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O Método CrioAPEX para Análise de Microscopia Eletrônica da Localização da Proteína da Membrana dentro de células ultraestruturalmente preservadas

Published: February 27, 2020 doi: 10.3791/60677
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5,6
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 3Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University, 4Bindley Biosciences Center, Purdue University, 5Purdue Institute of Integrative Neuroscience, Purdue University, 6Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

Summary

Este protocolo descreve o método crioAPEX, no qual uma proteína de membrana com etiqueta APEX2 pode ser localizada por microscopia eletrônica de transmissão dentro da ultraestrutura celular idealmente preservada.

Abstract

Eventos celulares-chave como transdução de sinal e tráfico de membrana dependem da localização adequada da proteína dentro dos compartimentos celulares. Compreender a localização subcelular precisa das proteínas é, portanto, importante para responder a muitas questões biológicas. A busca por um rótulo robusto para identificar a localização de proteínas combinada com a preservação e a coloração adequadas do celular tem sido historicamente desafiadora. Os recentes avanços nas imagens de microscopia eletrônica (EM) levaram ao desenvolvimento de muitos métodos e estratégias para aumentar a preservação celular e rotular proteínas alvo. Uma tag genética relativamente nova baseada em peroxidase, APEX2, é um líder promissor em etiquetas em ativas em clones. A preparação amostral para microscopia eletrônica de transmissão (TEM) também avançou nos últimos anos com o advento da criofixação por congelamento de alta pressão (FpE) e desidratação e coloração de baixa temperatura via substituição de congelamento (FS). O HPF e o FS proporcionam excelente preservação da ultraestrutura celular para imagens TEM, perdendo apenas para direcionar a crio-imagem de amostras vívidas. Aqui apresentamos um protocolo para o método crioAPEX, que combina o uso da tag APEX2 com HPF e FS. Neste protocolo, uma proteína de interesse é marcada com APEX2, seguida de fixação química e reação peroxidase. No lugar da tradicional coloração e desidratação alcoólica à temperatura ambiente, a amostra é criofixada e sofre desidratação e coloração em baixa temperatura via FS. Usando crioAPEX, não só uma proteína de interesse pode ser identificada dentro de compartimentos subcelulares, mas também informações adicionais podem ser resolvidas em relação à sua topologia dentro de uma membrana estruturalmente preservada. Mostramos que este método pode fornecer alta resolução suficiente para decifrar padrões de distribuição de proteínas dentro de um lumen organela, e distinguir a compartimentação de uma proteína dentro de uma organela próxima a outras organelas não rotuladas. Além disso, o crioAPEX é processualmente simples e incapacitado para células cultivadas na cultura tecidual. Não é mais tecnicamente desafiador do que métodos típicos de criofixação e congelamento de substituição. O CrioAPEX é amplamente aplicável para análise de TEM de qualquer proteína de membrana que possa ser geneticamente etiquetada.

Introduction

Estudos biológicos muitas vezes incluem questões de resolução de localização de proteínasubcelular dentro de células e organelas. A microscopia de imunofluorescência fornece uma visão útil de baixa resolução da localização de proteínas, e os recentes avanços na imagem de superresolução estão empurrando os limites de resolução para proteínas fluorescentesmarcadas 1,2,3. No entanto, a microscopia eletrônica (EM) continua sendo o padrão-ouro para a ultraestrutura celular de alta resolução por imagem, embora a rotulagem de proteínas seja um desafio.

Historicamente, vários métodos EM têm sido usados para abordar questões de localização de proteínas ultraestruturais. Um dos métodos mais utilizados é a microscopia imunoeletrônica (IEM), onde anticorpos primários específicos de antígeno são usados para detectar a proteína de interesse. O sinal EM é gerado pela aplicação de anticorpos secundários conjugados com partículas densas eletrônicas, mais comumente ouro coloidal4,5. Alternadamente, anticorpos conjugados com enzimas como peroxidase de rabanete de cavalo (HRP) podem ser usados para produzir um precipitado elétron-denso6,7,8. Existem duas abordagens principais para o IEM, denominada rotulagem pré-incorporação e post-incorporação. Na pré-incorporação do IEM, os anticorpos são introduzidos diretamente nas células, o que requer fixação de luz e permeabilização das células9,10,11. Ambas as etapas podem danificar a ultraestrutura12,13. O desenvolvimento de anticorpos significativamente menores que consistem em um fragmento fab anticorpo conjugado com nanogold de 1,4 nm permite que condições muito suaves de permeabilização sejam usadas; no entanto, o nanogold é muito pequeno para visualização direta TEM e requer passos adicionais de aprimoramento para se tornar visível14,15,16. No IEM pós-incorporação, os anticorpos são aplicados em finas seções de células que foram totalmente processadas por fixação, desidratação e incorporação em resina17. Embora essa abordagem evite a etapa de permeabilização, preservar o epítopo de interesse ao longo da preparação da amostra é desafiador18,19,20. O método tokuyasu de fixação de luz seguido de congelamento, seção crio-seccional e detecção de anticorpos fornece melhor preservação de epitope21,22. No entanto, os requisitos técnicos da crio-ultramicrotomia, bem como o contraste abaixo do ideal alcançado na célula, são desvantagens23.

