Summary

CryoAPEX-metoden til elektronmikroskopianalyse af membranproteinlokalisering i ultrastrukturelt bevarede celler

Published: February 27, 2020
doi:

Summary

Denne protokol beskriver cryoAPEX-metoden, hvor et APEX2-mærket membranprotein kan lokaliseres ved transmissionselektronmikroskopi i optimalt bevaret celleultrastruktur.

Abstract

Vigtige cellulære begivenheder som signaltransduktion og membranhandel er afhængige af korrekt proteinplacering i cellulære rum. Forståelse af præcis subcellulær lokalisering af proteiner er derfor vigtigt for at besvare mange biologiske spørgsmål. Jagten på en robust etiket til at identificere protein lokalisering kombineret med tilstrækkelig cellulær bevarelse og farvning har været historisk udfordrende. Nylige fremskridt inden for elektronmikroskopi (EM) billeddannelse har ført til udvikling af mange metoder og strategier til at øge cellulære bevarelse og etiket mål proteiner. En forholdsvis ny peroxidase-baserede genetiske tag, APEX2, er en lovende leder i klonelige EM-aktive tags. Prøveforberedelse til mikromikroskopi af transmissionselektron (TEM) er også udviklet i de senere år med fremkomsten af kryofixation ved højtryksfrysning (HPF) og lavtemperaturdehydrering og farvning via frysesubstitution (FS). HPF og FS giver fremragende bevarelse af cellulære ultrastruktur til TEM-billeddannelse, kun overgået af direkte kryo-billeddannelse af glasagtige prøver. Her præsenterer vi en protokol for cryoAPEX-metoden, som kombinerer brugen af APEX2-mærket med HPF og FS. I denne protokol mærkes et protein af interesse med APEX2, efterfulgt af kemisk fiksering og peroxidasereaktionen. I stedet for traditionel farvning og alkoholdehydrering ved stuetemperatur kryofikser prøven og gennemgår dehydrering og farvning ved lav temperatur via FS. Ved hjælp af cryoAPEX kan et protein af interesse ikke identificeres i subcellulære rum, men også yderligere oplysninger kan løses med hensyn til dets topologi i en strukturelt bevaret membran. Vi viser, at denne metode kan give høj nok opløsning til at dechifrere proteinfordelingsmønstre i et organellelumen og til at skelne mellem opdelingen af et protein i en organelle i nærheden af andre umærkede organeller. Desuden er cryoAPEX proceduremæssigt ligetil og modtagelig for celler dyrket i vævskultur. Det er ikke mere teknisk udfordrende end typiskkrofixation og frysesubstitutionsmetoder. CryoAPEX er almindeligt anvendelig for TEM analyse af enhver membran protein, der kan genetisk mærkes.

Introduction

Biologiske undersøgelser omfatter ofte spørgsmål om løsning af subcellulær proteinlokalisering i celler og organeller. Immunfluorescensmikroskopi giver en nyttig lav opløsning opfattelse af protein lokalisering, og de seneste fremskridt i super-opløsning imaging skubber grænserne for opløsning for fluorescerende mærkede proteiner1,2,3. Men elektronmikroskopi (EM) forbliver guldstandarden for billeddannelse cellulære ultrastruktur med høj opløsning, selv om mærkning af proteiner er en udfordring.

Historisk set er flere EM-metoder blevet anvendt til at behandle spørgsmål om ultrastrukturel proteinlokalisering. En af de mest almindeligt anvendte metoder er immunelektronmikroskopi (IEM), hvor antigen-specifikke primære antistoffer bruges til at detektere protein af interesse. EM-signalet genereres ved anvendelse af sekundære antistoffer konjugeret med elektrontætte partikler, oftest kolloidguld4,5. Alternativt kan antistoffer konjugeret med enzymer som hesteradisk peroxidase (HRP) anvendes til at producere en elektrontæt bundfald6,7,8. Der findes to hovedtilgange til IEM, der kaldes forindlejring og postintegreringsmærkning. Ved præintegrering i IEM indføres antistoffer direkte i celler, hvilket kræver lysfiksering og permeabilisering af cellerne9,10,11. Begge trin kan beskadige ultrastruktur12,13. Udvikling af betydeligt mindre antistoffer bestående af et antistof Fab fragment konjugeret med 1,4 nm nanoguld tillader meget blid permeabilisering betingelser, der skal anvendes; Nanoguld er dog for lille til direkte visualisering under TEM og kræver yderligere forbedringstrin for at blive synlige14,15,16. Ved post-indlejring IEM anvendes antistoffer på tynde dele af celler, som er blevet fuldt behandlet ved fiksering, dehydrering og indlejring i harpiks17. Selv om denne fremgangsmåde undgår gennemtrængelighedstrinnet, er det en udfordring at bevare interesseepicentret under hele prøveforberedelsen18,19,20. Tokuyasu-metoden til lysfiksering efterfulgt af frysning, kryo-skæring og antistofdetektion giver forbedret epitopkonservering21,22. Men de tekniske krav til kryo-ultramikrotomi, samt den sub-optimale kontrast opnået i cellen, er ulemper23.

