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Developmental Biology

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

Published: December 18, 2019
doi:
10.3791/60503
, , , ,
1Department of Genetics and Genomic Sciences,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology,Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

このプロトコルは、マウス胚の新鮮な凍結切片から軟骨および骨を分離するためのレーザー捕捉マイクロセクションを記述する。軟骨および骨はクレシルバイオレット染色によって急速に視覚化され、正確に集めることができるので、トランスクリプト工学的分析のための高品質のRNAを得ることができます。

Abstract

レーザー捕捉マイクロダイセクション(LCM)は、異種組織から目的の特定の細胞タイプまたは領域を分離するための強力なツールです。骨格要素の細胞および分子複合体は、発達とともに増加する。軟骨および骨の界面や周囲の組織との界面など、組織の不均一性は、軟骨および骨を発達させる研究の障害の1つである。当社のプロトコルは、遺伝子発現解析のための高品質RNAを生み出す軟骨および骨の組織処理および単離の迅速な方法を提供します。マウス胚の新鮮な凍結組織は切り離され、短いクレシルバイオレット染色は、周囲の組織とは異なる色で軟骨および骨を視覚化するために使用される。その後、スライドは急速に脱水され、軟骨と骨はLCMによってその後単離される。このプロセス中の水溶液への暴露の最小化は、RNAの完全性を維持します。E16.5におけるマウスメッケルの軟骨と下顎骨の採取に成功し、遺伝子発現解析により骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞のマーカー遺伝子の微分発現が示された。高品質のRNAはまた、組織および胚性年齢の範囲から単離された。このプロトコルは、低温栓、断面、染色および脱水新鮮な凍結組織を含むLCMのサンプル調製、およびLCMによる軟骨および骨の正確な分離を詳細に説明し、転写分析のための高品質RNAをもたらす。

Introduction

筋骨格系は、筋肉、結合組織、腱、靭帯、軟骨、および骨からなる多成分系であり、神経によって内在し、血管1によって血管化される。骨格組織は、細胞の不均一性と構造的複雑さの増加に伴って発症する。軟骨と骨は、同じ骨軟骨葉ゲニター系統から発症し、非常に関連しています。胚軟骨と骨は、筋肉、神経、血管、未分化間感に関連して発症する。軟骨はまた、メッケルの軟骨や下顎骨内の軟骨軟骨などの骨に囲まれていてもよい。これらの組織は解剖学的に関連しており、発達中に細胞外シグナルを介して互いに相互作用する。軟骨および骨の発達における遺伝子発現の研究において、1つの障害は、複数の組織型からなる骨格構造の不均一性である。目的の特定の組織の正確な分離は、転写分析を成功させるために重要です。

レーザー捕捉マイクロダイセクション(LCM)は、異種組織内の目的の細胞の種類または領域を分離するための強力なツールであり、再現性があり、単一細胞レベル2に敏感である。これは、トランスクリプトミクス、ゲノミクス、およびプロテオミクス3、4における幅広い下流アッセイに対して目的の細胞を正確に標的にし、捕捉することができる。単離されたRNA、DNA、またはタンパク質の品質は、バイオアナライザまたは同等のプラットフォームで評価することができます。例えば、RNA品質は、RNA完全性数(RIN)5で示される。

ここでは、新鮮な凍結組織からのLCMによる軟骨および骨の迅速な染色および単離のためのプロトコルを提供する。マウス胚を使用して、このプロトコルがRNAシーケンシング(RNA-seq)などの後続のトランスクリプトミクス解析のために高品質のRNAを生成することを実証します。

Protocol

マウスからの組織は、実験動物のケアと使用のための国立衛生ガイドに従って取得され、研究プロトコルは、マウントシナイのイカーン医学部の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されました。 1. 新鮮な冷凍標本の調製 目的の胚または組織を解剖する。最適な切断温度(OCT)化合物を使用して、使い捨て埋め金型にサンプルを埋め込みます。先端または針で?…

Representative Results

E16.5の新鮮な凍結マウス組織のコロナセクションは、メッケル軟骨(MC)、結節軟骨、およびLCMによる下顎骨の分離および採取を実証するために使用された。E16.5のマウス胚を解剖し、OCT化合物で極低温型に埋め込んだ。金型中のサンプルをドライアイスおよびメチル-2-ブタン浴中で急速に凍結し、-80°Cで保存した。 軟骨および骨のクレシルスミレ染色を実証するために、コ…

Discussion

LCMは、異種組織からの濃縮または均質な細胞集団の単離を可能にする。その利点は、その生体内文脈における細胞の迅速かつ正確な捕捉を含むが、潜在的な欠点は、時間がかかり、費用がかかり、かつ、ユーザが指定されたサンプル30内の個別の部分集団を認識する必要性によって制限されることを含む。このプロトコルは、マウス胚軟骨および骨のLCMの詳細を提供?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、国立歯科・頭蓋顔面研究所(R01DE022988)とユーニス・ケネディ・シュリバー国立小児保健・人間開発研究所(P01HD078233)によって支援されました。著者らは、シナイ山のイカーン医学部のライカLMD 6500プラットフォームへのアクセスに対するバイオリポジトリと病理学コアに感謝する。

Materials

2-Methylbutane ThermoFisher Scientific O3551-4
Bioanalyzer Agilent G2939BA
Centrifuge tube ThermoFisher Scientific 339653 Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042
Cryostat Leica Biosystems CM3050 S
Delicate task wiper ThermoFisher Scientific 06-666
Disposable embedding mold ThermoFisher Scientific 1220
Distilled water Invitrogen 10977-015 DNase/RNase-Free
Ethanol, absolute (200 proof) ThermoFisher Scientific BP2818 Molecular biology grade
Glass PEN membrane slide Leica Microsystems 11505158
LCM system Leica Microsystems Leica LMD6500
Microscope cover glass ThermoFisher Scientific 12-545FP
Microscope slides ThermoFisher Scientific 12-550-15
OCT compound Electron Microscopy Sciences 102094-106
PCR tube with flat cap, 0.5 mL Axygen PCR-05-C LCM collection tubes
Permanent mounting medium Vector Laboratories H-5000
RNA isolation kit ThermoFisher Scientific KIT0204
RNase decontamination agent Sigma-Aldrich R2020 RNase decontamination agent for cleaning surfaces
Xylene Sigma-Aldrich 214736
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Wu, M., Kriti, D., van Bakel, H., Jabs, E. W., Holmes, G. Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (154), e60503, doi:10.3791/60503 (2019).
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