Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Метод CryoAPEX для анализа электронной микроскопии мембранного белка в ультраструктурно-заповедных клетках

Published: February 27, 2020 doi: 10.3791/60677
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5,6
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 3Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University, 4Bindley Biosciences Center, Purdue University, 5Purdue Institute of Integrative Neuroscience, Purdue University, 6Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

Summary

Этот протокол описывает метод криоаПЕКС, в котором apEX2-тегами мембранного белка могут быть локализованы путем передачи электронной микроскопии в оптимально сохранившейся ультраструктуре клеток.

Abstract

Ключевые клеточные события, такие как трансдукция сигнала и мембранный оборот, зависят от правильного расположения белка в сотовых отсеках. Понимание точной субклеточной локализации белков, таким образом, имеет важное значение для ответа на многие биологические вопросы. Поискнадежной этикетки для определения локализации белка в сочетании с адекватной клеточной консервацией и окрашиванием исторически был сложным. Недавние достижения в области визуализации электронной микроскопии (EM) привели к разработке многих методов и стратегий для увеличения клеточной консервации и маркировки целевых белков. Относительно новый генетический тег на основе пероксидаза, APEX2, является перспективным лидером в области клонируемых ЭМ-активных тегов. Подготовка образцов для передачи электронной микроскопии (TEM) также продвинулась в последние годы с появлением криофиксации путем замораживания высокого давления (HPF) и низкотемпературного обезвоживания и окрашивания через замену замораживания (FS). HPF и FS обеспечивают превосходное сохранение клеточной ультраструктуры для tEM-изображений, уступая только прямой крио-изображению образцов стекловидного тела. Здесь мы представляем протокол для метода cryoAPEX, который сочетает в себе использование тега APEX2 с HPF и FS. В этом протоколе, белок интерес маркируется APEX2, а затем химической фиксации и реакции пероксидазы. Вместо традиционного окрашивания и обезвоживания алкоголя при комнатной температуре, образец крификируется и подвергается обезвоживанию и окрашиванию при низкой температуре через FS. Используя cryoAPEX, не только может быть идентифицирован интересуемый белок в субклеточных отсеках, но и дополнительная информация может быть решена в отношении его топологии в структурно сохранившейся мембране. Мы показываем, что этот метод может обеспечить достаточно высокое разрешение для расшифровки моделей распределения белка в просвете органеллы, а также различать разобщенность белка в пределах одной органеллы в непосредственной близости от других немаркированных органелл. Кроме того, cryoAPEX является процедурно простым и поддается клеткам, выращенным в культуре тканей. Это не более технически сложной задачей, чем типичные методы криофиксации и замораживания замены. CryoAPEX широко применим для TEM-анализа любого мембранного белка, который может быть генетически помечен.

Introduction

Биологические исследования часто включают в себя вопросы решения субклеточной локализации белка в клетках и органеллах. Иммунофлуоресцентная микроскопия обеспечивает полезное представление с низким разрешением локализации белка, и последние достижения в области визуализации супер-разрешения толкают границы разрешения для флуоресцентно помеченных белков1,2,3. Тем не менее, электронная микроскопия (EM) остается золотым стандартом для визуализации с высоким разрешением клеточной ультраструктуры, хотя маркировка белков является сложной задачей.

Исторически сложилось так, что некоторые методы EM были использованы для того чтобы причалить вопросам ультраструктурной локализации протеина. Одним из наиболее часто используемых методов является иммуноэлектронная микроскопия (IEM), где антиген-специфические первичные антитела используются для обнаружения белка, представляющих интерес. Сигнал EM генерируется применением вторичных антител, спряженных с электрон-плотными частицами, чаще всего коллоидным золотом4,5. Кроме того, антитела, спряженные с ферментами, такими как переоксидаза редиса (HRP), могут быть использованы для производства электронного плотного осадка6,7,8. Существуют два основных подхода к маркировке IEM, называемые предварительновнедентиями и поствстранительной маркировкой. В предварительном встраивании IEM, антитела вводятся непосредственно в клетки, что требует световой фиксации и промежности клеток9,10,11. Оба шага могут повредить ультраструктуру12,13. Разработка значительно меньших антител, состоящих из фрагмента антитела Fab, спряженого с 1,4 нм наноголдом, позволяет использовать очень нежные условия промеаблизации; однако, nanogold слишком мал для сразу визуализации под TEM и требует дополнительных шагов повышения, чтобы стать видимым14,15,16. В пост-встраиваемом IEM, антитела применяются на тонких участках клеток, которые были полностью обработаны фиксации, обезвоживания и встраивания в мише17. Хотя этот подход позволяет избежать шага permeabilization, сохранение эпитопа интереса на протяжении всего отбора образцов являетсясложной задачей 18,19,20. Метод Токуясу световой фиксации с последующим замораживанием, криосекцией и обнаружением антител обеспечивает улучшенное сохранение эпитопа21,22. Однако технические требования крио-ультрамикротомии, а также неоптимальный контраст, достигнутый в клетке, являются недостатками23.

Использование генетически закодированных тегов устраняет многие трудности IEM, связанные с обнаружением интересуемого белка. Различные теги доступны, в том числе HRP, ферритин, ReAsH, miniSOG, и metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Каждый из них имеет преимущества по сравнению с предыдущими методами, но каждый из них также имеет недостатки предотвращения широкого использования. Эти недостатки варьируются от бездействия HRP в цитозоле до большого размера тега ферритина, светочувствительности ReAsH, а также небольшого размера и отсутствия совместимости с клеточным окрашиванием металлотионеина. Недавно, белок, полученный из аскорбата переоксидаза была разработана как EM тег, названный APEX233,34. Как пероксидаза, APEX2 может катализировать окисление 3,3' диаминобензидин (DAB), производя осадок, который реагирует с тетродов осмия, чтобы обеспечить локальный контраст EM с минимальным диффузии из белка интерес (менее 25 нм)33,35. В отличие от традиционных методов на основе HRP, APEX2 чрезвычайно стабилен и остается активным во всех сотовых отсеках33. Образцы могут быть обработаны для TEM с использованием традиционных EM образца окрашивания и методы, которые позволяют хорошую визуализацию окружающих структур33,34,36. Из-за своего небольшого размера, стабильности и универсальности, APEX2 стал EM-тегс с большим потенциалом.

