Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

طريقة CryoAPEX لتحليل المجهر الإلكتروني لتوطين بروتين الغشاء داخل الخلايا المحفوظة فائقة الهيكلية

Published: February 27, 2020 doi: 10.3791/60677
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5,6
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 3Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University, 4Bindley Biosciences Center, Purdue University, 5Purdue Institute of Integrative Neuroscience, Purdue University, 6Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة cryoAPEX ، حيث يمكن ترجمة بروتين غشاء APEX2 الموسوم عن طريق المجهر الإلكتروني المنقول داخل بنية فائقة للخلايا محفوظة على النحو الأمثل.

Abstract

تعتمد الأحداث الخلوية الرئيسية مثل نقل الإشارات والاتجار بالأغشية على موقع البروتين المناسب داخل المقصورات الخلوية. وبالتالي فإن فهم التعريب الدقيق دون الخلوي للبروتينات مهم للإجابة على العديد من الأسئلة البيولوجية. كان السعي للحصول على تسمية قوية لتحديد توطين البروتين إلى جانب الحفاظ على الخلايا الكافية وتلطيخها تحديًا تاريخيًا. وقد أدت التطورات الأخيرة في التصوير المجهري الإلكتروني (EM) إلى تطوير العديد من الأساليب والاستراتيجيات لزيادة الحفاظ على الخلوية وتسمية البروتينات المستهدفة. علامة وراثية جديدة نسبيًا تعتمد على البيروكسيديز ، APEX2 ، هي شركة رائدة واعدة في العلامات النشطة EM القابلة للاستنساخ. كما تقدم إعداد العينة للمجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) في السنوات الأخيرة مع ظهور التثبيت بالتبريد عن طريق تجميد الضغط العالي (HPF) والجفاف المنخفض الحرارة وتلطيخها عن طريق استبدال التجميد (FS). يوفر HPF و FS الحفاظ الممتاز على البنية الفائقة الخلوية لتصوير TEM ، في المرتبة الثانية بعد التصوير بالتبريد المباشر للعينات الزجاجي. هنا نقدم بروتوكولا لطريقة cryoAPEX، الذي يجمع بين استخدام علامة APEX2 مع HPF و FS. في هذا البروتوكول ، يتم وضع علامة على بروتين الفائدة مع APEX2 ، يليه التثبيت الكيميائي ورد فعل بيروكسيديز. بدلا من تلطيخ التقليدية والجفاف الكحول في درجة حرارة الغرفة، يتم cryofixed العينة وتمر بالجفاف وتلطيخ في درجة حرارة منخفضة عن طريق FS. باستخدام cryoAPEX ، لا يمكن تحديد بروتين مهم داخل مقصورات دون الخلوية فحسب ، ولكن يمكن أيضًا حل معلومات إضافية فيما يتعلق طوبولوجياه داخل غشاء محفوظ هيكليًا. نحن نظهر أن هذه الطريقة يمكن أن توفر دقة عالية بما يكفي لفك أنماط توزيع البروتين داخل تجويف العضي ، والتمييز بين تجزئة البروتين داخل عضوواحد على مقربة من العضيات الأخرى غير المسماة. علاوة على ذلك ، cryoAPEX هو واضح من الناحية الإجرائية وقابلة للخلايا التي تزرع في زراعة الأنسجة. وهو ليس أكثر تحديا من الناحية الفنية من التبريد نموذجية وطرق استبدال التجميد. CryoAPEX ينطبق على نطاق واسع لتحليل TEM من أي بروتين غشاء التي يمكن أن تكون الموسومة وراثيا.

Introduction

غالبًا ما تتضمن الدراسات البيولوجية مسائل حل توطين البروتين دون الخلوي داخل الخلايا والعضيات. يوفر المجهر المناعي رؤية مفيدة منخفضة الدقة لتوطين البروتين ، وتدفع التطورات الأخيرة في التصوير فائقة الدقة حدود الدقة للبروتينات الموسومة بالفلورسنت1،2،3. ومع ذلك ، لا يزال المجهر الإلكتروني (EM) المعيار الذهبي لتصوير ultrastructure الخلوية عالية الدقة ، على الرغم من أن وضع العلامات على البروتينات يمثل تحديًا.

تاريخيا، وقد استخدمت العديد من أساليب م لنهج مسائل توطين البروتين فائقة الهيكلية. واحدة من الطرق الأكثر استخداما هو المجهر الإلكتروني المناعي (IEM)، حيث يتم استخدام الأجسام المضادة الأولية الخاصة بالمستضد للكشف عن البروتين ذات الفائدة. يتم إنشاء إشارة EM من خلال تطبيق الأجسام المضادة الثانوية مترافقة مع جزيئات كثيفة الإلكترون ، والذهب الأكثر شيوعا الغروية4،5. بالتناوب ، يمكن استخدام الأجسام المضادة المترافقة مع الإنزيمات مثل الفجل الحصان بيروكسيديز (HRP) لإنتاج رسب كثيف الإلكترون6،7،8. يوجد نهجان رئيسيان لـ IEM، يطلق عليهم التضمين المسبق وإعادة التضمين. في ما قبل تضمين IEM ، يتم إدخال الأجسام المضادة مباشرة إلى الخلايا ، مما يتطلب تثبيت الضوء ونفاذالخلايا9،10،11. يمكن أن تتلف كلتا الخطوتين البنية الفائقة12،13. تطوير أجسام مضادة أصغر بكثير تتكون من جزء Fab من الأجسام المضادة مترافق مع 1.4 نانومتر من الذهب النانوي يسمح بظروف نفاذية لطيفة للغاية لاستخدامها؛ ومع ذلك ، نانوغولد صغيرة جدا للتصور المباشر تحت TEM ويتطلب خطوات تعزيز إضافية لتصبح مرئية14،15،16. في ما بعد تضمين IEM ، يتم تطبيق الأجسام المضادة على أقسام رقيقة من الخلايا التي تمت معالجتها بالكامل عن طريق التثبيت والجفاف والتضمين في الراتنج17. في حين أن هذا النهج يتجنب خطوة permeabilization ، والحفاظ على epitope من الفائدة في جميع أنحاء إعداد العينة هو التحدي18،19،20. طريقة توكوياسو لتثبيت الضوء تليها تجميد، وأقسام التبريد، والكشف عن الأجسام المضادة يوفر تحسين حفظ epitope21،22. ومع ذلك ، فإن المتطلبات التقنية لاستئصال الموجات فوق البنفسجية ، وكذلك التباين دون الأمثل الذي تحقق في الخلية ، هي عيوب23.

