実証した。この方法は、局所的に炎症を抑制し、気道線維化を軽減するために、様々な免疫調節剤を試験するための薬物送達システムを提供する。ステントの製造は28-30時間かかり、容易に再生することができ、大きなコホートの実験を可能にする。ここでは、ステント内に薬物ラパマイシンを組み込み、線維化およびコラーゲン沈着を減少させる効果を試験した。結果は、PLLA-PCLテントが信頼性の高いラパマイシン放出を示し、生理学的条件下で機械的に安定であり、生体適合性であり、気管における炎症反応をほとんど誘発することを明らかにした。また、ラパマイシン溶出PLLA-PCLステントは、生体内の気管内の瘢痕形成を減少させた。
Introduction
喉頭気管狭窄(LTS)は、イアトロゲン後挿管損傷による気管の病理学的狭窄である。細菌のコロニー形成の組み合わせは、気管切開または気管内チューブに対する異物応答、および患者特異的因子が異常な炎症反応を引き起こす。この不適応免疫応答は、気管内のコラーゲンの沈着につながり、気管およびその後の狭窄1、2の発光狭窄をもたらす。この疾患の現在の治療法は主に外科的であるため、過剰なコラーゲン沈着につながる異常な炎症およびプロ線維性経路を標的とする代替医学的ベースの治療パラダイムの開発が検討されている。mTORシグナル伝達複合体を阻害するラパマイシンは、免疫抑制効果と堅牢な抗線維芽細胞効果を有することが示されている。しかしながら、ラパマイシンが全身的に投与されると、一般的な副作用(例えば、高脂血症、貧血、血小板減少症)は3と発音することができる。私たちの方法論の目的は、これらの全身的な影響を軽減する気道で使用するために実用的な地元の薬物送達のための車両を開発することです。我々の評価は、薬物送達構造に対する局所免疫応答と、線維芽細胞機能を阻害し、局所免疫微小環境を変化させる能力を調査することに焦点を当てている。疾患特異的な結果には、線維症のマーカーを評価する生体内検査が含まれる。
生分解性薬物溶出ステントは、気道4を含む多臓器系における疾患の動物モデルに用いられている。気道狭窄または崩壊の管理のために、以前の調査は、薬物被覆シリコーンおよびニッケルベースのステント5を使用している。PLLA-PCLコンストラクトは、その薬物溶出プロファイルおよび3週間にわたる生理学的状態における機械的強度のためにこの特定の方法に対して選択された、これは、以前に発表された研究6で実証されている。PLLA-PCLはまた、FDA4によって既に承認された生体適合性および生分解性材料である。シスプラチンやMMCを溶出する生体適合性ステントは、ウサギやイヌなどの大型動物モデルで研究されている。しかし、これらの動物モデルでは、ステントは疾患の動物モデルに入れられ、経皮的に移植された。本研究は、気道損傷および喉頭気管狭窄のマウスモデルに経経口的に配置された生体適合性薬物溶出ステントを評価するためのユニークな方法を提供する。免疫調節薬を局所的に溶出し、マウスモデルでの研究のために小型化することができる生体適合性ステントは、翻訳前臨床研究に役立ちます。他の材料構造とのステント利用の以前の試みは、LTS7を区別する基礎炎症を悪化させる堅牢な異物応答を生成しました。この方法論は、我々の知る限り、LTSのマウスモデルにおけるステントベースの薬物送達システムの免疫調節および抗線維化効果を研究する最初の種類である。マウスモデル自体は、気管に対する免疫調節薬の効果を研究するためのいくつかの利点を提供しています。遺伝子組み換えマウスや健康で病気のマウスの実験的コホートを研究することができ、実験的な再現性につながり、費用対効果を向上させることができます。さらに、マウス気管へのステントの送達は、ヒトにおけるこのようなステントの臨床送達を模倣し、この方法の翻訳上の利点をさらに強調する。最後に、薬物とPLLA-PCLステントを製造することができる相対的な容易さは、気管の瘢痕形成を減少させることを目的とした代替薬物療法を提供するための改変を可能にする。
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Protocol
注:ここで説明するすべての方法は、ジョンズホプキンス大学動物ケアと使用委員会(MO12M354)によって承認されました。
1. PLLA-PCLにおけるラパマイシンの調製
- 70:30 PLLA-PCLポリマー溶液(固有粘度1.3−1.8 DL/G)の2つのガラスバイアル(キャップ付き)を準備します。材料表)1.0%ラパマイシンを含む1つのバイアルとラパマイシンなしの他のバイアルを含むソリューション。
- ガラスバイアルに600mgの70:30 PLLA-PCLに6mgのラパマイシンを加えて、ポリマー溶液を含む1.0%のラパマイシンを作ります。
- ラパマイシン(制御)を含まないポリマー溶液の場合は、ガラスバイアルに70:30 PLLA-PCLの600 mgのみを追加します。
- ヒュームフードの下で、各ガラスバイアルに6mLのジクロロメタンを加えます。
注意:ジクロロメタンは腐食性材料であり、ガラスピペットのみを使用する必要があります。適切な安全対策には、個人的な目の保護と手袋が含まれます。 - 各ガラスバイアルに120μLのグリセロールを加えます(グリセロール溶液2%)。
注:グリセロールの添加により、ステント構造の柔軟性が向上し、剛性が低下します。 - ガラスバイアルをリキャップし、ラパマイシンの有無にかかわらず70:30 PLLA-PCLを6−12時間溶解し、均質化できるようにします。
メモ:ガラスバイアルは、より速い溶解のための回転揺れプラットフォーム上に配置することができます。
2. ラパマイシン溶出試験
- ガラスペトリ皿に1%ラパマイシンを含む70:30 PLLA-PCL溶液のピペット1 mL。
注:1%ラパマイシンを含む70:30 PLLA-PCL溶液のこのボリュームは、ラパマイシンの120 μgを含み、各コンストラクトのラパマイシンの総量を表します。代替体積および濃度を使用することができる。 - 1%ラパマイシンで70:30 PLLA-PCLを許可し、ガラスペトリ皿の平らなディスクに硬化させます。
- 硬化したら、リン酸緩衝生理食塩分(PBS、pH7.4)を2mLに入れ、37°Cのチャンバーでインキュベートします。
- PBS(2 mL)を24時間ごとに収集して交換し、収集したPBSを使用してラパマイシン含有量の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析を行います。
- オートサンプラーと C18 4.6 cm x 250 mm HPLC カラムを使用して、オートサンプラーインジェクタを介してサンプルを実行し、ラパマイシンのシリアル希釈を使用して、校正された標準曲線を作成します。各サンプルを三重に実行します。
注:試験されるラパマイシンの直希釈は、10%、1%、0.1%、および0.01%を含む。 - 流量2.0 mL/分の流量で10/90体積/体積のHPLCグレードの水とアセトニトリルの移動相を使用して、ラパマイシンのHPLC中の吸光度を280nmに設定します。
注:図1は、14日間にわたるラパマイシンの溶出を示しています。
3. ラパマイシン溶出PLLA-PCLマウス気道ステントの作成
メモ:滅菌材料と滅菌技術を使用して手順3.2-3.9を実行し、生体内およびインビトロアプリケーションに影響を与える汚染を回避します。
- セクション 1 で説明されているように、ラパマイシンを含む PLLA-PCL 溶液を準備します。
- ゴムバルーン付きガラスパスツールピペットを使用し、1%ラパマイシンを含むPLLA-PCL溶液を22Gフッ素エチレンプロピレンベースのアンギオテーテル(材料表)の静脈カニューレに塗布する。片手でアンゴガテルを持ち、ガラスピペットを使用してPLLA-PCL溶液をアンギオカテルに落とします。ゆっくりとアンゴカテルを回転させ、PLLA-PCL溶液でアンギオカテルの均質なカバレッジを確保します。
注:最初はPLLA-PCL溶液は薄くなりますが、ジクロロメタンがアンギオカテルへの適用中に蒸発するにつれて、溶液はアンギオカテルに成形するより粘性になります。アプリケーション中に継続的にアンゴカテルを回すのが有益です。このステップは、ステントの一貫した厚さを確保するために、ゆっくりと細心の注意を払って行う必要があります。 - 下向きのアンギオカテルの先端と、乾燥のためのガラスペトリ皿の端にヒルトで成形されたアンギオカテルをプロップ。