Многие из рассмотренных выше подходов либо не могут быть, либо еще не объединены с современным состоянием в ультраструктурной консервации, криофиксации и низкотемпературной заморозке-замещении. Таким образом, они страдают от отсутствия сохранения мембраны и/ или окрашивания клеток для определения точной локализации белка. Это обязательно ограничивает разрешение и интерпретацию данных, которые могут быть получены. Криофиксация путем замораживания высокого давления (HPF) включает в себя быструю заморозку образцов в жидком азоте при высоком давлении (2100 бар), что вызывает витрификации, а не кристаллизации водной образцов, тем самым сохраняя клетки в почти родном государстве37,38,39. HPF сопровождается замораживанием замены (FS), низкой температуры (-90 градусов по Цельсию) обезвоживание в ацетоне в сочетании с инкубации с типичными пятнами EM, таких как тетроксид осмия и уранила ацетат. HPF и FS вместе обеспечивают явное преимущество перед традиционной химической фиксацией (более длительный процесс, который может привести к артефактам) и обезвоживанию алкоголя при комнатной температуре или на льду (что может привести к извлечению липидов и сахаров), и, таким образом, желательно сочетать с лучшими МЕТками EM для обнаружения белка.

Одна из причин того, что HPF/FS не был объединен с маркировкой APEX2, заключается в том, что легкая химическая фиксация является необходимым условием реакции пероксидазы, ограничивающей диффузию продукта реакции DAB. В исследованиях APEX2 до сих пор, фиксация и реакция пероксидазы следуют традиционные методы EM для окрашивания и обезвоживания алкоголя33,36. Тем не менее, было показано, что после химической фиксации с HPF / FS обеспечивает явное преимущество в сохранении по сравнению с традиционной химической фиксации и обезвоживания алкоголя только40. Потеря ультраструктурной целостности, наблюдаемая в традиционных образцах TEM, оказывается менее связанной с фиксацией, чем с обезвоживанием, что обычно делается с использованием алкоголя при комнатной температуре или на льду, и может привести к извлечению липидов и сахаров40,41. Для разработки метода криоаПЕКС мы предположили, что химическая фиксация и реакция пероксидазы, за которыми следуют HPF и FS, дадут оптимальный результат с точки зрения ультраструктурной консервации.

Здесь мы представляем протокол криоаПЕКС, который сочетает в себе apEX2 пометки с криофиксированием и замораживание методов замены (Рисунок 1). Этот простой протокол состоит из трансфекции интересуемого белка APEX2, химической фиксации клеток и реакции пероксидазы. Затем HPF и FS выполняются с последующим типичным встраиванием в мелину и тонким сечением. TEM изображений показывает отличное сохранение ультраструктуры с помощью этого метода. Кроме того, наблюдалось субклеточная локализация с высоким разрешением и пространственное распределение эндоплазмического люменного белка (ER). Этот метод широко полезен для обнаружения локализации мембранного белка в клетках для анализа электронной микроскопии. В наших руках метод успешно работал для различных клеточных линий, выращенных в культуре тканей, в том числе HEK-293T (человеческий эмбриональный почки), HeLa (рак шейки матки человека), Cos7 (африканская зеленая обезьяна фибробласт), и BHK (ребенок хомяка почки). Подробные инструкции описаны ниже с помощью heK-293T клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Культура клеток и трансфекция

  1. Семена HEK-293T клетки на 60 мм в диаметре или больше ткани культуры блюдо и расти до 60%-90% слияния в инкубаторе клеточной культуры на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2.
  2. Трансфектные клетки с apEX2-тегами плазмиды выражения млекопитающих с использованием трансфекционного реагента (см. Таблица материалов) в соответствии с указаниями производителя.
  3. При 12-15 ч после трансфекции, мыть клетки один раз с фосфатами буферного солья (PBS). Удалите клетки из тарелки путем мягкой стирки с ПОМОЩЬю PBS. Реагент диссоциации, такой как трипсин, может быть использован при необходимости для данного типа ячейки. Центрифуга при 500 х г в течение 5 мин, чтобы сформировать гранулы.

