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Méthode CryoAPEX pour l’analyse de la microscopie électronique de la localisation des protéines membranaires dans les cellules ultrastructuralement conservées

Published: February 27, 2020 doi: 10.3791/60677
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5,6
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 3Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University, 4Bindley Biosciences Center, Purdue University, 5Purdue Institute of Integrative Neuroscience, Purdue University, 6Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

Summary

Ce protocole décrit la méthode cryoAPEX, dans laquelle une protéine de membrane APEX2-étiquetée peut être localisée par microscopie électronique de transmission dans l’ultrastructure optimale-préservée de cellules.

Abstract

Les événements cellulaires clés comme la transduction du signal et le trafic de membranes dépendent d’un emplacement approprié des protéines dans les compartiments cellulaires. Comprendre la localisation sous-cellulaire précise des protéines est donc important pour répondre à de nombreuses questions biologiques. La recherche d’un label robuste pour identifier la localisation des protéines combinée à une conservation cellulaire adéquate et la coloration a été historiquement difficile. Les progrès récents de la microscopie électronique (EM) ont mené au développement de nombreuses méthodes et stratégies visant à accroître la préservation cellulaire et les protéines cibles d’étiquettes. ApEX2, une étiquette génétique relativement nouvelle à base de peroxidase, est un chef de file prometteur dans le domaine des étiquettes actives em.- cloables. La préparation de l’échantillon pour la microscopie électronique de transmission (TEM) a également progressé ces dernières années avec l’avènement de la cryofixation par congélation à haute pression (HPF) et la déshydratation à basse température et la coloration par substitution par congélation (FS). HPF et FS fournissent une excellente conservation de l’ultrastructure cellulaire pour l’imagerie TEM, en second lieu seulement à la cryo-imagerie directe des échantillons vitreux. Ici, nous présentons un protocole pour la méthode cryoAPEX, qui combine l’utilisation de l’étiquette APEX2 avec HPF et FS. Dans ce protocole, une protéine d’intérêt est étiquetée avec APEX2, suivie de la fixation chimique et de la réaction de peroxidase. Au lieu de la coloration traditionnelle et de la déshydratation de l’alcool à température ambiante, l’échantillon est cryofixe et subit une déshydratation et une coloration à basse température via FS. À l’aide de cryoAPEX, non seulement une protéine d’intérêt peut être identifiée dans les compartiments subcellulaires, mais aussi des informations supplémentaires peuvent être résolues en ce qui concerne sa topologie au sein d’une membrane structurellement préservée. Nous montrons que cette méthode peut fournir une résolution assez élevée pour déchiffrer les modèles de distribution de protéines dans un lumen organelle, et pour distinguer la compartimentation d’une protéine dans un organite à proximité d’autres organelles non étiquetées. En outre, cryoAPEX est procéduralement simple et favorable aux cellules cultivées dans la culture de tissu. Il n’est pas plus difficile techniquement que les méthodes typiques de cryofixation et de substitution de gel. CryoAPEX est largement applicable pour l’analyse TEM de toute protéine membranaire qui peut être génétiquement étiquetée.

Introduction

Les études biologiques incluent souvent des questions de résolution de la localisation subcellulaire des protéines dans les cellules et les organites. La microscopie d’immunofluorescence fournit une vue utile à basse résolution de la localisation des protéines, et les progrès récents dans l’imagerie de super-résolution repoussent les limites de la résolution pour les protéines fluorescentes étiquetées1,2,3. Cependant, la microscopie électronique (EM) demeure l’étalon-or de l’imagerie de l’ultrastructure cellulaire à haute résolution, bien que l’étiquetage des protéines soit un défi.

Historiquement, plusieurs méthodes EM ont été utilisées pour aborder les questions de localisation des protéines ultrastructurales. L’une des méthodes les plus couramment utilisées est la microscopie immunoélectronique (IEM), où des anticorps primaires spécifiques à l’antigène sont utilisés pour détecter la protéine d’intérêt. Le signal EM est généré par l’application d’anticorps secondaires conjugués à des particules denses en électrons, le plus souvent l’or colloïdal4,5. Alternativement, les anticorps conjugués avec des enzymes telles que le radis de cheval peroxidase (HRP) peuvent être utilisés pour produire un précipité dense en électrons6,7,8. Deux approches principales existent pour l’IEM, appelée étiquetage pré-embedding et post-encastrage. Dans la pré-intégration IEM, les anticorps sont introduits directement dans les cellules, ce qui nécessite la fixation de la lumière et la perméabilisation des cellules9,10,11. Les deux étapes peuvent endommager l’ultrastructure12,13. Le développement d’anticorps significativement plus petits constitués d’un fragment d’anticorps Fab conjugué à 1,4 nm de nanogold permet d’utiliser des conditions de perméabilisation très douces; cependant, le nanogold est trop petit pour la visualisation directe sous TEM et nécessite des étapes supplémentaires d’amélioration pour devenir visible14,15,16. Dans l’IEM post-incorporation, les anticorps sont appliqués sur les sections minces des cellules qui ont été entièrement traitées par fixation, déshydratation, et l’intégration dans la résine17. Bien que cette approche évite l’étape de perméabilisation, la préservation de l’épitope d’intérêt tout au long de la préparation de l’échantillon est difficile18,19,20. La méthode Tokuyasu de fixation de la lumière suivie de la congélation, cryo-sectionnement, et la détection d’anticorps fournit la conservation améliorée d’épitope21,22. Cependant, les exigences techniques de la cryo-ultramicrotomie, ainsi que le contraste sous-optimal atteint dans la cellule, sont des inconvénients23.