- 室温で真空フードでステントを24時間乾燥させます(図2A)。
- 基になるカテーテルを自由にねじり、成形されたステントから滑り出すことによって、基礎となるアンギオカテーテルからステントコンストラクトを取り外します(図2B)。
- 鋳造プロセス中に発生した可能性のある欠陥がないか、ステントの円周を確認します。鋳造ステントに欠陥がある場合は、それを破棄します。
- エッジが軸になるように、鋳造ステントの両端を細かいストレートハサミでトリムします。
- 細かいストレートハサミを使用して、LTSのマウスモデルで使用するために鋳造ステントの3mm軸セグメントをカットします(図2C)。
注:約8つのステントは、ラパマイシンの120 μgを含む各3ミリメートルのステントで、1つの鋳造アンギオカテルから作ることができます。 - LTSのマウスモデルで使用する新しい22個の静脈カテーテルに3mmステントをロードします(図1)。
4. マウスにおける喉頭気管狭窄誘導
- 生体内マウス研究を行う前に、動物ケアと使用委員会の承認を得る。
- ケタミン(80−100 mg/kg)とキシラジン(5−10 mg/kg)の腹腔内注射を与えることによって、9週齢の雄C57BL/6を麻酔する。
注:マウスの他の株は置換することができますが、マウスの重量は20〜27gの間であることが推奨されます。 - マウスを実験群にランダム化する(1%ラパマイシン含有PLLA-PCLステントの配置による化学機械的損傷)と2つの対照群:1)PLLA-PCLステントの配置による化学機械的損傷、2)化学機械的損傷なしステントの配置。
- 手術用プラットフォーム上のマウスを、サフィンの位置に置きます。プラットフォームの上部に貼り付けたスレッドの小さなループを使用して、中央の切り傷の周りにループして頸椎を拡張します。
- 2インチのテープを使用して、マウスの手と脚をテーブルに貼り付けます。十分な麻酔を持っていることを確認するためにマウスの足をつまむ。
- その後、手術部位が準備される。上にある毛皮を取り除き、皮膚を3回洗浄する必要があります(アルコールまたは希釈された皮膚消毒剤でヨウ素またはクロルヘキシジンスクラブを交互に)。エリアはドレープし、無菌手袋を着用する必要があります。殺菌された器械は使用しないとき無菌の表面に置かれるべきである。
- 細かい湾曲した虹彩はさみを使用して、マウスの首に1.5cmの中線垂直切開を行います。上にある胸腺を分割し、気管を視覚化するために得られた2つの葉を横に分けます。上にあるステノヒイイドとステルノ甲状腺(ストラップ)の筋肉を上等の付着体で両側に分割する。
注:喉頭気管複合体全体は、この後に完全に露出する必要があります。 - 喉頭を通して22Gのアンギオカテテルを気管に通します。小さな鉗子を使用してマウスの前喉頭に圧力を加え、アンギオカテルの正しい配置を支援する。気管を通して白いアンギオカテルを視覚化し、正しい配置(非食道)を確保します。
注:マウス気管は非常に薄く、白いアンギオカテルは半透明の気管を通して視覚化されます。 - 挿入されたアンギオカテルを通してブレオマイシンコーティングされたワイヤーブラシを渡します。
- ワイヤーブラシだけが気管に残るように、アンギオカテルをゆっくりと引き出します。
- 気管の細かい鉗子を使用してカウンター圧力を加えるし、ワイヤーブラシで気管内腔を機械的に破壊する。
- ワイヤーブラシの上の気管にアンギオカテルを挿入し直します。
- ワイヤーブラシを取り外し、ブレオマイシンを再塗布します。
- 手順 4.8~4.12 の合計 5 倍を繰り返します。各アプリケーション間のブラシにブレオマイシンを適用します。
注: このモデルの検証と説明は Hillel etal. 8にあります。 - マウス気管からアンギオカテルを取り出します。
メモ:ステントを置く場合は、切開部を組織接着剤で閉じることができます。
5. マウスにおける経口PLLA-PCLステント配置
- 空の22 Gアンギオパテテルに3mm鋳造ステントを1つ積み込む(図3A)。
注:ステントは、アンギオカテルの先端から5ミリメートルを休ませる必要があります。 - 3mm鋳造ステントに細い黒い垂直線を描きます。
注:このラインは気管のステントの視覚化を改善することを可能にする。 - ステントを装填したアンギオカテルでマウスを経口挿管します。
- 経頸切切開を通して気管内のアンギオカテル上のステントを視覚化する(図3B)。
注:気管は非常に薄く、ステントの黒色の染料を気管を通して可視化することができます。正しい気管の配置を確認するために使用します。 - 細かい鉗子で経頸部切開を通して気管をつかむによって、所定の場所にステントを保持します。
- 細かい鉗子でステントのグリップを維持しながら、アンゴガテテルを経経口的に取り外します。
注:アンギオカテルが取り外されたときに内腔を押しつぶさないようにステントにあまりにも多くの力を加えないことが非常に重要です。しかし、ステントがアンゴカテルで除去されないようにするには十分な力が必要です。0.8 mmのシアレンドスコープは気管のステントの位置および配置を視覚化するために使用することができる。 - 組織接着剤で経頸部切開部を閉じます。
- 各マウスをケージに戻す前に、元のアクティビティ レベルに回復できるようにします。
6. サンプルの組織学的調製
- 7日後、14日後、または21日後に動物プロトコルごとに子宮頸部転位を有する麻酔薬と犠牲マウスを麻酔する。
注:研究の慢性性に基づいて、異なる時間間隔(例えば、28、30日など)を使用することができる。 - 手順 4.4 および 4.5 の説明に従って、手術用プラットフォームにマウスを配置します。
- 細かい湾曲した虹彩はさみを使用して、マウスの首の切開を再び開きます。
- ステップ 4.6 ごとに気管を露出します。
- 細かい湾曲した虹彩はさみを使用して、ステントのレベル以下の遠位気管を分割します。
- 近位気管を喉頭の下とステントの上に細かい湾曲した虹彩はさみを使って分けます。
注:気管が胸部に引き込むのを防ぐために、まず遠位気管を分割することが重要です。 - 分割された気管を後部食道から分離し、マウスから気管を取り除きます。
注:ステントはマウス気管内に保持されます。 - 気管からステントを取り出し、24時間10%ホルマリンで固定します。
- 次のステップで気管の軸切りができるように、遠位端を中心にパラフィンにホルマリン固定マウス気管標本を埋め込みます。
- ミクロトームを用いてパラフィン埋め込みマウス気管の5μm切片をカットします。
注:標本は遠位気管から軸に切断する必要があります。 - 試料の長さに沿って250μmごとに5μmの代表部を得る。
- 各代表的なセクションにH&E染色を完了します。
- スライドを3分間スライドあたりキシレン2xに配置してスライドを脱パラフィン化します。
- スライドを100%エタノール2分間、95%エタノール2分、70%エタノールを2分間、70%エタノールを2分間置いて水分補給します。
- 流水でスライドを2分間洗います。
- ヘマトキシリンのスライドを3~5分間染色します。
- 流水でスライドを5分間洗います。
- スライドを1%の酸性アルコールに1分間置きます。
- 流水でスライドを1分間洗います。
- 30sのための0.2%アンモニア水でリンス。
- 水道水のスライドを5分間流し、95%エタノール10倍に浸します。
- エオシン染色は、エオシンフロキシンに30sのスライドを置くことによって。
- スライドを脱水し、5分間95%エタノールに入れ、続いて5分間絶対エタノール2xを入れる。
- キシレン2xに5分間置きます。
- キシレンベースの取り付け媒体を使用してスライドをマウントします。
- Hillel etal. 8に記載されているように、層のプロプリアの厚さを測定します。
7. 生体内のステント生体適合性
- 手順 6.1−6.4 のように組織切片を準備します。気管内内のステントの位置に対する炎症の変化を可視化するために、これらの気管切片からステントを除去しないでください。