2. Химическая фиксация и реакция пероксидазы

  1. Тщательно удалите супернатант и resuspend гранулы в 2 мл 2% глютаральдегида (v/v) в 0,1 М натрия какодилат буфер, рН 7,4, при комнатной температуре. Поместите образец на лед и инкубировать в течение 30 мин. Пелле образец при 500 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. С этого момента до шага 2.3.3, держать образец и растворы на льду, и выполнять центрифугирование при 4 градусах Цельсия.
    ВНИМАНИЕ: Как гюмтаралдегид и натрий какодилат буфер (содержащий мышьяк) являются токсичными. Надлежащие процедуры безопасности и средства индивидуальной защиты должны использоваться во время обработки. Растворы, содержащие глутаральдегид и/или буфер какодилата натрия, должны быть утилизированы в качестве опасных химических отходов.
  2. Вымойте гранулы 3x в течение 5 минут с 2 мл 0,1 М буфер акодилат натрия. Для них, а также последующих спусков, осторожно resuspend клетки гранулы в требуемом растворе, затем центрифуга в течение 5 минут при 500 х г и тщательно удалить и отбросить супернатант. Следует соблюдать осторожность с помощью повторяющихся шагов по гранулировке и повторному восстановлению, чтобы свести к минимуму потерю образца.
  3. Провести реакцию пероксидазы
    1. Приготовьте свежий раствор, содержащий 1 мг/мл 3,3'-диаминобензидин тетрагидрохлорид (DAB) в буфере какодилата натрия 0,1 м. Растворите DAB путем энергичного вихря в течение 5-10 мин.
      ВНИМАНИЕ: DAB является токсичным и потенциальным канцерогеном и должен быть обработан с надлежащей процедуры безопасности и средств индивидуальной защиты. Решения, содержащие DAB, следует рассматривать как опасные химические отходы.
    2. Вымойте гранулы, переопрокинув 3 мл раствора DAB, а затем гранулы при 500 х г в течение 5 мин.
    3. Отрежь гранулы в растворе DAB 3 мл, к которому была добавлена перекись водорода, чтобы достичь конечной концентрации 5,88 мМ. Инкубировать в течение 30 минут при температуре номера. Гранулы становятся заметно коричневого цвета, указывающими на наличие нерастворимого продукта реакции DAB.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации DAB может потребоваться оптимизировать для каждого образца. Изменение цвета можно контролировать на световом микроскопе. По нашему опыту, инкубация 15–45 мин является адекватной для большинства белков. Перекись водорода должна быть получена из свежеиспулевой бутылки или той, которая была хорошо запечатана после открытия.
    4. Пеллетклетки, затем мыть 2x в течение 5 минут с 0,1 М натрия какодилат буфер, а затем одна шайба в Dulbecco в модифицированной среде Eagle (DMEM) или клеточного носителя выбора.
  4. Приостановите действие клеточной гранулы в 500 л криозащитного раствора DMEM (или других клеточных носителей выбора), содержащего 10% сыворотки крупного рогатого скота плода и 15% сывороточного сыворотки крупного рогатого скота. Пеллет снова, слегка увеличивая скорость центрифуги от 500 х г, если требуется для достижения гранулы в толстый крио-защиты раствора. Откажитесь от большинства супернатантов, гарантируя, что достаточно жидкости остается так, что гранулы не высохнут. Транспортировать клеточные гранулы к инструменту замораживания высокого давления.

3. Замораживание высокого давления

  1. Заполните резервуар морозильной камеры высокого давления жидким азотом (LN2) и запустите насос, чтобы заполнить образец камеры с LN2.
    ВНИМАНИЕ: Используйте надлежащие процедуры безопасности и средства индивидуальной защиты при работе с жидким азотом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги специфичны для морозильной камеры высокого давления Leica EMPACT2.
  2. Убрать любую оставшуюся жидкость из клеточной гранулы, используя угол лабораторной салфетки или бумажное полотенце. Достаточно жидкости должно оставаться, что гранулы образует пасту похож по консистенции на зубную пасту. Она должна быть достаточно тонкой, чтобы быть аспирированы в 20 л трубчатый наконечник.
  3. Аспир2-3 л клеточных гранул и откладывать его на мембранный переносчик. Заполните колодец мембранного носителя полностью, так что поверхностное натяжение создает небольшой купол на вершине, но жидкость не выливается из колодца. Никаких пузырьков воздуха не должно быть.
  4. Сдвиньте мембранный переносчик в картридж и закрепите. Поместите картридж в машину HPF, которая была подготовлена и загрунтована, и нажмите Начало замораживания.
  5. Проинспектировать температуру по сравнению с графиками времени, чтобы убедиться, что давление достигло 2100 бар и температура достигла -196 градусов по Цельсию в пределах 200 мс, и оба параметра оставались устойчивыми для 600 мс измерения.
  6. Повторите шаги от 3,3 до 3,5 до тех пор, пока не будет использована клеточная гранулы или не будет заморожено необходимое количество образцов.
  7. Ведение картриджи погружены в LN2, удалить каждый мембраны перевозчика из картриджа, место в пластиковой капсуле, и место пластиковой капсулы в крио-флакон полный LN2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь. Крио-флаконы с образцами могут храниться в LN2 dewar в крио-тростях или крио-коробках.

4. Замена заморозки

ВНИМАНИЕ: Используйте надлежащие процедуры безопасности и средства индивидуальной защиты при работе с жидким азотом. Кроме того, многие из химических веществ, используемых в шаге 4 являются токсичными, в том числе дубиновой кислоты, тетроксида осмия, и уранил ацетат. Эти химические вещества должны обрабатываться в соответствии с надлежащими процедурами безопасности и утилизироваться в качестве опасных химических отходов.

  1. Заполните автоматизированный блок замены замораживания с LN2. Доведите температуру до -90 градусов по Цельсию.
  2. Подготовка FS Mix 1 и начать FS.
    1. В химическом капюшоне, подготовить раствор 0,2% дубиновой кислоты (w/v) и 5% DI воды в ацетоне и аликут 1 мл на образец в крио-флаконы. Место в LN2, чтобы заморозить.
    2. Поместите флаконы FS Mix 1 и крио-флаконы, содержащие замороженные клеточные гранулы, в камеру образца fs-подразделения. Перенесите внутреннюю капсулу, содержащую мембранный переносчик из флакона LN2, в соответствующий флакон, содержащий FS Mix 1.
    3. Запустите протокол FS с его первым шагом в 24 ч при -90 градусов по Цельсию. После 24 ч, пауза FS, и мыть образцы 3x в течение 5 мин с ацетоном, который был охлажден до -90 градусов по Цельсию.
  3. Подготовка FS Mix 2 и полный FS
    ВНИМАНИЕ: Тетроксид осмия является высокотоксичным и окисляющим химическим веществом, которое должно обрабатываться только обученными людьми в соответствии с установленными протоколами безопасности. Необходимо соблюдать протоколы хранения и утилизации осмийсодержащих растворов, а также маркировки лабораторных участков, в которых используется тетроксид осмия. Тетроксид осмия должен быть обработан в химическом капюшоне с персональным защитным оборудованием, включая защиту глаз, лабораторное пальто, обеспечивающее полную защиту рук, двойные перчатки Nitrile и дополнительный респиратор.
    1. В химическом капоте, подготовить раствор 1% тетроксида осмия, 0,2% уранила ацетата, и 5% DI воды в ацетоне. Aliquot 1 мл на образец в крио-флаконы и место в LN2 заморозить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фондовые растворы дубиновой кислоты (10% ж/v в ацетоне), тетрокисода осмия (10% w/v в ацетоне) и уранил ацетат (8% w/v в метаноле) могут быть подготовлены и сохранены в крио-флаконах в LN2 dewar для удобства приготовления FS Mixes.
    2. Поместите крио-флаконы с FS Mix 2 в блок FS и перенесите капсулы из третьего ацетона мыть в FS Mix 2 флаконы. Инкубировать в FS Mix 2 для 72 ч при -90 градусах по Цельсию, а затем постепенное потепление до 0 градусов по Цельсию в течение 12-18 ч.
  4. Держите температуру на уровне 0 градусов и промойте 3x в течение 30 минут с предварительно охлажденный ацетон из свежеискрытой бутылки.

