Summary

Drosophila Wing Disc'ten Görüntüleme Dpp Salınımı

Published: October 30, 2019
doi:

Summary

Ligandlara maruz kalmanın zamanlaması gelişimsel sonuçlarını etkileyebilir. Burada kanat diskhücrelerinden Dpp adı verilen Drosophila kemik morfogenetik proteininin (BMP) nasıl görüntülenebildiğini gösteriyoruz.

Abstract

Transforming Büyüme Faktörü-beta (TGF-β) süper ailesi, çok hücreli organizmalarda erişkin yapıların erken embriyonik desenleşeme ve gelişimi için gereklidir. TGF-β süper familyası TGF-β, kemik morfogenetik protein (KBP), Aktivinler, Büyüme ve Farklılaşma Faktörleri ve Nodalları içerir. Uzun hücrelere maruz ligand miktarı etkileri için önemli olduğu bilinmektedir. Uzun menzilli konsantrasyon degradelerinin embriyonik desen kurduğu düşünülüyordu. Ancak, son zamanlarda bu ligands maruz kalma zamanlaması da onların downstream transkripsiyonel sonuçları için önemli olduğu ortaya çıkmıştır. TGF-β süper familya ligi, üretildiği hücreden serbest bırakılmadan gelişimsel bir sonucu olamaz. Yakın zamana kadar, bu ligandların hücrelerden ne zaman salınıldığını belirlemek zordu. Burada kanat primordium veya kanat diskhücrelerinden Decapentaplegic (Dpp) adlı bir Drosophila BMP salınımını ölçmek için nasıl göstereceğim. Bu yöntem diğer sistemler veya sinyal ligands için değiştirilebilir.

Introduction

Kemik Morfogenetik Proteinler (KPS) erken embriyogenez ve yetişkin yapıların desenleme için gereklidir. KİP’ler, yanıt veren hücrelerde büyüme ve hücre farklılaşması için gerekli hedef genlerin transkripsiyonunu etkileyecek şekilde üretilir ve salgılanır. Decapentaplegic (Dpp) kanat1gibi embriyonik ve yetişkin yapıların gelişimi için önemli olan BMP4 bir Drosophila homolog,2,3,4. Çeşitli gruplar yetişkin sinek kanatları desenleme Dpp rolü üzerinde duruldu çünkü 1) kanatları kolayca değerlendirilebilir tutarlı bir venasyon desenli iki şeffaf epitel levhaoluşur; 2) kanat diskleri de makul düz, larva dışında kültürlü olabilir ve görüntü ve desen farklılıkları ölçmek için basit; ve 3) kanat desen gelişimi dpp duyarlı dır ki yoldaki küçük tedirginlikler kanat venasyon deseni etkileyecektir.

Dpp kanat diski5,6,7,8ön /posterior sınırında bulunan hücrelerde üretilir. Dpp tip 1 ve tip 2 serine/ threonine kigaz reseptörleri9,10bir komplekse bağlanır. Dpp bağlanması üzerine tip 2 reseptörü, anneleri Dpp (Mad) ile fosforilasyona yol açan tip 1 reseptörü fosforilasyona, bir Smad 1/5/8 homolog. Fosforlu SMAD ek bir co-Smad acemi (Medea), hangi hedef genleri düzenleyen çekirdek girmek sağlar, bu tür çoğalma veya farklılaşma gibi downstream etkilerine yol açan4,11.

Son zamanlarda, Bates Lab kanat diskiçinde Dpp yanlış salınımı Mad fosforilasyon bir azalmaya yol açabilir göstermiştir, hedef gen ekspresyonu azalma, ve kanat desenleme kusurları12,13. Drosophila kanadıve ilişkili yapıların çeşitli iyon kanalları etkisi gelişimi14,15. Bu iyon kanalları da Dpp sürümü dahil olabilir. Morfojen salınım mekanizmasını belirlerken, serbest bırakma olaylarını görselleştirmek için bir yöntem olması önemlidir.

Dr Aurelio Teleman ve Stephen Cohen Dpp kaybı kurtarmak mümkün bir Dpp-GFP füzyon proteini oluşturdu, biyolojik olarak aktif olduğu anlamına gelir ve biyolojik olarak ilgili bir şekilde serbest bırakılır16. Burada, bu Dpp-GFP’yi kullanarak Dpp sürüm olaylarını nasıl görselleştirdiğimizi anlatıyoruz. GFP asidik veziküllerde olduğunda floresan17söndürülür gibi pH duyarlı olduğu için bu füzyon proteini özellikle yararlıdır. Bu nedenle, GFP ile etiketlenmiş bir protein daha nötr hücre dışı ortama bir vezikül serbest bırakıldığında, GFP floresans yoğunluğu artar17. Dpp-GFP’nin asidik veziküllerde olup olmadığını belirlemek için GFP’nin pH duyarlılığından yararlandık. Hücre içi kompartmanları nötralize eden amonyum klorür ilavesinden önce ve sonra Dpp-GFP ifade eden kanat disklerini görüntüledik18. Amonyum klorür ilavesinden sonra puncta floresansında önemli bir artış bulduk, bu da hücre içi Dpp-GFP’nin amonyum klorür18ilavesinden önce söndürüldünden kaynaklandı. Hücre içi Dpp-GFP’nin veziküller gibi asidik membrana bağlı bölmelerde bulunduğu ve hücre içi bölmelerin pH’ını nötralize etmek için amonyum klorür eklenmesi yle söndeğinin olmadığı sonucuna vardık18. Bu dpp-GFP canlı görüntüleme yararlı bir teknik olarak asidik bölmelerden hücre dışı ortama serbest bırakılır gibi Drosophila kanat diskinde Dpp dinamikleri görselleştirmek için yapar.

Burada, Dpp-GFP kullanarak Dpp sürüm olaylarını görselleştirmek için kullandığımız yöntemi açıklıyoruz. Dpp-GFP UAS-GAL4 sistemi19kullanılarak Drosophila kanat diskleri kendi yerli desen ifade edilebilir. Bu, Irk kanallarının Dpp salınımını18’eetkilediğini belirlemek için kullanılan yöntemdir. Bu yöntemi canlı görüntüleme z-yığınları ile doğruladık. Bir odak düzleminde elde ettiğimizde Dpp-GFP puncta’nın zaman serisinde odak düzleminde hareket diğini görmüyoruz. Biz de bir z-yığın görüntülenmiş eğer Dpp-GFP puncta hareketi görmüyorum. Bu yöntemle görülen Dpp-GFP puncta’sının hücre içi veziküllerin hareketi yerine serbest bırakma olayları olduğu sonucuna varıyoruz. Dpp-GFP canlı görüntüleme Bu yöntem potansiyel Dpp dinamikleri üzerindeki etkileri için Dpp sürümü diğer putatif değiştiriciler test etmek için kullanılabilir veya diğer ligands dinamikleri bakmak için değiştirilebilir

Protocol

1. Diseksiyon için Larva Oluşturmak için Yumurta Toplama Çapraz 30-40 bakire dişi Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu 10-15 erkek Sp/CyO-GFP uçar; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.NOT: Dpp-GAL4 ve UAS-Dpp-GFP içeren iki genotip, dengeleyicilerde larva evresinde uygun singenin seçilmesine olanak tanıyan larva belirteçleri olduğu sürece kullanılabilir. Yumurta toplamak için, çapraz sinekleri taze bir yiyecek şişesine çevirin ve şişeden çıkarmadan önce 3-4 saat yumurtlamalarına izin veri…

Representative Results

Şekil 2 bu protokolün temsili canlı görüntüleme sonuçlarını gösterir. Protokol başarılı olduğunda, Dpp-GFP kanat diskinin merkezinde nisbeten aşağı doğru bir şerit olarak görülebilir ve çekirdekleri Dpp-GFP bölgesinde floresan olmayan daireler olarak görülebilir (Şekil 2). Dpp-GFP sürümü görünür ve kaybolan floresan puncta olarak görülebilir. Dpp-GFP floresansının hücre cisimlerinde ve hücre cisimlerinden uzak larda ortaya ?…

Discussion

Dpp gibi BmP’ler, komşu veya görünüşte uzak hücrelerde hücre içi sinyal bir çağlayan neden membran bağlı reseptörleri karmaşık bir bağlamak zaman önemli bir etki yapmak. Dr Thomas Kornberg’in laboratuvarı göstermiştir ki, sitokinler15,24,25olarak adlandırılan aktin bazlı ince filapodia benzeri yapılar kullanarak sinyal alan Dpp sinyal temas hücrelerini üreten hücreler . Bu veriler, bu bağlamda gelişi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Sarala Pradhan’a bu protokolün daha önceki bir versiyonu üzerinde çalıştığı için teşekkür ederiz. Bu protokolü geliştirirken finansman için NSF-IOS 1354282’ye teşekkür ederiz. Nih-NIDCR RO1DE025311’e şu anda laboratuvarımızı finanse ettiği için teşekkür ederiz.

Materials

Baker's yeast Red Star    
CaCl2 dyhydrate Fisher Scientific C79-500
Coverslips VWR 484-457
Double-sided tape Scotch
Drosophila Agar Type II Apex 66-104
Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center
Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center
Dumont Tweezers #5 World Precision Instruments 500233 Forceps for dissecting
HEPES Sigma Aldrich H3375
KCl Fisher Scientific AC193780010
Light Corn Syrup Karo
Malt Extract Breiss
MgCl2 Fisher Scientific AC223210010
Microscope slides Sigma Aldrich S8400
NaCl Fisher Scientific S271-500
NaHCO3 RPI S22060-1000.0
Nail polish Electron Micsroscopy Sciences 72180
Propionic Acid VWR U330-09
Soy Flour ADM Specialty Ingredients 062-100
Sucrose Fisher Scientific S5-3
Sucrose Fisher S512
Tegosept Genesee Scientific 20-259
Trehalose dyhydrate Chem-Impex International, Inc. 00766
Yellow Corn Meal Quaker
Zeiss LSM 780 confocal microscope Zeiss Microscope for live imaging
Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope Zeiss Microscope for dissections

References

  1. Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
  2. Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
  3. Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
  4. Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).
  5. Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
  6. Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3′ cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
  7. de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
  8. De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
  9. Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
  10. Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
  11. Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).
  12. Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
  13. Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
  14. George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), 999-1008 (2019).
  15. Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
  16. Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
  17. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  18. Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
  19. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  20. Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).
  21. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
  22. Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
  23. Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
  24. Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
  25. Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
  26. Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch–neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).

Play Video

Cite This Article
George, L. F., Bates, E. A. Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc. J. Vis. Exp. (152), e60528, doi:10.3791/60528 (2019).

View Video