Ontwerp van een biocompatibele drug-Eluting tracheale stent in muizen met Laryngotracheale stenose

Summary

Laryngotracheale stenose is het resultaat van pathologische litteken afzetting die de tracheale luchtweg kritisch vernauwt en geen effectieve medische therapieën mist. Met behulp van een PLLA-PCL (70% poly-L-lactide en 30% polycaprolactone) stent als een lokale drug delivery systeem, potentiële therapieën gericht op het verminderen van litteken proliferatie in de luchtpijp kan worden bestudeerd.

Abstract

Laryngotracheale stenose (LTS) is een pathologische vernauwing van de subglottis en luchtpijp die leidt tot extrathoracale obstructie en significante kortademigheid. LTS resulteert in een slijmvlies beschadiging door een vreemd lichaam in de luchtpijp, wat leidt tot weefselbeschadiging en een lokale ontstekingsreactie die misgaat, wat leidt tot de afzetting van pathologisch littekenweefsel. De behandeling van LTS is chirurgisch vanwege het gebrek aan effectieve medische therapieën. Het doel van deze methode is om een biocompatibele stent te construeren die kan worden geminiaturiseerd om in muizen met LTS te plaatsen. We hebben aangetoond dat een plla-PCL (70% poly-L-lactide en 30% polycaprolactone) constructie een optimale biomechanische sterkte had, was biocompatibel, praktisch uitvoerbaar voor een in vivo plaatsing stent, en geschikt voor het eluering van drugs. Deze methode biedt een systeem voor het afleveren van geneesmiddelen voor het testen van verschillende immunomodulerende middelen om de ontsteking lokaal te remmen en de fibrose van de luchtwegen te verminderen. De productie van de stents duurt 28 − 30 uur en kan eenvoudig worden gereproduceerd, waardoor experimenten met grote cohorten mogelijk zijn. Hier hebben we het medicijn rapamycine binnen de stent opgenomen om de effectiviteit ervan te testen bij het verminderen van fibrose en collageen depositie. De resultaten toonden aan dat PLLA-PCL-tenten betrouwbare rapamycineafgifte vertoonden, mechanisch stabiel waren in fysiologische omstandigheden en biocompatibel waren, waardoor weinig ontstekingsreactie in de luchtpijp werd teweeggebracht. Verder vermindert de rapamycine-eluting PLLA-PCL stents de littekenvorming in de luchtpijp in vivo.

Introduction

Laryngotracheale stenose (LTS) is een pathologisch vernauwing van de luchtpijp, meestal als gevolg van iatrogene post-intubatie letsel. De combinatie van bacteriële kolonisatie, reactie van het buitenlandse lichaam op een tracheostomie of endotracheale buis, en patiëntspecifieke factoren leiden tot een afwijkende ontstekingsreactie. Deze maladaptieve immuunrespons leidt tot de afzetting van collageen in de luchtpijp, resulterend in Luminale vernauwing van de luchtpijp en daaropvolgende stenose^1,2. Aangezien de huidige behandeling voor deze ziekte primair chirurgisch is, is het ontwikkelen van een alternatief medisch gebaseerd behandelings paradigma gericht op de afwijkende inflammatoire en profibrotische trajecten die leiden tot overmatige collageen depositie. Rapamycine, die remt de mTOR signalering complex, is gebleken dat immunosuppressieve effecten evenals een robuuste antifibroblast effect. Wanneer rapamycine echter systemisch wordt toegediend, kunnen vaak voorkomende bijwerkingen (bijv. hyperlipidemie, anemie, trombocytopenie) worden uitgesproken³. Het doel van onze methodologie is het ontwikkelen van een voertuig voor lokale geneesmiddelafgifte uitvoerbaar voor gebruik op de luchtweg die deze systemische effecten zou verminderen. Onze beoordelingen zijn gericht op het onderzoeken van de lokale immuunrespons op de drug delivery construct evenals de capaciteit voor de remming van fibroblast functie en de lokale immune micro omgeving te veranderen. Ziektespecifieke uitkomsten omvatten in vivo testen die markers van fibrose evalueren.