5. Проникновение и встраивание в горюшку

ВНИМАНИЕ: используемая здесь мизаня (см. таблицу материалов)является токсичной до полимеризации и должна обрабатываться с помощью надлежащих процедур безопасности и средств индивидуальной защиты. Любая неполимеризованная мизаня должна быть утилизирована в качестве опасных химических отходов.

  1. Проникать в образцы с возрастающей концентрацией мисы, растворенного в ацетоне из недавно открытой бутылки. Приготовьте смесь компонентов из семы A, B и D в пластиковом стакане в соответствии с указаниями производителя и инкубините образцов в следующих концентрациях с мелины: 2%, 4% и 8% для 2 ч каждый при 0 градусах Цельсия. Инкубировать в 15%, 30%, 60%, 90%, и 100% синой по 4 ч каждый при комнатной температуре. Инкубировать 4 ч в смеси компонентов А, В, С и Д.
  2. Поместите мембранные носители с клеточной гранулой вверх в плоские формы встраивания и заполните с помощью миснины (A, B, C и D). Бумажные этикетки для образцов могут быть добавлены в скважины в это время.
  3. Полимеризуйте в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию на 24-36 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен после полимеризации.
  4. Удалите блоки из формы и дайте остыть. Чтобы удалить мембранный переносчик, сначала поместите образец в вертикальный патрон ультрамикротома, где его можно визуализировать с увеличением. Отделить мембранный носитель от блока путем комбинации dabbing жидкого азота на мембранном несущем для того чтобы отделить металл от пластмассы, и использование лезвия бритвы для того чтобы обломоками прочь сеялку с мибраны несущей. При разделении, осторожно отнимите мембранный переносчик, оставив купол клеточной гранулы на лице блока.
  5. Поместите блок с открытой клетки гранулы лицом вверх в плоской встраивающей формы, которая немного глубже, чем первая плесень, и заполнить с помощью мисы. Полимеризуется при 60 градусах по Цельсию при 24-36 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен после полимеризации.

6. Секция

  1. Обрезать блок вокруг клеточной гранулы с помощью лезвия бритвы. Затем поместите блок в образец патрона на секционную руку ультрамикротома. Используя стеклянный или алмазный нож, обрезать блок в трапециевидной формы, тесно окружающих клетки гранулы.
  2. Получить 90 нм ультратонких секций клеточной гранулы с помощью стеклянного или алмазного ножа.
  3. Возьмите ленту разделов на сетке TEM. Формвар покрытием медных слот сетки (1 х 2 мм2 слот) полезны для изображения серийных разделов. Высушите сетку, прогремя край на листе фильтровальной бумаги, и храните в ящике для хранения сетки TEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен после секции.

7. TEM Imaging

  1. Установите сетку на держатель TEM и поместите в микроскоп. Мы регулярно используем Tecnai T12 при 80 кВ для скрининга образцов криоапекса. Приобретайте изображения клеток и субклеточных структур, представляющих интерес с маркировкой APEX2.
  2. При желании получите дополнительный мембранный контраст с помощью свинца после окрашивания. См Рисунок 2 для сравнения не-пост-окрашенных образцов(Рисунок 2I-K) и привести пост-окрашенных образцов(Рисунок 2A-H).
    1. Поплавок сухих сеток раздела вниз на каплю разбавленного раствора хлорида натрия (1,5 мМ), 2x на 1 мин каждый, затем 1x на 10 мин.
    2. Поплавок сетки на капле свинцового раствора Сато в течение 1 мин. Вымойте, плавая на растворе хлорида натрия 3x на 1 мин, затем на DI воды 3x в течение 1 мин. Blot избыток жидкости из сетки и хранить в сетке коробки.
      ВНИМАНИЕ: Свинец является токсичным химическим веществом и должен быть обработан с надлежащей процедуры безопасности и средств индивидуальной защиты. Растворы, содержащие свинец, должны быть утилизированы в качестве опасных химических отходов.
  3. Изображение пост-окрашенных образцов на TEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При традиционной подготовке образца для TEM, ведущий контрастный шаг выполняется до TEM изображения. Тем не менее, рекомендуется, чтобы для cryoAPEX образцов, изображение осуществляется в первую очередь на неконтрастных образцов. Это гарантирует, что сигнал от тега может быть легко расположен его сильный контраст с более слегка окрашенных клеточных структур. Для многих образцов не потребуется никаких дальнейших окрашивания; однако, если пожелает дополнительный контраст мембраны, можно провести послеокирование свинца (Шаг 7.2) и повторно есеобразить образец.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для сравнения ультраструктурной консервации с помощью метода криоаПЕКС с традиционной фиксацией и обезвоживанием мы подготовили образцы, в которых эндоплазмическая мембрана ретикулума (ERM; ER мембраны) пептид был помечен APEX2 и трансфицируется в HEK-293T клеток. ERM-APEX2 локализуется к цитоплазматической стороне ER и переделывает структуру ER в морфологически различные структуры, известные как организованные гладкие ER (OSER)34,42,43. Морфология OSER включает в себя области гладких, параллельных, плотно сложенных мембран, которые служат оптимальной областью для сравнения ультраструктурной консервации. Подготовка образца традиционными методами APEX привела к четкой маркировке структур OSER(рисунок 2A-D). При осмотре при высоком увеличении, сложенные мембраны появились взъерошенные и неравномерные зазоры присутствовали между плотностью концентрической мембраны, что указывает на плохую консервацию мембраны и липидную экстракции(рисунок 2D). В выборке, подготовленной криоАПЕКС, также была четко определена маркировка структур OSER; однако, мембраны были гладкими и параллельными, и практически не было липидной экстракции было видно(Рисунок 2E-H). Результаты криоаПЕКС были аналогичного высокого качества сохранения тех, которые получены из образца, который прошел HPF / FS без дополнительной химической фиксации и APEX2/DAB реакции шаги (Рисунок 2I-K).

В дополнение к визуально заметной сохранения мембраны, метод криоаПЕКС сохраняет интересуя белок таким образом, что аспекты структуры распределения белка могут наблюдаться в некоторых случаях. Чтобы проиллюстрировать этот момент, мы использовали другой ER-локализованный белок, охотничий дрожжи взаимодействующих белков E (HYPE). HYPE представляет собой мембранный белок, расположенный на светило стороне мембраны ER 44,45,46,47. Конструкции HYPE-APEX2 были переэкспрессированы в ячейках HEK-293T. TEM анализ 90 нм тонких секций показали, что HYPE присутствовал на всей периферической ER, а также ядерного конверта (Рисунок 3A,B). Кроме того, плотность HYPE удалось решить в регулярно расположенных очагов вдоль луменальной мембраны ER(Рисунок 3C, стрелки). Распределение и очаги HYPE были также видны в образце, подготовленном с традиционной фиксацией и обезвоживанием; однако, обширные нарушения мембраны и экстракции присутствовали, что делает образец неоптимальным(Рисунок 3D,E).

Чтобы продемонстрировать надежную органелларную специфичность и применимость метода криоаПЕКС для целого ряда помеченных белков, мы выполнили маркировку APEX2 с использованием трех клеточных маркеров. Митохондрии были помечены с использованием мито-V5-APEX234. Этот маркер митохондриальной матрицы при условии, конкретные окрашивания митохондрий только(Рисунок 4A). Аналогичным образом, мы оценили плазменной мембраны маркировки с помощью CAAX-APEX234, который производится различные окрашивания плазменной мембраны только(Рисунок 4C). В внутриклеточных органеллах маркировки не наблюдалось(рисунок 4С). Кроме того, мы создали новую конструкцию в качестве маркера для проема Golgi путем сплавляя первые 118 аминокислот изоформы мыши из маннозидазе с геном APEX248. Полученный в результате Манни-APEX2 был временно трансфицирован в клетки, которые впоследствии были подготовлены методом криоаПЕКС. Запятнанные стеки Golgi были четко различимы от окружающих органелл(рисунок 4B). Индивидуальные стеки, цистерны, и некоторые пузырьки были помечены, типичные Golgi окрашивания(рисунок 4B). В целом, эти маркеры показывают, что метод cryoAPEX обеспечивает специфическую маркировку мембранных белков в различных органеллах с достаточно высоким разрешением, чтобы отличить их от окружающих субклеточных структур.

Figure 1
Рисунок 1: Схема основных шагов в протоколе CryoAPEX. (A) Клетки выращиваются и трансфицируются плазмид apEX2. (B) Клетки гранулируются и фиксируются с глютаральдегидом, а затем (C) инкубации с DAB и перекисью водорода для производства продукта реакции перекиси. (D) Гранулы криофиксируется HPF, (E) заморозить заменить тяжелыми металлами и ацетоном, и (F) встроенных в мисинке. Тонкие секции собираются на микротоме. (G) TEM изображения выполняется и дополнительный контраст может быть добавлен после окрашивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Сравнение сохранения мембран OSER с использованием традиционной химической фиксации, криоаПЕКС и HPF/FS. Реорганизованная морфология ER в химически фиксированной, DAB отреагировали ERM-APEX2-выражения клеток, которые были обработаны с помощью традиционной химической фиксации и обезвоживания алкоголя (A-D) или криоаПЕКС (E-H) был по сравнению с ERM-APEX2 выражая клетки, которые были криофиксированные жить и без реакции DAB (I-K). Криофиксированные клетки представляют собой наилучшую достижимую ультраструктурную консервацию и служат здесь в качестве метрики для оценки сохранения мембраны, полученных с помощью двух протоколов обнаружения на основе APEX(A-H). Равномерно-расставленные параллельные укладки ламеллярных мембран ER, полученных криоаПЕКС (примером для панелей G и H),в отличие от взъерошенных мембран, полученных традиционными методами (панели C и D), подчеркивает превосходную консервацию мембраны, полученную криоаПЕКС. Эта цифра была изменена с Sengupta et al. 201948. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Локализация белка мембранного белка APEX2 с тегами ER может быть решена в периодические очаги. (A) Изображение тонкой части клетки HEK-293T, выражающей HYPE-APEX2 и обработанной криоапексом, показывает окрашивание ER в хорошо сохранившемся (плотном) цитоплазмамном фоне (B,C). Более высокое увеличение изображения небольшой части периферийного ER (демаркированный желтой коробкой в A и показано в B, с дальнейшим увеличением красной коробки в Bпоказано в C ) экспонаты периодические очаги APEX2 генерируемых плотности(B, красный ящик и C, белые наконечники стрел, показывающие периодичность между hype foci). (D) Изображение тонкой части клетки, выражающей HYPE-APEX2 и подготовленной традиционной химической фиксацией и обезвоживанием, показывает специфическое окрашивание корковой ER и ядерной оболочки (красные стрелки). (E) При более высоком увеличении, периодические HYPE-специфических очагов были очевидны в пределах участков ER (желтый ящик и белые головки стрелки в вставке), несмотря на обширные нарушения мембраны, указанные красными стрелками. NE и ядерный конверт. Эта цифра была изменена с Sengupta et al. 201948. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Маркеры Органеллы показывают специфику сигнала, полученного из белков с маркировкой APEX2. Конструкции белка с тегами APEX2, предназначенные для локализации митохондриальной матрицы (mito-V5-APEX2; показаны в A),или люмене Golgi (a-mannII-APEX2; показаны в B),или плазменной мембране (CAAX-APEX2; показано в C)были преходяще выражены в клетках HEK293 и обработанных криоаПЕКС. Каждая конструкция давала органеллы специфические плотности. Показаны увеличенные виды двух секций (желтые или красные ящики) из ячеек, выражающих q-mannIIAPEX2 (панель B)или CAAX-APEX2 (панель C). Эта цифра была изменена с Sengupta et al. 201948. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Представленный здесь протокол криоаПЕКС обеспечивает надежный метод для характеристики локализации мембранных белков в клеточной среде. Мало того, что использование генетически закодированного тега APEX2 обеспечивает точную локализацию интересующего белка, но и использование криофиксации и низкотемпературного обезвоживания обеспечивает отличную консервацию и окрашивание окружающей клеточной ультраструктуры. В совокупности эти подходы являются мощным инструментом для локализации белка с высокой точностью в его субклеточном контексте.