- ステントに対する急性異物応答を決定するには、CD3およびF4/80マーカーを用いてマクロファージおよびT細胞活性を観察する。
注:他のマーカーは、ステントに対する急性炎症反応を決定するためにも使用することができる。 - 市販の親水性プラススライド(材料表)上のパラフィン埋め込み気管の5μmカットセクションを得る。各スライドに 2 つのセクションを配置します。
注:これらのセクションは、PLLA-PCLステントが配置された気管の領域からである必要があります。
- ステントに対する急性異物応答を決定するには、CD3およびF4/80マーカーを用いてマクロファージおよびT細胞活性を観察する。
- スライドをキシレン2xに入れ、それぞれ5分間行います。
- スライドを100%エタノール2xにそれぞれ3分間置きます。
- スライドを95%のエタノールに1分間置きます。
- スライドをヒストロジー染色ラックに入れ、抗原検索バッファー(材料の表)に浸し、20分間熱湯で野菜蒸し器に入れます。
- スチーマーから染色ラックを取り外し、抗原検索バッファを廃棄します。
- バッファを1 mLのPBSに交換します。
- スライドを濡れた染色箱に1分間置きます。
- PBSを廃棄し、30分間10%FBSでダルベッコの修正ワシ培地(DMEM)でスライドをインキュベートします。
- DMEMを廃棄し、異なる種で育てられた2つの一次抗体の混合物を追加します。スライドをパラフィンフィルムで覆い、暗い部屋で4°Cで一晩インキュベートします。
注:このプロトコルではウサギ抗CD3およびラット抗F4/80(材料の表)が使用されました。 - スライドをPBS 3xで5分間洗います。
- 一次抗体種に特異的な二次抗体(材料の表)を有するスライドを、DMEMで10%FBSで、暗闇の中の室温で0.5−1時間でインキュベートする。
- 暗闇の中でPBS 3xでスライドを5分間洗います。
- 4'6-ディアミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)で取り付け媒体の滴でカバースリップにスライドをマウントします。スライドは、20 °C または 4 °C のいずれかで暗闇の中に保管してください。
- レーザースキャン共焦点顕微鏡と写真で染色されたスライドを観察します。
- DAPIで染色する細胞の総数を定量化し、傷ついのない気管と比較するために目的の抗体を用いた。
8. マウス気管定量遺伝子発現解析
- 手順 6.1−6.7 の説明に従ってマウス気管を収集し、ステントを取り外します。
注:収穫されたマウス気管は、最大2年間-80°冷凍庫に保存することができます。 - ステップ8.1で収穫した気管組織を細かいハサミを用いて脱氷し、市販のカラムベースRNA抽出キットの一部として1.4mmセラミックビーズ(材料表)を用いたビーズミルホモジナイザーを用いてさらに均質化する(材料表)。
注:ビードミルホモジナイザー設定=6 m/sで1つの40 sサイクル。 - カラムベースの抽出精製キット(材料表)を使用して気管リサートからRNAを抽出します。
- 分光光度計(材料表)を用いて各サンプルからRNAを定量化する。
注:RNA純度は、純粋なRNAサンプル読み取り2.0で260/230 nm比を使用して評価されます。 - 逆転写酵素(材料表)とサーモサイカーを使用して抽出されたRNAから相補的なDNAを作成し、次の設定で5分(プライミング)、30分(逆転写)で46°C、1分間(逆転写酵素の不活性化)で95°Cを設定します。
- 定量的リアルタイムPCRで使用するために、RNase遊離水で相補的なDNAサンプルを10−25 ng/mLの濃度に希釈します。
- 相補DNAの1μL(10−25ng/mL)とPCRマスターミックスの10°L(材料の表)、ddH2 Oの8°L、10μM前方および逆プライマーの8μLを96ウェルPCRプレートの1ウェルの目的遺伝子に対して、前方および逆プライマーの10°Lを混合する(材料の表)。
メモ:各ウェルの総体積は20°Lでなければなりません。96ウェルプレート上の各ウェルは、目的の1つのサンプルと1つの遺伝子のみを含む必要があります。 - 対象のすべての遺伝子について手順 8.1 ~ 8.7 を繰り返し、トリプリケート内の各遺伝子に対して各サンプルを実行します。
注:コラーゲン1、コラーゲン3、および参照遺伝子β-アクチンの遺伝子特異的前方および逆プライマー(材料表)は、線維化のマーカーを調べるために一般的に使用される。 - 96ウェルプレートをリアルタイム定量PCRマシンに配置し、次のプロトコルを開始します:15sの場合は95°Cで変性し、40サイクルで60°Cで延びます。
- 目的の各遺伝子(GOI)の遺伝子産物検出のためのサイクル閾値(CT)を、すべてのサンプルの参照遺伝子β-アクチンのCT値に正規化し、各GOIに対してΔCTを得た。次に、処理されたサンプルと未処理のサンプルについて、各 GOI の ΔCT 値を比較して ΔΔCT を生成します。
注:サイクル閾値は、所定量の遺伝子産物(ΔRn)が存在する場合の増幅曲線上の点である。各反応のΔRn値は、目的の遺伝子ごとに決定されるべきであり、増幅曲線の直線部分に当たるべきである。
注: ΔCT = CT (GOI) – CT (参照遺伝子);ΔΔCT = ΔCT (処理済み) – ΔCT (未処理)。 - 2ΔΔCTを算出することにより、治療した試料と未処理サンプル間の遺伝子発現の相対的変化を折り畳み変化の発現として算出する。
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Representative Results
本研究で用いたラパマイシンを装填した生分解性PLLA-PCLステント構築物は、生理学的条件下で一貫した予測可能な方法でラパマイシンを溶出することができた(図1)。図2は、LTSのマウスモデルで使用するために22Gアンギオパテテルの周りに鋳造されたPLLA-PCLステントを示す。気管内のラパマイシン溶出の効果が線維化の減衰に有効であるかどうかを判断するために、線維化関連遺伝子発現および急性炎症のマーカーの測定された変化は、遺伝子発現解析、フローサイトメトリー、免疫蛍光、およびELISAを通じて評価することができる。上述した方法を用いてマウスの気管内への小型化ステントの配置に成功が実証されている。この方法の概略を図3に示します。図4は、半透明のマウス気管を介して可視化されるステント上の黒いマーカーによって示される気管内の座座中の小型生体適合性ステントを示す。初期実験では、気管内のステントの配置を確認するために0.8mmのシアレンドスコープを用いて役立った。21日後、ステントの経口配置が有効であり、ステントが元の位置から移行しなかったことを確認するために、頸部切開を再び開き、ステントの配置を決定した。図4Bに示すように、ステントの黒色染料マーカーは、気管内の位置を維持したステントを示した。ステントによる治療の21日後の気管の切除を図4Cに示す。
急性および慢性炎症のマーカーに対する免疫蛍光染色を用いた生体適合性試験の代表的な画像を図5に示す。これは、PLLA-PCLステント構築物(ラパマイシンを含まない)が、配置後に存在する免疫細胞の最小数によって決定される免疫反応性を示さなかったことを実証した。この方法では、正常な傷つけない気管を使用し、ラパマイシンのないPLLA-PCLステントを配置して、コンストラクト自体に対する炎症反応を決定することに注意することが重要です。
次に、ラパマイシン溶出PLLA-PCLステントが瘢痕の軽減に有効であったかどうかを判定するために、急性炎症および線維症6のマーカーにおける遺伝子発現変化を以前に実証した。具体的には、90.3倍の減少があります(SEM ± 26.0; n = 4;p < 0.01)4日目におけるcol1a1の減少、ならびに急性炎症マーカーINF-γ、CD11b、Arg-1、およびIL-1B6。一部の遺伝子の折り変えの違いは有意ではなかったが、マウスのより大きなコホートで、意義を達成できる可能性がある。薬物溶出による気管に対する変化があったのか、ステントによる放射力の発せによって気管に変化があったのかを判断するために、ラパマイシン溶性ステントを用いて治療した気管内の層子の幅が減少したことを実証した。