Biologisch afbreekbare drug-eluting stents zijn gebruikt in diermodellen van de ziekte in meerdere orgel systemen, met inbegrip van de luchtweg⁴. Voor het beheer van de luchtweg stenose of instorting, hebben eerdere onderzoeken gebruik gemaakt van met drugs beklede siliconen en op nikkel gebaseerde stents⁵. Een PLLA-PCL-constructie werd gekozen voor deze specifieke methode vanwege zijn geneesmiddel elutie profiel en mechanische sterkte in fysiologische omstandigheden gedurende een periode van 3 weken, wat is aangetoond in eerdere gepubliceerde studies⁶. PLLA-PCL is ook een biocompatibel en biologisch afbreekbaar materiaal dat al is goedgekeurd door de FDA⁴. Biocompatibele stents eluering cisplatine en MMC zijn bestudeerd in grote diermodellen zoals konijnen en honden. Echter, in deze diermodellen, stents werden niet geplaatst in een diermodel van de ziekte en werden geïmplanteerd transcervically. Deze studie biedt een unieke methode voor het beoordelen van een biocompatibele drug-eluting stent geplaatst transoraal in een muismodel van luchtweg letsel en laryngotracheale stenose. Een biocompatibele stent die lokaal een immunomodulerend geneesmiddel wegspost en kan worden geminiaturiseerd voor studie in een muriaans model is waardevol voor translationeel preklinisch onderzoek. Eerdere pogingen tot stent-gebruik met andere materiaal constructies genereerden robuuste reacties van het buitenlandse lichaam en verergeren de onderliggende ontsteking^{die LTS onderscheidt}. Deze methodologie, naar onze kennis, is de eerste in zijn soort om de immunomodulerende en antifibrotische effecten van een stent-based geneesmiddel bezorgingssysteem in een muriene model van LTS te bestuderen. Het model van de Murine zelf biedt verschillende voordelen voor het bestuderen van de effecten van een immunomodulerende drug op de luchtpijp. Genetisch gemodificeerde muizen en experimentele cohorten van gezonde en zieke muizen kunnen worden bestudeerd, wat kan leiden tot experimentele reproduceerbaarheid en het verbeteren van de kosteneffectiviteit. Bovendien bootst de levering van de stent transoraal in de luchtpijp van de muis de klinische levering van een dergelijke stent bij mensen na, wat het translationeel voordeel van deze methode verder benadrukt. Ten slotte, het relatieve gemak waarmee de PLLA-PCL stent met het medicijn kan worden geproduceerd, maakt het mogelijk om alternatieve medicamenteuze therapieën te leveren die gericht zijn op het verminderen van littekenvorming in de luchtpijp.

Protocol

Opmerking: alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Johns Hopkins University (MO12M354).

1. bereiding van rapamycine in PLLA-PCL

1. Bereid twee glazen flesjes (met doppen) van 70:30 PLLA-PCL Polymeeroplossingen (inherente viscositeit 1.3 − 1.8 DL/G; Tabel met materialen) oplossingen, met één injectieflacon met 1,0% rapamycine en de andere zonder rapamycine.
   1. Maak een 1,0% rapamycine bevattende polymeeroplossing door 6 mg rapamycine toe te voegen aan 600 mg van 70:30 PLLA-PCL in een glazen injectieflacon.
   2. Voor polymeeroplossing zonder rapamycine (controle), Voeg alleen 600 mg 70:30 PLLA-PCL toe aan de glazen injectieflacon.
2. Voeg onder een rook afzuigkap 6 mL dichloormethaan toe aan elke glazen injectieflacon.
   Let op: dichloormethaan is een corrosief materiaal en er mogen alleen glazen pipetten worden gebruikt. Gepaste veiligheidsmaatregelen zijn onder andere persoonlijke oogbescherming en handschoenen.
3. Voeg 120 μL glycerol toe aan elke glazen injectieflacon (voor 2% glycerol oplossing).
   Opmerking: de toevoeging van glycerol zorgt voor meer flexibiliteit en verminderde stijfheid in de stent construct.
4. Recap de glazen flesjes en laat 70:30 PLLA-PCL met en zonder rapamycine ontbinden en homogeniseren voor 6 − 12 uur.
   Opmerking: glazen flesjes kunnen ook op een draaiend schud platform worden geplaatst voor een snellere oplossing.

2. rapamycine elutie testen

1. Pipetteer 1 mL 70:30 PLLA-PCL-oplossing met 1% rapamycine in een glazen Petri schaaltje.
   Opmerking: dit volume van 70:30 PLLA-PCL oplossing met 1% rapamycine bevat 120 μg rapamycine en vertegenwoordigt de totale hoeveelheid rapamycine in elke constructie. Alternatieve volumes en concentraties kunnen worden gebruikt.
2. Laat 70:30 PLLA-PCL toe met 1% rapamycine om te harden in een vlakke schijf in de glazen Petri schaal.
3. Eenmaal gehard, plaats de schijf in 2 mL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) en inincuberen in een 37 °C kamer.
4. Verzamel en vervang PBS (2 mL) elke 24 uur en gebruik verzamelde PBS voor high-performance vloeistofchromatografie (HPLC)-analyse van rapamycine-inhoud.
5. Gebruik een autosampler en een C₁₈ 4,6 cm x 250 mm HPLC-kolom om monsters te draaien via de autosampler-injector, samen met seriële verdunningen van rapamycine om een gekalibreerde standaard curve te maken. Voer elk voorbeeld in drievand uit.
   Opmerking: seriële verdunningen van rapamycine die moeten worden getest zijn 10%, 1%, 0,1% en 0,01%.
6. Gebruik een mobiele fase van HPLC-kwaliteit water en acetonitril met 10/90 volume/volume met een debiet van 2,0 mL/min. Stel de extinctie in tijdens HPLC voor rapamycine tot 280 nm.
   Opmerking: afbeelding 1 toont de elutie van rapamycine over een periode van 14 dagen.

3. creatie van rapamycin-eluting PLLA-PCL Murine luchtweg stents

Opmerking: Voer de stappen 3.2 − 3.9 uit met steriele materialen en steriele techniek om besmetting te voorkomen die in vivo en in vitro toepassingen zou beïnvloeden.