Brugen af genetisk kodede tags eliminerer mange af de vanskeligheder, iiem i forbindelse med påvisning af protein af interesse. En række tags er tilgængelige, herunder HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG, og metallothionin24,25,26,27,28,29,30,31,32. Hver af disse har fordele i forhold til tidligere metoder, men hver har også ulemper, der forhindrer udbredt brug. Disse ulemper spænder fra inaktivitet af HRP i cytosol til den store størrelse af ferritin tag, lys følsomhed ReAsH, og lille størrelse og manglende kompatibilitet med cellulære farvning af metallothionin. For nylig, et protein fremstillet af ascorbat peroxidase er blevet manipuleret som en EM-tag, opkaldt APEX233,34. Som peroxidase kan APEX2 katalysere oxidationen af 3,3′ diaminobenzidin (DAB), der producerer en bundfald, der reagerer med osmiumtetroxid for at give lokal EM-kontrast med minimal diffusion fra proteinaf interesse (mindre end 25 nm)33,35. I modsætning til traditionelle HRP-baserede metoder er APEX2 ekstremt stabil og forbliver aktiv i alle cellerum33. Prøver kan forarbejdes for TEM ved hjælp af traditionel EM-prøvefarvning og metoder , der giver mulighed for god visualisering af de omkringliggende konstruktioner33,34,36. På grund af sin lille størrelse, stabilitet og alsidighed, apex2 har vist sig som en EM tag med stort potentiale.

Mange af de tilgange, der er beskrevet ovenfor, kan enten ikke kombineres med den aktuelle tekniske situation inden for ultrastrukturel konservering, kryoviation og frysesubstitution ved lav temperatur. Således lider de af mangel på membran konservering og / eller celle farvning at bestemme nøjagtig protein lokalisering. Dette begrænser nødvendigvis opløsningen og fortolkningen af de data, der kan indhentes. Kryofixation ved højtryksfrysning (HPF) indebærer hurtig frysning af prøver i flydende nitrogen ved et højt tryk (~ 2.100 bar), som forårsager vitrification snarere end krystallisering af vandige prøver, og dermed bevare celler i en næsten hjemmehørende tilstand37,38,39. HPF efterfølges af frysesubstitution (FS), en lav temperatur (-90 °C) dehydrering i acetone kombineret med inkubation med typiske EM-pletter såsom osmiumtetroxid og uranylacetat. HPF og FS giver tilsammen en klar fordel i forhold til traditionel kemisk fiksering (en længere proces, der kan føre til artefakter) og alkoholdehydrering ved stuetemperatur eller is (hvilket kan føre til udvinding af lipider og sukker), og derfor er ønskeligt at kombinere med de bedste EM-tags til påvisning af protein.

En af grundene til, at HPF/FS ikke er blevet kombineret med APEX2-mærkning, er, at lyskemisk fiksering er en forudsætning for peroxidasereaktionen, hvilket begrænser udbredelsen af DAB-reaktionsproduktet. I APEX2-undersøgelser indtil videre efterfølges fiksering og peroxidasereaktion af traditionelle EM-metoder til farvning og alkoholdehydrering33,36. Det er imidlertid blevet påvist, at efter kemisk fiksering med HPF/FS giver en klar fordel i konserveringen i forhold til traditionel kemisk fiksering og alkoholdehydrering alene40. Tabet af ultrastrukturel integritet, der ses i traditionelle TEM-prøver, synes mindre forbundet med fiksering end til dehydrering, hvilket typisk sker ved hjælp af alkohol ved stuetemperatur eller is, og kan føre til ekstraktion af lipider og sukker40,41. For at udvikle cryoAPEX-metoden antager vi, at kemisk fiksering og peroxidasereaktion efterfulgt af HPF og FS ville give et optimalt resultat med hensyn til ultrastrukturel konservering.

Her præsenterer vi cryoAPEX-protokollen, som kombinerer APEX2-mærkning med kryopræks- og frysesubstitutionsmetoder (figur 1). Denne enkle protokol består af omladning af et APEX2-mærket protein af interesse, kemisk fiksering af celler og peroxidasereaktionen. HPF og FS udføres derefter efterfulgt af typisk harpiksintegrering og tynd skæring. TEM imaging afslører fremragende bevarelse af ultrastruktur ved hjælp af denne metode. Derudover blev der observeret højopløsningssubcellulær lokalisering og rumlig fordeling af et endoplasmisk retikulum (ER) lumenalprotein. Denne metode er meget nyttig til påvisning af membranproteinlokalisering i celler til elektronmikroskopianalyse. I vores hænder har metoden fungeret med succes for en række cellelinjer dyrket i vævkultur, herunder HEK-293T (human embryonal nyre), HeLa (human livmoderhalskræft), Cos7 (afrikansk grøn abe nyre fibroblast), og BHK (baby hamster nyre). Detaljerede instruktioner er beskrevet nedenfor ved hjælp af HEK-293T celler.

Protocol

1. Cellekultur og omladning Frø HEK-293T celler på en 60 mm diameter eller større væv kultur parabol og vokse til 60% -90% sammenløb i en celle kultur inkubator ved 37 °C og 5% CO2. Transfect celler med APEX2-mærkede pattedyr udtryk plasmider ved hjælp af transfektionsreagens (se Tabel over materialer)i henhold til producentens anvisninger. Ved 12-15 timer efter omladning en gang med fosfat buffered saltvand (PBS). Fjern celler fra skålen ved skånsom vas…

Representative Results

For at sammenligne den ultrastrukturelle konservering ved hjælp af cryoAPEX-metoden med traditionel fiksering og dehydrering udarbejdede vi prøver, hvor en endoplasmisk reticulummembran (ERM; ER membran) peptid blev mærket med APEX2 og transfected i HEK-293T celler. ERM-APEX2 lokaliserer til erens cytoplasmatiske ansigt og ommodellerer ER-strukturen til morfologisk adskilte strukturer kendt som organiseret smooth ER (OSER)34,42,43<…

Discussion

Den cryoAPEX protokol præsenteres her giver en robust metode til at karakterisere lokaliseringen af membran proteiner i cellulære miljø. Ikke alene giver brugen af et genetisk kodet APEX2-tag præcis lokalisering af et protein af interesse, men brugen af kryoixation og lavtemperaturdehydrering giver fremragende bevarelse og farvning af den omgivende cellulære ultrastruktur. Kombineret er disse tilgange et kraftfuldt værktøj til lokalisering af et protein med høj præcision i sin undercellulære kontekst.

<p cl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Den protokol, der er beskrevet her, stammer fra en publikation af Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Dette arbejde understøttes af tilskud R01GM10092 (til SM) og AI081077 (R.V.S.) fra National Institutes of Health, CTSI-106564 (til S.M.) fra Indiana Clinical and Translational Sciences Institute og PI4D-209263 (til SM) fra Purdue University Institute for Inflammation, Immunologi og infektiøs sygdom.

Materials

3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate Sigma-Aldrich D5637-1G
Acetone (Glass Distilled) Electron Microscopy Sciences 10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc Electron Microscopy Sciences 60952
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL VWR 82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin Sigma-Aldrich 44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 Sigma-Aldrich 44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) Sigma-Aldrich 44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D Sigma-Aldrich 44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm Electron Microscopy Sciences 70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm Electron Microscopy Sciences 70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement Corning 355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm Electron Microscopy Sciences 71008
Glass Knifemaker Leica Microsystems EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16120
HEK 293 Cells ATCC CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System Leica Microsystems EM PACT2 Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution Fisher Scientific 50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm Mager Scientific 16707898
Osmium Tetroxide, crystalline Electron Microscopy Sciences 19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade VWR 97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm Mager Scientific 16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film Electron Microscopy Sciences FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) Avantor Macron Fine Chemicals 7708-10
Tannic Acid Electron Microscopy Sciences 21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm VWR 25382-166
Ultra Glass Knife Strips Electron Microscopy Sciences 71012
Ultramicrotome Leica Microsystems EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate Electron Microscopy Sciences 22400

References

  1. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  2. Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies. Trends in Cell Biology. 25, 730-748 (2015).
  3. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6, 022003 (2018).
  4. De Mey, J., Moeremans, M., Geuens, G., Nuydens, R., De Brabander, M. High resolution light and electron microscopic localization of tubulin with the IGS (Immuno Gold Staining) method. Cell Biology International Reports. 5, 889-899 (1981).
  5. Faulk, W., Taylor, G. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Brown, W. J., Constantinescu, E., Farquhar, M. G. Redistribution of Mannose-6-Phosphate Receptors Induced by Tunicamycin and Chloroquine. The Journal of Cell Biology. 99, 320-326 (1984).
  7. Brown, W. J., Farquhar, M. G. The Mannose-6-phosphate Enzymes Is Concentrated Receptor for Lysosomal in Cis Golgi Cisternae. Cell. 36, 295-307 (1984).
  8. Sternberger, L. A., Hardy, P. H., Cuculis, J. J., Meyer, H. G. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 18, 315-333 (1970).
  9. Oliver, C., Oliver, C., Jamur, M. C. Pre-embedding Labeling Methods. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 381-386 (2010).
  10. Polishchuk, E. V., Polishchuk, R. S. Pre-embedding labeling for subcellular detection of molecules with electron microscopy. Tissue and Cell. 57, 103-110 (2019).
  11. Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Luini, A., Mueller-Reichert, T., Verkade, P. Visualizing Live Dynamics and Ultrastructure of Intracellular Organelles with Preembedding Correlative Light-Electron Microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy. 111, 21-35 (2012).
  12. Humbel, B. M., De Jong, M. D. M., Müller, W. H., Verkleij, A. J. Pre-embedding immunolabeling for electron microscopy: An evaluation of permeabilization methods and markers. Microscopy Research and Technique. 42, 43-58 (1998).
  13. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9, 152-158 (2012).
  14. Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New Frontiers in Gold Labeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 471-480 (2000).
  15. Hainfeld, J. F., Furuya, F. R. A 1.4-nm Gold Cluster Covalently Attached to Antibodies Improves Immunolabeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40, 177-184 (1992).
  16. Baschong, W., Stierhof, Y. Preparation, Use, and Enlargement of Ultrasmall Gold Particles in Immunoelectron Microscopy. Microscopy Research and Technique. 42, 66-79 (1998).
  17. Roth, J., Bendayan, M., Orci, L. Ultrastructural loclaization of intracellular antigens by the use of Protein A-gold complex. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 26, 1074-1081 (1978).
  18. Armbruster, B. L., et al. Specimen preparation for electron microscopy using low temperature embedding resins. Journal of Microscopy. 126, 77-85 (1982).
  19. Fowler, C. B., Leary, T. J. O., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Laboratory Investigation. 88, 785-791 (2008).
  20. Newman, G. R., Hobot, J. A. Modern Acrylics for Post-embedding Immunostaining Techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35, 971-981 (1987).
  21. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. The Journal of Cell Biology. 57, 551-565 (1973).
  22. Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143, 139-149 (1986).
  23. Möbius, W., Posthuma, G. Sugar and ice Immunoelectron microscopy using cryosections according to the Tokuyasu method. Tissue and Cell. 57, 90-102 (2019).
  24. Gaietta, G., et al. Multicolor and Electron Microscopic Imaging of Connexin Trafficking. Science. 296, 503-508 (2002).
  25. Uttamapinant, C., et al. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 10914-10919 (2010).
  26. Porstmann, B., Porstmann, T., Nugel, E., Evers, U. Which of the Commonly Used Marker Enzymes Gives the Best Results in Colorimetric and Fluorimetric Enzyme Immunoassays: Horseradish Peroxidase, Alkaline Phosphatase or Beta-Galactosidase. Journal of Immunological Methods. 79, 27-37 (1985).
  27. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biology. 9, 1001041 (2011).
  28. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160, 70-82 (2007).
  29. Wang, Q., Mercogliano, C. P., Löwe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19, 147-154 (2011).
  30. Risco, C., et al. Specific, sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20, 759-766 (2012).
  31. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. E., Thorner, J., Emr, S. D., Abelson, J. N. Chimeric Molecules Employing Horseradish Peroxidase as Reporter Enzyme for Protein Localization in the Electron Microscope. Methods in Enzymology. 327, 35-45 (2000).
  32. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetrcysteine-tagged proteins in intact cells. Nature Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  33. Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30, 1143-1150 (2012).
  34. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12, (2015).
  35. Ariotti, N., et al. Modular Detection of GFP-Labeled Proteins for Rapid Screening by Electron Microscopy in Cells and Organisms. Developmental Cell. 35, 513-525 (2015).
  36. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12, 1792-1816 (2017).
  37. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130, 877-889 (2008).
  38. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure Freezing for the Preservation of Biological Structure: Theory and Practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  39. McDonald, K. L., Hajibagheri, N. High-Pressure Freezing for Preservation of High Resolution Fine Structure and Antigenicity for Immunolabeling. Electron Microscopy Methods and Protocols. 117, 77-97 (1999).
  40. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  41. Korn, E. D., Weisman, R. A. Loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 116, 309-316 (1966).
  42. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. Journal of Cell Biology. 163, 257-269 (2003).
  43. Sandig, G., et al. Regulation of endoplasmic reticulum biogenesis in response to cytochrome P450 overproduction. Drug Metabolism Reviews. 31, 393-410 (1999).
  44. Faber, P. W., et al. Huntingtin interacts with a family of WW domain proteins. Human Molecular Genetics. 7, 1463-1474 (1998).
  45. Worby, C. A., et al. Article The Fic Domain Regulation of Cell Signaling by Adenylylation. Molecular Cell. 34, 93-103 (2009).
  46. Sanyal, A., et al. A Novel Link between Fic (Filamentation Induced by cAMP) – mediated Adenylylation / AMPylation and the Unfolded Protein Response. The Journal of Biological Chemistry. 290, 8482-8499 (2015).
  47. Mattoo, S., et al. Comparative Analysis of Histophilus somni Immunoglobulin-binding Protein A (IbpA) with Other Fic Domain-containing Enzymes Reveals Differences in Substrate and Nucleotide Specificities. The Journal of Biological Chemistry. 286, 32834-32842 (2011).
  48. Sengupta, R., Poderycki, M. J., Mattoo, S. CryoAPEX – an electron tomography tool for subcellular localization of membrane proteins. Journal of Cell Science. 132, 222315 (2019).
  49. Tsang, T. K., et al. High-quality ultrastructural preservation using cryofixation for 3D electron microscopy of genetically labeled tissues. eLife. 7, 1-23 (2018).
  50. Giddings, T. H. Freeze-substitution protocols for improved visualization of membranes in high-pressure frozen samples. Journal of Microscopy. 212, 53-61 (2003).
  51. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  52. McDonald, K. Cryopreparation methods for electron microscopy of selected model systems. Methods in Cell Biology. 79, 23-56 (2007).
  53. Buser, C., Walther, P. Freeze-substitution: the addition of water to polar solvents enhances the retention of structure and acts at temperatures around -60 degrees C. Journal of Microscopy. 230, 268-277 (2008).
  54. Jiménez, N., et al. Tannic acid-mediated osmium impregnation after freeze-substitution A strategy to enhance membrane contrast for electron tomography. Journal of Structural Biology. 166, 103-106 (2009).
  55. Han, Y., et al. Directed Evolution of Split APEX2 Peroxidase. ACS chemical biology. 14, 619-635 (2019).
  56. Kuipers, J., Van Ham, T. J., Kalicharan, R. D., Schnell, U., Giepmans, B. N. G. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Research. 360, 61-70 (2015).
  57. Zhou, Y., et al. Expanding APEX2 Substrates for Spatial-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins in Living Cells. Angewandte Chemie. , (2019).
  58. Joesch, M., et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy. eLife. 5, 1-13 (2016).

Play Video

Cite This Article
Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin, R. V., Mattoo, S. The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells. J. Vis. Exp. (156), e60677, doi:10.3791/60677 (2020).

View Video