L’utilisation d’étiquettes génétiquement codées élimine bon nombre des difficultés de l’IEM liées à la détection de la protéine d’intérêt. Une variété d’étiquettes sont disponibles, y compris HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG, et metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Chacun e de ces avantages présente des avantages par rapport aux méthodes précédentes, mais chacune présente également des inconvénients empêchant une utilisation généralisée. Ces inconvénients vont de l’inactivité de HRP dans le cytosol à la grande taille de l’étiquette de ferritine, sensibilité à la lumière de ReAsH, et petite taille et le manque de compatibilité avec la coloration cellulaire de la métallothionein. Récemment, une protéine dérivée de l’ascorbate peroxidase a été conçue comme une étiquette EM, nommée APEX233,34. En peroxidase, APEX2 peut catalyser l’oxydation de 3,3' diaminobenzidine (DAB), produisant un précipité qui réagit avec du tétroxide d’osmium pour fournir un contraste local EM avec une diffusion minimale de la protéine d’intérêt (moins de 25 nm)33,35. Contrairement aux méthodes traditionnelles basées sur HRP, APEX2 est extrêmement stable et reste actif dans tous les compartiments cellulaires33. Les échantillons peuvent être traités pour TEM à l’aide de la coloration traditionnelle de l’échantillon EM et des méthodes qui permettent une bonne visualisation des structures environnantes33,34,36. En raison de sa petite taille, sa stabilité et sa polyvalence, APEX2 est devenu une étiquette EM à fort potentiel.

Bon nombre des approches mentionnées ci-dessus ne peuvent pas ou n’ont pas encore été combinées à l’état actuel de l’art en matière de préservation ultrastructurale, de cryofixation et de substitution par le gel à basse température. Ainsi, ils souffrent d’un manque de conservation de la membrane et / ou de coloration cellulaire pour déterminer la localisation précise des protéines. Cela limite nécessairement la résolution et l’interprétation des données qui peuvent être obtenues. La cryofixation par congélation à haute pression (HPF) implique une congélation rapide d’échantillons dans l’azote liquide à haute pression (2 100 barres), ce qui provoque la vitrification plutôt que la cristallisation des échantillons aqueux, préservant ainsi les cellules dans un état quasi-indigène37,38,39. Le HPF est suivi d’une substitution par gel (FS), d’une déshydratation à basse température (-90 oC) en acétone combinée à l’incubation avec des taches EM typiques telles que le tétroxide d’osmium et l’acétate uranyl. HPF et FS fournissent ensemble un avantage distinct sur la fixation chimique traditionnelle (un processus plus long qui peut conduire à des artefacts) et la déshydratation de l’alcool à température ambiante ou sur la glace (qui peut conduire à l’extraction des lipides et des sucres), et sont donc souhaitables de combiner avec les meilleures étiquettes EM pour la détection des protéines.

Une des raisons pour lesquelles HPF/FS n’a pas été combiné avec l’étiquetage APEX2 est que la fixation chimique légère est une condition préalable à la réaction de peroxidase, limitant la diffusion du produit de réaction de DAB. Dans les études APEX2 jusqu’à présent, la fixation et la réaction peroxidase sont suivies par les méthodes traditionnelles EM pour la coloration et la déshydratation de l’alcool33,36. Cependant, il a été démontré que la suite de fixation chimique avec HPF / FS fournit un avantage distinct dans la préservation par rapport à la fixation chimique traditionnelle et la déshydratation de l’alcool seul40. La perte d’intégrité ultrastructurale observée dans les échantillons traditionnels de TEM semble moins liée à la fixation qu’à la déshydratation, qui se fait généralement en utilisant de l’alcool à température ambiante ou sur la glace, et peut conduire à l’extraction des lipides et des sucres40,41. Pour développer la méthode cryoAPEX, nous avons émis l’hypothèse que la fixation chimique et la réaction de peroxidase, suivies par HPF et FS, produiraient un résultat optimal en termes de préservation ultrastructurale.

Ici, nous présentons le protocole cryoAPEX, qui combine apEX2 marquage avec des méthodes de cryofixation et de substitution de gel (Figure 1). Ce protocole simple se compose de la transfection d’une protéine APEX2-étiquetée d’intérêt, de fixation chimique des cellules, et de la réaction de peroxidase. HPF et FS sont ensuite effectués suivis de l’encastrage typique de résine et de la section mince. L’imagerie TEM révèle une excellente préservation de l’ultrastructure à l’aide de cette méthode. En outre, la localisation subcellulaire à haute résolution et la distribution spatiale d’une protéine lumenal de réticulum endoplasmique (ER) ont été observées. Cette méthode est largement utile pour la détection de la localisation des protéines membranaires dans les cellules pour l’analyse de la microscopie électronique. Dans nos mains, la méthode a fonctionné avec succès pour une variété de lignées cellulaires cultivées dans la culture tissulaire, y compris HEK-293T (rein embryonnaire humain), HeLa (cancer du col de l’utérus humain), Cos7 (fibroblaste de rein de singe vert africain), et BHK (rein de hamster bébé). Des instructions détaillées sont décrites ci-dessous à l’aide de cellules HEK-293T.

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Protocol

1. Culture cellulaire et transfection

  1. Seed HEK-293T cellules sur un 60 mm de diamètre ou plus grand plat de culture tissulaire et de croître à 60%-90% confluence dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC et 5% CO2.
  2. Cellules transfect avec plasmides d’expression de mammifères APEX2-marqués utilisant le réactif de transfection (voir tableau des matériaux) selon les directives du fabricant.
  3. À 12 à 15 heures après la transfection, laver les cellules une fois avec du phosphate tamponné saline (PBS). Retirer les cellules du plat par lavage doux avec PBS. Un réactif de dissociation tel que la trypsine peut être utilisé si nécessaire pour un type de cellule donné. Centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min pour former uneboulette.

2. Fixation chimique et réaction de peroxidase

  1. Retirez soigneusement le supernatant et suspendez la pastille dans 2 ml de glutaraldéhyde de 2 % (v/v) dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M, pH 7,4, à température ambiante. Placer l’échantillon sur la glace et incuber pendant 30 min. Pelleter l’échantillon à 500 x g pendant 5 min à 4 oC. À partir de ce moment jusqu’à l’étape 2.3.3, gardez l’échantillon et les solutions sur la glace, et effectuez la centrifugation à 4 oC.
    CAUTION : Le glutaraldéhyde et le tampon de cacodylate de sodium (contenant de l’arsenic) sont toxiques. Des procédures de sécurité appropriées et un équipement de protection individuelle doivent être utilisés pendant la manipulation. Les solutions contenant du glutaraldéhyde et/ou de la mémoire tampon de cacodylate de sodium doivent être éliminées en tant que déchets chimiques dangereux.
  2. Laver la pastille 3x pendant 5 min avec 2 ml de tampon cacodylate de 0,1 M de sodium. Pour ceux-ci ainsi que les lavages suivants, resuspendre doucement la pastille cellulaire dans la solution requise, puis centrifugeuse pendant 5 min à 500 x g et retirer soigneusement et jeter le supernatant. Il faut faire attention aux étapes répétées de granulation et de suspension, afin de minimiser la perte d’échantillon.
  3. Effectuer la réaction peroxidase
    1. Préparer une solution fraîche contenant 1 mg/mL de tétrahydrochlorure de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M. Dissoudre le DAB par un tourbillon vigoureux pendant 5 à 10 min.
      CAUTION: DAB est toxique et un cancérogène potentiel et doit être manipulé avec des procédures de sécurité appropriées et de l’équipement de protection individuelle. Les solutions contenant du DAB doivent être traitées comme des déchets chimiques dangereux.
    2. Laver les granulés en les rependants dans 3 ml de solution DAB suivie d’un granule à 500 x g pendant 5 min.
    3. Resuspendre le granule dans une solution DAB de 3 ml à laquelle le peroxyde d’hydrogène a été ajouté pour atteindre une concentration finale de 5,88 mM. Incuber pendant 30 min à l’température ambiante. La pastille devient visiblement de couleur brune indiquant la présence du produit de réaction DAB insoluble.
      REMARQUE : Le temps d’incubation du DAB peut devoir être optimisé pour chaque échantillon. Le changement de couleur peut être surveillé sur le microscope léger. D’après notre expérience, une incubation de 15 à 45 min est suffisante pour la plupart des protéines. Le peroxyde d’hydrogène doit être obtenu à partir d’une bouteille fraîchement ouverte ou d’une bouteille qui a été bien scellée après l’ouverture.
    4. Pelleter les cellules, puis laver 2x pendant 5 min avec 0,1 M tampon de cacodylate de sodium, suivi d’un lavage dans le milieu modifié de du Dulbecco Eagle (DMEM) ou le milieu cellulaire de choix.
  4. Resuspendre la pastille cellulaire en 500 l d’une solution cryo-protectrice de DMEM (ou autre support cellulaire de choix) contenant 10% de sérum bovin fœtal et 15% d’albumine de sérum bovin bovin. Pellet à nouveau, en augmentant légèrement la vitesse de centrifugeuse de 500 x g si nécessaire pour obtenir une pastille dans la solution cryo-protectrice épaisse. Jeter la majorité du supernatant, en veillant à ce qu’il reste suffisamment de liquide pour que le granule ne se dessèche pas. Transportez la pastille cellulaire jusqu’à l’instrument de congélation à haute pression.

3. Congélation à haute pression

  1. Remplissez le réservoir de congélation à haute pression avec de l’azote liquide (LN2) et démarrez la pompe pour remplir la chambre d’échantillon avec LN2.
    CAUTION : Utilisez les procédures de sécurité appropriées et l’équipement de protection individuelle lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide.
    REMARQUE : Ces étapes sont spécifiques au congélateur haute pression Leica EMPACT2.
  2. Éliminez tout liquide restant de la pastille cellulaire à l’aide du coin d’une lingette de laboratoire ou d’une serviette en papier. Il faut avoir suffisamment de liquide pour que la pastille forme une pâte semblable en consistance au dentifrice. Il doit être assez mince pour être aspiré dans une pointe de tuyauterie de 20 l.
  3. Aspirez 2 à 3 l de la pastille cellulaire et déposez-la sur un porte-membrane. Remplissez complètement le puits du porte-membrane, de sorte que la tension de surface crée un léger dôme sur le dessus, mais le liquide ne se déverse pas du puits. Aucune bulle d’air ne devrait être présente.
  4. Faites glisser le porte-membrane dans la cartouche et fixez-le. Placez la cartouche dans la machine HPF qui a été préparée et apprêtée, et appuyez sur Commencer à geler.
  5. Inspecter la température par rapport aux graphiques temporels et temporels pour vérifier que la pression a atteint 2100 barres et que la température a atteint -196 oC dans un rayon de 200 ms, et que les deux paramètres sont demeurés stables pendant les 600 m de mesure.
  6. Répétez les étapes 3.3 à 3.5 jusqu’à ce que le granule de cellule ait été utilisé ou que le nombre désiré d’échantillons ait été congelé.
  7. Garder les cartouches immergées dans LN2, retirer chaque porteur de membrane de sa cartouche, placer dans une capsule en plastique, et placer la capsule en plastique dans un cryo-vial plein de LN2.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les cryo-vials avec des échantillons peuvent être stockés dans un dewar LN2 dans des cryo-cannes ou des cryo-boîtes.

4. Substitution de gel

CAUTION : Utilisez les procédures de sécurité appropriées et l’équipement de protection individuelle lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide. En outre, beaucoup de produits chimiques utilisés à l’étape 4 sont toxiques, y compris l’acide tannique, le tétroxide d’osmium et l’acétate uranyl. Ces produits chimiques doivent être manipulés selon les procédures de sécurité appropriées et éliminés comme déchets chimiques dangereux.

  1. Remplissez l’unité de substitution automatisée de gel avec LN2. Porter la température à -90 oC.
  2. Préparer FS Mix 1 et commencer FS.
    1. Dans une hotte chimique, préparer une solution de 0,2 % d’acide tannique (w/v) et 5 % d’eau DI dans l’acétone et l’aliquot 1 ml par échantillon en cryo-vials. Placer dans LN2 pour congeler.
    2. Placez les flacons FS Mix 1 et les cryo-vials contenant les granulés de cellules congelées dans la chambre d’échantillon de l’unité FS. Transférer la capsule interne contenant le porteur de membrane du flacon LN2 dans le flacon correspondant contenant FS Mix 1.
    3. Démarrer un protocole FS avec sa première étape étant de 24 h à -90 oC. Après les 24 h, mettre en pause le FS, et laver les échantillons 3x pendant 5 min avec de l’acétone qui a été refroidi à -90 oC.
  3. Préparer FS Mix 2 et compléter FS
    CAUTION : Le tétroxide d’osmium est un produit chimique hautement toxique et oxydant qui ne devrait être manipulé que par des personnes formées selon les protocoles de sécurité établis. Les protocoles de stockage et d’élimination des solutions contenant de l’osmium doivent être suivis, ainsi que l’étiquetage des zones de laboratoire où le tétroxide d’osmium est utilisé. Le tétroxide d’osmium doit être manipulé dans une hotte chimique avec équipement de protection individuelle comprenant la protection d’oeil, une robe de laboratoire fournissant la protection complète de bras, les gants doubles de Nitrile, et un respirateur facultatif.
    1. Dans une hotte chimique, préparer une solution de 1% de tétroxide d’osmium, 0,2% d’acétate uranyl, et 5% d’eau DI dans l’acétone. Aliquot 1 ml par échantillon en cryo-vials et placer dans LN2 pour congeler.
      REMARQUE : Les solutions stock d’acide tannique (10 % w/v en acétone), de tétroxyde d’osmium (10 % w/v en acétone) et d’acétate uranyl (8 % w/v au méthanol) peuvent être préparées et stockées dans des cryo-vials dans un dewar LN2 pour faciliter la préparation des mélanges FS.
    2. Placez les cryo-vials avec FS Mix 2 dans l’unité FS et transférez les capsules du troisième lavage d’acétone dans les flacons FS Mix 2. Incuber dans FS Mix 2 pendant 72 h à -90 oC, suivi d’un réchauffement progressif à 0 oC sur 12-18 h.
  4. Maintenez la température à 0 oC et lavez 3x pendant 30 min avec de l’acétone pré-réfrigéré à partir d’une bouteille fraîchement ouverte.

5. Infiltration de résine et intégration

CAUTION: La résine utilisée ici (voir Tableau des matériaux) est toxique avant la polymérisation, et doit être manipulée avec des procédures de sécurité appropriées et de l’équipement de protection individuelle. Toute résine non polymérisée doit être éliminée comme déchets chimiques dangereux.

  1. Infiltrer les échantillons avec des concentrations croissantes de résine dissoute dans l’acétone à partir d’une bouteille nouvellement ouverte. Préparer un mélange de composants de résine A, B et D dans un bécher en plastique selon les directives du fabricant, et couver des échantillons dans les concentrations de résine suivantes : 2 %, 4 % et 8 % pour 2 h chacun à 0 oC. Incuber en 15%, 30%, 60%, 90%, et 100% résine pendant 4 h chacun à température ambiante. Incuber pendant 4 h dans un mélange de composants A, B, C et D.
  2. Placez les porteurs de membrane avec le côté de granule de cellules vers le haut dans les moules plats d’embedding et remplissez avec la résine (A, B, C, et D). Des étiquettes en papier pour les échantillons peuvent être ajoutées aux puits à ce moment-là.
  3. Polymériser dans un four à 60 oC pendant 24 à 36 h.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause après la polymérisation.
  4. Retirer les blocs du moule et laisser refroidir. Pour enlever le porteur de membrane, placez d’abord l’échantillon dans le mandrin vertical de l’ultramicrotome où il peut être visualisé avec grossissement. Séparez le porteur de membrane du bloc par une combinaison d’azote liquide tamponnant sur le support de membrane pour séparer le métal du plastique, et en utilisant une lame de rasoir pour écailler la résine autour du porteur de membrane. Une fois séparé, soulever délicatement le porte-membrane en laissant le dôme de granules de cellules sur la face du bloc.
  5. Placez le bloc avec le granule de cellules exposé vers le haut dans un moule plat d’embedding qui est légèrement plus profond que le premier moule, et remplissez avec la résine. Polymériser à 60 oC pour 24 à 36 h.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause après la polymérisation.

6. Sectionnement

  1. Couper le bloc autour de la pastille cellulaire à l’aide d’une lame de rasoir. Placez ensuite le bloc dans le mandrin d’échantillon sur le bras de section d’un ultramicrotome. À l’aide d’un couteau en verre ou en diamant, tailler le bloc en une forme trapézoïdale entourant étroitement la pastille cellulaire.
  2. Obtenir 90 sections ultraminces de la pastille cellulaire à l’aide d’un couteau en verre ou en diamant.
  3. Ramassez un ruban de sections sur une grille TEM. Les grilles de fente en cuivre enduites de Formvar (1 x 2 mm2 fentes) sont utiles pour l’imagerie des sections sérielles. Séchez la grille en buvant le bord sur un morceau de papier filtre, et entreposez-la dans une boîte de rangement de grille TEM.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause après la section.

7. Imagerie TEM

  1. Monter la grille sur le support TEM et placer dans le microscope. Nous utilisons régulièrement un Tecnai T12 à 80 kV pour le dépistage des échantillons cryoAPEX. Acquérir des images de cellules et de structures subcellulaires d’intérêt avec l’étiquetage APEX2.
  2. Si désiré, obtenir un contraste de membrane supplémentaire par l’utilisation de plomb post-coloration. Voir La figure 2 pour la comparaison des échantillons non tachés(figure 2I-K) et des échantillons de plomb post-tachés ( Figure2A-H).
    1. Flotter les grilles sèches côté section vers le bas sur une goutte de solution diluée de chlorure de sodium (1,5 mM), 2x pour 1 min chacun, puis 1x pour 10 min.
    2. Flottez les grilles sur une goutte de la solution de plomb de Sato pendant 1 min. Laver en flottant sur la solution de chlorure de sodium 3x pendant 1 min, puis sur l’eau DI 3x pendant 1 min. Blot excès liquide des grilles et stocker dans une boîte de grille.
      CAUTION: Le plomb est un produit chimique toxique et doit être manipulé avec des procédures de sécurité appropriées et de l’équipement de protection individuelle. Les solutions contenant du plomb doivent être éliminées en tant que déchets chimiques dangereux.
  3. Image post-tachée des échantillons sur le TEM.
    REMARQUE : Dans la préparation traditionnelle de l’échantillon pour tem, l’étape contrastante de plomb est effectuée avant la formation image de TEM. Cependant, il est recommandé que pour les échantillons cryoAPEX, l’imagerie est effectuée d’abord sur des échantillons non contrastés. Cela garantit que le signal de l’étiquette peut être facilement localisé par son fort contraste avec les structures cellulaires plus légèrement tachées. Pour de nombreux échantillons, aucune autre coloration ne sera requise; toutefois, si un contraste membranaire supplémentaire est souhaité, le plomb post-coloration peut être effectué (étape 7.2) et l’échantillon ré-imagené.

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Representative Results

Afin de comparer la conservation ultrastructurale utilisant la méthode cryoAPEX avec la fixation et la déshydratation traditionnelles, nous avons préparé des échantillons dans lesquels une membrane de réticulum endoplasmique (ERM ; ER membrane) peptide a été marqué avec APEX2 et transfecté dans les cellules HEK-293T. ERM-APEX2 localise à la face cytoplasmique de l’ER et transforme la structure ER en structures morphologiquement distinctes connues sous le nom d’ER lisse organisée (OSER)34,42,43. La morphologie OSER comprend des régions de membranes lisses, parallèles et densément empilées qui servent de région optimale pour comparer la préservation des ultrastructures. La préparation de l’échantillon par les méthodes APEX traditionnelles a permis d’étiqueter clairement les structures OSER(figure 2A-D). Lors de l’inspection à un grossissement élevé, les membranes empilées sont apparues ébouriffées et des écarts non uniformes étaient présents entre les densités concentriques de membrane, ce qui indique une mauvaise conservation de la membrane et l’extraction des lipides (Figure 2D). L’échantillon préparé par cryoAPEX avait également un étiquetage clairement défini des structures OSER; cependant, les membranes étaient lisses et parallèles, et peu ou pas d’extraction lipidique a été vue (Figure 2E-H). Les résultats du cryoAPEX étaient de conservation de qualité similaire à ceux obtenus à partir d’un échantillon qui a subi HPF/FS sans la fixation chimique supplémentaire et les étapes de réaction APEX2/DAB (Figure 2I-K).

En plus de la préservation visuellement appréciable de la membrane, la méthode cryoAPEX préserve la protéine d’intérêt de telle sorte que des aspects des modèles de distribution de protéines peuvent être observés dans certains cas. Pour illustrer ce point, nous avons utilisé une autre protéine ER-localisée, la levure huntingtine interagissant protéine E (HYPE). HYPE est une protéine membranaire située sur la face lumineuse de la membrane ER 44,45,46,47. Les constructions DE HYPE-APEX2 ont été surexprimées dans les cellules HEK-293T. L’analyse TEM de 90 sections minces nm a révélé que HYPE était présent dans l’ensemble des urgences périphériques ainsi que dans l’enveloppe nucléaire (figure 3A,B). De plus, la densité DE HYPE a pu être résolue en foyers régulièrement espacés le long de la membrane lumenale er(figure 3C, flèches). La distribution et les foyers de HYPE étaient également visibles dans un échantillon préparé avec la fixation et la déshydratation traditionnelles ; cependant, d’importantes perturbations et extractions de membranes étaient présentes, ce qui rendait l’échantillon sous-optimal(figure 3D,E).

Pour démontrer la spécificité et l’applicabilité robustes de la méthode cryoAPEX pour une gamme de protéines étiquetées, nous avons effectué l’étiquetage APEX2 à l’aide de trois marqueurs cellulaires. Les mitochondries ont été étiquetées à l’aide de mito-V5-APEX234. Ce marqueur de la matrice mitochondriale fournissait une coloration spécifique des mitochondries seulement (Figure 4A). De même, nous avons évalué l’étiquetage de la membrane plasmatique à l’aide de CAAX-APEX234, qui a produit une coloration distincte de la membrane plasmatique seulement (Figure 4C). Aucun étiquetage n’a été observé dans les organites intracellulaires (Figure 4C). En outre, nous avons créé une nouvelle construction comme marqueur pour le golgi lumen en fusionnant les 118 premiers acides aminés de l’isoforme de souris de mannosidase avec le gène APEX248. Le MannII-APEX2 résultant a été transfecté transitoirement dans des cellules qui ont été plus tard préparées par la méthode cryoAPEX. Les piles de Golgi tachées se distinguaient clairement des organites environnants (figure 4B). Des piles individuelles, des cisternae et quelques vésicules ont été étiquetées, typiques de la coloration de Golgi (Figure 4B). Au total, ces marqueurs démontrent que la méthode cryoAPEX fournit un étiquetage spécifique des protéines membranaires à l’intérieur de divers organites à une résolution suffisamment élevée pour les distinguer des structures sous-cellulaires environnantes.

Figure 1
Figure 1 : Schéma des étapes essentielles du protocole CryoAPEX. (A) Les cellules sont cultivées et transfectées avec un plasmide APEX2. (B) Les cellules sont granulées et fixées avec du glutaraldéhyde, suivies d’une incubation avec du DAB et du peroxyde d’hydrogène pour produire le produit de réaction à la peroxidase. (D) La pastille est cryo-fixe par HPF, (E) gel substitué par des métaux lourds et de l’acétone, et (F) incorporé dans la résine. Des sections minces sont recueillies sur le microtome. (G) L’imagerie TEM est réalisée et un contraste supplémentaire peut être ajouté par post-coloration. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Comparaison de la conservation de la membrane OSER à l’aide de fixation chimique traditionnelle, cryoAPEX et HPF/FS. La morphologie er réorganisée dans des cellules chimiquement fixes, DAB a réagi ERM-APEX2-exprimant des cellules qui ont été traitées par fixation chimique traditionnelle et déshydratation d’alcool (A-D) ou par cryoAPEX (E-H) a été comparée aux cellules exprimant ERM-APEX2 qui ont été cryofixed vivantes et sans la réaction de DAB (I-K). Les cellules cryofixes vivantes représentent la meilleure conservation ultrastructurale réalisable et servent ici de mesure pour évaluer la préservation de la membrane obtenue par l’intermédiaire des deux protocoles de détection basés sur l’APEX(A-H). L’empilement lamellar parallèle uniformément espacé des membranes dérivées des ER obtenue par cryoAPEX (illustré dans les panneaux G et H), par opposition aux membranes ébouriffées obtenues par les méthodes traditionnelles (panneaux C et D),met en évidence la préservation supérieure de la membrane obtenue par cryoAPEX. Ce chiffre a été modifié à partir de Sengupta et al. 201948. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : La localisation des protéines d’une protéine de membrane ER étiquetée APEX2 peut être résolue en foyers périodiques. (A) Une image d’une mince section d’une cellule HEK-293T exprimant HYPE-APEX2 et traitée par cryoAPEX révèle la coloration de l’URGENCE dans un fond cytoplasmique bien conservé (dense) (B,C). Des images de grossissement plus élevées d’une petite section de l’ER périphérique (délimitée par la boîte jaune en A et montrée en B, avec un grossissement supplémentaire de la boîte rouge en B montré en C) présentent des foyers périodiques de densité générée par APEX2 (B, boîte rouge et C, pointes de flèche séchétiques blanches montrant la périodicité entre les foci HYPE). (D) L’image d’une mince section d’une cellule exprimant HYPE-APEX2 et préparée par fixation chimique traditionnelle et déshydratation montre une coloration spécifique de l’ER cortical et de l’enveloppe nucléaire (flèches rouges). (E) À un grossissement plus élevé, des foyers périodiques spécifiques à la HYPE étaient apparents à l’intérieur des tronçons de l’ER (boîte jaune et têtes de flèche sévéraire blanches dans l’encours), malgré une perturbation importante de la membrane, indiquée par des flèches rouges. NE - enveloppe nucléaire. Ce chiffre a été modifié à partir de Sengupta et al. 201948. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Les marqueurs organites montrent la spécificité du signal obtenu à partir de protéines étiquetées APEX2. Les constructions de protéines apEX2-étiquetées conçues pour localiser à la matrice mitochondriale (mito-V5-APEX2 ; montrée dans A),ou le lumen de Golgi (-mannII-APEX2 ; montré dans B),ou la membrane de plasma (CAAX-APEX2 ; montré dans C)ont été transitoirement exprimées dans les cellules de HEK293 et les échantillons traités par cryoAPEX. Chaque construction a donné des densités spécifiques d’organelle. Des vues agrandies de deux sections (boîtes jaunes ou rouges) des cellules exprimant le tableau Bou CAAX-APEX2 (panel C). Ce chiffre a été modifié à partir de Sengupta et al. 201948. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Le protocole cryoAPEX présenté ici fournit une méthode robuste pour caractériser la localisation des protéines membranaires dans l’environnement cellulaire. Non seulement l’utilisation d’une étiquette APEX2 codée génétiquement permet-elle une localisation précise d’une protéine d’intérêt, mais l’utilisation de la cryofixation et de la déshydratation à basse température offre une excellente conservation et la coloration de l’ultrastructure cellulaire environnante. Combinées, ces approches sont un outil puissant pour localiser une protéine avec une grande précision dans son contexte subcellulaire.

Le nœud de l’avancement de cette méthode est le fait que la perte d’ultrastructure vécue après la préparation par les méthodes traditionnelles TEM vient principalement de l’étape de déshydratation plutôt que l’étape de fixation40. On a précédemment cru que les méthodes peroxidase-basées étaient incompatibles avec HPF/FS parce qu’elles exigent la fixation chimique avant la réaction de peroxidase. Pour contourner cela, un protocole nommé CryoCHEM a été récemment développé dans lequel les échantillons sont initialement cryofixed, suivie par la réhydratation et la réaction peroxidase49. Cette approche offre une excellente localisation cible avec des améliorations significatives dans la coloration et la préservation de l’échantillon. Il s’est avéré utile pour les échantillons de tissus et dans les cas où la fluorescence corrélative et la microscopie électronique sont souhaitées. Parallèlement au cryoCHEM, notre méthode combine la fixation du glutaraldéhyde avec HPF et FS. CryoAPEX offre un protocole simplifié qui fonctionne efficacement, même pour les petits échantillons cellulaires.

L’accès aux instruments de congélation et de substitution de congélation à haute pression est crucial pour la méthode cryoAPEX. Ces instruments et compétences sont de plus en plus courants dans les installations de seme. Même si l’équipement HPF et FS n’est pas facilement disponible, l’échantillon chimiquement fixe est assez stable pour un court laps de temps pour être transportés distances modestes40. Nous avons constaté que les échantillons peuvent être stockés après la réaction d’AbD à 4 oC pendant au moins 48 heures avant HPF sans perte significative de qualité. Un autre aspect essentiel du protocole cryoAPEX est l’inclusion de contrôles, qui sont essentiels pour une expérience robuste et des résultats convaincants. Les échantillons préparés par transfection transitoire avec une efficacité inférieure à 100% contiendront des cellules témoins négatives ainsi que des cellules étiquetées dans le même échantillon. Si vous utilisez des lignées cellulaires avec une expression stable de APEX2, un contrôle négatif distinct doit être préparé par transfection des cellules avec la protéine non-APEX2 étiquetée d’intérêt. Plusieurs constructions qui peuvent servir de contrôles organellar sont disponibles via Addgene, et des images publiées sont disponibles dans cette publication et d’autres qui peuvent être utilisés pour la vérification33,34,36,48. Martell et coll.36 ont fourni une discussion approfondie sur la conception expérimentale et la vérification des nouvelles constructions de fusion APEX2.

Bien que le cryoAPEX soit largement utile pour la détection des protéines membranaires, certaines limitations existent. Bien que APEX2 soit une petite protéine de 28 kDa, certaines protéines peuvent ne pas être en mesure d’incorporer l’étiquette33,34. APEX2 n’est pas considéré comme utile pour l’étiquetage des protéines solubles dans le cytosol, en raison du produit de réaction diffuse33,36. En outre, la détection de petites quantités de protéines pose un défi en raison de la présence de taches dans la cellule environnante. La préparation par HPF et FS préserve les composants cellulaires qui sont extraits par fixation et déshydratation traditionnelles. Cela conduit à la coloration globale plus foncée dans la cellule, potentiellement en concurrence avec de faibles niveaux d’étiquetage APEX2.

La technique cryoAPEX est largement applicable à de nombreuses protéines, avec un nombre limité d’étapes qui peuvent nécessiter une optimisation. Tout d’abord, en raison de la variabilité individuelle entre les protéines, le niveau d’expression des protéines et/ ou le temps de réaction d’ADC peuvent devoir être ajustés afin que le signal soit visualisé au-dessus de la coloration de fond de la cellule. Des informations et des protocoles utiles pour la validation des nouvelles constructions de fusion APEX2 et l’optimisation de l’expression et de la coloration DAB sont fournis par Martell et al.36 D’un point de vue de coloration cellulaire, le protocole FS et/ou les produits chimiques peuvent devoir être ajustés pour une visualisation optimale de différentes membranes d’organites, dans différents types de cellules, tissus ou organismes50,51,52,53,54. D’après notre expérience, les conditions FS présentées ici ont bien fonctionné pour une variété de lignées cellulaires de mammifères.

L’approche hybride de cryoAPEX a le potentiel d’être appliquée à de nombreuses autres techniques d’étiquetage génétique. Le remplacement de la déshydratation traditionnelle de l’alcool par du HPF/FS devrait grandement améliorer la préservation des ultrastructures et l’information sur la localisation des protéines. L’utilisation de disques de saphir comme substrat cellulaire pour fixer les cellules comme monocouche améliore la préservation de la périphérie cellulaire, y compris le cytosquelette et les contacts cellule-cellule. Des modifications mineures au protocole seraient nécessaires pour utiliser des disques de saphir. La technologie APEX peut être utilisée pour détecter les protéines fluorescentes vertes (GFP) étiquetées via un peptide liant GFP35. Cette méthode indirecte de détection ouvre la possibilité d’utiliser la technologie APEX pour la myriade de protéines déjà étiquetées avec GFP. Le split APEX2 récemment introduit sera avantageux pour les études de proximité et d’interaction55. En outre, les méthodes existantes basées sur HRP peuvent être combinées avec HPF/FS pour améliorer la préservation cellulaire. Un exemple est fluorescent indicator et peroxidase pour la récipitation pavec EM resolution (FLIPPER), dans lequel les marqueurs cellulaires individuels ont été fusionnés avec une étiquette fluorescente et HRP, fournissant des marqueurs lumenal pour Golgi ou ER56. L’utilisation de substrats de peroxidase améliorés à la place de DAB est également possible avec cette méthode, y compris les substrats qui sont optimisés pour l’étiquetage de l’ARN 57. CryoAPEX fournit également l’étiquetage dans les cellules et la préservation ultrastructurale nécessaires pour l’analyse tridimensionnelle de la distribution des protéines par la tomographie électronique, et potentiellement à des volumes élevés par le biais de SBF-SEM ou FIB-SEM48,58.

Dans l’ensemble, CryoAPEX est une méthode robuste avec une grande applicabilité. En principe, il peut être appliqué à n’importe quelle protéine membranaire, que ce soit dans l’espace lumenal d’un organite, sur le visage cytoplasmique, dans les vésicules, sur la membrane plasmatique de la cellule ou même dans l’espace extracellulaire. Pour cette vaste gamme de protéines membranaires, la méthode cryoAPEX offre le potentiel de voir la localisation et la distribution d’une protéine avec précision dans son contexte subcellulaire.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Le protocole décrit ici découle d’une publication de Sengupta et coll., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Ce travail est soutenu par des subventions R01GM10092 (à S.M.) et AI081077 (R.V.S.) des National Institutes of Health, CTSI-106564 (à S.M.) de l’Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, et PI4D-209263 (à S.M.) du National Institute for Inflammation, Immunology et Infectious Disease.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate Sigma-Aldrich D5637-1G
Acetone (Glass Distilled) Electron Microscopy Sciences 10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc Electron Microscopy Sciences 60952
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL VWR 82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin Sigma-Aldrich 44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 Sigma-Aldrich 44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) Sigma-Aldrich 44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D Sigma-Aldrich 44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm Electron Microscopy Sciences 70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm Electron Microscopy Sciences 70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement Corning 355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm Electron Microscopy Sciences 71008
Glass Knifemaker Leica Microsystems EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16120
HEK 293 Cells ATCC CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System Leica Microsystems EM PACT2 Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution Fisher Scientific 50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm Mager Scientific 16707898
Osmium Tetroxide, crystalline Electron Microscopy Sciences 19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade VWR 97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm Mager Scientific 16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film Electron Microscopy Sciences FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) Avantor Macron Fine Chemicals 7708-10
Tannic Acid Electron Microscopy Sciences 21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm VWR 25382-166
Ultra Glass Knife Strips Electron Microscopy Sciences 71012
Ultramicrotome Leica Microsystems EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate Electron Microscopy Sciences 22400

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Biologie Numéro 156 CryoAPEX protéine membranaire APEX2 microscopie électronique de transmission cryofixation congélation à haute pression substitution de gel
Méthode CryoAPEX pour l’analyse de la microscopie électronique de la localisation des protéines membranaires dans les cellules ultrastructuralement conservées
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Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin, R. V., Mattoo, S. The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells. J. Vis. Exp. (156), e60677, doi:10.3791/60677 (2020).

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