図1:ラパマイシンPLLA-PCL溶出1%のラパマイシンを含むPLLA-PCLコンストラクトは、14日間にわたってラパマイシンの一貫した予測可能な放出を実証した。データ点は、サンプリング溶出の平均±SEM(n=3)を表す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ステント鋳造(A) PLLA-PCL溶液を22Gアンギオパテテル付近で乾燥させた。(B) その後、キャストはアンギオカテルから取り除かれました。(C)ステントをマウスモデル6で使用するために3mmの長さに切断した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウスにおける経口ステント配置(A) ステントを空のアンギオカテルに積み込み、気管に経口状に入れた。(B)ステント上の黒色染料のマーキングは、マウス気管内での位置を確認するために経頸切切開を介して見られ得る。(C)病種マウス気管6における座座りにおけるステントの代表的な描画。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ステントの現場画像で。(A-B)黒色の染料のマーキングが付いているステントは、マウス気管の上に見られることがある。(C) 21日6時の収穫後のステントとマウス喉頭気管複合体の画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ステントの生体適合性。4日目のF4/80(マクロファージ、赤色発色)およびCD3(緑色発色、Tリンパ球)に対する免疫蛍光染色により、(A)傷ついた気管および(B)気管内の最小炎症細胞がPLLA-PCLステントを有することが明らかになった。これは、(C)傷ついた気管、肥厚したラミナプロプリアと陽性F4/80およびCD3染色6を有する多数の細胞の存在とは対照的である。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
生体内で薬物溶出ステントを正常に構築して使用するための最も重要なステップは、1)望ましい薬物溶出速度に対する最適なPLLA-PCL比を決定し、2)溶出する薬物の適切な濃度を決定し、3)ステントを成形する生体内使用のためのアンギオカテルの周り、および4)致命的な気道閉塞を引き起こすことなく、LTS誘導後にマウスにステントを経口的に送り込む。
気道疾患の動物モデルにおけるステントを用いた薬物送達にはいくつかの方法があるが、疾患性マウスモデルにおける薬物送達が可能な生体適合性ステントの開発は初めてである。薬物送達のためのこの方法を開発する際に、いくつかの改変が行われた。機械的に硬いステントを気管に入れ、生理的分泌物にもかかわらず気管に留まるための適切なPLLA-PCL組成物を決定することが重要でした。PLLA-PCLの70:30組成は、それが正常に耐え難い性質でラパマイシンを溶出し、私たちのマウスモデルで安全で信頼性の高い方法で配置され、生理学的に劣化しないので、アンゴガテーテル成形でステント構造のために決定されました条件。この方法の困難で潜在的にメーカー依存の部分は、アンギオカテルの周りにステントを成形することです。当初、インビボステントを構築する際に、22Gアンギオテーテルをガラスピペットの先端の内側に置き、ポリマー溶液をアンジオパテーテルとガラスピペットの間の空間に注ぎ、間のスペースのキャストを形成した。しかし、この方法から生じるステントの壁は薄すぎて気管に確実に入れることができなかったことが多かった。アンギオカテル上のステントを成形するための現在の方法の制限は、一貫性のためのメーカーへの依存であり、ステント生産における均質性を確保するために細部に細心の注意を払う必要性です。鋳造ステント間の厚さの差異の可能性は、将来の研究で対処する必要があります。さらなる研究では、アンゴカテーテルとガラスを囲むガラスの間のスペースが50μmとなるように、別のガラスまたは非腐食性材料に囲まれた22Gアンギオテーテルの金型を設計し、ステントの十分な壁の厚さであると判断したいと考えています。気管への容易な配置のため。
生体適合性ステントを使用して、影響を受けた気管への薬物送達を研究することにはいくつかの利点があります。全体的に、薬物を含むポリマーで被覆された金属またはシリコーンからなるステントは、気管の既に瘢痕化した部分に対する造粒組織およびさらなる炎症反応を産生することが示されている。この方法は、生体適合性である生体材料で完全に作られたステントの使用を尋問し、また信頼性の高い方法で免疫調節薬を放出することが有利である。PLLA-PCLステントはまた、マウスモデルにおいて生体適合性であることが示され、急性炎症反応を引き起こさない。線維化に対抗できる薬剤を研究する際には、この方法に記載されているようにPLLA-PCLなどの生体適合性物質から完全に構成されるステントを用いることは有益である。
この方法を使用して使用できるステントを構築する利点と容易さは、PLLA-PCLの組成を変化させることができ、組成物中に混合された薬物の放出プロファイルの違いを可能にすることです。PLLA-PCL材料の以前の研究は、PLLA-PCLブレンドの変動が材料のより大きな劣化につながることを示し、より速い薬物放出9を可能にする。また、この方法を用いてマウスに入れることができるステントを構築することは有利であり、気道疾患に対するほとんどのステント研究は、より大きな動物10、11、12で行われた。異なる疾患パラダイムに対して改変でき、疾患状態での薬物溶出ステントの試験を可能にするマウスモデルの使用は理想的である。病気の状態で薬物溶出ステントをテストし、病気のない動物のそれらにその有効性を比較することができることは、より大きな実験的な厳しさを可能にします。この方法はまた、ステントが外科的に移植された以前の研究とは対照的に、気道の薬物溶出ステントを経経口的に配置する方法を示す。
この研究は、小さな動物モデルにおけるステントの開発とテストに非常に使い可能なプラットフォームを示す。しかし、ヒト被験者で使用するための他の要因を考慮する必要があります。ステントの堅固で堅い性質を考えると、それはチャネル化された柔軟な気管支鏡を介して置くことができない可能性が高いが、直接喉頭鏡検査と硬質気管支鏡検査で経経口に配置する必要があります。理想的には、ステントは、気道のバルーン膨張後に配置され、通気性を緩和するのに役立ちます。患者の安全の見込みから、ステントが移動する可能性は、生命を脅かす気道の侵害につながる可能性が高いため、大きな懸念事項です。第二に、粘液または血液の蓄積に二次的なステント閉塞の可能性も考慮されなければならない。これらのリスクを最小限に抑えるには、さらなるテストと開発が必要です。
今後の研究では、この方法を利用してPLLA-PCLブレンドで異なる薬物を試験し、異なる免疫抑制治療が気管内の瘢痕形成をどのように軽減できるかをさらに理解することができます。このようなステントはマウスに配置できるため、瘢痕形成遺伝子に対する遺伝子改変を有するマウスまたはマウスのより大きなコホートを用いても試験することができる。今後の実験には、ステントの慢性移植後に起こりうる気管の変化(3~6ヶ月)や気管内腔の変化、炎症マーカーや線維症の遺伝子発現プロファイルの理解も含まれる。マーカー。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
国立衛生研究所の難聴およびその他のコミュニケーション障害に関する研究所は、受賞番号1K23DC014082および1R21DC017225(アレクサンダー・ヒレル)の下で。この研究はまた、三物学会と米国外科医大学(アレクサンダー・ヒレル)、米国医師会財団、シカゴ、IL(マダヴィ・ドゥヴリ)、T32 NIDCD研修助成金(ケビン・モッツ)によって財政的に支えられています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
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