Summary
Celle omprogrammering kræver indførelse af vigtige gener, som regulerer og vedligeholder pluripotente celle tilstand. Den beskrevne protokol muliggør dannelse af inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) kolonier fra humane Dermal fibroblaster uden virale/integreretsmetoder, men ved hjælp af ikke-modificerede RNAs (NM-RNAs) kombineret med immun unddragelse faktorer, der reducerer cellulære forsvarsmekanismer.
Abstract
Inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) kunne til dato betragtes som en lovende kilde til pluripotente celler til håndtering af sygdomme, der i øjeblikket ikke kan behandles, til rekonstitution og regenerering af skadede væv og til udvikling af nye lægemidler. Trods alle de fordele, der er forbundet med brugen af iPSCs, såsom den lave risiko for afvisning, de mindre etiske spørgsmål og muligheden for at få dem fra både unge og gamle patienter uden nogen forskel i deres omprogrammerings potentiale, problemer med at overvinde er stadig talrige. Faktisk, celle omprogrammering udført med virale og integrere virus kan forårsage infektioner og indførelsen af nødvendige gener kan fremkalde en genomisk ustabilitet af recipient cellen, forringe deres brug i klinikken. Der er især mange betænkeligheder ved brugen af c-MYC-genet, som er velkendt fra flere undersøgelser for sin mutation-inducerende aktivitet. Fibroblaster er dukket op som den egnede cellepopulation til cellulær omprogrammering, da de er nemme at isolere og kultur og høstes af en minimalt invasiv hudpunch biopsi. Den her beskrevne protokol indeholder en detaljeret trin-for-trin beskrivelse af hele proceduren, fra prøve behandling for at opnå cellekulturer, valg af reagenser og forsyninger, rengøring og tilberedning, til celle omprogrammering ved hjælp af en kommerciel ikke-modificeret RNAs (NM-RNAs)-baseret omprogrammering kit. Den valgte omprogrammering kit giver mulighed for en effektiv omprogrammering af human dermal fibroblast til iPSCs og små kolonier kan ses så tidligt som 24 h efter den første transfection, selv med ændringer med respekt for standarddata arket. Den omprogrammering procedure, der anvendes i denne protokol giver fordelen ved en sikker omprogrammering, uden risiko for infektioner forårsaget af viral vektor-baserede metoder, reducerer de cellulære forsvarsmekanismer, og giver mulighed for generering af Xeno-fri iPSCs, alle vigtige funktioner, der er obligatoriske for yderligere kliniske anvendelser.
Introduction
Celle omprogrammering repræsenterer en ny teknologi til at omdanne hver somatisk celle i kroppen til en pluripotente stamcelle, kendt som iPSC1. Muligheden for at omprogrammere en voksen somatisk celle tilbage til en pluripotente og udifferentieret tilstand har overvundet de grænser, der er pålagt af de ringe tilgængelighed og etiske spørgsmål i forbindelse med brugen af pluripotente celler, som tidligere kun kan udledes af menneskelige embryoner (embryonale stamceller eller ESC)2,3,4. I 2006 gennemførte Kazutoshi Takahashi og Shinya Yamanaka en pioner undersøgelse, der opnåede den første omdannelse af voksne somatiske celler fra huden til pluripotente celler ved kunstigt at tilføje fire specifikke gener (Oct4, Sox2, Klf4, c-MYC)5. Et år senere førte det arbejde, der blev udført i Thomsons laboratorium, til en vellykket omprogrammering af somatiske celler til iPSCs ved transduktion af en anden kombination af fire gener (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6.
iPSCs tilbyder en række muligheder for videnskabsfolk og forskere på forskellige områder, såsom regenerativ medicin og farmakologi, som er en glimrende platform til at studere og behandle forskellige sygdomme sammen med en genotypisk afspejling af de karakteristika af patienten, de er afledt af. Brugen af iPSCs giver flere fordele, herunder: den reducerede risiko for immunrespons på grund af en fuldstændig autologt oprindelse af celler; muligheden for at skabe et celle bibliotek, et vigtigt redskab til at forudsige respons på nye lægemidler og deres bivirkninger, da de er i stand til kontinuerligt selv forny og generere forskellige celletyper; og chancen for at udvikle en skræddersyet tilgang til Drug Administration7,8,9.
Forskellige teknikker er kendt på nuværende tidspunkt, at inducere udtryk for omprogrammering faktorer, og de er inkluderet i to hovedkategorier: ikke-virale og virale vektor-baserede metoder10,11,12,13. Ikke-virale metoder omfatter mRNA transfection, Mirna infektion/transfection, piggybac, minicircle vektorer og episomal plasmider og exosomer10,11,12,13. Viral-baserede metoder omfatter ikke-integrerede vira, såsom adenovirus, Sendai virus og proteiner, og integrere vira som retrovirus og lentivirus10,11,12,13.
Ifølge flere undersøgelser, ingen væsentlige forskelle er blevet bemærket blandt disse metoder med hensyn til effektiviteten af celle omprogrammering, derfor valget af den egnede metode strengt afhænger af den anvendte celletype og på de efterfølgende anvendelser af ipscs opnået14,15. Alle de nævnte metoder viser ulemper, for eksempel, Sendai virus er effektiv på alle celletyper, men kræver en masse passager for at få iPSCs; omprogrammering af episomes er fremragende til blodlegemer, men trænger til ændring af standard dyrkningsbetingelser for fibroblaster; piggybac-metoden kan udgøre et attraktivt alternativ, men undersøgelser i humane celler er stadig begrænsede og svage10,11,12,13. Exosomer er Nano-vesikler fysiologisk udskilles i alle kropsvæsker af celler. Ifølge nylige undersøgelser, de er ansvarlige for intercellulære kommunikation og kan have en rolle i vigtige biologiske processer, såsom celle spredning, migration og differentiering. Exosomer kan transportere og overføre mRNA og miRNA til modtager celler med en helt naturlig mekanisme, da de deler den samme sammensætning af cellemembranen16. Derfor er exosomer en lovende ny generation teknik til omprogrammering, men deres potentiale til at omprogrammere somatiske celler ved deres indhold er stadig under efterforskning. Viral vektorer-baserede metoder bruger vira modificeret for at formidle omprogrammering gener til modtager celler. Denne teknik, på trods af den høje effektivitet af omprogrammering, anses ikke for sikker, da integrationen af virus i cellen kan være ansvarlig for infektion, Teratomer og genomisk ustabilitet17.
Følgende protokol til at generere iPSCs kolonier kombinerer Yamanaka og Thompson's omprogrammering cocktail og er baseret på brugen af en metode, der kræver NM-RNAs og immun unddragelse faktorer med mulighed for at udføre det i Xeno-fri betingelser. Rationalet bag brugen af denne metode er at sprede, inden for det videnskabelige samfund, en protokol, der giver mulighed for en hurtig, enkel og meget effektiv omprogrammering af voksne humane fibroblaster fra abdominal hud i iPSCs18.
Den foreslåede metodes styrker er faktisk den nemme ydeevne og den korte tid, der er nødvendig for at opnå iPSCs. Desuden, metoden undgår cellulære forsvarsmekanismer og brugen af virale vektorer, ansvarlig for relevante spørgsmål.
Med hensyn til standardprotokollen blev der foretaget følgende ændringer: (1) Confluent fibroblaster blev synkroniseret ved passage 4 ved at placere i 0,1% serum for 48 h før trypsinization; (2) den cellulære densitet for kultur og mængden af reagenser blev justeret for udnyttelsen på en 24-brønd multi-brønd plade i stedet for en 6-brønd plade; (3) omprogrammerings forsøget blev udført ved hjælp af en 5% Co2 -inkubator i stedet for en inkubator med atmosfæriske (21% o2) eller hypoksiske (5% o2) betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prøverne fra humant væv blev indsamlet i henhold til Helsinki-erklæringen, mens de observerede University Hospital Federico II retningslinjer. Alle patienter, der er involveret i dette studie, gav skriftligt samtykke.
1. forberedelse af forsyninger og kultur medier
- Rengør og autoklave et stort par kirurgisk saks, to sæt fine pincet, to par microdissecting saks, 1 L steril flaske, 500 mL steril flaske og en 250 mL steril flaske.
- Forbered 100 mm plader, 60 mm plader, 35 mm plader, engangs Scalpels, 50 mL sterile rør, 15 mL sterile rør og en 100 mm glasplade. Opbevar instrumenterne under sterile forhold, indtil de er klar til brug.
- Rengør og sterilisere 22 mm x 22 mm Cover glas før brug. Til dette, placere Cover briller i en glasplade, dække dem med 70% ethanol og vente et par sekunder før aspirerer ethanol. Lad dækglas tørre i en ovn ved 37 °C og derefter autoklave dem.
- Forbered 1 L af Hank's afbalancerede saltopløsning (HBSS) ved pH 7,4 ved opløsning af kommercielt tilgængelige pulveriserede salte i dobbeltdestilleret sterilt vand og tilsætning af 0,35 g natriumbicarbonat. Steriliserer ved filtrering under en steril hætte og opbevares ved + 4 °C indtil brug.
- Forbered 500 mL steril 1x fosfat-buffer-saltvand (PBS) ved at opløse 0,1 g kaliumphosphat monobasic, 0,1 g kaliumchlorid, 4,0 g natriumchlorid og 0,575 g natriumphosphatdibasisk i sterilt, dobbeltdestilleret vand. Kontrollér pH-værdien (7,4), og Steriliser den under en steril hætte ved filtrering. Opbevares ved + 4 °C indtil brug.
- 50 mL trypsin stopopløsning (TSS) skal forberedes ved tilsætning af 5 mL 10% føtal bovint serum (FBS) til 45 mL HBSS under en steril hætte. Opbevares ved + 4 °C indtil brug.
- Du forbereder Dulbecco's modificerede Eagle medium til fibroblast isolation (I-DMEM) med 250 mL Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% FBS og 0,5% penicillin og streptomycin (pen/STREP) under en steril hætte. Opbevares ved + 4 °C indtil brug.
- Forbered DMEM til fibroblaster-synkronisering (S-DMEM) med 250 ml DMEM suppleret med 0,1% FBS og 0,5% pen/STREP under en steril hætte. Opbevares ved + 4 °C indtil brug.
2. isolering af humane Dermal fibroblaster
Bemærk: trin 2,1 til 2,3, der er rapporteret nedenfor, skal udføres under en steril hætte. En cylindrisk prøve, der måler ca. 0,8 cm i diameter, giver 2 x 106 fibroblaster ved passage 1.
- Vask den frisk fremstillede prøve af menneskelig hud fra maven i en 100 mm skål med HBSS opløsning. Ryst forsigtigt for at fjerne blod og andre biologiske væsker. Gentag trin tre gange, ændring af HBSS opløsning og pladen ved hver vask.
- Placer prøven i en 100 mm plade, Fjern hår og fedt ved hjælp af fine tang og saks, og dissekere den med en skalpel for at opnå 2 mm x 1 mm fragmenter (for i alt 16 fragmenter) undgå ar, beskidt (f. eks. som følge af tegninger med dermographic pen) eller brændte områder af vævet.
- Placer 4 små fragmenter i hver 35 mm skål, dæk med et sterilt 22 mm x 22 mm Cover glas. Juster ved hjælp af fine pincet. Tilsæt 1,5 mL I-DMEM.
- Pladerne inkubates ved 37 °C i 5% CO2 i ca. 15 dage, eller indtil cellerne når op på 85% sammenløbet. Skift kulturmediet hver 3. dag, og kontrollér cellernes vækst ved hjælp af et inverteret fasekontrast-mikroskop dagligt.
3. udvidelse af humane Hudfibroblaster
Bemærk: nedenstående trin skal udføres under en steril hætte med undtagelse af de trin, der udføres i inkubator.
- Løft Cover brillerne med fine pincet, Placer dem på hovedet i 1 100 mm skålen, og vask med 1x steril PBS.
- Fjerne fragmenter af prøverne og kassere dem, vaske plader med 1x steril PBS.
- Fjern 1x PBS og tilsæt 3 mL og 1 mL trypsin-EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre) til at dække briller placeret i henholdsvis 100 mm skålen og 35 mm retter. Inkuber i 5 min ved 37 °C med 5% CO2.
- Trypsinization blokeres ved at tilsætte 5 mL TSS til 100 mm skålen og 2 mL TSS til hver 35 mm skål. Suspensionen opsamles i 15 mL sterile rør, centrifugeres ved 400 x g ved 4 °c i 5 minutter.
- Aspirér supernatanten, og resuspender pellet i 12 mL i-DMEM. Cellesuspensionen opdeles i 3 mL aliquoter for hver 60 mm plade.
- Inkuber ved 37 °C med 5% CO2. Skift mellem mediet dagligt. Hold cellerne i kulturen, indtil de når en sammenløbet på 75%.
- Aspirer mediet fra pladerne og vask hurtigt i 1x PBS.
- Gentag trypsinisering (trin 3,3 og 3,4) tre gange for at få cellerne ved passage 4. Brug 1,5 mL trypsin-EDTA og 3 mL TSS i hver 60 mm skål. Opdel cellerne 1:3.
- Cellerne synkroniseres ved at erstatte i-DMEM med S-DMEM og der inkuberes ved i 48 h ved 37 °c med 5% Co2.
- Forbered følgende (under celle synkroniseringen).
- Lav fibroblast ekspansions mediet ved at tilsætte 5,0 mL FBS og 0,5 mL L-glutamin til 44,5 mL fremskreden DMEM (A-DMEM), opbevares ved + 4 °C.
- Forbered total NM-RNA-omprogrammering cocktail til fibroblast omprogrammering ved at kombinere følgende i hver af 9 sterile RNase-fri rør: 32 μL OSKMNL NM-RNA, 24 μL EKB NM-RNA, 5,6 μL NM-microRNAs (61,6 μL endelig volumen for 9 aliquoter).
- Inddel hvert rør på 61,6 μL af total NM-RNA-omprogrammering cocktail for fibroblast omprogrammering i fire 15,4 μL engangs-aliquoter i sterile, RNase-frie rør og opbevares ved-80 °C (15,4 μL endelig volumen for 36 aliquoter).
4. omprogrammering af Dermal fibroblaster til iPSCs
- Dag 0: celle såning
Bemærk: trin 4.1.1 til 4.1.3 og 4.1.8 til 4.1.9 skal udføres under en steril hætte. Kælder membran matrix (BMM) geler hurtigt ved stuetemperatur. Derfor anbefales det kraftigt at tø BMM natten over på is i et køleskab, fortynde det med iskold serumfrit medium og brug forkølede pipetter, spidser og rør.- Tilbered en 24-brønd plade ved at belægge hver brønd med 100 μL BMM og Inkuber i mindst 1 time ved 37 °C, før cellerne såes.
- Aspirere mediet fra plader med celler i kultur og hurtigt vaskes i 1x PBS.
- Gentag trypsinisering (trin 3,3 og 3,4) for at få cellerne ved passage 5. Aspirér supernatanten, og resuspender pellet i en passende mængde fibroblaster-udvidelses medium (Se trin 3,10).
- Forbered og rengør hemocytometer med 70% alkohol.
- Forbered en opløsning ved forsigtigt at blande 10 μl trypan og et blå og 10 μL cellesuspension i 1,5 mL rør, og Inkuber i 1 – 2 minutter ved stuetemperatur. Vær omhyggelig med ikke at inkubere længere end 5 min.
- Afpipettér 10 μL af opløsningen i hemocytometer Placer den på scenen af et inverteret fasekontrast mikroskop for at tælle. Ikke-levedygtige celler vil være blå, mens levedygtige celler vil være uplettet.
- Tæl cellerne i mindst 2 kvadrater af hemocytometer kammeret. Anvend følgende beregning for at få det samlede antal celler:
samlet antal celler = (samlet antal optalte celler/kvadrat nummer) x 2 x 10 x samlet volumen af cellesuspension - Udfør en fortynding for at opnå en tæthed på 2,5 x 104 celle pr. 500 μl fibroblaster-udvidelses medium baseret på det samlede antal optalte celler. Resuspension af pellet i et passende volumen af fibroblaster ekspansion medium.
- Pipetten 500 μL af cellesuspensionen ind i hver brønd af 24-brønden. Inkubatceller natten over ved 37 °C og 5% CO2.
- Dag 1: Transfection
Bemærk: alle arbejdsflader og forsyninger (f. eks. handsker, flasker, sterile hætte overflader, pipettorer) skal rengøres med rengørings reagens til fjernelse af RNase, før proceduren påbegyndes. Udfør trin 4.2.2, 4.2.4 – 4.2.8 under en steril hætte.- Varm op Xeno-fri, serum-fri, lav vækstfaktor humant ESC/iPSC kulturmedium (XF/FF kulturmedium) i et 37 °C vandbad.
- Fjern det gamle medium fra hver brønd, og Udskift det med 500 μL præ-varmet XF/FF-kulturmedium.
- Inkuber ved 37 °C under 5% CO2 i mindst 6 timer.
- Tø fem 15,4 μL aliquoter af total NM-RNA-omprogrammering cocktail ved stuetemperatur og anbring den derefter på is.
- Tilsæt 234,6 μL reduceret serum medium til hver alikvot, forsigtigt pipetten 3 – 5 gange og mærk hver enkelt som tube A (RNA + reduceret serum medium).
- Etiket 5 sterile, RNase-fri 0,5 ml rør som rør B og bland 6 μl syntetisk siRNA transfektering reagens med 244 μl reduceret serum medium (RNA-transfektering reagens + reduceret serum medium).
- Tilsæt indholdet af hvert rør B til et rør en dråbevis (for at opnå 500 μl endelige volumen af nm-RNA transfektering kompleks opløsning). Bland ved at tappe på bunden af røret. Inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Tilsæt 125 μl nm-RNA-transfektering-kompleks opløsning fra hver af de fem aliquoter på 500 μl til 4 brønde (for at nå i alt 20 brønde), vippe pladen og pipetterings dråbevis ind i mediet. Bland ved at Rocking forsigtigt. Brug de resterende 4 brønde som reference.
- Inkuber i 15 timer ved 37 °C, 5% CO2.
- Dag 2 – 4: Gennemfør transfektering
- Aspirer mediet. Gentag transftionsproceduren som på dag 1 under den sterile hætte.
- Dag 5 – 10: medieændringer
- Aspirer mediet og Ombyt med frisk, præ-opvarmet XF/FF-kulturmedium under en steril hætte.
- Inkuber natten over ved 37 °C, 5% CO2.
- Hold i kulturen, indtil observere dannelsen af iPSC kolonier overvågning dagligt af en fase-kontrast mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Formålet med protokollen var at omprogrammere Dermal fibroblaster isoleret fra abdominal hud ved hjælp af ikke-integrerende omprogrammerings metode baseret på NM-RNAs til at inducere ekspression af specifikke faktorer. For at nå dette mål blev humane Dermal fibroblaster isoleret fra hudprøver af patienter, der gennemgik mave sæk kirurgi, og iPSCs blev genereret ved at introducere Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, Lin28 omprogrammerings faktorer og E3, K3, B18 immun unddragelse faktorer ved en kommerciel klar til brug omprogrammering kit, der kombinerer NM-RNA og microRNA teknologi. Protokollens tidslinje er opsummeret i figur 1.
Humane fibroblaster udvoksede fra prøver af abdominal hud inden for en uge af kulturen (figur 2A) og nåede 85% sammenløbet inden for to uger (figur 2B). Celler var karakteriseret ved klæbende vækst på plastik kultur retter og deres morfologi varierede fra aflange og spindel-formet (figur 2C) til fladt og stjerne formet (figur 2D). Fibroblast morfologi og arrangement i kultur dramatisk ændret efter såning på BMM, da de erhvervede en aflang morfologi og arrangeret at danne tynde forgrenede strukturer (figur 3A). Små kolonier var allerede synlige i kultur på dag 1 fra første transfektering (figur 3B) og deres størrelse voksede gradvist over tid, mens antallet steg til dag 7 og derefter forblev stabilt mellem dag 7 og dag 14 (figur 3C, D), sandsynligvis som følge af mindre kolonier fusionere til at danne større kolonier.
Da omprogrammerings proceduren udføres ved hjælp af antibiotika frie medier, er mikrobiel kontaminering et stort problem, og det kan forekomme (figur 4), hvis der ikke garanteres sterile betingelser, vedtage standardprocedurer for at forhindre kontaminering (f. eks. iført handsker, fjerne støv fra alle overflader, rengøre alle flader og udstyr med 70% ethanol, undgå at tale i trin med afdækkede cellekultur plader)
Figur 1: protokol tidslinje. Tidslinje for isolering og omprogrammering af humane fibroblaster fra abdominal hud. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: isolering og kultur af Dermal fibroblaster. Repræsentative billeder af fibroblaster udvækster fra hudfragmenter (A). Fibroblaster nåede sammenløbet på ca. 14 dage (B) og viste spindel formet (C) og stjerne formet (D) fænotype. Hudfragmenter er indikeret af en hvid stjerne. Scale bar = 200 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: udvikling af hudfibroblast-omprogrammering. Celler seedede på BMM viste en markant ændring i arrangement og morfologi (a). Små kolonier af ipscs dannet så tidligt som 24 timer efter den første Trans fection (B) og deres størrelse steg progressivt på dag 7 (C), og 14 (D), mens deres antal steg mellem dag 1 og dag 7, men forblev stabilt mellem dag 7 og 14 fra første transfektering. Scale bar = 500 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: mikrobiel kontaminering under omprogrammerings proceduren. Repræsentativt billede ved hjælp af fase-kontrast mikroskopi, der viser en mikrobiel kontaminering af fibroblaster kultur under omprogrammerings proceduren. Scale bar = 500 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ipscs er hurtigt ved at dukke op som den mest lovende celle kandidat til regenerativ medicin applikationer og som et uhyre nyttigt værktøj til sygdoms modellering og Drug test3,8. Den protokol, der præsenteres her, beskriver den generation af humane iPSCs fra en prøve, der har størrelsen af en hud punch biopsi med en enkel og effektiv procedure, som ikke kræver noget specifikt udstyr eller tidligere erfaring med omprogrammering teknologi.
Det er af største vigtighed at optimere fibroblast isolation og kultur for at øge chancen for succes, som plating tæthed og spredning sats indvirkning omprogrammering effektivitet. Endvidere er det for nylig blevet rapporteret, at Dermal fibroblaster reagerer forskelligt på omprogrammering teknologi og, specifikt, fibroblaster isoleret fra huden i maveregionen er lettere og let omprogrammeret end Dermal fibroblaster isoleret fra andre organ områder18. Derfor er det vigtigt præcist at vælge de somatiske celler til at omprogrammere og definere plating tæthed på grundlag af cellernes spredningshastighed. Til dette formål, denne protokol også instruerer om, hvordan man isolerer Dermal fibroblaster fra abdominal hud og hvordan man udbrede dem in vitro for at lette og fremskynde proceduren.
Før omprogrammering blev fibroblaster formeret for at nå passage 5 for at slette celle hukommelsen18 og overholde rapporterede beviser for, at passaging kunne fremskynde induktion af pluripotente tilstand19. Desuden, ifølge vores erfaring, fibroblaster i kultur udviser variable proliferativ egenskaber, således vi ændrede protokollen ved at indføre et yderligere skridt til at synkronisere fibroblaster og reducere variabilitet i celle populationen.
Ved hjælp af en kommerciel nm-RNAs-baseret kit, der introducerer en kombination af omprogrammering faktorer som følge af Yamanaka og Thomsons tilgang5,6, sammen med Mirna, der har vist sig at forbedre mRNA-baseret omprogrammering20, Human Dermal fibroblaster kan med held omprogrammeres til IPSC og små kolonier bliver synlige så tidligt som 24 h efter den første transfection De vigtigste fordele ved mRNA-baseret omprogrammering er faktisk den tidlige opståen af kolonier, selv når et lavt antal celler omprogrammeres20 sammen med en meget lav aneuploidi sats og den fuldstændige fravær af integration, der gør ipscs genereret med denne metode sikkert for en anvendelse i regenerativ medicin. Desuden, det kommercielle kit, der anvendes til denne protokol Co-leverer immunmodulerende faktorer, der er kendt for at forbedre effektiviteten af omprogrammering ved at forhindre celledød forårsaget af cytotoksiske og immunogene nm-RNAs21,22.
Selv om det kit, der anvendes til omprogrammering var designet til 6-nå multi-brønd plade, vi optimeret cellulære tæthed og justeret mængden af reagenser til udnyttelse på en 24-brønd multi-brønd plade for at gøre protokollen effektiv til generering af humane iPSCs fra en hud punch biopsi. Desuden, selv om behovet for en vævskultur inkubator med O2 kontrol er rapporteret af flere forfattere20,23 og anbefalet af kit producenten, efter den protokol, der er beskrevet her, omprogrammerede vi humane Dermal fibroblaster fra abdominal hud i en standard 5% Co2 -kuvøse. Derfor kan proceduren udføres i enhver cellekultur laboratorium uden behov for atmosfæriske (21% o2) eller hypoksiske (5% o2) kulturforhold, selv om disse kan yderligere forbedre omprogrammering effektivitet24,25.
Ikke desto mindre brugte vi ikke-humane dyr-afledte reagenser til at udlede af små hudprøver iPSCs, der kan anvendes til forskningsformål. Selv om den mest attraktive applikation er til regenerering af væv og organer, ipscs har været anvendt til modellering forskellige sygdomme og derefter både undersøge om underliggende molekylære mekanismer og udvikle specifikke lægemidler og terapier3,26.
Bemærkelsesværdigt, erstatte dyr-afledte reagenser til passende Xeno-fri reagenser, den samme protokol giver mulighed for omprogrammering af voksne humane fibroblaster i iPSCs i et komplet Xeno-fri kultur miljø, der berettiger deres kliniske brug.
Der skal dog tages hensyn til den tunge arbejdsbyrde. Efter vores mening er det afgørende at planlægge eksperimentet omhyggeligt i forvejen, herunder trin, der skal udføres i weekenden, og at forberede alle transfektering reagenser under synkroniserings trinnet. Transfektering skal faktisk udføres hver dag i fire dage, og bagefter skal cellerne overvåges hver dag, og mediet skal udskiftes dagligt.
Desuden kan den nøjagtige identifikation af iPSC-kolonier ikke udelukkende baseres på morfologiske kriterier. Derfor skal nyafledte iPSCs være karakteriseret ved at søge efter udtrykket af flere pluripotente markører gennem cellulære og molekylære analyser. Bredt accepterede markører omfatter NANOG, OCT4, SOX2, TRA-1-60, TRA-1-81 og SSEA4, som kan identificeres ved immunocytochemical analyse og ved genekspression analyse ved hjælp af semi-kvantitativ eller kvantitativ RT-PCR. Da alkalisk fosfataseaktivitet har vist sig at være upreguleret i pluripotente stamceller, kan påvisning af en sådan enzymatisk aktivitet let udføres for at identificere ipscs og verificere forekomsten af omprogrammering27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen kvitteringer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357551 | Sterile, polystyrene |
| 100 mm plates | Falcon | 351029 | Treated, sterile cell culture dish |
| 15 mL sterile tubes | Falcon | 352097 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| 24-well plates | Falcon | 353935 | Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357525 | Sterile, polystyrene |
| 35 mm plates | Falcon | 353001 | Treated, sterile cell culture dish |
| 5 mL serological pipet | Falcon | 357543 | Sterile, polystyrene |
| 50 mL sterile tubes | Falcon | 352098 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 12491-015 | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Sigma- Aldrich | D6429-500ml | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Fetal Bovine Serum | Sigma- Aldrich | F9665-500ml | Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma- Aldrich | H1387-1L | Powder |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | INVITROGEN | 13778-030 | Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C |
| Matrigel | CORNING | 354234 | Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws. |
| Neubauer Chamber | VWR | 631-1116 | Hemocytometer |
| NutriStem XF Culture Medium | Biological Industries | 05-100-1A-500ml | Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-062-100ml | Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma- Aldrich | P4333-100ml | Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Potassium Chloride | Sigma- Aldrich | P9333 | Powder |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma- Aldrich | P5665 | Powder |
| RNase-free 0.5 mL tubes | Eppendorf | H0030124537 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Eppendorf | H0030120086 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNaseZAP | INVITROGEN | AM9780 | Cleaning agent for removing RNase |
| Sodium Bicarbonate | Sigma- Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium Chloride | Sigma- Aldrich | S7653 | Powder |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma- Aldrich | 94046 | Powder |
| StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit | Reprocell | 00-0076 | Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C. |
| Trypsin-EDTA | Sigma- Aldrich | T4049-100ml | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
References
- Lo, B., Parham, L. Ethical Issues in Stem Cell Research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
- Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine. Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).
- Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).
- Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases. Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).
- Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications. Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422 (2016).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Malik, N., Rao, M. R. A Review of the Methods for Human iPSC Derivation. Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).
- Poleganov, M. A., et al. Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion. Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).
- Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies. Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).
- Revilla, A., et al. Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).
- Lee, Y. S., et al. Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells. ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Shan, Z. Y., et al. Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells. Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts. Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).
- Beissert, T., et al. Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins. Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).
- Mathieu, J., et al. Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency. Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).
- Wang, Y., et al. Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells. Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).
- Deng, Y., et al. Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).
- Karagiannis, P., et al. Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development. Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).
- Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).
- Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).