استخدام العلامات المشفرة وراثيا يزيل العديد من الصعوبات التي تواجهها IEM المتعلقة بالكشف عن البروتين ذات الأهمية. تتوفر مجموعة متنوعة من العلامات ، بما في ذلك HRP ، ferritin ، ReAsH ، miniSOG ، وmetallothionein24،25،26،27،28،29،30،31،32. كل من هذه لها مزايا على الأساليب السابقة، ولكن كل أيضا عيوب منع الاستخدام على نطاق واسع. هذه العيوب تتراوح بين الخمول من HRP في السيتوسول إلى حجم كبير من علامة الفيريتين، وحساسية الضوء من ReAsH، وصغر الحجم وعدم التوافق مع تلطيخ الخلوية من metallothionein. في الآونة الأخيرة ، تم تصميم بروتين مشتق من البيروكسيديز الأسكوربات كعلامة EM ، اسمه APEX233،34. كما بيروكسيديز, APEX2 يمكن تحفيز أكسدة 3,3 'ديامينوبنزيدين (DAB), إنتاج راسب التي تتفاعل مع tetroxide osmium لتوفير التباين EM المحلية مع الحد الأدنى من الانتشار من البروتين الفائدة (أقل من 25 نانومتر)33,35. على عكس الأساليب التقليدية المستندة إلى HRP ، فإن APEX2 مستقر للغاية ويظل نشطًا في جميع المقصورات الخلوية33. يمكن معالجة العينات لTEM باستخدام تلطيخ عينة EM التقليدية والأساليب التي تسمح بالتصور الجيد للهياكل المحيطة33،34،36. بسبب صغر حجمها واستقرارها وتعدد استخداماتها ، برزت APEX2 كعلامة EM ذات إمكانات كبيرة.

ولا يمكن أو لم يتم الجمع بين العديد من النهج التي نوقشت أعلاه أو لم يتم الجمع بينها وبين الحالة الراهنة للفنون في الحفظ الفائق الهيكلي، والتثبيت بالتبريد، واستبدال التجميد المنخفض الحرارة. وبالتالي ، فإنها تعاني من عدم وجود الحفاظ على الغشاء و / أو تلطيخ الخلية لتحديد توطين البروتين دقيقة. وهذا يحد بالضرورة من دقة وتفسير البيانات التي يمكن الحصول عليها. التبريد عن طريق تجميد الضغط العالي (HPF) ينطوي على التجميد السريع للعينات في النيتروجين السائل عند ضغط عال (~ 2100 بار) ، مما يسبب التزجيج بدلا ً من تبلور العينات المائية ، وبالتالي الحفاظ على الخلايا في حالة شبه أصلية37،38،39. ويتبع HPF استبدال التجميد (FS) ، وهو جفاف منخفض في درجة حرارة (-90 درجة مئوية) في الأسيتون إلى جانب الحضانة مع بقع EM النموذجية مثل تيتروأكسيد الأوسيميوم وخلات الأورانال. يوفر HPF و FS معاً ميزة واضحة على التثبيت الكيميائي التقليدي (عملية أطول يمكن أن تؤدي إلى القطع الأثرية) وجفاف الكحول في درجة حرارة الغرفة أو على الجليد (مما يمكن أن يؤدي إلى استخراج الدهون والسكريات) ، وبالتالي فهي مرغوبة في الجمع مع أفضل علامات EM للكشف عن البروتين.

أحد الأسباب التي لم يتم الجمع بين HPF / FS مع وضع العلامات APEX2 هو أن التثبيت الكيميائي الخفيف هو شرط أساسي لرد فعل البيروكسيديز ، مما يحد من انتشار منتج تفاعل DAB. في دراسات APEX2 حتى الآن ، ويتبع التثبيت والتفاعل بيروكسيديز من قبل أساليب م التقليدية لتلطيخ وجفاف الكحول33،36. ومع ذلك ، فقد ثبت أن بعد التثبيت الكيميائي مع HPF / FS يوفر ميزة واضحة في الحفاظ على التثبيت الكيميائي التقليدي والجفاف الكحول وحده40. فقدان النزاهة الفائقة الهيكلية التي شوهدت في عينات TEM التقليدية يبدو أقل ارتباطا ً بالتثبيت من الجفاف ، والذي يتم عادة باستخدام الكحول في درجة حرارة الغرفة أو على الجليد ، ويمكن أن يؤدي إلى استخراج الدهون والسكريات40،41. لتطوير طريقة cryoAPEX ، افترضنا أن التثبيت الكيميائي وتفاعل البيروكسيديز ، يليه HPF و FS ، من شأنه أن ينتج نتيجة مثالية من حيث الحفاظ على البُرِك.

هنا نقدم بروتوكول cryoAPEX ، الذي يجمع بين وضع علامات APEX2 مع التثبيت اتّحاديّ وطرق استبدال التجميد(الشكل 1). يتكون هذا البروتوكول المباشر من نقل بروتين APEX2 الموسوم ة ذات الفائدة ، والتثبيت الكيميائي للخلايا ، ورد فعل بيروكسيديز. ثم يتم تنفيذ HPF و FS متبوعة بتضمين الراتنج النموذجي والمقطعة الرقيقة. يكشف التصوير TEM عن الحفاظ الممتاز على البنية الفائقة باستخدام هذه الطريقة. بالإضافة إلى ذلك، لوحظ توطين عالي الدقة تحت الخلايا والتوزيع المكاني لبروتين الخلايا الانندوبلازمية (ER). هذه الطريقة مفيدة على نطاق واسع للكشف عن توطين بروتين الغشاء داخل الخلايا لتحليل المجهر الإلكتروني. في أيدينا، وقد عملت هذه الطريقة بنجاح لمجموعة متنوعة من خطوط الخلايا التي تزرع في زراعة الأنسجة، بما في ذلك HEK-293T (الكلى الجنينية البشرية)، HeLa (سرطان عنق الرحم البشري)، Cos7 (الأفريقي الأخضر القرد الليفية)، وBHK (الطفل الهامستر الكلى). يتم وصف التعليمات التفصيلية أدناه باستخدام خلايا HEK-293T.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ثقافة الخلية وTransfection

  1. البذور HEK-293T الخلايا على قطر 60 ملم أو أكبر طبق زراعة الأنسجة وتنمو إلى 60٪ -90٪ التقاء في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  2. الخلايا Transfect مع APEX2 الموسومة الثدييات التعبير plasmids باستخدام كاشف transfection (انظر جدول المواد)وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة.
  3. في 12-15 ساعة بعد الترانزفان، اغسل الخلايا مرة واحدة مع الفوسفات المالحة العازلة (PBS). إزالة الخلايا من الطبق عن طريق الغسيل لطيف مع برنامج تلفزيوني. يمكن استخدام كاشف الانفصام مثل التربسين إذا لزم الأمر لنوع خلية معينة. جهاز طرد مركزي في 500 × ز لمدة 5 دقيقة لتشكيلبيليه.