Суть продвижения этого метода является тот факт, что потеря ультраструктуры опытных после подготовки традиционными методами TEM происходит в первую очередь от обезвоживания шаг, а не фиксации шаг40. Ранее считалось, что методы на основе пероксидазы несовместимы с HPF/FS, поскольку они требуют химической фиксации до реакции пероксидазы. Для работы над этим недавно был разработан протокол под названием CryoCHEM, в котором образцы сначала криофиксируются, а затем регидратации и реакции пероксидазы49. Такой подход обеспечивает отличную целевую локализацию со значительными улучшениями в окрашивании и сохранении образцов. Было показано, что полезно для образцов тканей и в тех случаях, когда коррелятивная флуоресценция и электронная микроскопия желательно. Параллельно с криочем, наш метод сочетает в себе гюмтаральдегидную фиксацию с HPF и FS. CryoAPEX предлагает обтекаемый протокол, который эффективно работает даже для небольших клеточных образцов.

Доступ к инструментам замораживания и замораживания высокого давления имеет решающее значение для метода криоаПЕКС. Эти инструменты и навыки все чаще встречаются в EM-объектах. Даже если оборудование HPF и FS не доступны, химически фиксированный образец достаточно стабилен в течение короткого периода времени, чтобы транспортироваться на скромные расстояния40. Мы обнаружили, что образцы могут храниться после реакции DAB при 4 градусах по Цельсию в течение по крайней мере 48 часов до HPF без значительной потери качества. Другим важным аспектом протокола криоаПЕКС является включение элементов управления, которые необходимы для надежного эксперимента и убедительных результатов. Образцы, подготовленные переходной преображаемый с эффективностью менее 100% будет содержать отрицательные контрольные клетки, а также помеченные клетки в том же образце. При использовании клеточных линий со стабильным выражением APEX2, отдельный отрицательный контроль должен быть подготовлен путем трансфекции клеток с не-APEX2 помечены белка интереса. Несколько конструкций, которые могут служить в качестве органеллара управления доступны через Addgene, и опубликованные изображения доступны в этой и других публикациях, которые могут быть использованы для проверки33,34,36,48. Углубленное обсуждение экспериментального проектирования и проверки новых конструкций синтеза APEX2 было предоставлено Martell et al.36

Хотя криоаПЕКС в целом полезен для обнаружения мембранных белков, существуют некоторые ограничения. Хотя APEX2 является небольшой 28 kDa белка, некоторые белки не могут быть в состоянии включить тег33,34. APEX2 не считается полезным для маркировки растворимых белков в цитозоле, из-за диффузного реакции продукта33,36. Кроме того, обнаружение небольших количеств белка создает проблемы из-за присутствия окрашивания в окружающих клетках. Препарат HPF и FS сохраняет клеточные компоненты, которые извлекаются при традиционной фиксации и обезвоживании. Это приводит к общему темнее окрашивания в клетку, потенциально конкурирующих с низким уровнем маркировки APEX2.

Техника cryoAPEX широко применима ко многим белкам, с ограниченным числом шагов, которые могут потребовать оптимизации. Во-первых, из-за индивидуальной изменчивости белков, уровень экспрессии белка и/или время реакции DAB, возможно, необходимо отрегулировать для того, чтобы сигнал был визуализирован над фоновым окрашиванием клетки. Полезная информация и протоколы для проверки новых конструкций синтеза APEX2 и оптимизации экспрессии и DAB окрашивания предоставляются Martell et al.36 С точки зрения клеточного окрашивания, протокол FS и/или химические вещества, возможно, потребуется настроить для оптимальной визуализации различных органелловых мембран, в различных типах клеток, тканях или организмах50,52,53. По нашему опыту, условия FS, представленные здесь, хорошо работали для различных клеточных линий млекопитающих.

Гибридный подход криоаПЕКС имеет потенциал, который будет применяться ко многим другим методам генетической маркировки. Замена традиционного обезвоживания алкоголя на HPF/FS, как ожидается, значительно улучшит ультраструктурную консервацию и информацию о локализации белка. Использование сапфировых дисков в качестве клеточного субстрата для фиксации клеток в качестве монослойа улучшает сохранение клеточной периферии, включая цитоскелет и контакты клеток. Для использования сапфировых дисков потребуются незначительные изменения в протоколе. Технология APEX может быть использована для обнаружения зеленого флуоресцентного белка (GFP) помеченных белков с помощью Пептида35,связывающего GFP. Этот косвенный метод обнаружения открывает потенциал для использования технологии APEX для множества белков, уже помеченных GFP. Недавно введенный раскол APEX2 будет выгоднее для исследований близости и взаимодействия55. Кроме того, существующие методы на основе HRP могут быть объединены с HPF/FS для улучшения сотовой консервации. Одним из примеров является fluorescent indicator и peroxidase для реципации с EM resolution (FLIPPER), в котором отдельные маркеры клеток были слиты как с флуоресцентной меткой, так и с HRP, обеспечивая луменальные маркеры для Golgi или ER56. Использование улучшенных субстратов пероксидазы вместо DAB также возможно с помощью этого метода, в том числе субстратов, которые оптимизированы для РНК маркировки 57. CryoAPEX также обеспечивает в-клеточной маркировки и ультраструктурной сохранения, необходимых для трехмерного анализа распределения белка с помощью электронной томографии, и, возможно, в больших объемах через SBF-SEM или FIB-SEM48,58.

В целом, CryoAPEX является надежным методом с широким применимостью. В принципе, его можно применять к любому мембранному белку, будь то в люменальном пространстве органеллы, на цитоплазмамическое лицо, в пузырьки, на плазменной мембране клетки или даже в внеклеточном пространстве. Для этого огромного спектра мембранных белков, метод cryoAPEX обеспечивает потенциал, чтобы увидеть локализацию и распределение белка с точностью в его субклеточном контексте.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Acknowledgments