1. Bereid PLLA-PCL-oplossingen die rapamycine bevatten, zoals beschreven in punt 1.
2. Gebruik een glazen Pasteur-pipet met een rubberen ballon en breng 1 mL PLLA-PCL-oplossing met 1% rapamycine aan op de veneuze canule van een op 22 G gefluoreerde ethyleen propyleen gebaseerde angio katheter (Inhoudsopgave). Houd de angio katheter in één hand vast en gebruik de glazen pipet om de PLLA-PCL-oplossing op de angio katheter te laten vallen. Draai de angio katheter langzaam om een homogene dekking van de angiocatheter met de PLLA-PCL-oplossing te garanderen.
   Opmerking: in eerste plaats zal de PLLA-PCL-oplossing dun zijn, maar naarmate de dichloormethaan tijdens de toepassing op de angio katheter verdampt, zal de oplossing meer visceus worden om op de angio katheter te schimmel. Continu draaien van de angio katheter tijdens de toepassing is gunstig. Deze stap moet langzaam en nauwgezet worden uitgevoerd om de consistente dikte van de stent te garanderen.
3. Prop de gevormde angio katheter met de punt van de angio katheter naar beneden gericht en de gevest op de rand van een glazen Petri schaaltje om te drogen.
4. Laat de stents 24 uur drogen in een vacuüm afzuigkap bij kamertemperatuur (Figuur 2a).
5. Verwijder de stent-constructie van de onderliggende angio katheter door de onderliggende katheter voorzichtig vrij te draaien en uit de gevormde stent te schuiven (Figuur 2B).
6. Controleer de stent omtrek op eventuele defecten die tijdens het gietproces hebben kunnen ontstaan. Als er een defect in de gegoten stent aanwezig is, gooi deze dan weg.
7. Trim elk uiteinde van de gegoten stent met een fijne rechte schaar zodat de randen axiaal zijn.
8. Met behulp van fijne rechte schaar, knip 3 mm axiale segmenten van de cast stent voor gebruik in een muismodel van LTS (Figuur 2C).
   Opmerking: ongeveer 8 stents kunnen worden gemaakt van één gegoten angio katheter, met elke 3 mm stent met 120 μg rapamycine.
9. Laad de 3 mm stent op een nieuwe 22 veneuze katheter voor gebruik in een muismodel van LTS (Figuur 1).

4. laryngotracheale stenose inductie bij muizen

1. Voorafgaand aan het uitvoeren in vivo muis studies krijgen goedkeuring van het Dierenzorg-en gebruiks Comité.
2. Anesthetiseer een 9 weken oude mannelijke C57BL/6 door het geven van een intraperitoneale injectie van ketamine (80 − 100 mg/kg) en xylazine (5 − 10 mg/kg).
   Opmerking: andere muizenstammen kunnen worden vervangen, maar het wordt aanbevolen dat het gewicht van de muizen tussen de 20 − 27 g ligt.
3. Muizen randomiseren tot een experimentele groep (chemomechanische verwonding met een plaatsing van een 1% rapamycine bevattende PLLA-PCL stent) en twee controlegroepen: 1) chemomechanische verwonding met de plaatsing van een PLLA-PCL stent, 2) chemomechanische verwonding zonder de plaatsing van een stent.
4. Plaats een muis op een chirurgisch platform in rugligging. Gebruik een kleine lus van draad aangebracht op de bovenkant van het platform om de cervicale wervelkolom uit te breiden door deze rond de centrale snijtanden te herhalen.
5. Bevestig de handen en benen van de muis aan de tafel met 2 inch stukjes tape. Knijp muis paw om ervoor te zorgen dat het voldoende verdoving heeft gehad.
6. De operatieplaats wordt dan afgebroken. De bovenliggende vacht moet worden verwijderd en de huid moet worden gereinigd (afwisselend jodium of chloorhexidine scrub met alcohol of verdunde huid ontsmettingsmiddel) driemaal. Het gebied moet worden gedrapeerd en steriele handschoenen worden gedragen. De gesteriliseerde instrumenten moeten op een steriel oppervlak worden gelegd wanneer ze niet in gebruik zijn.
7. Maak een 1,5 cm middenlijn verticale incisie in de nek van de muis met behulp van fijne gebogen Iris schaar. Verdeel de overliggende thymus en lateraliseer de twee resulterende lobben om de luchtpijp te visualiseren. Verdeel de bovenliggende sternohyoid en sternoschildklier (riem) spieren bij de superieure bevestiging bilateraal.
   Opmerking: het hele laryngotracheale complex moet na deze volledig worden blootgesteld.
8. Passeren een 22 G angio katheter transoraal door het strottenhoofd in de luchtpijp. Gebruik kleine tang om druk toe te passen op het voorste strottenhoofd van de muis om te helpen bij de juiste plaatsing van de angio katheter. Visualiseer de witte angio katheter door de luchtpijp om een correcte plaatsing te garanderen (niet-oesofageale).
   Opmerking: de luchtpijp van de muis is extreem dun en de witte angio katheter zal worden gevisualiseerd door de doorschijnende luchtpijp.
9. Laat een draad borstel met bleomycine coating door de ingebracht angio katheter.
10. Trek de angio katheter langzaam terug zodat alleen de draad borstel in de luchtpijp blijft.
11. Breng tegen druk aan met behulp van fijne Tang op de luchtpijp om het tracheale lumen mechanisch te verstoren met de draad borstel.
12. Plaats de angio katheter opnieuw in de luchtpijp over de draad borstel.
13. Verwijder de draad borstel en breng Bleomycine opnieuw aan.
14. Herhaal stap 4.8 − 4.12 een totaal van 5x. Breng bleomycine aan op het penseel tussen elke toepassing.
    Opmerking: validatie en beschrijving van dit model kan worden gevonden in Hillel et al.⁸.
15. Verwijder de angio katheter uit de luchtpijp van de muis.
    Opmerking: als er geen stent moet worden geplaatst, kan de incisie worden gesloten met weefsellijm.

5. transoral PLLA-PCL stent plaatsing bij muizen

1. Laad één 3 mm gegoten stent op een lege angio katheter van 22 G (Figuur 3A).
   NB: de stent moet 5 mm van de punt van de angio katheter rusten.
2. Teken een dunne zwarte verticale lijn op de 3 mm gegoten stent.
   Opmerking: deze lijn zorgt voor een verbeterde visualisatie van de stent in de luchtpijp.
3. Transorale intuberen de muis met de angio katheter die vooraf is geladen met de stent.
4. Visualiseer de stent op de angio katheter in de luchtpijp door de transcervicale incisie (Figuur 3B).
   Let op: de luchtpijp is erg dun, waardoor de zwarte kleurstof op de stent door de luchtpijp gevisualiseerd kan worden. Gebruik dit om de juiste tracheale plaatsing te bevestigen.
5. Houd de stent op zijn plaats door de luchtpijp door de transcervicale incisie met fijne Tang te grijpen.
6. Verwijder de angiocatheter transoraal met behoud van grip op de stent met de fijne Tang.
   Opmerking: het is uitermate belangrijk om de stent niet te veel kracht toe te passen om het lumen niet te verpletteren wanneer de angio katheter wordt verwijderd. Er is echter voldoende kracht nodig om ervoor te zorgen dat de stent niet wordt verwijderd met de angio katheter. Een 0,8 mm sialendoscoop kan worden gebruikt om de locatie en plaatsing van de stent in de luchtpijp te visualiseren.
7. Sluit de transcervicale incisie met weefsellijm.
8. Laat elke muis herstellen naar zijn oorspronkelijke activiteitsniveau voordat u deze terug in de kooi plaatst.

6. histologische bereiding van monsters

1. Anesthetiseren muizen met geïnhaleerde verdoving en offeren muizen met cervicale dislocatie per dier protocol na 7, 14, of 21 dagen.
   Opmerking: op basis van de chroniteit van het onderzoek kunnen verschillende tijdsintervallen worden gebruikt (bijvoorbeeld 28, 30 dagen, enz.).
2. Plaats een muis op het chirurgische platform zoals beschreven in de stappen 4,4 en 4,5.
3. Open de nekincisie op de muis met behulp van fijn gebogen Iris schaar.
4. Stel de luchtpijp per stap 4,6 bloot.
5. Verdeel de distale luchtpijp onder het niveau van de stent met behulp van fijn gebogen Iris schaar.
6. Verdeel de proximale luchtpijp onder het strottenhoofd en boven de stent met behulp van fijn gebogen Iris schaar.
   Opmerking: het is belangrijk om de distale luchtpijp eerst te verdelen om te voorkomen dat de luchtpijp in de thorax terugtrekt.
7. Scheid de verdeelde luchtpijp van de slokdarm posteriorly en verwijder de luchtpijp van de muis.
   Opmerking: stents blijft behouden binnen de muis luchtpijp.
8. Verwijder stent uit de luchtpijp en fixeer 10% formaline voor 24 uur.
9. Insluiten formalin-vaste muis luchtpijp specimens in paraffine met de distale einde georiënteerde bovenzijde zodat axiale sneden van de luchtpijp kunnen worden gemaakt in de volgende stap.
10. Snijd 5 μm delen van de met paraffine ingesloten muis luchtpijp met behulp van een microtoom.
    Opmerking: monsters moeten axiaal worden gesneden vanaf de distale trachea.
11. Verkrijg een representatieve 5 μm-sectie van elke 250 μm over de lengte van het preparaat.
12. Voltooi H & E vlek op elke representatieve sectie.
    1. Deparaffine de glaasjes door het plaatsen van xyleen 2x per glijbaan gedurende 3 min.
    2. Plaats de glaasjes in 100% ethanol gedurende 2 min, 95% ethanol gedurende 2 min en 70% ethanol gedurende 2 minuten om te hydrateren.
    3. Was de glaasjes met stromend kraanwater gedurende 2 min.
    4. Vlekken op de dia's in hematoxyline voor 3 − 5 min.
    5. Was de glaasjes met stromend kraanwater gedurende 5 min.
    6. Plaats de glaasjes gedurende 1 minuut in 1% zure alcohol.
    7. Was de glaasjes met stromend kraanwater gedurende 1 minuut.
    8. Spoel in 0,2% ammoniak water gedurende 30 sec.
    9. Spoel de dia's in stromend kraanwater gedurende 5 min. dip in 95% ethanol 10x.
    10. Eosine vlek door het plaatsen van de dia in eosine phloxine voor 30 s.
    11. Dehydraat de glaasjes door in 95% ethanol gedurende 5 min te plaatsen, gevolgd door absolute ethanol 2x gedurende 5 min.
    12. Plaats in xyleen 2x gedurende 5 min.
    13. Monteer de dia's met een afdekmedium op basis van xylene.
13. Meet de dikte van de lamina propria zoals beschreven in Hillel et al.⁸.

7. stent-biocompatibiliteit in vivo

1. Bereid weefsel secties voor zoals beschreven in stappen 6.1 − 6.4. Verwijder stent niet uit deze tracheale gedeelten om de veranderingen in ontstekingen te visualiseren ten opzichte van de locatie van de stent binnen het lumen van de luchtpijp.
   1. Om de acute reactie van het buitenlandse lichaam op de stent te bepalen, observeren macrofaag en T Cell activiteit met behulp van CD3 en F4/80 markeringen.
      Opmerking: andere markers kunnen ook worden gebruikt om acute ontstekingsreactie op de stent te bepalen.
   2. Verkrijg 5 μm gesneden delen van de met paraffine ingesloten luchtpijp op in de handel verkrijgbare hydrofiele plus glaasjes (tabel van materialen). Plaats twee secties op elke dia.
      Opmerking: deze secties moeten afkomstig zijn uit een gebied van de luchtpijp waar de PLLA-PCL stent is geplaatst.
2. Plaats de glaasjes in xyleen 2x gedurende 5 min.
3. Plaats de glaasjes in 100% ethanol 2x voor 3 min per stuk.
4. Plaats de glaasjes in 95% ethanol gedurende 1 minuut.
5. Plaats de dia's in een histologisch kleurenrek, zodat ze worden ondergedompeld in een antigeen-ophaalbuffer (tabel met materialen) en vervolgens gedurende 20 minuten in een groente stomer met kokend water worden gehouden.
6. Verwijder de kleurings rekken uit de stomer en gooi de antigeen-ophaal buffer weg.
7. Vervang de buffer door 1 mL PBS.
8. Plaats de glaasjes gedurende 1 minuut in een natte kleurbox.
9. Gooi de PBS weg en inbroed de glaasjes met Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met 10% FBS gedurende 30 minuten.
10. Gooi de DMEM weg en voeg een mengsel toe van twee primaire antilichamen die in verschillende soorten worden opgewekt. Bedek de dia's met paraffine folie en inbroed 's nachts bij 4 °C in een donkere kamer.
    Opmerking: in dit protocol werden konijn anti-CD3 en rat anti-F4/80 (tabel met materialen) gebruikt.
11. Was de glijbanen in PBS 3x gedurende 5 min.
12. Inbroed de glaasjes met secundaire antilichamen die specifiek zijn voor de primaire antilichaam soort (tabel van de materialen), verdund in DMEM met 10% FBS voor 0,5 − 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
13. Was de glijbanen in PBS 3x voor 5 min in het donker.
14. Monteer de dia's op dekstroken met een druppel afdekmedium met 4 ' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Bewaar de glaasjes in het donker bij 20 °C of 4 °C.
15. Observeer de gekleurde dia's op een laser scan confocale Microscoop en foto.
16. Kwantificeer het totale aantal cellen dat wordt gekleurd met DAPI en antilichamen van belang voor vergelijking met ongewonde luchtpijp.

8. muis luchtpijp kwantitatieve genexpressie analyse

1. Verzamel de muis luchtpijp zoals beschreven in stap 6.1 − 6.7 en verwijder stent.
   Opmerking: geoogste muis trachea's kunnen tot 2 jaar worden bewaard in een diepvries-80 °C-vriezer.
2. Desiccate het tracheale weefsel geoogst in stap 8,1 met behulp van fijne schaar en verder homogeniseren met behulp van een kraal molen homogenisator met 1,4 mm keramische kralen (tabel van materialen) als onderdeel van een commercieel beschikbare kolom gebaseerde RNA extraction Kit (tabel van materialen).
   Opmerking: kraal molen homogenisator instellingen = 1 40 s cyclus bij 6 m/s.
3. Extract RNA van tracheale lysaat met behulp van een kolom gebaseerde extractie en zuivering Kit (tabel van de materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
4. Kwantificeer RNA van elk monster met behulp van een spectrofotometer (tabel met materialen).
   Opmerking: RNA-zuiverheid wordt beoordeeld aan de hand van de verhouding van 260/230 nm met een zuiver RNA-monster 2,0.
5. Maak aanvullend DNA van geëxtraheerd RNA met behulp van reverse transcriptase (tabel met materialen) en een Thermocycler met de volgende instellingen: 5 min bij 25 °c (priming), 46 °c gedurende 30 min (omgekeerde transcriptie) en vervolgens 95 °c gedurende 1 minuut (inactivatie van reverse transcriptase).
6. Verdun complementaire DNA-monsters met RNase vrij water tot een concentratie van 10 − 25 ng/mL voor gebruik in kwantitatieve real-time PCR.
7. Meng 1 μL van het complementaire DNA (10 − 25 ng/mL) met 10 μL van een PCR-Mastermix (tabel met materialen), 8 μl DDH₂O en 0,5 μL van 10 μM naar voren en omgekeerd primers voor het gen van belang in een put van een 96-well PCR-plaat (tabel metmaterialen).
   Opmerking: het totale volume in elke put moet 20 μL zijn. Elke put op de 96 goed plaat mag slechts één monster en één gen van belang bevatten.
8. Herhaal stap 8.1 – 8.7 voor alle genen die van belang zijn en voer elk monster uit voor elk gen in drievlaat.
   Opmerking: de genspecifieke voorwaartse en omgekeerde primers (tabel met materialen) voor collageen 1, collageen 3 en het referentie-gen β-actin worden vaak gebruikt om markers van fibrose te onderzoeken.
9. Plaats de 96 well plate op de real-time kwantitatieve PCR-machine en begin met het volgende Protocol: denatureren bij 95 °C gedurende 15 sec. en anneal bij 60 °C gedurende 60 s voor 40 cycli.
10. Normaliseer de cyclus drempelwaarde (CT) voor genproduct detectie van elk gen van belang (GOI) tot de CT-waarde voor het referentie-gen β-actin voor alle monsters om een ΔCT voor elke GOI te verkrijgen. Vergelijk vervolgens de ΔCT-waarden voor elke GOI voor behandelde en onbehandelde monsters om een ΔΔCT te genereren.
    Opmerking: de cyclus drempelwaarde is het punt op de versterkings curve wanneer een vooraf bepaalde hoeveelheid genproduct aanwezig is (ΔRn). De waarde ΔRn voor elke reactie moet worden bepaald voor elk gen dat van belang is en moet vallen op het lineaire gedeelte van de versterkings curve.
    Opmerking: ΔCT = CT (GOI) – CT (referentie-gen); ΔΔCT = ΔCT (behandeld) – ΔCT (onbehandeld).
11. Bereken de relatieve verandering in de genexpressie tussen behandelde en onbehandelde monsters als uitdrukking van een vouw verandering door 2^ΔδCTte berekenen.

Representative Results

De biologisch afbreekbare PLLA-PCL stent constructie, geladen met rapamycine die in deze studie werd gebruikt, kon rapamycine op consistente en voorspelbare wijze in fysiologische omstandigheden Elzen (Figuur 1). Figuur 2 toont de plla-PCL stent die rond een 22 G angio katheter is geplaatst voor gebruik in een muriene model van LTS. Om te bepalen of de effecten van rapamycine elutie in de luchtpijp werkzaam zijn in verzachtende fibrose, kunnen gemeten veranderingen in de fibrose-gerelateerde genexpressie en markers van acute ontsteking worden beoordeeld via genexpressie analyse, Flowcytometrie, immunofluorescentie en ELISA. Succesvolle plaatsing van een miniatuur stent in de luchtpijp van de muis met behulp van de hierboven beschreven methode is aangetoond. Een schematische weergave van de methode is afgebeeld in Figuur 3. Figuur 4 toont de geminiaturiseerde, biocompatibele stent in situ in de luchtpijp zoals aangegeven door de zwarte marker op de stent, die wordt gevisualiseerd door de doorzichtige muis luchtpijp. In eerste experimenten was het nuttig om een 0,8 mm sialendoscoop te gebruiken om de plaatsing van de stent in de luchtpijp te bevestigen. Na 21 dagen, om te bevestigen dat de transorale plaatsing van de stent doeltreffend was en de stent niet van de oorspronkelijk geplaatste positie migrete, werd de nekincisie heropend om de plaatsing van de stent te bepalen. Zoals weergegeven in Figuur 4B, toonde de zwarte kleurstof marker van de stent de stent zijn positie in de luchtpijp gehandhaafd. Resectie van de luchtpijp na 21 dagen behandeling met de stent wordt weergegeven in Figuur 4C.

Representatieve beelden van biocompatibiliteitstesten met immunofluorescentie kleuring voor markers van acute en chronische ontstekingen worden weergegeven in Figuur 5. Dit toonde aan dat de PLLA-PCL stent construct (zonder rapamycine) niet immunoreactief was, zoals bepaald door het minimale aantal immuuncellen dat aanwezig was na plaatsing. Het is belangrijk op te merken dat in deze methode normale ongewonde trachea's werden gebruikt en een PLLA-PCL stent zonder rapamycine werd geplaatst om de ontstekingsreactie op de constructie zelf te bepalen.

Vervolgens, om te bepalen of de rapamycine-eluting PLLA-PCL stent effectief was bij het verzachten van littekens, toonden we eerder genexpressie veranderingen in markers van acute ontsteking en fibrose⁶. Specifiek, er is een 90,3 vouwen reductie (SEM ± 26,0; n = 4; p < 0,01) vermindering van col1a1 op dag 4, evenals de acute INFLAMMATOIRE markers inf-γ, CD11b, ARG-1, en Il-1B⁶. Hoewel de verschillen in vouw verandering voor sommige genen niet significant waren, is het mogelijk dat met een groter cohort van muizen, significantie kan worden bereikt. Om te bepalen of er veranderingen waren in de luchtpijp vanwege een histologisch of er veranderingen waren in de luchtpijp als gevolg van radiale krachtinspanning door de stent, we toonden aan dat er een afname was in de breedte van de lamina propria in die trachea's die werden behandeld met rapamycine-eluting-stents in vergelijking met die zonder rapamycine-eluting-stents⁶.

Figuur 1: Rapamycine PLLA-PCL-elutie. De PLLA-PCL-constructie met 1% rapamycine toonde een consistente en voorspelbare afgifte van rapamycine gedurende een periode van 14 dagen. Gegevenspunten vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM van de bemonsterde elutie (n = 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: stent casting. A) deplla-PCL-oplossing mocht rond een angio katheter van 22 G drogen. (B) de cast werd vervolgens uit de angio katheter verwijderd. (C) stents werden tot 3 mm lengte gesneden voor gebruik in de muismodel⁶. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Transorale stent-plaatsing bij muizen. A) de stent werd op een lege angio katheter geladen en transoraal in de luchtpijp geplaatst. B) de zwarte kleurstof markering op de stent kan worden gezien door middel van een transcervicale incisie om zijn positie in de luchtpijp van de muis te bevestigen. C) representatieve tekening van de stent in situ in de zieke muis luchtpijp⁶. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4: in situ beelden van stent. (a-B) De stent met zwarte kleurstof markeringen kan in situ worden gezien in de muriene luchtpijp. C) een afbeelding van de stent en het muriene laryngotracheale complex na de oogst op 21 dagen⁶. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: stent biocompatibiliteit. Immunofluorescentie kleuring voor F4/80 (macrofagen, rode chromophore) en CD3 (groen chromophore, T-lymfocyten) op dag 4 onthulde minimale ontstekingscellen in de (A) onbeschadigde luchtpijp en (B) luchtpijp met plla-PCL stent. Dit contrasteert met (C) een gewonde luchtpijp, met een verdikte lamina propria en de aanwezigheid van talrijke cellen met positieve F4/80 en CD3 kleuring⁶. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

De meest kritische stappen voor het succesvol construeren en gebruiken van een drug-eluting stent in vivo zijn 1) het bepalen van de optimale PLLA-PCL ratio voor de gewenste drug elutie rate, 2) het bepalen van de juiste concentratie van het geneesmiddel dat moet worden verwijderd, 3) het vormen van de stents rond de angio katheter voor in vivo gebruik, en 4) transoraal het leveren van de stent in de muizen na LTS inductie zonder fatale luchtwegobstructie veroorzaken.

Hoewel er verschillende methoden voor de levering van geneesmiddelen met behulp van stents in diermodellen van luchtweg ziekte, ontwikkeling van een biocompatibele stent geschikt voor de levering van geneesmiddelen in een zieke Murine model is een eerste. Bij het ontwikkelen van deze methode voor de levering van geneesmiddelen, verschillende wijzigingen werden aangebracht in de methode. Het was belangrijk om de juiste samenstelling van PLLA-PCL te bepalen voor het maken van stents die mechanisch stijf genoeg waren om in de luchtpijp te worden geplaatst en in de luchtpijp te blijven ondanks fysiologische afscheidingen. Een 70:30-samenstelling van PLLA-PCL werd beslist voor stent-constructie met een angio-katheter vorming omdat het met succes rapamycine kon afwerken in een predicabele natuur, op een veilige en betrouwbare manier in ons muismodel kon worden geplaatst en niet degraderen in fysiologische Voorwaarden. Een moeilijk en mogelijk fabrikant afhankelijk deel van deze methode is het vormen van de stent rond de angiocatheters. Aanvankelijk werden bij de bouw van de in-vivo-stents 22 G angio-katheters in de punt van een glazen pipet geplaatst en werd de polymeeroplossing in de ruimte gegoten tussen de angio katheter en de glazen pipet, waardoor een cast van de ruimte tussen werd gevormd. De wand van de stents die uit deze methode voortvloeien, was echter vaak te dun en kon niet betrouwbaar in de luchtpijp worden geplaatst. Een beperking van de huidige methode voor het vormen van stents op de angiocatheter is de afhankelijkheid van de fabrikant voor consistentie en de noodzaak van nauwgezette aandacht voor detail om de homogeniteit in stent-productie te waarborgen. Het potentieel voor variantie in dikte tussen gegoten stents moet in toekomstige studies worden aangepakt. Met verdere studies hopen we een mal voor een 22 G angio katheter te ontwerpen, omringd door een ander glas of niet-corrosief materiaal, zodat de ruimte tussen de angio katheter en het glas is 50 μm, waarvan we hebben vastgesteld dat ze een adequate wanddikte van de stent voor gemakkelijke plaatsing in de luchtpijp.

Er zijn verschillende voordelen voor het gebruik van een biocompatibele stent om de afgifte van medicijnen aan de aangetaste luchtpijp te bestuderen. Algemene, stents samengesteld uit metaal of siliconen die zijn bekleed met een polymeer bevattende het geneesmiddel is aangetoond dat granulatieweefsel en verdere inflammatoire reactie op een reeds gehavende gedeelte van de luchtpijp produceren. Deze methode, die het gebruik van een stent die volledig is gemaakt van biomateriaal die biocompatibel is en ook een immunomodulerende drug op een betrouwbare manier vrijgeeft, is voordelig. De PLLA-PCL stent blijkt ook biocompatibel te zijn in het muriene model en ontdoet geen acute ontstekingsreactie. Bij het bestuderen van geneesmiddelen die fibrose kunnen bestrijden, is het nuttig om een stent te gebruiken die volledig bestaat uit biocompatibel materiaal zoals PLLA-PCL zoals beschreven in deze methode.

Het voordeel en het gemak van het gebruik van deze methode om bruikbare stents te construeren is dat de samenstelling van de PLLA-PCL kan worden gevarieerd, waardoor verschillen in release profielen voor de drug gemengd in de samenstelling. Eerdere studies van het PLLA-PCL-materiaal tonen aan dat variatie in PLLA-PCL-mengsels kan leiden tot een grotere afbraak van het materiaal, waardoor snellere drug release⁹mogelijk is. Bovendien is het gebruik van deze methode om stents te construeren die in muizen kunnen worden geplaatst voordelig, omdat de meeste stent-studies voor luchtweg ziekten werden uitgevoerd bij grotere dieren^10,11,12. Het gebruik van een muismodel dat kan worden aangepast voor verschillende ziekte paradigma's en het mogelijk maakt om de drug-eluting stent in een zieke toestand te testen is ideaal. Het testen van het medicijn-eluting stent in een zieke toestand en het kunnen vergelijken van de werkzaamheid ervan aan die bij dieren zonder ziekte maakt een grotere experimentele rigor mogelijk. Deze methode laat ook zien hoe een drug-eluting stent voor de luchtweg kan worden geplaatst transoraal, in tegenstelling tot eerdere studies waar stents operatief werden geïmplanteerd.

Deze studie demonstreert een zeer bruikbaar platform voor stent-ontwikkeling en testen in een klein dieren model. Echter, andere factoren voor gebruik bij menselijke proefpersonen moeten worden overwogen. Gezien de stevige en stijve aard van de stent kan het waarschijnlijk niet worden geplaatst door middel van een flexibele bronchoscoop gekanaliseerd, maar zal het moeten worden geplaatst transoraal met directe laryngoscopie en rigide bronchoscopie. Idealiter zou de stent na ballon verwijding van de luchtweg worden geplaatst om restenose te helpen verzachten. Van de prospectieve patiëntveiligheid is het potentieel voor de stent om te migreren een grote zorg, omdat het potentieel kan leiden tot een levensbedreigend luchtweg compromis. Subsidiair moet ook rekening worden gehouden met het potentieel voor stent-obstructie dat ondergeschikt is aan de accumulatie van slijm of bloed. Verder testen en ontwikkelen zijn nodig om deze Risico's te minimaliseren.

Toekomstige studies kunnen gebruik maken van deze methode om verschillende drugs in de PLLA-PCL mix te testen om verder te begrijpen hoe verschillende immunosuppressieve behandelingen littekenvorming in de luchtpijp kunnen verzachten. Omdat dergelijke stents in muizen kunnen worden geplaatst, kan het gebruik van een groter cohort muizen of muizen met genetische modificaties aan litteken vormende genen ook worden getest. Toekomstige experimenten kunnen ook inzicht bieden in de veranderingen in de luchtpijp die kunnen optreden na chronische implantatie van de stent (3 – 6 maanden) en de veranderingen in het lumen van de luchtpijp en de genexpressie profielen van inflammatoire markers en fibrose Markeringen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. For stent
22-gauge angiocatheter	Jelco	4050
Dichloromethane	Sigma Aldrich	270997-100ML
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5	Available from other vendors as well.
PDLGA	Sigma Aldrich	739955-5G
PLLA-PCL (70 : 30)	Evonik Industries AG	65053
Rapamycin	LC Laboratories	R-5000
2. Animal surgery
Wire brush	Mill-Rose Company	320101
3. For immunohistochemistry staining
Antigen retrival buffer	Abcam	ab93678	Available from other vendors as well; acidic pH needed
DAPI	Cell Signaling	8961S
DMEM	ThermoFisher Scientific	11965-092	Available from other vendors as well.
FBS (Fetal Bovine Serum)	MilliporeSigma	F4135-500ML
Goat anti-rabbit-488 antibody	Lif technology	a11008
Goat anti-rat-633 antibody	Lif technology	a21094
Hydrophilic plus slide	BSB7028
PBS	ThermoFisher Scientific	100-10023	Available from other vendors as well.
Rabbit anti-CD3 antibody	Abcam	ab5690
Rat antiF4/80 antibody	Biolengend	123101
Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope	Zeiss
4. For quantative PCR
0.5mm glass beads	OMNI International	19-645
Bead Mill Homoginizer	OMNI International
Gene Specific Forward/Reverse Primers	Genomic Resources Core Facility
Nanodrop 2000 spectrophotometer	Thermo Scientific
Power SYBR Green Mastermix	Life Technologies	4367659
RNeasy mini kit	Qiagen	80404
StepOnePlus Real Time PCR system	Life Technologies