2. التثبيت الكيميائي والتفاعل بيروكسيديز

  1. قم بإزالة supernatant بعناية وإعادة تعليق بيليه في 2 مل من 2٪ الجلوتارالدهيد (v/v) في 0.1 M الصوديوم cacodylate العازلة، ودرجة الحموضة 7.4، في درجة حرارة الغرفة. ضع عينة على الثلج واحتضان لمدة 30 دقيقة بيليه العينة في 500 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية. من هذه النقطة حتى الخطوة 2.3.3، والحفاظ على العينة والحلول على الجليد، وإجراء الطرد المركزي في 4 درجة مئوية.
    تنبيه: كل من الجلوتارالدهيد وعازل كاكوكات الصوديوم (الذي يحتوي على الزرنيخ) سامان. وينبغي استخدام إجراءات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية أثناء المناولة. وينبغي التخلص من المحاليل التي تحتوي على الجلوتارالدهيد و/أو عازل كاكوديلات الصوديوم كنفايات كيميائية خطرة.
  2. غسل بيليه 3x لمدة 5 دقيقة مع 2 مل من 0.1 M الصوديوم cacodylate العازلة. لهذه وكذلك السُلة اللاحقة، وبلطف إعادة تعليق بيليه الخلية في الحل المطلوب، ثم الطرد المركزي لمدة 5 دقيقة في 500 × ز وإزالة بعناية والتخلص من supernatant. وينبغي توخي الحذر مع الخطوات المتكررة الكريات وإعادة التعليق، من أجل تقليل فقدان العينة.
  3. تنفيذ رد فعل بيروكسيديز
    1. إعداد محلول جديد يحتوي على 1 ملغ / مل من 3,3'-diaminobenzidine رباعي هيدروكلوريد (DAB) في 0.1 م الصوديوم كاكوكات العازلة. حل DAB عن طريق دوامة قوية لمدة 5-10 دقيقة.
      تنبيه: DAB هو مادة سامة ومسرطنة محتملة وينبغي التعامل معها مع إجراءات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية. وينبغي التعامل مع الحلول التي تحتوي على داب كنفايات كيميائية خطرة.
    2. غسل بيليه عن طريق إعادة تعليق في 3 مل من الحل DAB تليها الكريات في 500 × ز لمدة 5 دقيقة.
    3. إعادة تعليق بيليه في 3 مل الداب الحل الذي تمت إضافة بيروكسيد الهيدروجين لتحقيق تركيز نهائي من 5.88 mm. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بيليه يصبح واضح البني اللون مما يدل على وجود منتج رد فعل DAB غير قابلة للذوبان.
      ملاحظة: قد تحتاج إلى تحسين وقت حضانة DAB لكل عينة. يمكن رصد تغيير اللون على المجهر الضوئي. في تجربتنا، و15-45 دقيقة حضانة كافية لمعظم البروتينات. يجب الحصول على بيروكسيد الهيدروجين من زجاجة مفتوحة حديثا أو واحدة التي تم الاحتفاظ بها مختومة جيدا بعد الافتتاح.
    4. بيليه الخلايا، ثم غسل 2x لمدة 5 دقيقة مع 0.1 M العازلة كاكوليتي الصوديوم، تليها غسل واحد في متوسط النسر تعديل Dulbecco (DMEM) أو وسائل الإعلام الخلية من الاختيار.
  4. إعادة تعليق بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من محلول حماية التبريد من DMEM (أو غيرها من وسائل الإعلام الخلية من اختيار) التي تحتوي على 10٪ مصل الأبقار الجنين و 15٪ الزلال مصل البقر. بيليه مرة أخرى، زيادة طفيفة في سرعة الطرد المركزي من 500 × ز إذا لزم الأمر لتحقيق بيليه في محلول سميكة التبريد protectant. تجاهل غالبية supernatant، وضمان أن يتم ترك ما يكفي من السائل بحيث بيليه لن تجف. نقل بيليه الخلية إلى أداة تجميد الضغط العالي.

3. ارتفاع ضغط التجميد

  1. ملء خزان الفريزر عالي الضغط بالنيتروجين السائل (LN2)وبدء المضخة لملء غرفة العينة بـ LN2.
    تنبيه: استخدم إجراءات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية عند العمل مع النيتروجين السائل.
    ملاحظة: هذه الخطوات خاصة بثلاجة الضغط العالي Leica EMPACT2.
  2. الفتيل بعيدا أي السائل المتبقية من بيليه الخلية باستخدام زاوية مسح المختبر أو منشفة ورقية. يجب أن يبقى ما يكفي من السائل أن بيليه يشكل عجينة مماثلة في الاتساق معجون الأسنان. وينبغي أن تكون رقيقة بما يكفي ليتم استنشاقها في تلميح أنابيب 20 ميكرولتر.
  3. استريد 2-3 ميكرولتر من بيليه الخلية وأودعها على حامل غشاء. ملء بئر الناقل غشاء تماما، بحيث التوتر السطحي يخلق قبة طفيفة على القمة، ولكن السائل لا ينسكب من البئر. لا ينبغي أن تكون فقاعات الهواء موجودة.
  4. حرك حامل الغشاء في الخرطوشة وآمنًا. ضع الخرطوشة في جهاز HPF الذي تم إعداده وإعداده، واضغط على ابدأ للتجميد.
  5. فحص درجة الحرارة مقابل الوقت والضغط مقابل الرسوم البيانية الوقت للتحقق من أن الضغط وصل إلى 2100 بار ووصلت درجة الحرارة إلى -196 درجة مئوية في غضون 200 مللي ثانية ، وظلت كل المعلمات ثابتة لقياس 600 مللي ثانية.
  6. كرر الخطوات من 3.3 إلى 3.5 حتى يتم استخدام بيليه الخلية أو تم تجميد العدد المطلوب من العينات.
  7. الحفاظ على خراطيش مغمورة في LN2،وإزالة كل حامل غشاء من خرطوشة لها، ووضعها في كبسولة بلاستيكية، ووضع كبسولة بلاستيكية في قارورة التبريد الكامل من LN2.
    ملاحظة: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. يمكن تخزين القنينات الباردة مع العينات في dewar LN2 في قصب التبريد أو صناديق التبريد.

4- استبدال التجميد

تنبيه: استخدم إجراءات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية عند العمل مع النيتروجين السائل. بالإضافة إلى ذلك، العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في الخطوة 4 سامة، بما في ذلك حمض التانيك، وtetroxide الأوزيميوم، وخلات أورانال. ويجب التعامل مع هذه المواد الكيميائية وفقاً لإجراءات السلامة السليمة والتخلص منها كنفايات كيميائية خطرة.