Описанный здесь протокол вытекает из публикации Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Эта работа поддерживается грантами R01GM10092 (для S.M.) и AI081077 (R.V.S.) от Национальных институтов здравоохранения, CTSI-106564 (до S.M.) от Института клинических и трансляционных наук Индианы, и PI4D-209263 (до S.M.) от Института клинического и клинического заболевания.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate Sigma-Aldrich D5637-1G
Acetone (Glass Distilled) Electron Microscopy Sciences 10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc Electron Microscopy Sciences 60952
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL VWR 82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin Sigma-Aldrich 44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 Sigma-Aldrich 44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) Sigma-Aldrich 44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D Sigma-Aldrich 44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm Electron Microscopy Sciences 70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm Electron Microscopy Sciences 70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement Corning 355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm Electron Microscopy Sciences 71008
Glass Knifemaker Leica Microsystems EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16120
HEK 293 Cells ATCC CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System Leica Microsystems EM PACT2 Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution Fisher Scientific 50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm Mager Scientific 16707898
Osmium Tetroxide, crystalline Electron Microscopy Sciences 19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade VWR 97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm Mager Scientific 16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film Electron Microscopy Sciences FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) Avantor Macron Fine Chemicals 7708-10
Tannic Acid Electron Microscopy Sciences 21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm VWR 25382-166
Ultra Glass Knife Strips Electron Microscopy Sciences 71012
Ultramicrotome Leica Microsystems EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate Electron Microscopy Sciences 22400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  2. Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies. Trends in Cell Biology. 25, 730-748 (2015).
  3. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6, 022003 (2018).
  4. De Mey, J., Moeremans, M., Geuens, G., Nuydens, R., De Brabander, M. High resolution light and electron microscopic localization of tubulin with the IGS (Immuno Gold Staining) method. Cell Biology International Reports. 5, 889-899 (1981).
  5. Faulk, W., Taylor, G. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Brown, W. J., Constantinescu, E., Farquhar, M. G. Redistribution of Mannose-6-Phosphate Receptors Induced by Tunicamycin and Chloroquine. The Journal of Cell Biology. 99, 320-326 (1984).
  7. Brown, W. J., Farquhar, M. G. The Mannose-6-phosphate Enzymes Is Concentrated Receptor for Lysosomal in Cis Golgi Cisternae. Cell. 36, 295-307 (1984).
  8. Sternberger, L. A., Hardy, P. H., Cuculis, J. J., Meyer, H. G. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 18, 315-333 (1970).
  9. Oliver, C. Pre-embedding Labeling Methods. Immunocytochemical Methods and Protocols. Oliver, C., Jamur, M. C. 588, Humana Press. 381-386 (2010).
  10. Polishchuk, E. V., Polishchuk, R. S. Pre-embedding labeling for subcellular detection of molecules with electron microscopy. Tissue and Cell. 57, 103-110 (2019).
  11. Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Luini, A. Visualizing Live Dynamics and Ultrastructure of Intracellular Organelles with Preembedding Correlative Light-Electron Microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy. Mueller-Reichert, T., Verkade, P. 111, Elsevier. 21-35 (2012).
  12. Humbel, B. M., De Jong, M. D. M., Müller, W. H., Verkleij, A. J. Pre-embedding immunolabeling for electron microscopy: An evaluation of permeabilization methods and markers. Microscopy Research and Technique. 42, 43-58 (1998).
  13. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9, 152-158 (2012).
  14. Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New Frontiers in Gold Labeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 471-480 (2000).
  15. Hainfeld, J. F., Furuya, F. R. A 1.4-nm Gold Cluster Covalently Attached to Antibodies Improves Immunolabeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40, 177-184 (1992).
  16. Baschong, W., Stierhof, Y. Preparation, Use, and Enlargement of Ultrasmall Gold Particles in Immunoelectron Microscopy. Microscopy Research and Technique. 42, 66-79 (1998).
  17. Roth, J., Bendayan, M., Orci, L. Ultrastructural loclaization of intracellular antigens by the use of Protein A-gold complex. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 26, 1074-1081 (1978).
  18. Armbruster, B. L., et al. Specimen preparation for electron microscopy using low temperature embedding resins. Journal of Microscopy. 126, 77-85 (1982).
  19. Fowler, C. B., Leary, T. J. O., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Laboratory Investigation. 88, 785-791 (2008).
  20. Newman, G. R., Hobot, J. A. Modern Acrylics for Post-embedding Immunostaining Techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35, 971-981 (1987).
  21. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. The Journal of Cell Biology. 57, 551-565 (1973).
  22. Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143, 139-149 (1986).
  23. Möbius, W., Posthuma, G. Sugar and ice Immunoelectron microscopy using cryosections according to the Tokuyasu method. Tissue and Cell. 57, 90-102 (2019).
  24. Gaietta, G., et al. Multicolor and Electron Microscopic Imaging of Connexin Trafficking. Science. 296, 503-508 (2002).
  25. Uttamapinant, C., et al. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 10914-10919 (2010).
  26. Porstmann, B., Porstmann, T., Nugel, E., Evers, U. Which of the Commonly Used Marker Enzymes Gives the Best Results in Colorimetric and Fluorimetric Enzyme Immunoassays: Horseradish Peroxidase, Alkaline Phosphatase or Beta-Galactosidase. Journal of Immunological Methods. 79, 27-37 (1985).
  27. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biology. 9, 1001041 (2011).
  28. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160, 70-82 (2007).
  29. Wang, Q., Mercogliano, C. P., Löwe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19, 147-154 (2011).
  30. Risco, C., et al. Specific, sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20, 759-766 (2012).
  31. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. E. Chimeric Molecules Employing Horseradish Peroxidase as Reporter Enzyme for Protein Localization in the Electron Microscope. Methods in Enzymology. Thorner, J., Emr, S. D., Abelson, J. N. 327, 35-45 (2000).
  32. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetrcysteine-tagged proteins in intact cells. Nature Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  33. Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30, 1143-1150 (2012).
  34. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12, (2015).
  35. Ariotti, N., et al. Modular Detection of GFP-Labeled Proteins for Rapid Screening by Electron Microscopy in Cells and Organisms. Developmental Cell. 35, 513-525 (2015).
  36. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12, 1792-1816 (2017).
  37. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130, 877-889 (2008).
  38. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure Freezing for the Preservation of Biological Structure: Theory and Practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  39. McDonald, K. L. High-Pressure Freezing for Preservation of High Resolution Fine Structure and Antigenicity for Immunolabeling. Electron Microscopy Methods and Protocols. Hajibagheri, N. 117, Humana Press. 77-97 (1999).
  40. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  41. Korn, E. D., Weisman, R. A. Loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 116, 309-316 (1966).
  42. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. Journal of Cell Biology. 163, 257-269 (2003).
  43. Sandig, G., et al. Regulation of endoplasmic reticulum biogenesis in response to cytochrome P450 overproduction. Drug Metabolism Reviews. 31, 393-410 (1999).
  44. Faber, P. W., et al. Huntingtin interacts with a family of WW domain proteins. Human Molecular Genetics. 7, 1463-1474 (1998).
  45. Worby, C. A., et al. Article The Fic Domain Regulation of Cell Signaling by Adenylylation. Molecular Cell. 34, 93-103 (2009).
  46. Sanyal, A., et al. A Novel Link between Fic (Filamentation Induced by cAMP) - mediated Adenylylation / AMPylation and the Unfolded Protein Response. The Journal of Biological Chemistry. 290, 8482-8499 (2015).
  47. Mattoo, S., et al. Comparative Analysis of Histophilus somni Immunoglobulin-binding Protein A (IbpA) with Other Fic Domain-containing Enzymes Reveals Differences in Substrate and Nucleotide Specificities. The Journal of Biological Chemistry. 286, 32834-32842 (2011).
  48. Sengupta, R., Poderycki, M. J., Mattoo, S. CryoAPEX - an electron tomography tool for subcellular localization of membrane proteins. Journal of Cell Science. 132, 222315 (2019).
  49. Tsang, T. K., et al. High-quality ultrastructural preservation using cryofixation for 3D electron microscopy of genetically labeled tissues. eLife. 7, 1-23 (2018).
  50. Giddings, T. H. Freeze-substitution protocols for improved visualization of membranes in high-pressure frozen samples. Journal of Microscopy. 212, 53-61 (2003).
  51. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  52. McDonald, K. Cryopreparation methods for electron microscopy of selected model systems. Methods in Cell Biology. 79, 23-56 (2007).
  53. Buser, C., Walther, P. Freeze-substitution: the addition of water to polar solvents enhances the retention of structure and acts at temperatures around -60 degrees C. Journal of Microscopy. 230, 268-277 (2008).
  54. Jiménez, N., et al. Tannic acid-mediated osmium impregnation after freeze-substitution A strategy to enhance membrane contrast for electron tomography. Journal of Structural Biology. 166, 103-106 (2009).
  55. Han, Y., et al. Directed Evolution of Split APEX2 Peroxidase. ACS chemical biology. 14, 619-635 (2019).
  56. Kuipers, J., Van Ham, T. J., Kalicharan, R. D., Schnell, U., Giepmans, B. N. G. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Research. 360, 61-70 (2015).
  57. Zhou, Y., et al. Expanding APEX2 Substrates for Spatial-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins in Living Cells. Angewandte Chemie. , International ed. in English (2019).
  58. Joesch, M., et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy. eLife. 5, 1-13 (2016).

Tags

Биология Выпуск 156 CryoAPEX мембранный белок APEX2 электронная микроскопия передачи криофиксация замораживание высокого давления замена замораживания
Метод CryoAPEX для анализа электронной микроскопии мембранного белка в ультраструктурно-заповедных клетках
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin,… More

Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin, R. V., Mattoo, S. The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells. J. Vis. Exp. (156), e60677, doi:10.3791/60677 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter