Summary
Cell omprogrammering kräver införandet av viktiga gener, som reglerar och bibehålla pluripotenta cell tillstånd. Det protokoll som beskrivs möjliggör bildandet av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) kolonier från Human dermal fibroblaster utan viral/integrera metoder men med hjälp av icke-modifierade RNAs (NM-RNAs) kombinerat med immunförsvaret undvikande faktorer minska cellulära försvarsmekanismer.
Abstract
Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) skulle kunna övervägas, hittills, en lovande källa till pluripotenta celler för hantering av för närvarande icke behandlingsbara sjukdomar, för beredning och förnyelse av skadade vävnader och för utveckling av nya läkemedel. Trots alla fördelar i samband med användningen av iPSCs, såsom den låga risken för avslag, de minskat etiska frågor, och möjligheten att få dem från både unga och gamla patienter utan någon skillnad i deras omprogrammering potential, problem att övervinna är fortfarande många. I själva verket kan cell omprogrammering utförs med viral och integrera virus orsaka infektioner och införandet av nödvändiga gener kan framkalla en genomisk instabilitet i mottagar cellen, försämra deras användning i kliniken. I synnerhet, det finns många farhågor om användningen av c-MYC-genen, välkänd från flera studier för dess mutation-inducerande aktivitet. Fibroblaster har dykt upp som lämplig cellpopulation för cellulära omprogrammering som de är lätta att isolera och kultur och skördas av en minimalt invasiv hudpunsch biopsi. Det protokoll som beskrivs här ger en detaljerad steg-för-steg-beskrivning av hela förfarandet, från provbearbetning för att erhålla cellkulturer, val av reagenser och förnödenheter, rengöring och beredning, till cell omprogrammering med hjälp av en kommersiell icke-modifierat RNAs (NM-RNAs)-baserad omprogrammeringssats. Den valda omprogrammering Kit möjliggör en effektiv omprogrammering av Human dermal fibroblast till iPSCs och små kolonier kan ses så tidigt som 24 h efter den första transfektion, även med ändringar med hänsyn till standarddata bladet. Den omprogrammering förfarande som används i detta protokoll ger fördelen av en säker omprogrammering, utan risk för infektioner orsakade av viral Vector-baserade metoder, minskar cellulära försvarsmekanismer, och möjliggör generering av Xeno-fria iPSCs, alla viktiga funktioner som är obligatoriska för ytterligare kliniska tillämpningar.
Introduction
Cell omprogrammering representerar en ny teknik för att omvandla varje somatisk cell i kroppen till en pluripotenta stamcell, känd som iPSC1. Möjligheten att omprogrammering en vuxen somatisk cell tillbaka till en pluripotenta och odifferentierad stat har övervinna de gränser som införts av dålig tillgänglighet och etiska frågor i samband med användningen av pluripotenta celler, tidigare endast kan härledas från mänskliga embryon (embryonala stamceller eller ESC)2,3,4. I 2006 genomförde Kazutoshi Takahashi och Shinya Yamanaka en banbrytande studie för att uppnå den första omvandlingen av vuxna somatiska celler från huden till pluripotenta celler genom att artificiellt lägga till fyra specifika gener (Oct4, Sox2, Klf4, c-MYC)5. Ett år senare ledde arbetet i Thomson laboratorium till en lyckad omprogrammering av somatiska celler till iPSCs genom transduktion av en annan kombination av fyra gener (Oct4, Sox2, nanog, Lin28)6.
iPSCs erbjuder ett antal möjligheter för forskare och forskare inom olika områden, såsom regenerativ medicin och farmakologi, är en utmärkt plattform för att studera och behandla olika sjukdomar tillsammans med en genotypisk reflektion av egenskaperna hos den patient de härstammar från. Användningen av iPSCs ger flera fördelar, bland annat: den minskade risken för immunsvar på grund av ett fullständigt autologt ursprung av celler; möjligheten att skapa ett cell bibliotek, ett viktigt verktyg för att förutsäga svar på nya läkemedel och deras biverkningar, eftersom de kan kontinuerligt självförnya och generera olika celltyper; och chansen att utveckla en skräddarsydd metod för läkemedelsadministration7,8,9.
Olika tekniker är kända för närvarande, för att inducera uttrycket av omprogrammeringskoefficienter och de ingår i två huvudkategorier: icke-virala och virala vektorbaserade metoder10,11,12,13. Icke-virala metoder inkluderar mRNA transfektion, Mirna infektion/transfektion, piggybac, minicircle vektorer och episomala plasmider och undanflykt10,11,12,13. Viral-baserade metoder inkluderar icke-integrerande virus, såsom adenovirus, Sendai virus och proteiner, och integrera virus som retrovirus och lentivirus10,11,12,13.
Enligt flera studier, inga signifikanta skillnader har noterats bland dessa metoder när det gäller effektiviteten av cell omprogrammering, därav, valet av lämplig metod beror strikt på den celltyp som används och på de efterföljande tillämpningarna av iPSCs erhålls14,15. Alla de nämnda metoderna visar nackdelar, till exempel är Sendai-viruset effektivt på alla celltyper, men kräver en hel del passager för att få iPSCs; omprogrammering av episomes är utmärkt för blodkroppar men behöver modifiering av standard odlingsförhållanden för fibroblaster; den piggybac metoden kan representera ett attraktivt alternativ men studier i mänskliga celler är fortfarande begränsade och svaga10,11,12,13. Exosomer är nanovesikler fysiologiskt utsöndras i alla kroppsvätskor av celler. Enligt nyare studier, de är ansvariga för intercellulära kommunikation och kan ha en roll i viktiga biologiska processer, såsom cellproliferation, migration och differentiering. Exosomes kan transportera och överföra mRNA och miRNA till mottagar celler med en helt naturlig mekanism, eftersom de delar samma sammansättning av cellmembranet16. Därför är undanflykt en lovande ny generation teknik för omprogrammering, men deras potential att programmera somatiska celler av deras innehåll är fortfarande under utredning. Viral vektorer-baserade metoder använder virus modifierade för att förmedla omprogrammering gener till mottagar celler. Denna teknik, trots den höga effektiviteten av omprogrammering, anses inte vara säker, eftersom integrationen av viruset i cellen kan vara ansvarig för infektion, Teratomu och genomisk instabilitet17.
Följande protokoll för att generera iPSCs kolonier kombinerar Yamanaka ' s och Thompson ' s omprogrammering cocktail och bygger på användning av en metod som kräver NM-RNAs och immunsuppressiva faktorer med möjlighet att utföra det i Xeno-fria villkor. Logiken bakom användningen av denna metod är att sprida, inom det vetenskapliga samfundet, ett protokoll som möjliggör en snabb, enkel och mycket effektiv omprogrammering av vuxna mänskliga fibroblaster från buken huden till iPSCs18.
Styrkan i den föreslagna metoden är i själva verket den lätthet av prestanda och den korta tid som krävs för att få iPSCs. Dessutom, metoden undviker cellulära försvarsmekanismer och användning av virala vektorer, ansvarig för relevanta frågor.
När det gäller standardprotokollet gjordes följande ändringar: (1) Confluent fibroblaster synkroniserades vid passage 4 genom att placera i 0,1% serum för 48 h före trypsinization; (2) den cellulära densitet för kultur och volymen av reagenser justerades för utnyttjande på en 24-väl multi-well plattan i stället för en 6-brunn tallrik; (3) omprogrammeringexperimentet utfördes med hjälp av en 5% CO2 -inkubator i stället för en inkubator med atmosfäriskt (21% o2) eller hypoxisk (5% o2) villkor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Proverna från mänsklig vävnad samlades in enligt Helsingforsdeklarationen medan de observerade Federico II-riktlinjerna för University Hospital. Alla patienter som deltog i denna studie gav skriftligt medgivande.
1. beredning av förbrukningsmaterial och odlingsmedier
- Rengör och autoklav ett stort par av kirurgisk sax, två uppsättningar av fina pinpett, två par microdissecting sax, 1 L steril flaska, 500 mL steril flaska, och en 250 mL steril flaska.
- Förbered 100 mm plattor, 60 mm tallrikar, 35 mm plattor, engångsskalpeller, 50 mL sterila rör, 15 mL sterila rör, och en 100 mm glasplatta. Förvara instrumenten under sterila förhållanden tills de är färdiga att användas.
- Rengör och sterilisera 22 mm x 22 mm täckglas före användning. För detta, placera täckglas i en glasplatta, täck dem med 70% etanol och vänta några sekunder innan aspirera etanol. Låt täckglasögonen torka i en ugn vid 37 ° c och autoklav dem sedan.
- Förbered 1 L av Hank ' s balanserade saltlösning (HBSS) vid pH 7,4 genom att lösa kommersiellt tillgängliga pulveriserade salter i dubbeldestillerat sterilt vatten och lägga till 0,35 g natriumbikarbonat. Sterilisera genom filtrering under en steril huva och förvara vid + 4 ° c tills användning.
- Bered 500 ml steril 1x fosfatbuffrad-saltlösning (PBS) genom att lösa upp 0,1 g kaliumfosfat monobasic, 0,1 g kaliumklorid, 4,0 g natriumklorid och 0,575 g natriumfosfat dibasiskt i sterilt dubbeldestillerat vatten. Kontrollera pH-värdet (7,4) och sterilisera under en steril huva genom filtrering. Förvaras vid + 4 ° c fram till användning.
- Bered 50 mL trypsin-stopplösning (TSS) genom att tillsätta 5 mL 10% fetalt bovint serum (FBS) till 45 mL HBSS under en steril huva. Förvaras vid + 4 ° c fram till användning.
- Förbered Dulbecco modifierade Eagle medium för fibroblast isolering (I-DMEM) med 250 mL av Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) kompletteras med 10% FBS och 0,5% penicillin och streptomycin (penna/STREP) under en steril huva. Förvaras vid + 4 ° c fram till användning.
- Förbered DMEM för fibroblaster synkronisering (S-DMEM) med 250 mL DMEM kompletterat med 0,1% FBS och 0,5% penna/STREP under en steril huva. Förvaras vid + 4 ° c fram till användning.
2. isolering av humana dermal fibroblaster
Anmärkning: steg 2,1 till 2,3 som rapporteras nedan måste utföras under en steril huva. Ett cylindriskt prov som mäter ca 0,8 cm i diameter ger 2 x 106 fibroblaster vid passage 1.
- Tvätta det nyligen erhållna provet av mänsklig hud från buken i en 100 mm maträtt med HBSS-lösning. Skaka försiktigt för att ta bort blod och andra biologiska vätskor. Upprepa steg tre gånger, ändra HBSS-lösningen och plattan vid varje tvätt.
- Placera provet i en 100 mm platta, ta bort hår och fett med hjälp av fina tång och sax, och dissekera den med en skalpell för att få 2 mm x 1 mm fragment (för totalt 16 fragment) undvika ärr, smutsiga (t. ex., som följd av ritningar med dermographic penna) eller brände områden av vävnaden.
- Placera 4 små fragment i varje 35 mm fat, täck med ett sterilt 22 mm x 22 mm täckglas. Justera med hjälp av fin tång. Tillsätt 1,5 mL I-DMEM.
- Inkubera plattorna vid 37 ° c i 5% CO2 i ca 15 dagar eller tills cellerna når 85% Confluence. Ändra odlingsmediet var tredje dag och kontrollera utväxt av celler med hjälp av en inverterad faskontrastmikroskop dagligen.
3. expansion av mänsklig hud fibroblaster
Obs: stegen som rapporteras nedan måste utföras under en steril huva förutom de steg som utförs i inkubatorn.
- Lyft täckglasögonen med fin tång, placera dem upp och ner i 1 100 mm skålen och tvätta med 1x steril PBS.
- Ta bort fragment av proverna och kassera dem, tvätta plattorna med 1x steril PBS.
- Ta bort 1x PBS och tillsätt 3 mL och 1 mL trypsin-EDTA (etylendiamintetraättiksyra) för att täcka glasögon som placerats i 100 mm-skålen respektive 35 mm-rätterna. Inkubera i 5 min vid 37 ° c med 5% CO2.
- Blockera trypsinization genom att tillsätta 5 mL TSS till 100 mm skålen och 2 mL TSS till varje 35 mm maträtt. Samla upp suspensionen i 15 mL sterila rör, Centrifugera vid 400 x g vid 4 ° c i 5 min.
- Sug upp supernatanten och Omsuspendera pelleten i 12 mL i-DMEM. Dela upp cellsuspensionen i 3 mL-portioner för varje 60 mm-platta.
- Inkubera vid 37 ° c med 5% CO2. Ändra mediet dagligen. Behåll celler i kulturen tills de når en sammanflödet av 75%.
- Sug upp mediet från plattorna och tvätta snabbt i 1x PBS.
- Upprepa trypsinization (steg 3,3 och 3,4) tre gånger för att få celler vid passage 4. Använd 1,5 mL trypsin-EDTA och 3 mL TSS i varje 60 mm maträtt. Dela cellerna 1:3.
- Synkronisera cellerna genom att ersätta i-DMEM med S-DMEM och inkubera för 48 h vid 37 ° c med 5% CO2.
- Förbered följande (under cellsynkronisering).
- Förbered fibroblast expansions medium genom att tillsätta 5,0 mL FBS och 0,5 mL L-glutamin till 44,5 mL av Advanced DMEM (A-DMEM), förvaras vid + 4 ° c.
- Förbered total nm-RNA-omprogrammering cocktail för fibroblast omprogrammering genom att kombinera följande i varje 9 sterila RNase-fria rör: 32 μl av oskmnl nm-RNA, 24 μl EKB nm-RNA, 5,6 μl av nm-micrornas (61,6 μl slutlig volym för 9 alikvoter).
- Dela varje tub med 61,6 μl total nm-RNA-omprogrammering cocktail för fibroblast omprogrammering i fyra 15,4 μl engångsportioner i sterila, RNase-fria rör och förvara vid-80 ° c (15,4 μl slutlig volym för 36 alikvoter).
4. omprogrammering av dermal fibroblaster till iPSCs
- Dag 0: cell sådd
Anmärkning: steg 4.1.1 till 4.1.3 och 4.1.8 till 4.1.9 måste utföras under en steril huva. Basalmembran Matrix (BMM) geler snabbt vid rumstemperatur. Därför är det starkt rekommenderat att Tina BMM över natten på is i ett kylskåp, späd den med is-kallt serumfritt medium och använda förkylda Pipets, tips och rör.- Förbered en 24-brunn plattan genom att täcka varje brunn med 100 μL av BMM och inkubera i minst 1 h vid 37 ° c innan sådd cellerna.
- Aspirera mediet från tallrikar med celler i kulturen och snabbt tvätta i 1x PBS.
- Upprepa trypsinization (steg 3,3 och 3,4) för att erhålla celler vid passage 5. Aspirera supernatanten och Omsuspendera pelleten i en lämplig volym av expansions mediet fibroblaster (se steg 3,10).
- Förbered och rengör hemocytometern med 70% alkohol.
- Bered en lösning genom att försiktigt blanda 10 μl trypan Blue och 10 μL cellsuspension i 1,5 mL tub, och inkubera i 1 – 2 min vid rumstemperatur. Var försiktig så att du inte Inkubera längre än 5 min.
- Pipettera 10 μL av lösningen i hemocytometern placera den på scenen av en inverterad faskontrastmikroskop att räkna. Icke-livskraftiga celler kommer att vara blå, medan livskraftiga celler kommer att vara ofärgade.
- Räkna cellerna i minst 2 rutor av hemocytometern kammaren. Använd följande beräkning för att få det totala antalet celler:
Totalt antal celler = (totalt antal räknade celler/kvadrattal) x 2 x 10 x total volym av cellsuspensionen - Utför en utspädning för att få en densitet av 2,5 x 104 cell per 500 μl av fibroblaster expansions medium, baserat på det totala antalet räknade celler. Omsuspendera pelleten i en lämplig mängd fibroblaster expansions medium.
- Pipettera 500 μL av cellsuspensionen i varje brunn av 24-brunnen plattan. Inkubera celler över natten vid 37 ° c och 5% CO2.
- Dag 1: transfektion
Anmärkning: alla arbetsytor och förbrukningsmaterial (t. ex. handskar, flaskor, sterila huv ytor, pipettorer) måste rengöras med rengöringsreagens för att avlägsna RNase innan proceduren påbörjas. Utför steg 4.2.2, 4.2.4 – 4.2.8 under en steril huva.- Värm upp Xeno-fri, serum-fri, låg tillväxtfaktor Human ESC/iPSC kultur medium (XF/FF kultur medium) i en 37 ° c vattenbad.
- Ta bort det gamla mediet från varje brunn och Ersätt det med 500 μL av pre-warmed XF/FF odlingssubstrat.
- Inkubera vid 37 ° c under 5% CO2 i minst 6 h.
- Tina fem 15,4 μL alikvoter av totalt NM-RNA omprogrammering cocktail vid rumstemperatur placera den på is.
- Tillsätt 234,6 μL reducerat serum medium till varje alikvot, Pipettera försiktigt 3 – 5 gånger och märk var och en som tub a (RNA + reducerat serum medium).
- Märk 5 sterila, RNase-fria 0,5 mL-rör som rör B och blanda 6 μl syntetiskt siRNA-transfektionsreagens med 244 μl reducerat serum medium (RNA-transfektionsreagens + reducerat serum medium).
- Tillsätt innehållet i varje tub B till ett rör en droppvis (för att erhålla 500 μl slutlig volym nm-RNA transfektion komplex lösning). Blanda genom att knacka på botten av röret. Inkubera i rumstemperatur i 15 min.
- Tillsätt 125 μL av NM-RNA transfektion Complex Solution från var och en av de fem alikvoter på 500 μL till 4 brunnar (för att nå totalt 20 brunnar), luta plattan och Pipettera droppvis i mediet. Blanda genom att gunga försiktigt. Använd de återstående 4 brunnarna som referens.
- Inkubera i 15 h vid 37 ° c, 5% CO2.
- Dag 2 – 4: Slutför transfektion
- Aspirera mediet. Upprepa proceduren för transfektion som på dag 1 under den sterila huven.
- Dag 5 – 10: medie byten
- Aspirera mediet och utbyta med färska, förvärmda XF/FF odlingssubstrat under en steril huva.
- Inkubera över natten vid 37 ° c, 5% CO2.
- Håll i kulturen tills Observera bildandet av iPSC kolonier övervakning dagligen av ett fas-kontrast Mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syftet med protokollet var att programmera dermal fibroblaster isolerade från buk huden med hjälp av icke-integrerande omprogrammering metod baserad på NM-RNAs att inducera uttrycket av specifika faktorer. För att uppnå detta mål, var Human dermal fibroblaster isolerade från hudprover av patienter som genomgår bukplastik och iPSCs genererades införa Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, nanog, Lin28 omprogrammering faktorer och E3, K3, B18 immun skatteflykt faktorer av en kommersiell färdig att använda omprogrammering kit som kombinerar NM-RNA och microRNA teknik. Protokollets tidslinje sammanfattas i figur 1.
Humana fibroblaster växte ur prover av buk hud inom en vecka av kultur (figur 2A) och nådde 85% sammanflödet inom två veckor (figur 2B). Celler präglades av självhäftande tillväxt på plast kultur rätter och deras morfologi varierade från långsträckta och spindel-formade (figur 2C) till tillplattad och stjärnformade (figur 2D). Fibroblastmorfologi och arrangemang i kulturen förändrats dramatiskt efter sådd på BMM, när de förvärvade en långsträckt morfologi och arrangerade för att bilda tunna förgrenade strukturer (figur 3A). Små kolonier var redan synliga i kulturen på dag 1 från första transfektion (figur 3B) och deras storlek växte successivt över tiden, medan deras antal ökade till dag 7 och sedan förblev stabilt mellan dag 7 och dag 14 (figur 3C, D), förmodligen som ett resultat av mindre kolonier samman för att bilda större kolonier.
Eftersom omprogrammeringen utförs med hjälp av antibiotika fria medier är mikrobiell kontaminering en viktig fråga och det kan förekomma (figur 4) om sterila förhållanden inte garanteras anta standardförfaranden för att förhindra kontaminering (t. ex. bär handskar, ta bort damm från alla ytor, rengöra alla ytor och utrustning med 70% etanol, Undvik att prata under steg med avslöjade cellkulturer plattor).
Bild 1: protokollets tidslinje. Tidslinje för isolering och omprogrammering av humana fibroblaster från buk hud. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: isolering och kultur av dermal fibroblaster. Representativa bilder av fibroblaster utväxt från huden fragment (a). Fibroblaster nådde sammanflödet i cirka 14 dagar (B) och visade spindel-formade (C) och stjärnformade (D) fenotyp. Hudfragment indikeras av en vit stjärna. Skalstapel = 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: hud fibroblast omprogrammering progression. Celler som seedas på BMM visade en markant förändring i ordning och morfologi (a). Små kolonier av iPSCs bildas så tidigt som 24 h efter den första transfektion (B) och deras storlek ökade successivt vid dag 7 (C), och 14 (D), medan deras antal ökade mellan dag 1 och dag 7 men förblev stabil mellan dag 7 och 14 från första transfektion. Skalstapel = 500 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: mikrobiell kontaminering under omprogrammeringen. Representativ bild med hjälp av fas-kontrast Mikroskop som visar en Mikrobiell förorening av fibroblaster kultur under omprogrammering förfarande. Skalstapel = 500 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
iPSCs växer snabbt som den mest lovande cell kandidat för regenerativ medicin applikationer och som ett oerhört användbart verktyg för sjukdomsmodellering och drogtester3,8. Det protokoll som presenteras här beskriver generering av mänskliga iPSCs från ett prov som har storleken på en hudpunsch biopsi med ett enkelt och effektivt förfarande som inte kräver någon särskild utrustning eller tidigare erfarenhet av omprogrammering teknik.
Det är av största vikt att optimera fibroblast isolering och kultur för att öka chansen att lyckas, som plätering densitet och spridning takt inverkan omprogrammering effektivitet. Ytterligare, det har nyligen rapporterats att dermal fibroblaster reagera annorlunda på omprogrammering teknik och, specifikt, fibroblaster isolerade från huden i buken regionen är lättare och lättare omprogrammeras än dermal fibroblaster isolerade från andra organ regioner18. Därför är det viktigt att noggrant välja de somatiska cellerna för att programmera och definiera beläggningstätheten på grundval av cell spridnings frekvensen. Till detta syfte, det nuvarande protokollet instruerar också om hur man kan isolera dermal fibroblaster från buk huden och hur man propagerar dem in vitro för att underlätta och påskynda förfarandet.
Före omprogrammering, fibroblaster propagerades för att nå passage 5 för att radera cell minne18 och följa rapporterade bevis för att passaging kan påskynda induktion av pluripotenta stat19. Dessutom, enligt vår erfarenhet, fibroblaster i kulturen uppvisar varierande proliferativa egenskaper, så vi ändrat protokollet genom att införa ett ytterligare steg för att synkronisera fibroblaster och minska variationen i cellpopulationen.
Med hjälp av ett kommersiellt nm-rnas-baserat kit som introducerar en kombination av omprogrammeringskoefficienter till följd av Yamanakas och Thomson Approach5,6, tillsammans med Mirna som har visat sig förbättra mRNA-baserade omprogrammering20, Human dermal fibroblaster kan framgångsrikt omprogrammeras till IPSC och små kolonier blir uppenbara så tidigt som 24 h efter den första transfektion. De främsta fördelarna med mRNA-baserade omprogrammering är, faktiskt, den tidiga uppkomsten av kolonier även när ett lågt antal celler omprogrammeras20 tillsammans med en mycket låg aneuploidi takt och fullständig avsaknad av integration som gör iPSCs genereras med denna metod säker för en användning i regenerativ medicin. Dessutom, den kommersiella kit som används för detta protokoll CO-levererar immunmodulerande faktorer som är kända för att förbättra effektiviteten i omprogrammering genom att förhindra celldöd orsakad av cytotoxiska och immunogena nm-rnas21,22.
Även om det kit som används för omprogrammering utformades för 6-väl multi-well plattan, vi optimerad cellulära densitet och justerade volymen av reagenser för utnyttjande på en 24-väl multi-well plattan för att göra protokollet effektivt för generering av mänskliga iPSCs från en hudpunsch biopsi. Dessutom, även om behovet av en vävnadsodling inkubator med O2 kontroll rapporteras av flera författare20,23 och rekommenderas av kit tillverkaren, efter det protokoll som beskrivs här vi omprogrammeras Human dermal fibroblaster från buken huden i en standard 5% Co2 inkubator. Därför kan förfarandet utföras i alla cellkulturer laboratorium utan behov av atmosfäriska (21% o2) eller hypoxisk (5% o2) odlingsförhållanden, även om dessa kan ytterligare förbättra omprogrammering effektivitet24,25.
Ändå använde vi icke-mänskliga animaliska reagenser för att härleda från små hudprover iPSCs som kan användas för forskningsändamål. Även om den mest attraktiva ansökan är för förnyelse av vävnader och organ, iPSCs har använts för modellering av olika sjukdomar och sedan både undersöka om bakomliggande molekylära mekanismer och utveckla specifika läkemedel och terapier3,26.
Anmärkningsvärt, att ersätta animaliska reagenser för lämpliga xeno-fria reagenser, tillåter samma protokoll omprogrammering av vuxna humana fibroblaster till iPSCs i en komplett Xeno-fri kulturmiljö som motiverar deras kliniska användning.
Den tunga arbetsbördan måste dock beaktas. Enligt vår mening är det viktigt att planera experimentet noggrant i förväg, inklusive steg som måste utföras under helgerna, och att förbereda alla transfektion reagenser under synkroniseringen steg. Faktum är att transfektion ska utföras varje dag i fyra dagar och efteråt måste celler övervakas varje dag och medium ska bytas ut dagligen.
Dessutom kan den korrekta identifieringen av iPSC-kolonier inte enbart grundas på morfologiska kriterier. Därför måste nyligen härledda iPSCs kännetecknas söka efter uttrycket av flera pluripotenta markörer genom cellulära och molekylära analyser. Allmänt accepterade markörer inkluderar NANOG, OCT4, SOX2, TRA-1-60, TRA-1-81 och SSEA4, som kan identifieras genom immunocytokemisk analys och genom gen uttrycks analys med hjälp av semikvantitativ eller kvantitativ RT-PCR. Eftersom alkaliskt fosfatasaktivitet har visats vara uppreglerad i pluripotenta stamceller, kan upptäckten av sådan enzymatisk aktivitet lätt utföras för att identifiera iPSCs och kontrollera förekomsten av omprogrammering27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna har inga erkännanden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357551 | Sterile, polystyrene |
| 100 mm plates | Falcon | 351029 | Treated, sterile cell culture dish |
| 15 mL sterile tubes | Falcon | 352097 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| 24-well plates | Falcon | 353935 | Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357525 | Sterile, polystyrene |
| 35 mm plates | Falcon | 353001 | Treated, sterile cell culture dish |
| 5 mL serological pipet | Falcon | 357543 | Sterile, polystyrene |
| 50 mL sterile tubes | Falcon | 352098 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 12491-015 | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Sigma- Aldrich | D6429-500ml | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Fetal Bovine Serum | Sigma- Aldrich | F9665-500ml | Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Hank's Balanced Salt Solution | Sigma- Aldrich | H1387-1L | Powder |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | INVITROGEN | 13778-030 | Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C |
| Matrigel | CORNING | 354234 | Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws. |
| Neubauer Chamber | VWR | 631-1116 | Hemocytometer |
| NutriStem XF Culture Medium | Biological Industries | 05-100-1A-500ml | Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-062-100ml | Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma- Aldrich | P4333-100ml | Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
| Potassium Chloride | Sigma- Aldrich | P9333 | Powder |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma- Aldrich | P5665 | Powder |
| RNase-free 0.5 mL tubes | Eppendorf | H0030124537 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Eppendorf | H0030120086 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
| RNaseZAP | INVITROGEN | AM9780 | Cleaning agent for removing RNase |
| Sodium Bicarbonate | Sigma- Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium Chloride | Sigma- Aldrich | S7653 | Powder |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma- Aldrich | 94046 | Powder |
| StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit | Reprocell | 00-0076 | Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C. |
| Trypsin-EDTA | Sigma- Aldrich | T4049-100ml | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
References
- Lo, B., Parham, L. Ethical Issues in Stem Cell Research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
- Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine. Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).
- Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).
- Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases. Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).
- Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications. Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422 (2016).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Malik, N., Rao, M. R. A Review of the Methods for Human iPSC Derivation. Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).
- Poleganov, M. A., et al. Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion. Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).
- Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies. Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).
- Revilla, A., et al. Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).
- Lee, Y. S., et al. Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells. ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Shan, Z. Y., et al. Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells. Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts. Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).
- Beissert, T., et al. Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins. Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).
- Mathieu, J., et al. Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency. Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).
- Wang, Y., et al. Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells. Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).
- Deng, Y., et al. Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).
- Karagiannis, P., et al. Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development. Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).
- Maherali, N., Hochedlinger, K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).
- Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).