O uso de tags geneticamente codificadas elimina muitas das dificuldades do IEM relacionadas à detecção da proteína de interesse. Estão disponíveis uma variedade de tags, incluindo HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG e metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Cada um deles tem vantagens em relação aos métodos anteriores, mas cada um também tem desvantagens impedindo o uso generalizado. Essas desvantagens vão desde a inatividade de HRP no citosol até o grande tamanho da tag de ferritina, sensibilidade à luz do ReAsH, e tamanho pequeno e falta de compatibilidade com a coloração celular de metallothioneina. Recentemente, uma proteína derivada da peroxidase ascorbate foi projetada como uma tag EM, chamada APEX233,34. Como peroxidase, o APEX2 pode catalisar a oxidação de 3,3' diaminobenzidina (DAB), produzindo um precipitado que reage com tetróxido de osmômio para fornecer contraste EM local com difusão mínima da proteína de interesse (menos de 25 nm)33,35. Ao contrário dos métodos tradicionais baseados em HRP, o APEX2 é extremamente estável e permanece ativo em todos os compartimentos celulares33. As amostras podem ser processadas para TEM usando a coloração tradicional da amostra EM e métodos que permitem uma boa visualização das estruturas circundantes33,34,36. Devido ao seu pequeno tamanho, estabilidade e versatilidade, a APEX2 emergiu como uma tag EM com grande potencial.

Muitas das abordagens discutidas acima não podem ser ou ainda não foram combinadas com o estado atual da arte em preservação ultraestrutural, criofixação e substituição de congelamento de baixa temperatura. Assim, sofrem com a falta de preservação da membrana e/ou coloração celular para determinar a localização precisa das proteínas. Isso limita necessariamente a resolução e interpretação dos dados que podem ser obtidos. A criofixação por congelamento de alta pressão (HPF) envolve o congelamento rápido de amostras em nitrogênio líquido a uma alta pressão (~2.100 bar), o que causa vitrificação em vez de cristalização de amostras aquosas, preservando assim células em um estado quase nativo37,38,39. O HPF é seguido por substituição de congelamento (FS), uma desidratação de baixa temperatura (-90 °C) em acetona combinada com incubação com manchas típicas em como tetróxido de osmó e acetato de uranyl. HPF e FS juntos fornecem uma vantagem distinta sobre a fixação química tradicional (um processo mais longo que pode levar a artefatos) e desidratação alcoólica à temperatura ambiente ou no gelo (o que pode levar à extração de lipídios e açúcares), e, portanto, são desejáveis para combinar com as melhores tags EM para detecção de proteínas.

Uma das razões pelas quais o HPF/FS não foi combinado com a rotulagem APEX2 é que a fixação química leve é um pré-requisito para a reação peroxidase, limitando a difusão do produto de reação DAB. Nos estudos da APEX2 até agora, a fixação e a reação peroxidase são seguidas pelos métodos tradicionais em para coloração e desidratação alcoólica33,36. No entanto, mostrou-se que após a fixação química com o HPF/FS fornece uma vantagem distinta na preservação sobre a fixação química tradicional e a desidratação do álcool sozinha40. A perda de integridade ultraestrutural vista em amostras tradicionais de TEM parece menos ligada à fixação do que à desidratação, que normalmente é feita usando álcool à temperatura ambiente ou no gelo, e pode levar à extração de lipídios e açúcares40,41. Para desenvolver o método crioAPEX, suporam que a fixação química e a reação peroxidase, seguida séfeio e FS, produziriam um resultado ideal em termos de preservação ultraestrutural.

Aqui apresentamos o protocolo crioAPEX, que combina marcação APEX2 com métodos de criofixação e congelamento de métodos de substituição(Figura 1). Este protocolo simples consiste na transfecção de uma proteína de interesse apex2 marcada, fixação química das células e reação peroxidase. HPF e FS são então realizados seguidos de incorporação típica de resina e secção fina. A imagem TEM revela excelente preservação da ultraestrutura usando esse método. Além disso, observou-se localização subcelular de alta resolução e distribuição espacial de uma proteína lumenal de retículo endoplasmático (ER). Este método é amplamente útil para detecção da localização da proteína da membrana dentro das células para análise de microscopia eletrônica. Em nossas mãos, o método tem trabalhado com sucesso para uma variedade de linhas celulares cultivadas na cultura tecidual, incluindo HEK-293T (rim embrionário humano), HeLa (câncer cervical humano), Cos7 (fibroblasto renal de macaco verde africano) e BHK (rim de hamster bebê). Instruções detalhadas são descritas abaixo usando células HEK-293T.

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Protocol

1. Cultura Celular e Transfecção

  1. As células HEK-293T de sementes em um prato de 60 mm de diâmetro ou cultura tecidual maior e crescem para 60% a 90% de confluência em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% de CO2.
  2. Células transfect com plasmídeos de expressão mamífero com apex2 com marca ção de forma ativa da transfecção usando reagente transfection (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
  3. Às 12 h e 15 h após a transfecção, lave células uma vez com soro lona tampão de fosfato (PBS). Remova as células do prato lavando suavemente com PBS. Um reagente dissociante, como a trippsina, pode ser usado se necessário para um determinado tipo de célula. Centrífuga a 500 x g por 5 min para formar uma pelota.

2. Fixação Química e Reação Peroxidase

  1. Remova cuidadosamente o supernatant e resuspenda a pelota em 2 mL de 2% glutaraldeído (v/v) em 0,1 M tampão cacodylate de sódio, pH 7.4, em temperatura ambiente. Coloque a amostra no gelo e incuba por 30 min. Pelota a amostra a 500 x g por 5 min a 4 °C. Deste ponto até a etapa 2.3.3, mantenha a amostra e as soluções no gelo e realize a centrífuga a 4°C.
    ATENÇÃO: Tanto o glutaraldeído quanto o tampão cacodylate de sódio (contendo arsênico) são tóxicos. Os procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual devem ser utilizados durante o manuseio. Soluções contendo glutaraldeído e/ou tampão cacodylate de sódio devem ser descartadas como resíduos químicos perigosos.
  2. Lave a pelota 3x por 5 min com 2 mL de 0,1 M tampão de cacodylate de sódio. Para estas, bem como lava-louças subsequentes, suspenda suavemente a pelota celular na solução necessária, em seguida, centrífuga por 5 min a 500 x g e remover cuidadosamente e descartar o supernatant. Deve-se tomar cuidado com as repetidas etapas de pelotização e resuspensão, a fim de minimizar a perda amostral.
  3. Realizar a reação peroxidase
    1. Prepare uma nova solução contendo 1 mg/mL de 3,3'-diaminobenzidina tetraclorato (DAB) em 0,1 M tampão de catequeiro de sódio. Dissolva o DAB por vórtice vigorosa por 5-10 min.
      ATENÇÃO: O DAB é tóxico e um potencial cancerígeno e deve ser tratado com procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual. As soluções que contenham da DAB devem ser tratadas como resíduos químicos perigosos.
    2. Lave pelotas resuspendendo em 3 mL de solução DAB seguida de pelotas a 500 x g por 5 min.
    3. Resuspender a pelota em solução DAB de 3 mL à qual o peróxido de hidrogênio foi adicionado para alcançar uma concentração final de 5,88 mM. Incubar por 30 min na temperatura do quarto. A pelota fica visivelmente de cor marrom indicando a presença do produto de reação insolúvel da DAB.
      NOTA: O tempo de incubação do DAB pode precisar ser otimizado para cada amostra. A mudança de cor pode ser monitorada no microscópio de luz. Em nossa experiência, uma incubação de 15 a 45 min é adequada para a maioria das proteínas. O peróxido de hidrogênio deve ser obtido a partir de uma garrafa recém-aberta ou uma que foi mantida bem lacrada após a abertura.
    4. Contine as células, depois lave 2x por 5 min com tampão de cacodylate de sódio de 0,1 M, seguido por uma lavagem no meio modificado da Águia de Dulbecco (DMEM) ou mídia celular de escolha.
  4. Resuspender a pelota celular em 500 μL de uma solução crio-protetora de DMEM (ou outra mídia celular escolhida) contendo 10% de soro bovino fetal e 15% de albumina de soro bovino 15%. Pelota novamente, aumentando ligeiramente a velocidade de centrífuga de 500 x g se necessário para alcançar uma pelota na espessa solução crio-protetora. Descarte a maioria do supernatante, garantindo que reste líquido suficiente para que a pelota não seque. Transporte a pelota celular para o instrumento de congelamento de alta pressão.

3. Congelamento de alta pressão

  1. Encha o reservatório congelador de alta pressão com nitrogênio líquido (LN2)e inicie a bomba para encher a câmara de amostra com LN2.
    ATENÇÃO: Use procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual ao trabalhar com nitrogênio líquido.
    NOTA: Estas etapas são específicas para o congelador de alta pressão Leica EMPACT2.
  2. Afaste qualquer líquido restante da pelota celular usando o canto de um lenço de laboratório ou toalha de papel. O líquido suficiente deve permanecer para que a pelota forme uma pasta semelhante na consistência à pasta de dente. Deve ser fino o suficiente para ser aspirado em uma ponta de tubo de 20 μL.
  3. Aspirar 2-3 μL da pelota celular e depositá-la em um portador de membrana. Encha completamente o poço do portador da membrana, para que a tensão superficial crie uma leve cúpula em cima, mas o líquido não derrama do poço. Nenhuma bolha de ar deve estar presente.
  4. Deslize o porta-membrana para dentro do cartucho e proteja. Coloque o cartucho na máquina HPF que foi preparado e preparado, e pressione comece a congelar.
  5. Inspecione a temperatura versus tempo e a pressão versus gráficos de tempo para verificar se a pressão atingiu 2100 barras e a temperatura chegou a -196 °C dentro de 200 ms, e ambos os parâmetros permaneceram estáveis para os 600 ms de medição.
  6. Repita as etapas de 3,3 a 3,5 até que a pelota celular tenha sido usada ou o número desejado de amostras tenha sido congelado.
  7. Mantendo os cartuchos imersos em LN2,remova cada porta-membrana de seu cartucho, coloque em uma cápsula de plástico e coloque a cápsula de plástico em um crio-frasco cheio de LN2.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Os crio-frascos com amostras podem ser armazenados em uma deguerra LN2 em crio-canas ou crio-caixas.

4. Substituição de congelamento

ATENÇÃO: Use procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual ao trabalhar com nitrogênio líquido. Além disso, muitos dos produtos químicos utilizados na etapa 4 são tóxicos, incluindo ácido tânnico, tetróxido de osmio e acetato de uranyl. Esses produtos químicos devem ser manuseados de acordo com os procedimentos de segurança adequados e descartados como resíduos químicos perigosos.

  1. Preencha a unidade automatizada de substituição de congelamento com LN2. Leve a temperatura para -90 °C.
  2. Prepare o FS Mix 1 e comece a FS.
    1. Em uma capa química, prepare uma solução de 0,2% de ácido tânnico (w/v) e 5% de água DI em acetona e alíquota 1 mL por amostra em crio-frascos. Coloque em LN2 para congelar.
    2. Coloque os frascos FS Mix 1 e os crio-frascos contendo as pelotas de células congeladas na câmara amostral da unidade FS. Transfira a cápsula interna contendo o porta-membrana do frasco LN2 para o frasco correspondente contendo FS Mix 1.
    3. Inicie um protocolo de FS com seu primeiro passo sendo 24 h a -90°C. Após as 24 horas, pausa ras, e lave as amostras 3x por 5 min com acetona que foi resfriado para -90 °C.
  3. Prepare fs mix 2 e fs completo
    ATENÇÃO: O tetróxido de osmio é um produto químico altamente tóxico e oxidante que só deve ser manuseado por indivíduos treinados de acordo com protocolos de segurança estabelecidos. Devem ser seguidos protocolos para armazenamento e descarte de soluções contendo odômio, bem como rotulagem de áreas de laboratório onde o tetróxido de osmio está em uso. O tetróxido de osmio deve ser manuseado em uma capa química com equipamentos de proteção individual, incluindo proteção ocular, um jaleco que fornece proteção completa do braço, luvas de nitrile duplas e um respirador opcional.
    1. Em uma capa química, prepare uma solução de 1% de tetróxido de osmômio, acetato de uranyl de 0,2% e 5% de água DI em acetona. Aliquot 1 mL por amostra em crio-frascos e coloque em LN2 para congelar.
      NOTA: As soluções de estoque de ácido tânico (10% w/v na acetona), tetróxido de osmio (10% w/v na acetona) e acetato uranyl (8% w/v no metanol) podem ser preparadas e armazenadas em crio-frascos em uma guerra de LN2 para facilitar a preparação das FS Mixes.
    2. Coloque os crio-frascos com FS Mix 2 para a unidade FS e transfira as cápsulas da terceira lavagem acetona para os frascos FS Mix 2. Incubar no FS Mix 2 por 72 h a -90 °C, seguido pelo aquecimento gradual para 0 °C acima de 12-18 h.
  4. Mantenha a temperatura em 0 °C e lave 3x por 30 min com acetona pré-resfriada de uma garrafa recém-aberta.

5. Infiltração de Resin e Incorporação

ATENÇÃO: A resina utilizada aqui (ver Tabela de Materiais) é tóxica antes da polimerização, e deve ser tratada com procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual. Qualquer resina não polimerizada deve ser descartada como resíduos químicos perigosos.

  1. Infiltrar-se nas amostras com concentrações crescentes de resina dissolvidas em acetona de uma garrafa recém-aberta. Prepare uma mistura de componentes de resina A, B e D em um béquer plástico de acordo com as direções do fabricante, e incuba amostras nas seguintes concentrações de resina: 2%, 4% e 8% para 2h cada a 0°C. Incubar em 15%, 30%, 60%, 90%, e 100% de resina para 4h cada uma à temperatura ambiente. Incubar por 4 h em uma mistura de componentes A, B, C e D.
  2. Coloque os portadores de membrana com o lado da pelota celular em moldes de incorporação plana e encha com resina (A, B, C e D). Os rótulos de papel das amostras podem ser adicionados aos poços neste momento.
  3. Polimerize em um forno a 60 °C por 24-36 h.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado após a polimerização.
  4. Retire os blocos do molde e deixe esfriar. Para remover o porta-membrana, coloque primeiro a amostra no mchuck vertical do ultramicrotome onde pode ser visualizada com ampliação. Separe o porta-membrana do bloco por uma combinação de nitrogênio líquido no porta-membrana para separar o metal do plástico e usar uma lâmina de barbear para cortar a resina ao redor do porta-membrana. Quando separado, levante suavemente o porta-membrana deixando a cúpula da pelota celular na face do bloco.
  5. Coloque o bloco com a pelota de célula exposta voltada para cima em um molde de incorporação plana que é ligeiramente mais profundo que o primeiro molde, e encha com resina. Polimerize a 60 °C por 24-36 h.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado após a polimerização.

6. Seccional

  1. Corte o bloco ao redor da pelota celular usando uma lâmina de barbear. Em seguida, coloque o bloco no mandril de amostra no braço seccional de um ultramicrotome. Usando um vidro ou uma faca de diamante, corte o bloco em uma forma trapezoidal ao redor da pelota celular.
  2. Obtenha 90 nm seções ultrafinas da pelota celular usando um vidro ou faca de diamante.
  3. Pegue uma fita de seções em uma grade TEM. As grades de caça-níqueis revestidas de formvar (slot de 1 x 2 mm2) são úteis para seções de série de imagem. Seque a grade manchando a borda em um pedaço de papel filtro e armazene em uma caixa de armazenamento de grade TEM.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado após a secção.

7. Tem Imagem

  1. Monte a grade no suporte tem e coloque no microscópio. Usamos rotineiramente um Tecnai T12 a 80 kV para triagem de amostras crioAPEX. Adquirir imagens de células e estruturas subcelulares de interesse com rotulagem APEX2.
  2. Se desejar, obtenha contraste de membrana adicional pelo uso de chumbo pós-coloração. Consulte a Figura 2 para comparação de amostras não manchadas(Figura 2I-K) e leve amostras pós-manchadas(Figura 2A-H).
    1. Flutue grades secas de lado para baixo em uma gota de solução diluída de cloreto de sódio (~1,5 mM), 2x por 1 min cada, depois 1x por 10 min.
    2. Grades flutuantes em uma gota da solução de chumbo de Sato por 1 min. Lave flutuando na solução de cloreto de sódio 3x por 1 min, em seguida, na água DI 3x por 1 min. Blot excesso de líquido das grades e armazenar em uma caixa de grade.
      ATENÇÃO: O chumbo é um produto químico tóxico e deve ser tratado com procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual. Soluções contendo chumbo devem ser descartadas como resíduos químicos perigosos.
  3. Imagem amostras pós-manchadas no TEM.
    NOTA: Na preparação tradicional da amostra para TEM, o passo contrastante de chumbo é realizado antes da imagem TEM. No entanto, recomenda-se que para amostras crioAPEX, a imagem seja realizada primeiro em amostras não contrastadas. Isso garante que o sinal da tag possa ser facilmente localizado pelo seu forte contraste com as estruturas celulares mais levemente manchadas. Para muitas amostras, não será necessária mais manchas; no entanto, se for desejado contraste adicional de membrana, a pós-coloração do chumbo pode ser realizada (Passo 7.2) e a amostra re-imaged.

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Representative Results

Para comparar a preservação ultraestrutural utilizando o método crioAPEX com fixação e desidratação tradicionais, preparamos amostras em que uma membrana retícula endoplasmática (ERM; O peptídeo da membrana ER foi marcado com APEX2 e transfecdo em células HEK-293T. ERM-APEX2 localiza a face citoplasmática do PS e remodela a estrutura ER em estruturas morfologicamente distintas conhecidas como ER (OSER)34,42,43. A morfologia oSER inclui regiões de membranas lisas, paralelas e densamente empilhadas que servem como uma região ideal para comparar a preservação ultraestrutural. A preparação da amostra pelos métodos TRADICIONAis APEX resultou em rotulagem clara das estruturas OSER (Figura 2A-D). Após a inspeção na alta ampliação, as membranas empilhadas pareciam arretidas e lacunas não uniformes estavam presentes entre densidades de membrana concêntrica, indicando má preservação da membrana e extração lipídica(Figura 2D). A amostra preparada pelo crioAPEX também tinha rotulagem claramente definida das estruturas OSER; no entanto, as membranas eram lisas e paralelas, e pouco ou nenhuma extração lipídica foi vista (Figura 2E-H). Os resultados do crioAPEX foram de preservação de alta qualidade semelhante às obtidas a partir de uma amostra submetida ao HPF/FS sem as etapas adicionais de fixação química e apex2/DAB (Figura 2I-K).

Além da preservação visualmente apreciável da membrana, o método crioAPEX preserva a proteína de interesse de tal forma que aspectos dos padrões de distribuição de proteínas possam ser observados em alguns casos. Para ilustrar este ponto, usamos outra proteína localizada em ER, a proteína interagindo de huntingtin e (HYPE). HYPE é uma proteína de membrana localizada na face luminal da membrana ER 44,45,46,47. As construções hype-APEX2 foram superexpressas nas células HEK-293T. A análise TEM de 90 nm de seções finas revelou que o HYPE estava presente em todo o PS periférico, bem como no envelope nuclear (Figura 3A,B). Além disso, a densidade hype foi capaz de ser resolvida em focos regularmente espaçados ao longo da membrana er lumenal (Figura 3C, setas). Distribuição hype e focos também foram visíveis em uma amostra preparada com fixação tradicional e desidratação; no entanto, houve extensa interrupção e extração da membrana, tornando a amostra subótima (Figura 3D,E).

Para demonstrar a robusta especificidade organellar e aplicabilidade do método crioAPEX para uma gama de proteínas marcadas, realizamos rotulagem APEX2 usando três marcadores celulares. Mitocôndrias foram rotuladas usando mito-V5-APEX234. Este marcador da matriz mitocondrial forneceu apenas uma coloração específica das mitocôndrias (Figura 4A). Da mesma forma, avaliamos a rotulagem da membrana plasmática usando CAAX-APEX234, que produziu apenas uma coloração distinta da membrana plasmática(Figura 4C). Não foi observada rotulagem em organelas intracelulares (Figura 4C). Além disso, criamos uma nova construção como marcador para os lúmens de Golgi, fundindo os primeiros 118 aminoácidos do camundongo isoform de α-mannosidase com o gene APEX248. O MannII-APEX2 resultante foi transfeccionada transitóriamente em células que foram posteriormente preparadas pelo método crioAPEX. As pilhas golgi manchadas eram claramente distinguíveis das organelas circundantes (Figura 4B). Pilhas individuais, cisternas e algumas vesículas foram rotuladas, típicas da coloração de Golgi (Figura 4B). Ao todo, esses marcadores demonstram que o método crioAPEX fornece rotulagem específica de proteínas de membrana dentro de várias organelas em alta resolução suficiente para distingui-las das estruturas subcelulares circundantes.

Figure 1
Figura 1: Esquemática dos passos essenciais no protocolo CryoAPEX. (A)As células são cultivadas e transfecdas com um plasmídeo APEX2. (B) As células são arrofadas e fixadas com glutaraldeído, seguidas por incubação(C)com DAB e peróxido de hidrogênio para produzir o produto de reação peroxidase. (D) A pelota é criofixada pelo HPF,(E)congelar substituída por metais pesados e acetona, e (F) embutida em resina. Seções finas são coletadas no microtome. (G)A imagem TEM é realizada e contraste adicional pode ser adicionado por pós-coloração. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 2
Figura 2: Comparação da preservação da membrana OSER utilizando fixação química tradicional, crioAPEX e HPF/FS. A morfologia er reorganizada em quimicamente fixa, daB reagiu células erm-APEX2 expressando que foram processadas através da fixação química tradicional e desidratação alcoólica(A-D) ou por crioAPEX (E-H) foi comparada ao ERM-APEX2 expressando células que foram criofixadas ao vivo e sem a reação da DAB(I-K). As células criofixadas vivas representam a melhor preservação ultraestrutural alcançável e servem aqui como métrica para avaliar a preservação da membrana obtida através dos dois protocolos de detecção baseados em APEX (A-H). O empilhamento lamellar paralelo uniformemente espaçado das membranas derivadas do ER obtidas pelo crioAPEX (exemplificado nos painéis G e H),em oposição às membranas de babados obtidas pelos métodos tradicionais (painéis C e D),destaca a preservação superior da membrana obtida pelo crioAPEX. Esse número foi modificado a partir de Sengupta et al. 201948. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 3
Figura 3: A localização de proteínas de uma proteína de membrana ER com etiqueta APEX2 pode ser resolvida em focos periódicos. (A) Uma imagem de uma seção fina de uma célula HEK-293T expressando HYPE-APEX2 e processada pelo crioAPEX revela a coloração do ER em um fundo citoplasmático bem preservado(denso) (B,C). Imagens de ampliação mais alta de uma pequena seção do ER periférico (demarcada por caixa amarela em A e mostradas em B, com maior ampliação da caixa vermelha em B mostrada em C) exibefocos periódicos de densidade gerada pelo APEX2 (B,caixa vermelha e C,pontas de flecha brancas mostrando periodicidade entre os focos hype). (D) A imagem de uma seção fina de uma célula expressando HYPE-APEX2 e preparada pela fixação química tradicional e desidratação mostra a coloração específica do ER cortical e do envelope nuclear (setas vermelhas). (E) Em uma ampliação mais alta, os focos periódicos específicos do HYPE eram aparentes dentro de trechos do PS (caixa amarela e pontas de flecha branca no início), apesar da extensa interrupção da membrana, indicada por setas vermelhas. NE = envelope nuclear. Esse número foi modificado a partir de Sengupta et al. 201948. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 4
Figura 4: Marcadores organela mostram especificidade do sinal obtido de proteínas apex2 marcadas. Construções proteicas com marca APEX2 projetadas para localizar a matriz mitocondrial (mito-V5-APEX2; mostrada em A), ou os lúmens Golgi (α-mannII-APEX2; mostrados em B), ou a membrana plasmática (CAAX-APEX2; mostrada em C) foram expressas transitóriamente nas células HEK293 e as amostras processadas pelo crioAPEX. Cada construção produziu densidades específicas organela. São mostradas visualizações ampliadas de duas seções (caixas amarelas ou vermelhas) das células expressando α-mannIIAPEX2 (painel B)ou CAAX-APEX2 (painel C). Esse número foi modificado a partir de Sengupta et al. 201948. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

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Discussion

O protocolo crioAPEX aqui apresentado fornece um método robusto para caracterizar a localização das proteínas da membrana dentro do ambiente celular. Não só o uso de uma tag APEX2 geneticamente codificada fornece localização precisa de uma proteína de interesse, mas o uso de criofixação e desidratação de baixa temperatura proporciona excelente preservação e coloração da ultraestrutura celular circundante. Combinados, essas abordagens são uma poderosa ferramenta para localizar uma proteína com alta precisão dentro de seu contexto subcelular.

O cerne do avanço desse método é o fato de que a perda de ultraestrutura experimentada após a preparação pelos métodos tradicionais tem vem principalmente da etapa de desidratação em vez da etapa de fixação40. Acreditava-se anteriormente que os métodos à base de peroxidase eram incompatíveis com o HPF/FS porque requerem fixação química antes da reação peroxidase. Para contornar isso, um protocolo chamado CryoCHEM foi recentemente desenvolvido no qual as amostras são inicialmente criofixadas, seguida sem reidratação e reação peroxidase49. Essa abordagem proporciona excelente localização de alvos com melhorias significativas na coloração e preservação da amostra. Tem se mostrado útil para amostras de tecido e nos casos em que a fluorescência correlativa e a microscopia eletrônica são desejadas. Paralelamente ao crioCHEM, nosso método combina fixação glutaraldeídeo com HPF e FS. A CryoAPEX oferece um protocolo simplificado que funciona efetivamente até mesmo para pequenas amostras celulares.

O acesso a instrumentos de congelamento e congelamento de alta pressão é crucial para o método crioAPEX. Esses instrumentos e habilidades são cada vez mais comuns nas instalações em. Mesmo que os equipamentos De HPF e FS não estejam prontamente disponíveis, a amostra quimicamente fixa é estável o suficiente para um curto período de tempo para ser transportada distâncias modestas40. Descobrimos que as amostras podem ser armazenadas após a reação da DAB a 4 °C por pelo menos 48 horas antes do HPF sem perda significativa de qualidade. Outro aspecto crítico do protocolo crioAPEX é a inclusão de controles, essenciais para um experimento robusto e resultados convincentes. Amostras preparadas por transfecção transitória com eficiência inferior a 100% conterão células de controle negativas, bem como células rotuladas na mesma amostra. Se usar linhas celulares com expressão estável de APEX2, um controle negativo separado deve ser preparado pela transfecção de células com a proteína de interesse não rotulada APEX2. Várias construções que podem servir como controles organellar estão disponíveis através da Addgene, e imagens publicadas estão disponíveis nesta e em outras publicações que podem ser usadas para verificação33,34,36,48. A discussão aprofundada sobre o design experimental e a verificação de novas construções de fusão APEX2 foi fornecida por Martell et al.36

Embora o crioAPEX seja amplamente útil para a detecção de proteínas de membrana, existem algumas limitações. Embora o APEX2 seja uma pequena proteína de 28 kDa, algumas proteínas podem não ser capazes de incorporar a tag33,34. O APEX2 não é considerado útil para rotular proteínas solúveis no citosol, devido ao produto de reação difusa33,36. Além disso, a detecção de pequenas quantidades de proteína representa um desafio devido à presença de manchas na célula circundante. A preparação por HPF e FS preserva componentes celulares extraídos pela fixação e desidratação tradicionais. Isso leva à coloração geral mais escura na célula, potencialmente competindo com baixos níveis de rotulagem APEX2.

A técnica crioAPEX é amplamente aplicável a muitas proteínas, com um número limitado de passos que podem exigir otimização. Primeiro, devido à variabilidade individual entre as proteínas, o nível de expressão proteica e/ou o tempo de reação DAB podem precisar ser ajustados para que o sinal seja visualizado acima da coloração de fundo da célula. Informações e protocolos úteis para validação de novas construções de fusão APEX2 e otimização da expressão e coloração DAB são fornecidos por Martell et al.36 De uma perspectiva de coloração celular, o protocolo fs e/ou produtos químicos podem precisar ser ajustados para a visualização ideal de diferentes membranas organelas, dentro de diferentes tipos de células, tecidos ou organismos50,51,52,53,54. Em nossa experiência, as condições de FS aqui apresentadas funcionaram bem para uma variedade de linhas de células de mamíferos.

A abordagem híbrida do crioAPEX tem potencial para ser aplicada a muitas outras técnicas de rotulagem genética. Espera-se que a substituição da desidratação tradicional do álcool pelo HPF/FS melhore muito a preservação da ultraestrutural e as informações de localização da proteína. Utilizar discos de safira como substrato celular para consertar células como monocamada melhora a preservação da periferia celular, incluindo os contatos de citoesqueleto e células celulares. Pequenas modificações no protocolo seriam necessárias para usar discos de safira. A tecnologia APEX pode ser usada para detectar proteínas verdes fluorescentes (GFP) marcadas através de um peptídeo de ligação GFP35. Este método indireto de detecção abre o potencial de utilizar a tecnologia APEX para as inúmeras proteínas já marcadas com GFP. O APEX2 dividido recém-introduzido será vantajoso para estudos de proximidade e interação55. Além disso, os métodos baseados em HRP existentes podem ser combinados com o HPF/FS para melhorar a preservação celular. Um exemplo é fluorescent indicator e peroxidase para recicionação pcom EM resolution (FLIPPER), no qual marcadores de células individuais foram fundidos com uma tag fluorescente e HRP, fornecendo marcadores lumenais para Golgi ou ER56. O uso de substratos peroxidase melhorados no lugar do DAB também é possível com este método, incluindo substratos que são otimizados para rotulagem rna 57. O CryoAPEX também fornece rotulagem nas células e preservação ultraestrutural necessária para análise tridimensional da distribuição de proteínas por meio da tomografia eletrônica, e potencialmente em grandes volumes através do SBF-SEM ou FIB-SEM48,58.

No geral, o CryoAPEX é um método robusto com ampla aplicabilidade. Em princípio, pode ser aplicado a qualquer proteína de membrana, seja dentro do espaço lúmenl de uma organela, na face citoplasmática, dentro de vesículas, na membrana plasmática da célula ou mesmo no espaço extracelular. Para esta vasta gama de proteínas de membrana, o método crioAPEX fornece o potencial de ver a localização e distribuição de uma proteína com precisão dentro de seu contexto subcelular.

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Disclosures

Os autores não declaram conflito de interesses.

Acknowledgments

O protocolo aqui descrito decorre de uma publicação de Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs22315 (2019)48. Este trabalho é apoiado por subsídios R01GM10092 (para S.M.) e AI081077 (R.V.S.) dos Institutos Nacionais de Saúde, CTSI-106564 (para S.M.) do Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, e PI4D-209263 (to S.M.) do Instituto purdue university de inflamação, imunologia, imunologia e doença infecciosa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate Sigma-Aldrich D5637-1G
Acetone (Glass Distilled) Electron Microscopy Sciences 10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc Electron Microscopy Sciences 60952
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL VWR 82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin Sigma-Aldrich 44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 Sigma-Aldrich 44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) Sigma-Aldrich 44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D Sigma-Aldrich 44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm Electron Microscopy Sciences 70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm Electron Microscopy Sciences 70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement Corning 355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm Electron Microscopy Sciences 71008
Glass Knifemaker Leica Microsystems EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16120
HEK 293 Cells ATCC CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System Leica Microsystems EM PACT2 Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution Fisher Scientific 50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm Mager Scientific 16707898
Osmium Tetroxide, crystalline Electron Microscopy Sciences 19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade VWR 97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm Mager Scientific 16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film Electron Microscopy Sciences FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) Avantor Macron Fine Chemicals 7708-10
Tannic Acid Electron Microscopy Sciences 21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm VWR 25382-166
Ultra Glass Knife Strips Electron Microscopy Sciences 71012
Ultramicrotome Leica Microsystems EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate Electron Microscopy Sciences 22400

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Biologia Edição 156 CrioAPEX proteína de membrana APEX2 microscopia eletrônica de transmissão criofixação congelamento de alta pressão substituição de congelamento
O Método CrioAPEX para Análise de Microscopia Eletrônica da Localização da Proteína da Membrana dentro de células ultraestruturalmente preservadas
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Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin, R. V., Mattoo, S. The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells. J. Vis. Exp. (156), e60677, doi:10.3791/60677 (2020).

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