Summary
La stenosi larifica deriva da una deposizione di cicatrici patologiche che restringe criticamente le vie aeree tracheali e manca di terapie mediche efficaci. Utilizzando uno stent PLLA-PCL (70% poli-L-lactide e 30% policaprolactone) come sistema locale di somministrazione di farmaci, possono essere studiate potenziali terapie volte a ridurre la proliferazione della cicatrice nella trachea.
Abstract
La stenosi larifica (LTS) è un restringimento patologico della subglottide e della trachea che porta all'ostruzione extratoracica e alla significativa mancanza di respiro. LTS deriva da lesioni mucose da un corpo estraneo nella trachea, che porta a danni ai tessuti e una risposta infiammatoria locale che va storto, portando alla deposizione del tessuto cicatriziale patologico. Il trattamento per LTS è chirurgico a causa della mancanza di terapie mediche efficaci. Lo scopo di questo metodo è quello di costruire uno stent biocompatibile che può essere miniaturizzato per inserire nei topi con LTS. Abbiamo dimostrato che un costrutto PLLA-PCL (70% poli-L-lactide e 30% policaprolactone) aveva una forza biomeccanica ottimale, era biocompatibile, praticabile per uno stent di posizionamento in vivo e in grado di eluire il farmaco. Questo metodo fornisce un sistema di somministrazione di farmaci per testare vari agenti immunomodulatori per inibire localmente l'infiammazione e ridurre la fibrosi delle vie aeree. La produzione degli stent richiede 28-30 ore e può essere riprodotta facilmente, consentendo esperimenti con grandi coorti. Qui abbiamo incorporato il farmaco rapamicina all'interno dello stent per testare la sua efficacia nel ridurre la fibrosi e la deposizione di collagene. I risultati hanno rivelato che le tende PLLA-PCL mostravano un rilascio affidabile di rapamici, erano meccanicamente stabili in condizioni fisiologiche e erano biocompatibili, inducendo poca risposta infiammatoria nella trachea. Inoltre, gli stent PLLA-PCL che hanno ridotto la formazione di cicatrici nella trachea in vivo.
Introduction
La stenosi larifica (LTS) è un restringimento patologico della trachea più spesso a causa di lesioni post-intubazione iatrogene. La combinazione di colonizzazione batterica, risposta del corpo estraneo a una tracheostomia o tubo endotrachiale, e fattori specifici del paziente portano ad una risposta infiammatoria aberrante. Questa risposta immunitaria disadattata porta alla deposizione di collagene nella trachea, con conseguente restringimento luminale della trachea e successiva stenosi1,2. Poiché l'attuale trattamento per questa malattia è principalmente chirurgico, è stato studiato lo sviluppo di un paradigma di trattamento alternativo basato sulla medicamente che mira alle vie infiammatorie e profibrotiche aberranti che portano a una deposizione eccessiva di collagene. La rapamicia, che inibisce il complesso di segnalazione mTOR, ha dimostrato di avere effetti immunosoppressivi e un robusto effetto antifibroblasto. Tuttavia, quando la rapamicia è somministrata sistemicamente, gli effetti collaterali comuni (ad esempio, iperlipidemia, anemia, trombocitopenia) possono essere pronunciati3. Lo scopo della nostra metodologia è quello di sviluppare un veicolo per la somministrazione di farmaci locali praticabile per l'uso nelle vie aeree che diminuirebbe questi effetti sistemici. Le nostre valutazioni si concentrano sullo studio della risposta immunitaria locale al costrutto di somministrazione di farmaci, nonché sulla sua capacità di inibire la funzione del fibroblasto e alterare il microambiente immunitario locale. Gli esiti specifici della malattia includono test in vivo che valutano i marcatori della fibrosi.
Stent biodegradabili che eludino farmaci sono stati utilizzati in modelli animali di malattia in sistemi di organi multipli, tra cui le vie respiratorie4. Per la gestione della stenosi delle vie aeree o del collasso, indagini precedenti hanno utilizzato stent a base di silicone e nichel rivestiti di farmaci5. Un costrutto PLLA-PCL è stato scelto per questo particolare metodo a causa del suo profilo di eluzione di farmaci e della forza meccanica in condizioni fisiologiche per un periodo di 3 settimane, che è stato dimostrato in precedenti studi pubblicati6. PLLA-PCL è anche un materiale biocompatibile e biodegradabile già approvato dalla FDA4. Gli stent biocompatibili che elucano cisplatina e MMC sono stati studiati in grandi modelli animali come conigli e cani. Tuttavia, in questi modelli animali, gli stent non sono stati collocati in un modello animale di malattia e sono stati impiantati transcervicalmente. Questo studio fornisce un metodo unico per valutare uno stent biocompatibile che epelle farmaci collocato in modo transorale in un modello murino di lesioni delle vie aeree e stenosi largotrale. Uno stent biocompatibile che eluisce un farmaco immunomodulatore localmente e può essere miniaturizzato per lo studio in un modello murino è prezioso per la ricerca preclinica traslazionale. I precedenti tentativi di utilizzo dello stent con altri costrutti materiali hanno generato solide risposte del corpo estraneo che peggiorano l'infiammazione sottostante che distingue LTS7. Questa metodologia, a nostra conoscenza, è la prima nel suo genere a studiare gli effetti immunomodulati e antifibrotici di un sistema di somministrazione di farmaci a base di stent in un modello murino di LTS. Il modello murino stesso offre diversi vantaggi per studiare gli effetti di un farmaco immunomodulatore sulla trachea. Possono essere studiati topi geneticamente modificati e coorti sperimentali di topi sani e malati, che possono portare alla riproducibilità sperimentale e migliorare l'efficacia in termini di costi. Inoltre, la consegna dello stent transoralmente nella trachea del topo imita la consegna clinica di tale stent negli esseri umani, che evidenzia ulteriormente il vantaggio traslazionale di questo metodo. Infine, la relativa facilità con cui lo stent PLLA-PCL con il farmaco può essere prodotta consente modifiche per fornire terapie farmacologiche alternative volte a ridurre la formazione di cicatrici nella trachea.
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Protocol
NOTA: tutti i metodi descritti di seguito sono stati approvati dal Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee (MO12M354).
1. Preparazione della rapamicia in PLLA-PCL
- Preparare due fiale di vetro (con tappi) di 70:30 soluzioni polimeriche PLLA-PCL (viscosità intrinseca 1.3.1.8 DL/G; Tabella dei materiali) soluzioni, con una fiala contenente 1.0% rapamicino e l'altro senza rapamicino.
- Fare una raamicicina 1.0% contenente soluzione polimerica con l'aggiunta di 6 mg di rapamicia a 600 mg di 70:30 PLLA-PCL in una fiala di vetro.
- Per la soluzione polimerica senza rapamicia (controllo), aggiungere solo 600 mg di 70:30 PLLA-PCL alla fiala di vetro.
- Sotto un cofano fumato, aggiungere 6 mL di diclorometanonero ad ogni fiala di vetro.
AVVISO: Il diclorometano è un materiale corrosivo e devono essere utilizzate solo pipette di vetro. Precauzioni di sicurezza adeguate includono protezione personale e guanti. - Aggiungere 120 l of glicerol ad ogni fiala di vetro (per una soluzione di glicerolo del 2%.).
NOTA: l'aggiunta di glicerolo consente una maggiore flessibilità e una minore rigidità nel costrutto stent. - Ricapitoli le fiale di vetro e lascia che 70:30 PLLA-PCL con e senza rapamicino si dissolvano e omogeneizzino per 6-12 h.
NOTA: le fiale di vetro possono anche essere posizionate su una piattaforma di agitazione rotante per una dissoluzione più rapida.
2. Test di eluizione della rapamicia
- Pipette 1 mL di 70:30 soluzione PLLA-PCL contenente l'1% di rapamicina in un piatto di vetro Petri.
NOTA: Questo volume di soluzione PLLA-PCL 70:30 che contiene l'1% di rapamicino conterrà 120 rocchienomi e rappresenta la quantità totale di rapamicia in ogni costrutto. È possibile utilizzare volumi e concentrazioni alternativi. - Lasciare 70:30 PLLA-PCL con 1% di rapamicina per indurirsi in un disco piatto nel piatto di vetro Petri.
- Una volta indurito, posizionare il disco in 2 mL di salina con buffer fosfato (PBS, pH 7.4) e incubare in una camera a 37 gradi centigradi.
- Raccogliere e sostituire PBS (2 mL) ogni 24 h e utilizzare PBS raccolti per l'analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) del contenuto di rapamicia.
- Utilizzare una colonna HPLC da18 cm x 250 mm per eseguire campioni attraverso l'iniettore dell'autocampione insieme a diluizioni seriali di rapamicina per creare una curva standard calibrata. Eseguire ogni campione in triplice copia.
NOTA: le diluizioni seriali della rapamicia da testare includono 10%, 1%, 0,1% e 0,01%. - Utilizzare una fase mobile di acqua di grado HPLC e acetonitrile con volume/volume 10/90 con una portata di 2,0 mL/min. Impostare l'assorbimento durante HPLC per la rapamicina a 280 nm.
NOTA: La figura 1 mostra l'eluzione della rapamicino in un periodo di 14 giorni.
3. Creazione di stent delle vie respiratorie muranti PLLA-PCL
NOTA: Eseguire i passaggi 3.2-3.9 utilizzando materiali sterili e una tecnica sterile per evitare la contaminazione che influenzerebbe le applicazioni in vivo e in vitro.
- Preparare le soluzioni PLLA-PCL contenenti la rapamicino, come descritto nella sezione 1.
- Utilizzando una pipetta Pasteur in vetro con un palloncino di gomma, applicare 1 mL di soluzione PLLA-PCL contenente 1% di rapamicina sulla venosa cannula di un propilene di etilene fluorurato da 22 G basato su angiocate (Tavolo dei materiali). Tenere l'angiocateter in una mano e utilizzare la pipetta di vetro per far cadere la soluzione PLLA-PCL sull'angiocateter. Ruotare lentamente l'angiocatere per garantire una copertura omogenea dell'angiocatheter con la soluzione PLLA-PCL.
NOTA: In un primo momento, la soluzione PLLA-PCL sarà sottile, ma come il diclorometano evapora durante l'applicazione sull'angiocathete, la soluzione diventerà più viscosa per modellare su un angiocater. Girare continuamente l'angiocatere durante l'applicazione è vantaggioso. Questo passaggio deve essere fatto lentamente e meticolosamente per garantire lo spessore costante dello stent. - Prop l'angiocate modellato con la punta dell'anter rivolto verso il basso e l'enizione sul bordo di un piatto di vetro Petri per l'essiccazione.
- Lasciare asciugare gli stent per 24 h in un cofano sottovuoto a temperatura ambiente (Figura 2A).
- Rimuovere il costrutto stent dall'angiocateter sottostante ruotando delicatamente libero il catetere sottostante e facendolo scorrere fuori dallo stent modellato (Figura 2B).
- Controllare lo stent circonferivamente per eventuali difetti che potrebbero essere stati provocati durante il processo di colata. Se è presente un difetto nello stent fuso, eliminarlo.
- Tagliare ogni estremità dello stent fuso con forbici dritte fini in modo che i bordi siano assidi.
- Utilizzando le forbici dritte fini, tagliare segmenti assiali da 3 mm dello stent fuso per l'uso in un modello di mouse di LTS (Figura 2C).
NOTA: Circa 8 stent possono essere fatti da un antheter fuso, con ogni stent da 3 mm contenente 120 g di rapamicino. - Caricare lo stent da 3 mm su un nuovo catetere venoso da 22 per l'uso in un modello murino di LTS (Figura 1).
4. Induzione della stenosi laryngotracheale nei topi
- Prima di condurre studi sui topi in vivo ottenere l'approvazione dal Comitato per la cura e l'uso degli animali.
- Anestesizza un maschio di 9 settimane C57BL/6 dando un'iniezione intraperitoneale di ketamina (80-100 mg/kg) e xylazina (5-10 mg/kg).
NOTA: Altri ceppi di topi possono essere sostituiti, ma si consiglia di utilizzare il peso dei topi tra i 20 e i 27 g. - Randomizzare i topi in un gruppo sperimentale (lesione chemiomeccanica con un posizionamento di uno stent PLLA-PCL contenente 1%) e due gruppi di controllo: 1) lesioni chemiomeccaniche con il posizionamento di uno stent PLLA-PCL, 2) posizionamento di uno stent.
- Posizionare un mouse su una piattaforma chirurgica in una posizione supina. Utilizzare un piccolo anello di filo apposto nella parte superiore della piattaforma per estendere la colonna vertebrale cervicale facendola scorrere intorno agli incisivi centrali.
- Apporre le mani e le gambe del mouse al tavolo utilizzando 2 pollici pezzi di nastro adesivo. Pizzica la zampa del topo per assicurarti che abbia avuto un'anestesia adeguata.
- Il sito chirurgico viene quindi preparato. La pelliccia sovrastante deve essere rimossa e la pelle deve essere pulita (lavaggio alternato scrub di iodio o clorèxidine con alcool o disinfettante della pelle diluito) tre volte. L'area deve essere drappeggiata e guanti sterili da indossare. Gli strumenti sterilizzati devono essere posati su una superficie sterile quando non sono in uso.
- Fare un'incisione verticale linea mediana di 1,5 cm nel collo del mouse utilizzando forbici iride curve fini. Dividere il timo sovrastante e lateralizzare i due lobi risultanti per visualizzare la trachea. Dividere bilateralmente i muscoli sternoidi e sternotroidi sovrastanti all'attacco superiore.
NOTA: L'intero complesso laryngotracheal deve essere completamente esposto dopo questo. - Passare un 22 G angiocate transoralmente attraverso la lassocia nella trachea. Utilizzare piccole pinze per applicare pressione alla laricella anteriore del mouse per facilitare il corretto posizionamento dell'angiocatere. Visualizzate l'angiocatere bianco attraverso la trachea per garantire una corretta collocazione (non esofagea).
NOTA: La trachea del topo è estremamente sottile e l'angiocater bianco verrà visualizzato attraverso la trachea traslucida. - Passare una spazzola di filo rivestita di bleomycin attraverso l'angiocatere inserito.
- Ritirare lentamente l'angiocater in modo che solo il pennello filo rimanga nella trachea.
- Applicare la contropressione utilizzando pinze sottili sulla trachea per interrompere meccanicamente il lume tracheale con il pennello filo.
- Reinserire l'angiocathete nella trachea sopra il pennello filo.
- Rimuovere il pennello filo e riapplicare la bleomycin.
- Ripetere i passaggi 4,8 e 4,12 per un totale di 5x. Applicare la bleomycin al pennello tra ogni applicazione.
NOTA: La convalida e la descrizione di questo modello sono disponibili in Hillel etal. - Rimuovere l'angiocatere dalla trachea del topo.
NOTA: Se non deve essere posizionato alcuno stent, l'incisione può essere chiusa con colla di tessuto.
5. Posizionamento dello stent PLLA-PCL transorale nei topi
- Caricare uno stent fuso da 3 mm su un angiocate vuoto da 22 G (Figura 3A).
NOTA: lo stent deve riposare a 5 mm dalla punta dell'angiocater. - Disegnare una sottile linea verticale nera sullo stent fuso di 3 mm.
NOTA: questa linea consente una migliore visualizzazione dello stent nella trachea. - Intubare il mouse in modo transorale con l'angiocatheter che è stato precaricato con lo stent.
- Visualizzare lo stent sull'angiocater nella trachea attraverso l'incisione transcervica (Figura 3B).
NOTA: La trachea è molto sottile, permettendo al tinbio nero sullo stent di essere visualizzato attraverso la trachea. Utilizzare questa opzione per confermare il corretto posizionamento tracheale. - Tenere lo stent in posizione afferrando la trachea attraverso l'incisione transcervica con pinze sottili.
- Rimuovere l'angiocata transoralmente mantenendo una presa sullo stent con le pinze sottili.
NOTA: È estremamente importante non applicare troppa forza allo stent per non schiacciare il lume quando l'angiocatere viene rimosso. Tuttavia, è necessaria una forza sufficiente per garantire che lo stent non venga rimosso con l'angiocateter. Un parodoscopio di 0,8 mm può essere utilizzato per visualizzare la posizione e il posizionamento dello stent nella trachea. - Chiudere l'incisione transcervica con colla di tessuto.
- Consentire a ogni mouse di riprendere al livello di attività originale prima di rimetterlo nella sua gabbia.
6. Preparazione istologica di campioni
- Anestetizza i topi con anestetico inalato e sacrifica i topi con lussazione cervicale per protocollo animale dopo 7, 14 o 21 giorni.
NOTA: In base alla cronicità dello studio, è possibile utilizzare intervalli di tempo diversi (ad esempio, 28, 30 giorni, ecc.). - Posizionare un mouse sulla piattaforma chirurgica come descritto nei passaggi 4.4 e 4.5.
- Riaprire l'incisione del collo sul mouse utilizzando le forbici iride curve fini.
- Esporre la trachea per passo 4.6.
- Dividere la trachea distale sotto il livello dello stent utilizzando le forbici sottili e curve.
- Dividere la trachea prossimale sotto la laidrola e sopra lo stent utilizzando le forbici aride curve fini.
NOTA: È importante dividere prima la trachea distale per evitare che la trachea si ritragga nel torace. - Separare la trachea divisa dall'esofago posteriormente e rimuovere la trachea dal mouse.
NOTA: gli Stent verranno comunque mantenuti all'interno della trachea del topo. - Rimuovere lo stent dalla trachea e fissare in formalina 10% per 24 h.
- Incorporare campioni di trachea murina fissati in formalina in paraffina con l'estremità distale orientata in modo superiore in modo che i tagli assiali della trachea possano essere fatti nella fase successiva.
- Tagliare 5 sezioni della trachea del topo incorporata in paraffina utilizzando un microtoma.
NOTA: Gli esemplari devono essere tagliati assialmente a partire dalla trachea distale. - Ottenere una sezione rappresentativa di 5 m ogni 250 m lungo la lunghezza del campione.
- Completa la macchia H&E su ogni sezione rappresentativa.
- Deparaffinizzare le diapositive inserendo in xilene 2x per diapositiva per 3 min.
- Mettere i vetrini al 100% etanolo per 2 min, 95% etanolo per 2 min e 70% etanolo per 2 min per reidratarsi.
- Lavare i vetrini con acqua corrente del rubinetto per 2 min.
- Macchia gli scivoli in ematossilina per 3/5 min.
- Lavare i vetrini con acqua corrente del rubinetto per 5 min.
- Mettere i vetrini in 1% di alcool acido per 1 min.
- Lavare i vetrini con acqua corrente del rubinetto per 1 min.
- Risciacquare in 0,2% di acqua di ammoniaca per 30 s.
- Sciacquare gli scivoli nell'acqua del rubinetto corrente per 5 min.
- Macchie di eosina mettendo slide in phloxine eosina per 30 s.
- Disidratare i vetrini mettendo in 95% etanolo per 5 min, seguito da etanolo assoluto 2x per 5 min.
- Mettere in xilene 2x per 5 min.
- Montare i vetrini con un supporto di montaggio basato su xilene.
- Misurare lo spessore della lamina propria come descritto in Hillel etal.
7. Biocompatibilità Stent in vivo
- Preparare le sezioni di tessuto come nei passi 6.1.6.4. Non rimuovere lo stent da queste sezioni tracheali per visualizzare i cambiamenti nell'infiammazione rispetto alla posizione dello stent all'interno del lume della trachea.
- Per determinare la risposta acuta del corpo estraneo allo stent, osservare l'attività delle cellule macrofaage e T utilizzando i marcatori CD3 e F4/80.
NOTA: Altri marcatori possono anche essere utilizzati per determinare la reazione infiammatoria acuta allo stent. - Ottenere 5 sezioni di taglio della trachea incorporata in paraffina su vetrini idrofili più idrofili disponibili in commercio (Tabella dei materiali). Posizionare due sezioni su ogni diapositiva.
NOTA: Queste sezioni devono provvedere da un'area della trachea in cui è stato posizionato lo stent PLLA-PCL.
- Per determinare la risposta acuta del corpo estraneo allo stent, osservare l'attività delle cellule macrofaage e T utilizzando i marcatori CD3 e F4/80.
- Mettere i vetrini in xilene 2x per 5 min ciascuno.
- Mettere i vetrini in etanolo 100% 2x per 3 min ciascuno.
- Posizionare i vetrini nel 95% di etanolo per 1 min.
- Mettere i vetrini in un rack di colorazione istologica in modo che siano immersi nel buffer di recupero dell'antigene (Tabella dei materiali) e quindi mettere in un piroscafo vegetale con acqua bollente per 20 min.
- Rimuovere i rack di colorazione dal piroscafo ed eliminare il buffer di recupero dell'antigene.
- Sostituire il buffer con 1 mL di PBS.
- Posizionare i vetrini in una scatola di colorazione bagnata per 1 min.
- Scartare il PBS e incubare i vetrini con il mezzo aquila modificato di Dulbecco (DMEM) con il 10% di FBS per 30 min.
- Eliminare il DMEM e aggiungere una miscela di due anticorpi primari allevati in specie diverse. Coprire i vetrini con pellicola di paraffina e incubare durante la notte a 4 gradi centigradi in una stanza buia.
NOTA: In questo protocollo sono stati utilizzati conigli anti-CD3 e ratto anti-F4/80 (Tabella dei materiali). - Lavare i vetrini in PBS 3x per 5 min.
- Incubare i vetrini con anticorpi secondari specifici per le specie di anticorpi primari (Tabella dei materiali) diluiti nel DMEM con 10% FBS per 0,5h1 h a temperatura ambiente al buio.
- Lavare i vetrini in PBS 3x per 5 min al buio.
- Montare i vetrini su copricapi con una goccia di supporto di montaggio con 4'6-diamidino-2-fenylindole (DAPI). Conservare i vetrini al buio a 20 o 4 gradi centigradi.
- Osservare i vetrini macchiati su un microscopio confocale a scansione laser e fotografare.
- Quantificare il numero totale di cellule che colorano con DAPI e anticorpi di interesse per il confronto con la trachea non lesa.
8. Analisi dell'espressione genica quantitativa della trachea del topo
- Raccogliere la trachea del topo come descritto nei passaggi 6.1-6.7 e rimuovere lo stent.
NOTA: Le trachea di topo raccolte possono essere conservate in un congelatore a -80 gradi centigradi per un massimo di 2 anni. - Desicare il tessuto tracheale raccolto al punto 8.1 utilizzando forbici fini e omogeneizzare ulteriormente utilizzando un omogeneizzatore perline con perline in ceramica 1,4 mm (Tabella dei materiali) come parte di un kit di estrazione dell'RNA a colonna disponibile in commercio ( Table ofMaterials).
NOTA: Impostazioni omogenei del mulino di perline - un ciclo di 40 s a 6 m/s. - Estrarre l'RNA da lisato tracheale utilizzando un kit di estrazione e purificazione a colonna (Tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
- Quantificare l'RNA da ogni campione utilizzando uno spettrofotometro (Tabella dei materiali).
NOTA: la purezza dell'RNA viene valutata utilizzando il rapporto 260/230 nm con un campione di RNA puro che legge 2.0. - Creare DNA complementare dall'RNA estratto utilizzando la trascrizione inversa (Tabella dei materiali) e un termociclore con le seguenti impostazioni: 5 min a 25 gradi (priming), 46 Gradi C per 30 min (trascrizione inversa), e poi 95 gradi C per 1 min (inattivazione della trascrizione inversa).
- Diluire campioni di DNA complementari con rNase acqua libera ad una concentrazione di 10-25 ng/mL per l'uso in PCR quantitativo in tempo reale.
- Mescolare 1 -L del DNA complementare (10-25 ng/mL) con 10 -L di un mastermix PCR (Tabella dei materiali), 8 -L di ddH2O e 0,5 L di 10 M avanti e indietro primer per il gene di interesse in un pozzo di una piastra PCR di 96 pozzetti ( Tavolodei materiali).
NOTA: Il volume totale in ogni pozzo dovrebbe essere di 20 gradi. Ogni pozzo sulla piastra del pozzo 96 dovrebbe contenere un solo campione e un gene di interesse. - Ripetere i passaggi da 8.1 a 8,7 per tutti i geni di interesse ed eseguire ogni campione per ogni gene in triplice copia.
NOTA: I primer in avanti e inverso specifici del gene (Tabella dei materiali) per il collagene 1, il collagene 3 e il gene di riferimento - actino sono comunemente utilizzati per studiare i marcatori della fibrosi. - Posizionare il 96 pozzo sulla macchina PCR quantitativa in tempo reale e avviare il seguente protocollo: denaturare a 95 s per 15 s e anneal e estendere a 60 s per 60 s per 40 cicli.
- Normalizzare il valore soglia del ciclo (TC) per la rilevazione del prodotto genico di ciascun gene di interesse (GOI) al valore della TC per il gene di riferimento, ovvero l'atto per tutti i campioni, per ottenere una CT per ogni GOI. Quindi, confrontare i valori DI CT per ogni GOI per i campioni trattati e non trattati per generare un'operazione di tipo CT.
NOTA: La soglia del ciclo è il punto sulla curva di amplificazione quando è presente una quantità predeterminata di prodotto genetico (Rn). Il valore di srl per ogni reazione deve essere determinato per ogni gene di interesse e deve cadere sulla porzione lineare della curva di amplificazione.
N.B.: CT - CT (GOI) – TC (gene di riferimento); - CT -z - CT (trattato) – CT (non trattato). - Calcolare il cambiamento relativo nell'espressione genica tra campioni trattati e non trattati come espressione di cambiamento di piegatura calcolando 2zCT.
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Representative Results
Il costrutto biodegradabile dello stent PLLA-PCL caricato con la rapamicicina utilizzato in questo studio era in grado di eluire la rapamicicina in modo coerente e prevedibile in condizioni fisiologiche (Figura 1). Figura 2 Mostra lo stent PLLA-PCL fuso intorno a un 22 Ggiocatheter per l'uso in un modello murino di LTS. Per determinare se gli effetti dell'eluzione della rapamicina nella trachea sono efficaci nella fibrosi attenuante, i cambiamenti misurati nell'espressione genica correlata alla fibrosi e i marcatori di infiammazione acuta possono essere valutati attraverso l'analisi dell'espressione genica, la citometria del flusso, l'immunofluorescenza e ELISA. È stato dimostrato il posizionamento riuscito di uno stent miniaturizzato nella trachea del topo utilizzando il metodo descritto in precedenza. Uno schema del metodo è illustrato nella Figura 3. La figura 4 mostra lo stent biocompatibile miniaturizzato in situ nella trachea come indicato dal marcatore nero sullo stent, che viene visualizzato attraverso la trachea traslucida del topo. Negli esperimenti iniziali, l'uso di un sialendoscopio da 0,8 mm per confermare il posizionamento dello stent nella trachea è stato utile. Dopo 21 giorni, per confermare che il posizionamento transorale dello stent era efficace e lo stent non migrava dalla sua posizione originariamente posizionata, l'incisione del collo è stata riaperta per determinare il posizionamento dello stent. Come mostrato nella Figura 4B, il marcatore di tinzione nera dello stent ha mostrato che lo stent ha mantenuto la sua posizione nella trachea. La resezione della trachea dopo 21 giorni di trattamento con lo stent è mostrata nella Figura 4C.
Immagini rappresentative dei test di biocompatibilità utilizzando la colorazione immunofluorescente per marcatori di infiammazione acuta e cronica sono mostrate nella Figura 5. Ciò ha dimostrato che il costrutto dello stent PLLA-PCL (senza rapamicia) non era immunoreattivo come determinato dal numero minimo di cellule immunitarie presenti dopo il posizionamento. È importante notare che in questo metodo sono state utilizzate normali trachea non levirate e uno stent PLLA-PCL senza rapamicia è stato posizionato per determinare la risposta infiammatoria al costrutto stesso.
Successivamente, per determinare se lo stent PLLA-PCL che eligenera va dalla rapamicia era efficace nel mitigare le cicatrici, in precedenza abbiamo dimostrato cambiamenti di espressione genica nei marcatori di infiammazione acuta e fibrosi6. In particolare, c'è una riduzione di 90,3 pieghe (SEM - 26,0; n - 4; p < 0.01) riduzione in col1a1 al giorno 4, così come i marcatori infiammatori acuti INF-z, CD11b, Arg-1 e IL-1B6. Anche se le differenze nel cambiamento di piegatura per alcuni geni non erano significative, è possibile che con una maggiore coorte di topi si possa raggiungere un significato. Per determinare se ci sono state modifiche alla trachea a causa dell'eluzione esologicamente della droga, o se ci sono state modifiche alla trachea a causa dello sforzo di forza radiale da parte dello stent, abbiamo dimostrato che c'era una diminuzione della larghezza della lamina propria in quelle trachea trattate con stent rapamicino rispetto a quelli senza stent di rapamicina6.
Figura 1: Rapamicino PLLA-PCL eluzione. Il costrutto PLLA-PCL contenente l'1% di rapamicino ha dimostrato un rilascio coerente e prevedibile della rapamicia in un periodo di 14 giorni. I punti dati rappresentano la media: SEM dell'eluizione campionata (n - 3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: lancio dello stent. (A) La soluzione PLLA-PCL è stata autorizzata ad asciugare intorno a un'angiocateter di 22. (B) Il cast è stato poi rimosso dall'angiocatheter. (C) Gli stent sono stati tagliati a lunghezze di 3 mm per l'uso nel modello del mouse6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Posizionamento dello stent transorale nei topi. (A) Lo stent è stato caricato su un angiocate vuoto e collocato in trasorazione transoralmente nella trachea. (B) La marcatura del colore nero sullo stent può essere vista attraverso un'incisione transcervicale per confermare la sua posizione nella trachea del topo. (C) Disegno rappresentativo dello stent in situ nella trachea del topo malato6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini in situ di stent. (A-B) Lo stent con segni di tintura nera può essere visto in situ nella trachea murina. (C) Un'immagine dello stent e del complesso laringotraale murino dopo il raccolto a 21 giorni6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Biocompatibilità dello Stent. La colorazione immunofluorescente per F4/80 (macrofagi, cromoforo rosso) e CD3 (cromoforo verde, linfociti T) al giorno 4 ha rivelato cellule infiammatorie minime nella trachea illesa(A)e (B) con stent PLLA-PCL. Questo contrasta con (C) una trachea ferita, con una lamina ispessita propria e la presenza di numerose cellule con f4/80 e colorazione CD3 positivi6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I passaggi più critici per costruire e utilizzare con successo uno stent in vivo che elui scandiet a un farmaco sono 1) che determinano il rapporto PLLA-PCL ottimale per il tasso di eguagliazione del farmaco desiderabile, 2) determinando l'adeguata concentrazione del farmaco da eluire, 3) modellare gli stent intorno all'angiocatere per l'uso in vivo, e 4) consegnando transoralmente lo stent nei topi dopo l'induzione della LTS senza causare ostruzione fatale delle vie aeree.
Mentre ci sono diversi metodi per la somministrazione di farmaci utilizzando stent in modelli animali di malattie delle vie aeree, lo sviluppo di uno stent biocompatibile in grado di somministrazione di farmaci in un modello di murino malato è un primo. Nello sviluppo di questo metodo per la somministrazione di farmaci, sono state apportate diverse modifiche al metodo. Era importante determinare l'appropriata composizione PLLA-PCL per la realizzazione di stent che fossero abbastanza rigidi meccanicamente da essere collocati nella trachea e rimanere nella trachea nonostante le secrezioni fisiologiche. Una composizione 70:30 di PLLA-PCL è stata decisa per la costruzione di stent con uno stampaggio agiocateter perché poteva eluire con successo la rapamicicina in una natura predicabile, essere collocata in modo sicuro e affidabile nel nostro modello murino, e non degradare in fisiologica Condizioni. Una porzione difficile e potenzialmente dipendente dal produttore di questo metodo sta modellando lo stent intorno agli angiocatheters. Inizialmente, nella costruzione degli stent in vivo, 22 Angiocateters sono stati collocati all'interno della punta di una pipetta di vetro e la soluzione polimerica è stata versata nello spazio tra l'angiocater e la pipetta di vetro, formando un cast dello spazio tra. Tuttavia, la parete degli stent derivanti da questo metodo spesso era troppo sottile e non erano in grado di essere collocati in modo affidabile nella trachea. Una limitazione dell'attuale metodo di stampaggio degli stent sull'anthegiocante è la dipendenza dal produttore per la coerenza e la necessità di un'attenzione meticolosa ai dettagli per garantire l'omogeneità nella produzione di stent. Il potenziale di varianza nello spessore tra gli stent castati deve essere affrontato in studi futuri. Con ulteriori studi, speriamo di progettare uno stampo per un angiocatheter da 22 G circondato da un altro vetro o materiale non corrosivo in modo che lo spazio tra l'angiocater e l'involucro del vetro sia di 50 m, che abbiamo determinato ad essere un adeguato spessore della parete dello stent per un facile posizionamento nella trachea.
Ci sono diversi vantaggi nell'utilizzare uno stent biocompatibile per studiare la somministrazione di farmaci alla trachea interessata. Nel complesso, gli stent composti da metallo o silicone che sono stati rivestiti con un polimero contenente il farmaco hanno dimostrato di produrre tessuto di granulazione e ulteriore risposta infiammatoria a una porzione già cicatrizzata della trachea. Questo metodo, che interroga l'uso di uno stent fatto interamente di biomateriale che è biocompatibile e rilascia anche un farmaco immunomodulatore in modo affidabile è vantaggioso. Lo stent PLLA-PCL è anche dimostrato di essere biocompatibile nel modello murino e non suscita una risposta infiammatoria acuta. Nello studio di farmaci in grado di combattere la fibrosi, utilizzando uno stent interamente composto da materiale biocompatibile come PLLA-PCL come descritto in questo metodo è utile.
Il vantaggio e la facilità di utilizzare questo metodo per costruire stent utilizzabili è che la composizione del PLLA-PCL può essere variato, consentendo differenze nei profili di rilascio per il farmaco misto nella composizione. Precedenti studi sul materiale PLLA-PCL mostrano che la variazione nelle miscele PLLA-PCL può portare a una maggiore degradazione del materiale, consentendo un rilascio più rapido difarmaci 9. Inoltre, l'utilizzo di questo metodo per costruire stent che possono essere collocati nei topi è vantaggioso, poiché la maggior parte degli studi sugli stent per le malattie delle vie aeree sono stati fatti in animali più grandi10,11,12. L'uso di un modello murino che può essere modificato per diversi paradigmi di malattia e consentire di testare lo stent che elametta farmaci in uno stato malato è l'ideale. Testare lo stent che emito farmaco in uno stato malato ed essere in grado di confrontare la sua efficacia con quelli negli animali senza malattia consente un maggiore rigore sperimentale. Questo metodo mostra anche come uno stent farmaco-eludente per le vie aeree può essere posizionato transoralmente, al contrario di studi precedenti in cui gli stent sono stati impiantati chirurgicamente.
Questo studio dimostra una piattaforma molto utilizzabile per lo sviluppo e il test dello stent in un piccolo modello animale. Tuttavia, altri fattori per l'uso in soggetti umani devono essere considerati. Data la natura ferma e rigida dello stent, è probabile che non possa essere collocato attraverso un broncoscopio flessibile incanalato, ma dovrà essere collocato in modo transorale con lalantoscopia diretta e broncoscopia rigida. Idealmente, lo stent sarebbe stato posizionato dopo la dilatazione pallone delle vie aeree per contribuire a mitigare la restenosi. Dalla prospettiva della sicurezza del paziente, il potenziale di migrazione dello stent è una grande preoccupazione in quanto potrebbe potenzialmente portare a compromessi tra le vie aeree potenzialmente in pericolo di vita. In secondo luogo, deve essere considerato anche il potenziale di ostruzione dello stent secondario all'accumulo di muco o sangue. Ulteriori test e sviluppo sono necessari per ridurre al minimo questi rischi.
Studi futuri possono utilizzare questo metodo per testare diversi farmaci nella miscela PLLA-PCL per comprendere ulteriormente come diversi trattamenti immunosoppressivi potrebbero mitigare la formazione di cicatrici nella trachea. Poiché tali stent possono essere posizionati nei topi, è possibile testare anche una coorte più ampia di topi o topi con modifiche genetiche ai geni che formano cicatrici. Esperimenti futuri possono anche includere la comprensione dei cambiamenti alla trachea che possono verificarsi dopo l'impianto cronico dello stent (3-6 mesi) e i cambiamenti al lume della trachea, nonché i profili di espressione genica di marcatori infiammatori e fibrosi Marcatori.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Istituto nazionale di sordità e altri disturbi della comunicazione dei National Institutes of Health con il numero 1K23DC014082 e 1R21DC017225 (Alexander Hillel). Questo studio è stato anche sostenuto finanziariamente dalla Triological Society e dall'American College of Surgeons (Alexander Hillel), dall'American Medical Association, Chicago, IL (Madhavi Duvvuri) e da una sovvenzione di formazione T32 NIDCD (Kevin Motz).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
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