  1. ملء وحدة استبدال التجميد الآلي مع LN2. رفع درجة الحرارة إلى -90 درجة مئوية.
  2. إعداد FS ميكس 1 وتبدأ FS.
    1. في غطاء محرك السيارة الكيميائية، وإعداد محلول من 0.2٪ حمض التانيك (ث / v) و 5٪ DI المياه في الأسيتون وaliquot 1 مل لكل عينة في قنينات التبريد. ضع في LN2 لتجميد.
    2. ضع قارورة FS Mix 1 وقوارير التبريد التي تحتوي على كريات الخلايا المجمدة في غرفة عينة وحدة FS. نقل الكبسولة الداخلية التي تحتوي على حامل الغشاء من قارورة LN2 إلى القارورة المقابلة التي تحتوي على FS Mix 1.
    3. بدء بروتوكول FS مع الخطوة الأولى التي تكون 24 ساعة في -90 درجة مئوية. بعد 24 ساعة، وقفة FS، وغسل العينات 3x لمدة 5 دقيقة مع الأسيتون التي تم تبريدها إلى -90 درجة مئوية.
  3. إعداد FS ميكس 2 وFS كاملة
    تنبيه: أوميوم تيتريأكسيد هو مادة كيميائية شديدة السمية ومؤكسدة يجب التعامل معها فقط من قبل الأفراد المدربين وفقًا لبروتوكولات السلامة المعمول بها. ويجب اتباع بروتوكولات لتخزين الحلول المحتوية على الأوميوم والتخلص منها، فضلاً عن وضع علامات على مناطق المختبر التي يستخدم فيها تسيد الأوميوم. يجب التعامل مع أشيميوم tetroxide في غطاء محرك السيارة الكيميائية مع معدات الحماية الشخصية بما في ذلك حماية العين، ومعطف مختبر توفير حماية الذراع الكامل، قفازات نيتريل مزدوجة، وجهاز التنفس الاختياري.
    1. في غطاء محرك السيارة الكيميائية، وإعداد حل من 1٪ أسيدوك الأوميوم، 0.2٪ خلات أورانال، و 5٪ DI المياه في الأسيتون. Aliquot 1 مل لكل عينة في قنينات التبريد ووضعها في LN2 لتجميد.
      ملاحظة: يمكن إعداد حلول المخزون من حمض التانيك (10٪ ث /v في الأسيتون)، وأوميوم tetroxide (10٪ ث / v في الأسيتون) وخلات أورانال (8٪ ث / v في الميثانول) وتخزينها في قوارير التبريد في dewar LN2 لسهولة إعداد ميكسات FS.
    2. ضع القنينات الباردة مع FS Mix 2 في وحدة FS ونقل الكبسولات من غسل الأسيتون الثالث في قارورة FS Mix 2. احتضان في FS ميكس 2 لمدة 72 ساعة في -90 درجة مئوية، تليها الاحترار التدريجي إلى 0 درجة مئوية على مدى 12-18 ساعة.
  4. الحفاظ على درجة الحرارة في 0 درجة مئوية وغسل 3x لمدة 30 دقيقة مع الأسيتون المبردة مسبقا من زجاجة مفتوحة حديثا.

5. تسلل الراتنج والتضمين

تنبيه: الراتنج المستخدم هنا (انظر جدول المواد)سام قبل البلمرة، وينبغي التعامل معه بإجراءات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية. وينبغي التخلص من أي راتنج غير معمرة كنفايات كيميائية خطرة.

  1. التسلل العينات مع تركيزات متزايدة من الراتنج المذاب في الأسيتون من زجاجة فتحت حديثا. إعداد خليط من مكونات الراتنج A و B و D في كوب بلاستيكي وفقًا لتوجيهات الشركة المصنعة ، واحتضان العينات في تركيزات الراتنج التالية: 2٪ ، 4 ٪ ، و 8٪ لكل من 2 ساعة عند درجة حرارة 0 درجة مئوية. احتضان في 15٪، 30٪، 60٪، 90٪، و 100٪ الراتنج لمدة 4 ساعة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. احتضان لمدة 4 ساعة في خليط من المكونات A و B و C و D.
  2. ضع حاملات الغشاء مع جانب بيليه الخلية في قوالب تضمين مسطحة واملأ بالراتنج (A و B و C و D). يمكن إضافة ملصقات ورقية للعينات إلى الآبار في هذا الوقت.
  3. بلمرة في فرن في 60 درجة مئوية لمدة 24-36 ساعة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا بعد البلمرة.
  4. إزالة كتل من القالب والسماح لتبرد. لإزالة الناقل غشاء، في المقام الأول العينة في تشاك العمودي من ultramicrotome حيث يمكن تصور مع التكبير. فصل الناقل غشاء من كتلة عن طريق مزيج من النيتروجين السائل dabbing على الناقل غشاء لفصل المعدن من البلاستيك، واستخدام شفرة حلاقة لرقاقة بعيدا الراتنج حول الناقل الغشاء. عند فصلها، ورفع بلطف بعيدا الناقل غشاء ترك قبة بيليه الخلية على وجه الكتلة.
  5. ضع الكتلة مع بيليه الخلية المكشوفة التي تواجه إلى أعلى في قالب تضمين مسطح أعمق قليلاً من القالب الأول ، واملأ بالراتنج. بلمرة في 60 درجة مئوية لمدة 24-36 ساعة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا بعد البلمرة.

6- قسمة

  1. تقليم كتلة حول بيليه الخلية باستخدام شفرة حلاقة. ثم ضع الكتلة في عينة تشاك على ذراع قسمة من ultramicrotome. باستخدام سكين من الزجاج أو الماس، وتقليم كتلة في شكل شبه منحرف المحيطة عن كثب بيليه الخلية.
  2. الحصول على 90 نانومتر أقسام رقيقة من بيليه الخلية باستخدام الزجاج أو سكين الماس.
  3. التقاط شريط من المقاطع على شبكة TEM. شبكات فتحة النحاس المغلفة بـ Formvar (فتحة 1 × 2 مم2) مفيدة لتصوير المقاطع التسلسلية. جفف الشبكة عن طريق النشاف على الحافة على قطعة من ورق التصفية ، وخزنفي صندوق تخزين شبكة TEM.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً بعد المقطعة.

7. تيم التصوير

  1. قم بتركيب الشبكة على حامل TEM ووضعه في المجهر. نحن نستخدم بشكل روتيني Tecnai T12 بسرعة 80 كيلوفولت لفحص عينات cryoAPEX. الحصول على صور من الخلايا والهياكل دون الخلوية ذات الأهمية مع وضع العلامات APEX2.
  2. إذا رغبت في ذلك، والحصول على تباين غشاء إضافية من خلال استخدام الرصاص بعد تلطيخ. انظر الشكل 2 لمقارنة العينات غير الملطخة(الشكل 2I-K) وعينات الرصاص الملطخة(الشكل 2A-H).
    1. تعويم الشبكات الجافة الجانب أسفل على قطرة من محلول كلوريد الصوديوم المخفف (~ 1.5 mm)، 2x لمدة 1 دقيقة لكل منهما، ثم 1x لمدة 10 دقيقة.
    2. تعويم الشبكات على قطرة من محلول الرصاص Sato لمدة 1 دقيقة غسل عن طريق العائمة على محلول كلوريد الصوديوم 3x لمدة 1 دقيقة، ثم على المياه DI 3x لمدة 1 دقيقة. Blot السائل الزائد من الشبكات وتخزينها في مربع الشبكة.
      تنبيه: الرصاص مادة كيميائية سامة وينبغي التعامل معها مع إجراءات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية. وينبغي التخلص من الحلول التي تحتوي على الرصاص كنفايات كيميائية خطرة.
  3. صورة عينات ما بعد الملطخة على TEM.
    ملاحظة: في إعداد العينة التقليدية لTEM، يتم تنفيذ الخطوة المتناقضة الرصاص قبل التصوير TEM. ومع ذلك، فمن المستحسن أن لعينات cryoAPEX، يتم إجراء التصوير أولاً على عينات غير متباين. وهذا يضمن أن الإشارة من العلامة يمكن أن تكون موجودة بسهولة من خلال تباينها القوي مع الهياكل الخلوية أكثر ملطخة طفيفة. بالنسبة للعديد من العينات، لن تكون هناك حاجة إلى مزيد من تلطيخ; ومع ذلك ، إذا كان تباين الغشاء الإضافي مطلوبًا ، يمكن إجراء تلطيخ الرصاص بعد الرصاص (الخطوة 7.2) وإعادة صورة العينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من أجل مقارنة الحفاظ على ultrastructural باستخدام طريقة cryoAPEX مع التثبيت التقليدي والجفاف ، أعددنا عينات فيها غشاء البلتيكلوم الإنتوبلازمي (ERM ؛ ERM؛ ER غشاء) تم وضع علامة الببتيد مع APEX2 وتنتقل إلى خلايا HEK-293T. ERM-APEX2 توطينالوجه السيتوبلازمي للER ويعيد تشكيل هيكل ER إلى هياكل متميزة شكليا المعروفة باسم تنظيم تنظيم سلس ER (OSER)34،42،43. يتضمن نظام OSER مورفولوجيا مناطق من الأغشية السلسة المتوازية والمكدسة بكثافة والتي تعمل كمنطقة مثالية لمقارنة الحفظ فائق الهيوبنية. أدى إعداد العينة بالطرق التقليدية APEX إلى وضع علامات واضحة على هياكل OSER(الشكل 2A-D). عند التفتيش على التكبير العالي ، بدت الأغشية المكدسة مكشكشة وكانت الفجوات غير الموحدة موجودة بين كثافات الأغشية متحدة المركز ، مما يشير إلى سوء الحفاظ على الأغشية واستخراج الدهون(الشكل 2D). كما أن العينة التي أعدتها cryoAPEX حددت بوضوح هياكل OSER؛ ومع ذلك ، كانت الأغشية ناعمة ومتوازية ، ولم يكن هناك سوى القليل من استخراج الدهون(الشكل 2E-H). وكانت النتائج من cryoAPEX من الحفاظ على جودة عالية مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها من عينة التي خضعت HPF / FS دون التثبيت الكيميائي إضافية وخطوات التفاعل APEX2/DAB(الشكل 2I-K).

بالإضافة إلى الحفاظ على الغشاء الملموس بصريًا ، تحافظ طريقة cryoAPEX على البروتين المهم بحيث يمكن ملاحظة جوانب من أنماط توزيع البروتين في بعض الحالات. لتوضيح هذه النقطة، استخدمنا آخر البروتين ER المترجمة، وخميرة هنتنغتين تفاعل البروتين E (HYPE). HYPE هو بروتين غشاء يقع على الوجه اللمع لغشاء ER 44،45،46،47. تم التعبير عن بنيات HYPE-APEX2 بشكل مفرط في خلايا HEK-293T. كشف تحليل TEM من أقسام رقيقة 90 نانومتر أن HYPE كان موجودا في جميع أنحاء ER الطرفية وكذلك المغلف النووي(الشكل 3A, B). بالإضافة إلى ذلك ، كانت كثافة HYPE قادرة على حلها إلى بؤر متباعدة بانتظام على طول غشاء ER التجويفي(الشكل 3C، السهام). كما كان توزيع الضجيج وبؤره مرئيين في عينة أعدت مع التثبيت التقليدي والجفاف؛ ومع ذلك ، كان هناك اضطراب واسع النطاق للغشاء واستخراجه ، مما يجعل العينة دون المستوى الأمثل(الشكل 3D ، E).

لإظهار خصوصية organellar القوية وقابلية تطبيق طريقة cryoAPEX لمجموعة من البروتينات الموسومة ، قمنا بإجراء وضع علامة APEX2 باستخدام ثلاث علامات خلوية. ووصفت الميتوكوندريا باستخدام ميتو-V5-APEX234. قدمت هذه العلامة من مصفوفة الميتوكوندريا تلطيخ محددة من الميتوكوندريا فقط(الشكل 4A). وبالمثل، قمنا بتقييم تسمية غشاء البلازما باستخدام CAAX-APEX234، والتي أنتجت تلطيخ متميزة من غشاء البلازما فقط(الشكل 4C). لم تلاحظ أي علامات في العضيات داخل الخلايا(الشكل 4C). بالإضافة إلى ذلك، أنشأنا بناء جديد كعلامة للومن غولجي عن طريق دمج أول 118 الأحماض الأمينية من isoform الماوس من α-mannosidase مع الجين APEX248. تم نقل MannII-APEX2 الناتج بشكل عابر إلى الخلايا التي تم إعدادها لاحقًا بواسطة طريقة cryoAPEX. كانت مداخن Golgi الملطخة مميزة بوضوح عن العضيات المحيطة بها(الشكل 4B). تم تصنيف المداخن الفردية والصهريج وبعض الحويصلات ، وهي نموذجية لتلطيخ Golgi(الشكل 4B). وإجمالاً، تثبت هذه العلامات أن طريقة cryoAPEX توفر وضع علامات محددة على بروتينات الغشاء داخل مختلف العضيات بدقة عالية بما يكفي لتمييزها عن الهياكل دون الخلوية المحيطة.

Figure 1
الشكل 1: تخطيطي للخطوات الأساسية في بروتوكول CryoAPEX. (أ)تزرع الخلايا وتنتقل مع البلازميد APEX2. (B)يتم بيليه الخلايا وثابتة مع الجلوتارالدهيد، تليها(C)حضانة مع DAB وبيروكسيد الهيدروجين لإنتاج المنتج تفاعل بيروكسيديز. (D)يتم تثبيت الكريات بواسطة HPF ،(E)تجميد استبدال المعادن الثقيلة والأسيتون ، و(F)جزءا لا يتجزأ من الراتنج. يتم جمع أقسام رقيقة على الميكروتومي. (G)يتم تنفيذ التصوير TEM ويمكن إضافة تباين إضافي عن طريق تلطيخ ما بعد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مقارنة الحفاظ على غشاء OSER باستخدام التثبيت الكيميائي التقليدي ، cryoAPEX ، وHPF / FS. تم مقارنة مورفولوجيا ER المعاد تنظيمها في الخلايا الثابتة كيميائيًا ، DAB ERM-APEX2-expressing الخلايا التي تمت معالجتها عن طريق التثبيت الكيميائي التقليدي وجفاف الكحول(A-D)أو عن طريق cryoAPEX(E-H)مع ERM-APEX2 التعبير عن الخلايا التي تم cryofixed live وبدون تفاعل DAB(I-K). تمثل الخلايا الحية المبردة أفضل حفظ فائق الوضوح يمكن تحقيقه وتعمل هنا كمقياس لتقييم الحفاظ على الأغشية التي تم الحصول عليها من خلال بروتوكولي الكشف المستندين إلى APEX(A-H). التراص اللاميلار المتوازي المتوازي المتباعد بالتساوي للأغشية المشتقة من ER التي تم الحصول عليها من قبل cryoAPEX (متمثلة في الألواح G و H)، على عكس الأغشية المكشكشة التي تم الحصول عليها بالطرق التقليدية (الألواح C و D)، يسلط الضوء على الحفاظ على الأغشية المتفوق الذي تم الحصول عليه من قبل cryoAPEX. وقد تم تعديل هذا الرقم من سينغوبتا وآخرون 201948. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: يمكن حل توطين البروتين من بروتين غشاء ER الموسومة APEX2 إلى بؤر دورية. (أ)صورة لقسم رقيق من خلية HEK-293T تعبر عن HYPE-APEX2 ومعالجتها بواسطة cryoAPEX يكشف تلطيخ ER في خلفية سيتوبلازمية (كثيفة) محفوظة جيدًا(B،C). صور التكبير أعلى من قسم صغير من ER الطرفية (مرسومة بواسطة مربع أصفر في A ويظهر في B، مع مزيد من التكبير من مربع أحمر في B هو مبين في C) معارض بؤر دورية من APEX2 ولدت كثافة (B، مربع أحمر وجيم، رؤوس الأسهم البيضاء التي تظهر الدورية بين بؤر الضجيج). (د)صورة لقسم رقيق من خلية تعبر عن HYPE-APEX2 وأعدتها التثبيت الكيميائي التقليدي والجفاف يظهر تلطيخ محددة من ER القشرية والمغلف النووي (السهام الحمراء). (E)عند تكبير أعلى ، كانت بؤر الضجيج المحددة الدورية واضحة داخل امتدادات من ER (مربع أصفر ورؤوس الأسهم البيضاء في الداخل) ، على الرغم من اضطراب الغشاء الواسع النطاق ، المشار إلى ذلك بواسطة السهام الحمراء. NE = مغلف نووي. وقد تم تعديل هذا الرقم من سينغوبتا وآخرون 201948. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تظهر علامات الأورجانية خصوصية الإشارة التي تم الحصول عليها من البروتينات الموسومة APEX2. تم التعبير عن بنيات البروتين الموسومة APEX2 المصممة للترجمة إلى مصفوفة الميتوكوندريا (mito-V5-APEX2 ؛ الموضحة في A)، أو تجويف Golgi (α-mannII-APEX2 ؛ الموضح في B)، أو غشاء البلازما (CAAX-APEX2 ؛ الموضح في C)بشكل عابر في خلايا HEK293 والعينات التي تمت معالجتها بواسطة cryoAPEX. كل بناء أسفرت عن كثافات محددة organelle. يتم عرض طرق العرض المكبرة لقسمين (مربعات صفراء أو حمراء) من الخلايا التي تعبر عن α-mannIIAPEX2 (اللوحة B)أو CAAX-APEX2 (اللوحة C). وقد تم تعديل هذا الرقم من سينغوبتا وآخرون 201948. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر بروتوكول cryoAPEX المعروض هنا طريقة قوية لتوصيف توطين البروتينات الغشائية داخل البيئة الخلوية. لا يوفر استخدام علامة APEX2 المشفرة وراثيًا توطينًا دقيقًا لبروتين مهم فحسب ، بل يوفر استخدام التثبيت البارد والجفاف منخفض الحرارة الحفاظ الممتاز وتلطيخ البنية الخلوية المحيطة. مجتمعة، هذه النهج هي أداة قوية لتوطين البروتين مع دقة عالية ضمن سياقه دون الخلوي.

جوهر التقدم في هذا الأسلوب هو حقيقة أن فقدان البنية الفائقة التي شهدتها بعد إعداد أساليب TEM التقليدية يأتي في المقام الأول من خطوة الجفاف بدلا من خطوة التثبيت40. وكان يُعتقد سابقاً أن الأساليب القائمة على البيروكسيديز لا تتوافق مع HPF/FS لأنها تتطلب تثبيتاً كيميائياً قبل تفاعل البيروكسيديز. ولحل هذا الأمر، تم مؤخراً وضع بروتوكول يحمل اسم Cryochem حيث يتم تبريد العينات في البداية، تليها الإماهة ورد الفعل البيروكسيديز49. يوفر هذا النهج توطين ًا مستهدفًا ممتازًا مع تحسينات كبيرة في تلطيخ العينة وحفظها. وقد ثبت أن تكون مفيدة لعينات الأنسجة وفي الحالات التي يكون فيها الفلورسينس المترابط والمجهر الإلكتروني مرغوبا. بالتوازي مع cryoCHEM ، تجمع طريقتنا بين تثبيت الجلوتارالدهيد مع HPF و FS. تقدم CryoAPEX بروتوكولًا مبسطًا يعمل بفعالية حتى بالنسبة للعينات الخلوية الصغيرة.

يعد الوصول إلى أدوات التجميد والتجميد عالية الضغط أمرًا حاسمًا لطريقة التبريد. هذه الأدوات والمهارات شائعة بشكل متزايد في مرافق EM. حتى لو لم تكن معدات HPF و FS متوفرة بسهولة ، فإن العينة الثابتة كيميائيًا مستقرة بما يكفي لفترة قصيرة من الوقت ليتم نقلها لمسافات متواضعة40. لقد وجدنا أنه يمكن تخزين العينات بعد رد فعل DAB عند 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة على الأقل قبل HPF دون فقدان كبير للجودة. ومن الجوانب الحاسمة الأخرى لبروتوكول cryoAPEX إدراج عناصر التحكم، التي تعد ضرورية لإجراء تجربة قوية ونتائج مقنعة. العينات التي أعدتها الترانزفان العابر مع كفاءة أقل من 100٪ ستحتوي على خلايا التحكم السلبية وكذلك الخلايا المسماة داخل نفس العينة. إذا كان استخدام خطوط الخلية مع تعبير مستقر من APEX2، ينبغي إعداد عنصر تحكم سلبي منفصل عن طريق نقل الخلايا مع البروتين غير APEX2 المسمى الفائدة. العديد من البنى التي يمكن أن تكون بمثابة ضوابط organellar متوفرة من خلال Addgene، والصور المنشورة متوفرة في هذا وغيرها من المنشورات التي يمكن استخدامها للتحقق33،34،36،48. تم توفير مناقشة متعمقة للتصميم التجريبي والتحقق من الهياكل الانصهار APEX2 جديدة من قبل Martellوآخرون.

في حين أن cryoAPEX مفيد على نطاق واسع للكشف عن بروتينات الغشاء ، توجد بعض القيود. على الرغم من أن APEX2 هو بروتين صغير 28 كيلو دا، قد لا تكون بعض البروتينات قادرة على دمج العلامة33،34. لا يعتبر APEX2 مفيدًا لوضع العلامات على البروتينات القابلة للذوبان في السيتوسول ، بسبب منتج التفاعل المنتشر33،36. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الكشف عن كميات صغيرة من البروتين يشكل تحديا بسبب وجود تلطيخ في الخلية المحيطة بها. إعداد HPF وFS يحافظ على المكونات الخلوية التي يتم استخراجها عن طريق التثبيت التقليدي والجفاف. وهذا يؤدي إلى تلطيخ أغمق عموما في الخلية، ويحتمل أن تتنافس مع مستويات منخفضة من وضع العلامات APEX2.

تقنية cryoAPEX قابلة للتطبيق على نطاق واسع على العديد من البروتينات ، مع عدد محدود من الخطوات التي قد تتطلب التحسين. أولاً، بسبب التباين الفردي بين البروتينات، قد يحتاج مستوى التعبير البروتيني و/أو وقت رد فعل DAB إلى تعديل لكي يتم تصور الإشارة فوق تلطيخ الخلفية للخلية. يتم توفير معلومات مفيدة وبروتوكولات للتحقق من صحة البنى الانصهار APEX2 الجديدة والتحسين من التعبير وتلطيخ DAB من قبل Martellوآخرون. 36 من منظور تلطيخ الخلوية، قد تحتاج إلى تعديل بروتوكول FS و / أو المواد الكيميائية للتصور الأمثل للأغشية العضوية المختلفة، داخل أنواع الخلايا المختلفة، والأنسجة، أو الكائنات الحية50،51،52،53،54. في تجربتنا ، وقد عملت ظروف FS المعروضة هنا بشكل جيد لمجموعة متنوعة من خطوط خلايا الثدييات.

النهج الهجين من cryoAPEX لديه القدرة على تطبيقها على العديد من تقنيات وضع العلامات الوراثية الأخرى. ومن المتوقع استبدال الجفاف الكحول التقليدية مع HPF / FS إلى تحسين كبير في الحفاظ على ultrastructural ومعلومات توطين البروتين. استخدام أقراص الياقوت كركيزة الخلية لإصلاح الخلايا كطبقة أحادية يحسن الحفاظ على محيط الخلية، بما في ذلك الهيكل الخلوي والاتصالات الخلية الخلية. وسيلزم إدخال تعديلات طفيفة على البروتوكول لاستخدام أقراص الياقوت. يمكن استخدام تقنية APEX للكشف عن البروتينات الفلورية الخضراء (GFP) الموسومة عبر الببتيد GFP الملزم35. هذه الطريقة غير المباشرة للكشف تفتح إمكانية استخدام تكنولوجيا APEX للبروتينات التي لا تعد ولا تحصى الموسومة بالفعل مع GFP. وسوف يكون تقسيم APEX2 التي أدخلت مؤخرا مفيدة للقرب والتفاعل الدراسات55. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين الأساليب القائمة المستندة إلى HRP مع HPF/FS لتحسين الحفاظ على الخلوية. مثال واحد هو fluorescent indicator و peroxidase لـ precipitation مع EM resolution (FLIPPER) ، حيث تم دمج علامات الخلايا الفردية مع كل من علامة الفلورسنت وHRP ، مما يوفر علامات تجويفية لـ Golgi أو ER56. استخدام ركائز بيروكسيديز المحسنة بدلا من DAB هو ممكن أيضا مع هذه الطريقة، بما في ذلك ركائز التي تم تحسينها لالحمض النووي الريبي وسم 57. يوفر CryoAPEX أيضًا وضع العلامات في الخلية والحفاظ على ultrastructural اللازمة لتحليل ثلاثي الأبعاد لتوزيع البروتين من خلال التصوير المقطعي الإلكتروني ، وربما بكميات كبيرة من خلال SBF-SEM أو FIB-SEM48،58.

بشكل عام، CryoAPEX هي طريقة قوية مع إمكانية تطبيق واسعة. من حيث المبدأ ، يمكن تطبيقه على أي بروتين غشاء ، سواء داخل الفضاء التجويفي للعضوية ، على الوجه السيتوبلازمي ، داخل الحويصلات ، على غشاء البلازما في الخلية أو حتى في الفضاء خارج الخلية. بالنسبة لهذه المجموعة الواسعة من البروتينات الغشائية، توفر طريقة cryoAPEX إمكانية رؤية توطين وتوزيع البروتين بدقة ضمن سياقه دون الخلوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

البروتوكول الموصوف هنا ينبع من منشور من قبل سينغوبتا وآخرون، مجلة علوم الخلايا، 132 (6)، jcs222315 (2019)48. ويدعم هذا العمل من المنح R01GM10092 (لS.M.) وAI081077 (R.V.S.) من المعاهد الوطنية للصحة، CTSI-106564 (إلى S.M.) من معهد إنديانا للعلوم السريرية والانتقالية، وPI4D-209263 (إلى S.M.) من معهد جامعة بوردو للالتهابات وعلم المناعة والأمراض المعدية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate Sigma-Aldrich D5637-1G
Acetone (Glass Distilled) Electron Microscopy Sciences 10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc Electron Microscopy Sciences 60952
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL VWR 82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin Sigma-Aldrich 44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 Sigma-Aldrich 44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) Sigma-Aldrich 44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D Sigma-Aldrich 44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm Electron Microscopy Sciences 70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm Electron Microscopy Sciences 70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement Corning 355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm Electron Microscopy Sciences 71008
Glass Knifemaker Leica Microsystems EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16120
HEK 293 Cells ATCC CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System Leica Microsystems EM PACT2 Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution Fisher Scientific 50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm Mager Scientific 16707898
Osmium Tetroxide, crystalline Electron Microscopy Sciences 19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade VWR 97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm Mager Scientific 16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film Electron Microscopy Sciences FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) Avantor Macron Fine Chemicals 7708-10
Tannic Acid Electron Microscopy Sciences 21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm VWR 25382-166
Ultra Glass Knife Strips Electron Microscopy Sciences 71012
Ultramicrotome Leica Microsystems EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate Electron Microscopy Sciences 22400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  2. Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies. Trends in Cell Biology. 25, 730-748 (2015).
  3. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6, 022003 (2018).
  4. De Mey, J., Moeremans, M., Geuens, G., Nuydens, R., De Brabander, M. High resolution light and electron microscopic localization of tubulin with the IGS (Immuno Gold Staining) method. Cell Biology International Reports. 5, 889-899 (1981).
  5. Faulk, W., Taylor, G. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Brown, W. J., Constantinescu, E., Farquhar, M. G. Redistribution of Mannose-6-Phosphate Receptors Induced by Tunicamycin and Chloroquine. The Journal of Cell Biology. 99, 320-326 (1984).
  7. Brown, W. J., Farquhar, M. G. The Mannose-6-phosphate Enzymes Is Concentrated Receptor for Lysosomal in Cis Golgi Cisternae. Cell. 36, 295-307 (1984).
  8. Sternberger, L. A., Hardy, P. H., Cuculis, J. J., Meyer, H. G. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 18, 315-333 (1970).
  9. Oliver, C. Pre-embedding Labeling Methods. Immunocytochemical Methods and Protocols. Oliver, C., Jamur, M. C. 588, Humana Press. 381-386 (2010).
  10. Polishchuk, E. V., Polishchuk, R. S. Pre-embedding labeling for subcellular detection of molecules with electron microscopy. Tissue and Cell. 57, 103-110 (2019).
  11. Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Luini, A. Visualizing Live Dynamics and Ultrastructure of Intracellular Organelles with Preembedding Correlative Light-Electron Microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy. Mueller-Reichert, T., Verkade, P. 111, Elsevier. 21-35 (2012).
  12. Humbel, B. M., De Jong, M. D. M., Müller, W. H., Verkleij, A. J. Pre-embedding immunolabeling for electron microscopy: An evaluation of permeabilization methods and markers. Microscopy Research and Technique. 42, 43-58 (1998).
  13. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9, 152-158 (2012).
  14. Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New Frontiers in Gold Labeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 471-480 (2000).
  15. Hainfeld, J. F., Furuya, F. R. A 1.4-nm Gold Cluster Covalently Attached to Antibodies Improves Immunolabeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40, 177-184 (1992).
  16. Baschong, W., Stierhof, Y. Preparation, Use, and Enlargement of Ultrasmall Gold Particles in Immunoelectron Microscopy. Microscopy Research and Technique. 42, 66-79 (1998).
  17. Roth, J., Bendayan, M., Orci, L. Ultrastructural loclaization of intracellular antigens by the use of Protein A-gold complex. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 26, 1074-1081 (1978).
  18. Armbruster, B. L., et al. Specimen preparation for electron microscopy using low temperature embedding resins. Journal of Microscopy. 126, 77-85 (1982).
  19. Fowler, C. B., Leary, T. J. O., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Laboratory Investigation. 88, 785-791 (2008).
  20. Newman, G. R., Hobot, J. A. Modern Acrylics for Post-embedding Immunostaining Techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35, 971-981 (1987).
  21. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. The Journal of Cell Biology. 57, 551-565 (1973).
  22. Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143, 139-149 (1986).
  23. Möbius, W., Posthuma, G. Sugar and ice Immunoelectron microscopy using cryosections according to the Tokuyasu method. Tissue and Cell. 57, 90-102 (2019).
  24. Gaietta, G., et al. Multicolor and Electron Microscopic Imaging of Connexin Trafficking. Science. 296, 503-508 (2002).
  25. Uttamapinant, C., et al. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 10914-10919 (2010).
  26. Porstmann, B., Porstmann, T., Nugel, E., Evers, U. Which of the Commonly Used Marker Enzymes Gives the Best Results in Colorimetric and Fluorimetric Enzyme Immunoassays: Horseradish Peroxidase, Alkaline Phosphatase or Beta-Galactosidase. Journal of Immunological Methods. 79, 27-37 (1985).
  27. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biology. 9, 1001041 (2011).
  28. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160, 70-82 (2007).
  29. Wang, Q., Mercogliano, C. P., Löwe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19, 147-154 (2011).
  30. Risco, C., et al. Specific, sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20, 759-766 (2012).
  31. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. E. Chimeric Molecules Employing Horseradish Peroxidase as Reporter Enzyme for Protein Localization in the Electron Microscope. Methods in Enzymology. Thorner, J., Emr, S. D., Abelson, J. N. 327, 35-45 (2000).
  32. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetrcysteine-tagged proteins in intact cells. Nature Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  33. Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30, 1143-1150 (2012).
  34. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12, (2015).
  35. Ariotti, N., et al. Modular Detection of GFP-Labeled Proteins for Rapid Screening by Electron Microscopy in Cells and Organisms. Developmental Cell. 35, 513-525 (2015).
  36. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12, 1792-1816 (2017).
  37. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130, 877-889 (2008).
  38. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure Freezing for the Preservation of Biological Structure: Theory and Practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  39. McDonald, K. L. High-Pressure Freezing for Preservation of High Resolution Fine Structure and Antigenicity for Immunolabeling. Electron Microscopy Methods and Protocols. Hajibagheri, N. 117, Humana Press. 77-97 (1999).
  40. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  41. Korn, E. D., Weisman, R. A. Loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 116, 309-316 (1966).
  42. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. Journal of Cell Biology. 163, 257-269 (2003).
  43. Sandig, G., et al. Regulation of endoplasmic reticulum biogenesis in response to cytochrome P450 overproduction. Drug Metabolism Reviews. 31, 393-410 (1999).
  44. Faber, P. W., et al. Huntingtin interacts with a family of WW domain proteins. Human Molecular Genetics. 7, 1463-1474 (1998).
  45. Worby, C. A., et al. Article The Fic Domain Regulation of Cell Signaling by Adenylylation. Molecular Cell. 34, 93-103 (2009).
  46. Sanyal, A., et al. A Novel Link between Fic (Filamentation Induced by cAMP) - mediated Adenylylation / AMPylation and the Unfolded Protein Response. The Journal of Biological Chemistry. 290, 8482-8499 (2015).
  47. Mattoo, S., et al. Comparative Analysis of Histophilus somni Immunoglobulin-binding Protein A (IbpA) with Other Fic Domain-containing Enzymes Reveals Differences in Substrate and Nucleotide Specificities. The Journal of Biological Chemistry. 286, 32834-32842 (2011).
  48. Sengupta, R., Poderycki, M. J., Mattoo, S. CryoAPEX - an electron tomography tool for subcellular localization of membrane proteins. Journal of Cell Science. 132, 222315 (2019).
  49. Tsang, T. K., et al. High-quality ultrastructural preservation using cryofixation for 3D electron microscopy of genetically labeled tissues. eLife. 7, 1-23 (2018).
  50. Giddings, T. H. Freeze-substitution protocols for improved visualization of membranes in high-pressure frozen samples. Journal of Microscopy. 212, 53-61 (2003).
  51. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  52. McDonald, K. Cryopreparation methods for electron microscopy of selected model systems. Methods in Cell Biology. 79, 23-56 (2007).
  53. Buser, C., Walther, P. Freeze-substitution: the addition of water to polar solvents enhances the retention of structure and acts at temperatures around -60 degrees C. Journal of Microscopy. 230, 268-277 (2008).
  54. Jiménez, N., et al. Tannic acid-mediated osmium impregnation after freeze-substitution A strategy to enhance membrane contrast for electron tomography. Journal of Structural Biology. 166, 103-106 (2009).
  55. Han, Y., et al. Directed Evolution of Split APEX2 Peroxidase. ACS chemical biology. 14, 619-635 (2019).
  56. Kuipers, J., Van Ham, T. J., Kalicharan, R. D., Schnell, U., Giepmans, B. N. G. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Research. 360, 61-70 (2015).
  57. Zhou, Y., et al. Expanding APEX2 Substrates for Spatial-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins in Living Cells. Angewandte Chemie. , International ed. in English (2019).
  58. Joesch, M., et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy. eLife. 5, 1-13 (2016).

Tags

علم الأحياء، العدد 156، CryoAPEX، بروتين الغشاء، APEX2، المجهر الإلكتروني انتقال، cryofixation، ارتفاع ضغط التجميد، تجميد استبدال
طريقة CryoAPEX لتحليل المجهر الإلكتروني لتوطين بروتين الغشاء داخل الخلايا المحفوظة فائقة الهيكلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin,… More

Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin, R. V., Mattoo, S. The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells. J. Vis. Exp. (156), e60677, doi:10.3791/60677 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter