Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Ultrayapısal Olarak Korunmuş Hücrelerde Membran Protein Lokalizasyonunun Elektron Mikroskobu Analizi için CryoAPEX Yöntemi

Published: February 27, 2020 doi: 10.3791/60677
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4, 1,4,5,6
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 3Purdue Institute of Inflammation, Immunology and Infectious Disease, Purdue University, 4Bindley Biosciences Center, Purdue University, 5Purdue Institute of Integrative Neuroscience, Purdue University, 6Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

Summary

Bu protokol, apex2 etiketli membran proteininin en iyi korunmuş hücre ultrayapısı içinde iletim elektron mikroskobu ile lokalize edilebildiği kriyoAPEX yöntemini açıklar.

Abstract

Sinyal iletimi ve membran ticareti gibi önemli hücresel olaylar hücre kompartmanları içinde uygun protein konumuna dayanır. Proteinlerin kesin hücre altı lokalizasyonunu anlamak birçok biyolojik sorunun yanıtlanması için önemlidir. Yeterli hücresel koruma ve boyama ile birlikte protein lokalizasyonunu belirlemek için sağlam bir etiket arayışı tarihsel olarak zor olmuştur. Elektron mikroskobu (EM) görüntülemedeki son gelişmeler, hücresel koruma ve etiket hedef proteinlerini artırmak için birçok yöntem ve stratejinin geliştirilmesine yol açmıştır. Nispeten yeni peroksidaz bazlı genetik etiket, APEX2, klonlanabilir EM-aktif etiketleri umut verici bir liderdir. İletim elektron mikroskobu (TEM) için örnek hazırlama da son yıllarda yüksek basınç donma (HPF) ve düşük sıcaklık dehidratasyon ve donma ikamesi (FS) ile boyama ile cryofixation gelişiyle gelişmiştir. HPF ve FS, TEM görüntüleme için hücresel ultrayapının mükemmel korunmasını sağlar, vitreus örneklerinin doğrudan kriyo-görüntülemesi için ikinci sıradadır. Burada HPF ve FS ile APEX2 etiketinin kullanımını birleştiren cryoAPEX yöntemi için bir protokol salıyoruz. Bu protokolde, ilgi bir protein APEX2 ile etiketlenir, ardından kimyasal fiksasyon ve peroksidaz reaksiyonu. Oda sıcaklığında geleneksel boyama ve alkol dehidratasyon yerine, örnek kriyofixed ve FS ile düşük sıcaklıkta dehidratasyon ve boyama uğrar. CryoAPEX kullanılarak, sadece ilgi bir protein hücre altı bölmeleri içinde tespit edilebilir, ama aynı zamanda ek bilgi yapısal olarak korunmuş bir membran içinde topolojisi ile ilgili olarak çözülebilir. Bu yöntemin, bir organel lümen içindeki protein dağılım modellerini deşifre edecek ve bir organel içindeki proteinin diğer etiketlenmemiş organellere yakın bir şekilde bölümlere ayrılmasını ayırt edecek kadar yüksek çözünürlük sağlayabileceğini gösteriyoruz. Ayrıca, cryoAPEX usulen basit ve doku kültüründe yetişen hücreleriçin münasip. Bu teknik olarak tipik cryofixation ve dondurma ikame yöntemleri daha zor. CryoAPEX, genetik olarak etiketlenebilen herhangi bir membran proteininin TEM analizi için yaygın olarak uygulanabilir.

Introduction

Biyolojik çalışmalar genellikle hücre ve organeller içinde subsellüler protein lokalizasyonu çözme sorularını içerir. İmmünofloresan mikroskopisi protein lokalizasyonu yararlı bir düşük çözünürlüklü görünüm sağlar, ve süper çözünürlüklü görüntüleme son gelişmeler floresan etiketli proteinler için çözünürlük sınırlarını zorluyor1,2,3. Ancak, elektron mikroskobu (EM) yüksek çözünürlüklü hücresel ultrayapı görüntüleme için altın standart kalır, proteinlerin etiketleme bir sorun olmasına rağmen.

Tarihsel olarak, ultrastrüktürel protein lokalizasyonu sorularını n için çeşitli EM yöntemleri kullanılmıştır. En sık kullanılan yöntemlerden biri immünelektron mikroskobu (IEM), antijene özgü primer antikorlar ilgi proteintespit etmek için kullanılır. EM sinyali elektron yoğun parçacıklar ile konjuge sekonder antikorların uygulanması ile oluşturulur, en sık kolloidal altın4,5. Alternatif olarak, at turp peroksidaz (HRP) gibi enzimler ile konjuge antikorlar bir elektron yoğun çökelti üretmek için kullanılabilir6,7,8. IEM için ön katıştırma ve katıştırma sonrası etiketleme olarak adlandırılan iki ana yaklaşım vardır. Ön gömme IEM'de antikorlar doğrudan hücrelere tanıtılır, bu da9,10,11. Her iki adım da ultrayapıya zarar verebilir12,13. 1.4 nm nanogold ile konjuge bir antikor Fab parçası oluşan önemli ölçüde daha küçük antikorların geliştirilmesi çok nazik permeabilizasyon koşulları kullanılmasını sağlar; ancak, nanogold TEM altında doğrudan görselleştirme için çok küçük ve görünür olmak için ek geliştirme adımları gerektirir14,15,16. Katıştırma sonrası IEM'de, fiksasyon, dehidratasyon ve reşin17'yekatıştırma ile tam olarak işlenmiş hücrelerin ince kısımlarına antikorlar uygulanır. Bu yaklaşım permeabilizasyon adımı önler iken, örnek hazırlanması boyunca ilgi epitopkorunması zor18,19,20. Işık fiksasyon Tokuyasu yöntemi donma takip, kriyo-kesit, ve antikor tespiti gelişmiş epitop koruma sağlar21,22. Ancak, kriyo-ultramikrotomi teknik gereksinimleri, hem de hücrede elde edilen alt-optimal kontrast, dezavantajlarıvardır 23.

Genetik olarak kodlanmış etiketlerin kullanımı, iEM'nin ilgi proteininin saptanmasıyla ilgili birçok zorluklarını ortadan kaldırır. HrP, ferritin, ReAsH, miniSOG ve metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32dahil olmak üzere etiketleri çeşitli mevcuttur. Bunların her biri önceki yöntemlere göre avantajları vardır, ancak her biri de yaygın kullanımı engelleyen dezavantajları vardır. Bu sakıncaları ferritin etiketinin büyük boyutu sitosol HRP hareketsizlik arasında değişir, ReAsH ışık hassasiyeti, ve küçük boyutu ve metallothionein hücresel boyama ile uyumluluk eksikliği. Son zamanlarda, askorbat peroksidaz türetilen bir protein APEX233,34adlı bir EM etiketi olarak mühendislik olmuştur. Bir peroksidaz olarak, APEX2 3,3 'diaminobenzidin oksidasyon katalize edebilirsiniz,DAB),ilgi protein (az 25 nm)33,35 minimum difüzyon ile lokal EM kontrast sağlamak için osmiyum tetroksit ile reaksiyona bir çökelti üreten . Geleneksel HRP tabanlı yöntemlerin aksine, APEX2 son derece kararlıdır ve tüm hücresel bölmelerde aktif kalır33. Geleneksel EM örnek boyama ve çevredeki yapıların iyi görüntülenmesiiçin yöntemler kullanılarak TEM için numuneler işlenebilir33,34,36. Küçük boyutu, stabilitesi ve çok yönlülüğü nedeniyle APEX2 büyük potansiyele sahip bir EM etiketi olarak ortaya çıkmıştır.

Yukarıda tartışılan yaklaşımların çoğu, ultrastrüktürel koruma, cryofixation ve düşük sıcaklıklı donma-ikame sanatın mevcut durumu ile birleştirilemez veya henüz birleştirilmiştir. Böylece, doğru protein lokalizasyonunu belirlemek için membran koruma ve/veya hücre boyama eksikliğinden muzdarip olurlar. Bu, elde edilebilen verilerin çözümünü ve yorumlanmasını zorunlu olarak sınırlar. Yüksek basınç donma tarafından Cryofixation (HPF) yüksek basınçta sıvı azot örneklerinin hızlı donma içerir (~ 2,100 bar), hangi vitrifikasyon yerine sulu örneklerin kristalizasyonu neden, böylece yakın yerli devlet hücreleri koruyarak37,38,39. HPF'yi, osmiyum tetroksit ve uranyl asetat gibi tipik EM lekeleri ile birlikte asetonda düşük sıcaklık (-90 °C) dehidratasyon olan donma ikamesi (FS) takip eder. HPF ve FS birlikte geleneksel kimyasal fiksasyon üzerinde ayrı bir avantaj sağlar (eserler yol açabilir daha uzun bir süreç) ve oda sıcaklığında veya buz üzerinde alkol dehidratasyon (lipidler ve şekerlerin çıkarılmasına yol açabilir), ve böylece protein tespiti için en iyi EM etiketleri ile birleştirmek için arzu edilir.

HPF/FS'nin APEX2 etiketlemesi ile birleştirilememesinin bir nedeni, hafif kimyasal fiksasyonun dab reaksiyon uyrmacı ürününün difüzyonunu sınırlayan peroksidaz reaksiyonu için bir ön koşul olmasıdır. APEX2 çalışmalarında şimdiye kadar, fiksasyon ve peroksidaz reaksiyonu boyama ve alkol dehidratasyon için geleneksel EM yöntemleri tarafından takip edilmektedir33,36. Ancak, HPF / FS ile kimyasal fiksasyon aşağıdaki geleneksel kimyasal fiksasyon ve alkol dehidratasyon tek başına40üzerinde koruma ayrı bir avantaj sağladığı gösterilmiştir. Geleneksel TEM örneklerinde görülen ultrastrüktürel bütünlük kaybı genellikle oda sıcaklığında veya buz üzerinde alkol kullanılarak yapılır dehidratasyon daha fiksasyon daha az bağlı görünür, ve lipidler ve şekerlerin çıkarılmasına yol açabilir40,41. CryoAPEX yöntemini geliştirmek için, kimyasal fiksasyon ve peroksidaz reaksiyonunun, ardından HPF ve FS'nin, ultrayapısal koruma açısından optimum sonuç vereceğini varsaydık.

Burada, APEX2 etiketlemesini cryofixation ve freeze ikame yöntemleriyle birleştiren cryoAPEX protokolünü sıyoruz (Şekil 1). Bu basit protokol ilgi apex2 etiketli protein transfeksiyon oluşur, hücrelerin kimyasal fiksasyon, ve peroksidaz reaksiyonu. HPF ve FS daha sonra tipik reşin katıştırma ve ince kesit ler yapılır. TEM görüntüleme, bu yöntemle ultrayapının mükemmel bir şekilde korunmasını ortaya koymaktadır. Ayrıca, yüksek çözünürlüklü subsellüler lokalizasyon ve bir endoplazmik retikulum (ER) lümenal proteinin mekansal dağılımı gözlendi. Bu yöntem elektron mikroskobu analizi için hücreler de membran protein lokalizasyonu nun saptanmasında yaygın olarak yararlıdır. Elimizde, yöntem hek-293T (insan embriyonik böbrek), HeLa (insan rahim ağzı kanseri), Cos7 (Afrika yeşil maymun böbrek fibroblast) ve BHK (bebek hamster böbrek) dahil olmak üzere doku kültüründe yetiştirilen hücre hatları çeşitli için başarıyla çalıştı. Ayrıntılı talimatlar hek-293T hücreleri kullanılarak aşağıda açıklanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hücre Kültürü ve Transfeksiyon

  1. 60 mm çapında veya daha büyük bir doku kültürü çanak üzerinde tohum HEK-293T hücreleri ve 37 °C ve% 5 CO2bir hücre kültürü kuluçka içinde% 60-90 birleştiğinde büyür.
  2. Apex2 etiketli memeli ekspresyonu ile transfect hücreleri transfeksiyon reaktifi kullanarak (Bkz. Malzemeler Tablosu)üreticinin talimatlarına göre.
  3. Transfeksiyon sonrası 12-15 h'de hücreleri bir kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. PBS ile hafifçe yıkayarak hücreleri bulaşıktan çıkarın. Belirli bir hücre tipi için gerekirse tripsin gibi bir dissosinasyon reaktifi kullanılabilir. Santrifüj 500 x g 5 dk bir pelet oluşturmak için.

2. Kimyasal Fiksasyon ve Peroksidaz Reaksiyonu

  1. Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve oda sıcaklığında 0,1 M sodyum kacodylate tamponu olan pH 7.4'te %2 glutaraldehit (v/v) 2 mL'lik peleti yeniden askıya alın. Numuneyi buz üzerine yerleştirin ve 30 dk. Pelet için numuneyi 500 x g'de 4 °C'de 5 dk'ya yerleştirin. Bu noktadan 2.3.3 adıma kadar numune ve çözümleri buzüzerinde tutun ve 4 °C'de santrifüj gerçekleştirin.
    DİkKAT: Hem glutaraldehit hem de sodyum kacodylate tampon (arsenik içeren) toksiktir. Kullanım sırasında uygun güvenlik prosedürleri ve kişisel koruyucu ekipmanlar kullanılmalıdır. Glutaraldehit ve/veya sodyum kacodylate tampon içeren çözeltiler tehlikeli kimyasal atık olarak atılmalıdır.
  2. Pelet 3x'i 5 dk boyunca 0,1 M sodyum kacodylate tampon2 mL ile yıkayın. Bunlar ve sonraki yıkarlar için, gerekli çözeltide hücre peletini hafifçe yeniden askıya alın, 500 x g'de 5 dakika santrifüj ve supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve atın. Numune kaybını en aza indirmek için tekrarlanan peletleme ve yeniden süspansiyon adımlarıyla dikkat edilmelidir.
  3. Peroksidaz reaksiyonu yürütmek
    1. 0,1 M sodyum kacodylate tampon içinde 3,3'-diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB) 1 mg/mL içeren yeni bir çözelti hazırlayın. 5-10 dakika boyunca güçlü girdap tarafından DAB çözün.
      DİkKAT: DAB toksik ve potansiyel bir karsinojendir ve uygun güvenlik prosedürleri ve kişisel koruyucu ekipmanlarla kullanılmalıdır. DAB içeren çözeltiler tehlikeli kimyasal atık olarak ele alınmalıdır.
    2. 3 mL DAB çözeltisi içinde tekrar susutarak peletyı yıkayın ve ardından 5 000 x g'da 5 dk peletleme.
    3. 5,88 mM'lik son konsantrasyonu elde etmek için hidrojen peroksit eklendiği 3 mL DAB çözeltisindeki peleti yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka. Pelet çözünmez DAB reaksiyon ürün varlığını gösteren gözle görülür kahverengi renkli olur.
      NOT: DAB kuluçka süresi her örnek için optimize edilmesi gerekebilir. Renk değişimi ışık mikroskobunda izlenebilir. Deneyimlerimize göre, 15-45 dk kuluçka çoğu protein için yeterlidir. Hidrojen peroksit, yeni açılmış bir şişeden veya açıldıktan sonra iyice mühürlenmiş bir şişeden alınmalıdır.
    4. Pelet hücreleri, daha sonra 0,1 M sodyum kacodylate tampon ile 5 dakika için 2x yıkayın, Dulbecco değiştirilmiş Eagle's orta (DMEM) veya tercih edilen hücre medya bir yıkama izledi.
  4. %10 fetal sığır serumu ve %15 büyükbaş hayvan serumu içeren DMEM 'in (veya tercih edilen diğer hücre medyasının) kriyo-koruyucu çözeltisinin 500 μL'lik hücre pelletini yeniden askıya alın. Pelet tekrar, kalın kriyo-koruyucu çözeltibir pelet elde etmek için gerekirse 500 x g santrifüj hızını biraz artırarak. Peletin kuruması için yeterli sıvının kalmasını sağlayarak supernatantın çoğunluğunu atın. Hücre peletini yüksek basınç dondurma aletine taşıyın.

3. Yüksek Basınç Dondurma

  1. Yüksek basınçlı dondurucu haznesini sıvı nitrojen (LN2)ile doldurun ve numune haznesini LN2ile doldurmak için pompayı çalıştırın.
    DİkKAT: Sıvı nitrojenle çalışırken uygun güvenlik prosedürlerini ve kişisel koruyucu ekipmanı kullanın.
    NOT: Bu adımlar Leica EMPACT2 yüksek basınçlı dondurucuya özgüdir.
  2. Wick uzak bir laboratuvar silme veya kağıt havlu köşesini kullanarak hücre pelet kalan sıvı. Yeterli sıvı pelet diş macunu tutarlılık benzer bir hamur formları kalmalıdır. 20 μL'lik pipet ucuna aspire edilecek kadar ince olmalıdır.
  3. Hücre peletinin 2-3 μL'lik aspire edin ve bir membran taşıyıcısına yatırın. Membran taşıyıcısının kuyuyu tamamen doldurun, böylece yüzey gerilimi üstte hafif bir kubbe oluşturur, ancak sıvı kuyudan dökülmez. Hava kabarcıkları bulunmamalıdır.
  4. Membran taşıyıcısını kartuşa doğru kaydırın ve emniyete alanın. Kartuşun hazırve astarlanmış HPF makinesine yerleştirin ve donmak için Başlat'a basın.
  5. Basıncın 2100 bar'a ulaştığını ve sıcaklığın 200 ms içinde -196 °C'ye ulaştığını ve her iki parametrenin de 600 ms ölçüm için sabit kaldığını doğrulamak için sıcaklık ve zaman ve basınç karşılaştırması ile sıcaklık ve zaman grafikleri inceleyin.
  6. Hücre peleti kullanılana veya istenilen sayıda numune dondurulana kadar 3,3 ile 3,5 adımlarını tekrarlayın.
  7. Kartuşları LN2'yedaldırılmış tutmak, her membran taşıyıcısını kartuşundan çıkarın, plastik bir kapsüle yerleştirin ve plastik kapsülü LN2ile dolu bir kriyo-şişeye yerleştirin.
    NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Örnekleri ile kriyo-şişeler kriyo-canes veya kriyo-kutuları bir LN2 dewar saklanabilir.

4. Değiştirme dondurun

DİkKAT: Sıvı nitrojenle çalışırken uygun güvenlik prosedürlerini ve kişisel koruyucu ekipmanı kullanın. Ayrıca, adım 4 kullanılan kimyasalların çoğu toksik, tannik asit dahil, osmiyum tetroksit, ve uranyl asetat. Bu kimyasallar uygun güvenlik prosedürlerine göre işlenmeli ve tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edilmelidir.

  1. Otomatik dondurma ikame ünitesini LN2ile doldurun. Sıcaklığı -90 °C'ye getirin.
  2. FS Mix 1'i hazırlayın ve FS'yi başlatın.
    1. Kimyasal bir başlıkta, %0,2 tannik asit (w/v) ve aseton da %5 DI su ve numune başına 1 mL'lik bir çözelti hazırlayın. Donmak için LN2'ye yerleştirin.
    2. FS Mix 1 şişelerini ve donmuş hücre peletlerini içeren kriyo-şişeleri FS ünitesinin numune odasına yerleştirin. Membran taşıyıcısını içeren iç kapsülü LN2 şişesinden FS Mix 1 içeren ilgili şişeye aktarın.
    3. -90°C'de 24 saat olmak için ilk adımı 24 saat olan bir FS protokolü başlatın. 24 saat sonra FS'yi duraklatın ve -90 °C'ye soğutulmuş aseton ile numuneleri 5 dk boyunca 3 x yıkayın.
  3. FS Mix 2'yi hazırlayın ve FS'yi tamamlayın
    DİkKAT: Osmiyum tetroksit, sadece eğitimli kişiler tarafından belirlenen güvenlik protokollerine göre ele alınması gereken son derece zehirli ve oksitleyici bir kimyasaldır. Osmiyum içeren çözeltilerin depolanması ve bertaraf edilmesine yönelik protokollerin yanı sıra osmiyum tetroksitin kullanıldığı laboratuvar alanlarının etiketlenmesi de izlenmelidir. Osmiyum tetroksit göz koruması, tam kol koruması sağlayan bir laboratuvar önlüğü, çift Nitril eldiven ve isteğe bağlı solunum cihazı dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman ile kimyasal bir başlık ele alınmalıdır.
    1. Kimyasal bir başlık, % 1 osmiyum tetroksit, % 0.2 uranyl asetat ve aseton% 5 DI su çözeltisi hazırlamak. Aliquot 1 mL kriyo-şişeler içine örnek başına mL ve donmak için LN2 yer.
      NOT: Tannik asit stok çözeltileri (%10 w/v aseton), osmiyum tetroksit (%10 w/v aseton) ve uranyal asetat (%8 w/v in metanol) hazırlanabilir ve FS Karışımlarının hazırlanmasıkolaylığı için bir LN2 dewar içinde kriyo-şişelerde saklanabilir.
    2. FS Mix 2 ile kriyo-şişeleri FS ünitesine yerleştirin ve kapsülleri üçüncü aseton yıkamadan FS Mix 2 şişelerine aktarın. -90 °C'de 72 saat fs mix 2'de kuluçka, ardından 12-18 saat üzerinden 0 °C'ye kademeli ısınma.
  4. Sıcaklığı 0 °C'de tutun ve 30 dakika boyunca 3x yıkayın ve önceden soğutulmuş aseton ile yeni açılmış bir şişeden.

5. Reşin Sızma ve Katıştırma

DİkKAT: Burada kullanılan reçine (bkz. Malzemeler Tablosu)polimerizasyondan önce zehirlidir ve uygun güvenlik prosedürleri ve kişisel koruyucu ekipmanlarla kullanılmalıdır. Polimerize edilmemiş reçin tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edilmelidir.

  1. Yeni açılan bir şişeden aseton içinde çözünmüş reçin konsantrasyonları artan örnekleri sızmak. Üreticinin talimatlarına göre plastik bir kabın içinde a, b ve D reçin bileşenlerinin karışımını hazırlayın ve aşağıdaki reçin konsantrasyonlarında numuneleri kuluçkaya yatırın: 0 °C'de 2 saat için %2, %4 ve %8. Oda sıcaklığında her biri için %15, %30, %60, %90 ve %100 reçine kuluçka. A, B, C ve D bileşenlerinin karışımında 4 saat kuluçka.
  2. Hücre pelet tarafı ile membran taşıyıcıları düz gömme kalıplara yerleştirin ve rezorin (A, B, C ve D) ile doldurun. Örnekler için kağıt etiketler şu anda kuyulara eklenebilir.
  3. 24-36 saat için 60 °C'de bir fırında polimerize.
    NOT: Protokol polimerizasyondan sonra duraklatılabilir.
  4. Kalıp blokları çıkarın ve soğumaya bırakın. Membran taşıyıcısını çıkarmak için, numuneyi önce büyütme ile görüntülenebilen ultramikrotomun dikey aynasına yerleştirin. Membran taşıyıcısını, metali plastikten ayırmak için membran taşıyıcısında sıvı nitrojen inip bir kombinasyon oluşturarak ve membran taşıyıcısının etrafındaki resenin yongasını parçalamak için bir jilet kullanarak bloktan ayırın. Ayrıldığınızda, hücre pelet kubbesini bloğun yüzünde bırakarak membran taşıyıcıyı yavaşça kaldırın.
  5. İlk kalıp biraz daha derin düz bir gömme kalıp yukarı bakacak şekilde maruz hücre pelet ile blok yerleştirin ve rezorile doldurun. 24-36 saat boyunca 60 °C'de polimerize edin.
    NOT: Protokol polimerizasyondan sonra duraklatılabilir.

6. Kesitleme

  1. Bir jilet kullanarak hücre pelet etrafında blok kırpın. Daha sonra bir ultramicrotome kesit kolu na örnek chuck blok yerleştirin. Bir cam veya elmas bıçak kullanarak, hücre pelet çevreleyen bir yamuk şeklinde blok kırpın.
  2. Bir cam veya elmas bıçak kullanarak hücre pelet 90 nm ultrathin bölümleri elde edin.
  3. TEM şebekesindeki bölümlerden oluşan bir şerit seçin. Formvar kaplı bakır yuva ızgaraları (1 x 2 mm2 yuva) seri bölümlerin görüntülenmesi nde yararlıdır. Kenarı bir filtre kağıdı üzerinde lekeleyerek ızgarayı kurutun ve TEM ızgara depolama kutusunda saklayın.
    NOT: Protokol kesitten sonra duraklatılabilir.

7. TEM Görüntüleme

  1. TEM tutucusu üzerinde ızgara monte ve mikroskop içine yerleştirin. KriyoAPEX numuneleri tatmak için 80 kV'da rutin olarak Tecnai T12 kullanıyoruz. APEX2 etiketleme ile hücrelerin ve hücre altı yapıların görüntülerini edinin.
  2. İstenirse, kurşun boyama sonrası kullanarak ek membran kontrastı elde edin. Lekeli olmayan örneklerin(Şekil 2I-K) ve kurşun lekeli örneklerin karşılaştırılması için Şekil 2'yebakınız ( Şekil 2A-H).
    1. Seyreltik sodyum klorür çözeltisi (~1,5 mM), 1 dk her biri için 2x, sonra 10 dakika için 1x bir damla üzerinde float kuru ızgaraları bölüm tarafı aşağı.
    2. 1 dk. 1 dk. 1 dk için Sato kurşun çözeltisi bir damla Float ızgaraları 1 dk için sodyum klorür çözeltisi üzerinde yüzen tarafından, daha sonra DI su 3x üzerinde 1 dk. Lekeler fazla sıvı ızgaraları ve bir ızgara kutusunda saklamak.
      DİkKAT: Kurşun toksik bir kimyasaldır ve uygun güvenlik prosedürleri ve kişisel koruyucu ekipmanlar la birlikte kullanılmalıdır. Kurşun içeren çözeltiler tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf edilmelidir.
  3. TEM'deki lekeli örnekler.
    NOT: TEM için geleneksel numune hazırlığında, öncü kontrast adım TEM görüntüleme öncesinde gerçekleştirilir. Ancak, kriyoAPEX örnekleri için önce kontrastsız örneklerde görüntüleme nin yapılması önerilir. Bu, etiketten gelen sinyalin daha hafif lekeli hücresel yapılarla güçlü kontrastı ile kolayca bulunabilmesini sağlar. Birçok örnek için, başka bir boyama gerekli olacaktır; ancak ek membran kontrastı isteniyorsa kurşun sonrası boyama yapılabilir (Adım 7.2) ve numune yeniden görüntülenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

KriyoAPEX yöntemini kullanarak ultrayapısal korumayı geleneksel fiksasyon ve dehidratasyonla karşılaştırmak için endoplazmik retikulum membranının (ERM; ER membran) peptid APEX2 ile etiketlendi ve HEK-293T hücrelerine transfected. ERM-APEX2 ER'nin sitoplazmik yüzüne lokalize olur ve ER yapısını organize pürüzsüz ER (OSER)34,42,43olarak bilinen morfolojik olarak farklı yapılara dönüştürür. OSER morfolojisi, ultrastrüktürel korumayı karşılaştırmak için en uygun bölge olarak hizmet veren pürüzsüz, paralel, yoğun yığılmış membranbölgeleri içerir. Numunenin geleneksel APEX yöntemleriile hazırlanması, OSER yapılarının açık bir şekilde etiketletilmesiyle sonuçlandı (Şekil 2A-D). Yüksek büyütme de muayene üzerine, yığılmış membranlar kabarık çıktı ve konsantrik membran yoğunlukları arasında tekdüze olmayan boşluklar mevcut, kötü membran koruma ve lipid çıkarma gösteren(Şekil 2D). CryoAPEX tarafından hazırlanan örnek de açıkça OSER yapıların etiketleme tanımlanmış vardı; ancak membranlar pürüzsüz ve paraleldi ve lipid ekstraksiyonu çok azdı (Şekil 2E-H). CryoAPEX'in sonuçları, ek kimyasal fiksasyon ve APEX2/DAB reaksiyon adımları olmadan HPF/FS'den geçirilen bir numuneden elde edilen numuneye benzer yüksek kalitede koruma elde edilmiştir(Şekil 2I–K).

KriyoAPEX yöntemi, görsel olarak kayda değer membran korumanın yanı sıra, bazı durumlarda protein dağılım şekillerinin görülebileceği ilgi proteinini de korur. Bu noktayı göstermek için, başka bir ER-lokalize protein, huntingtin maya etkileşim protein E (HYPE) kullanılır. HYPE ERmembran 44, 45,46,47luminal yüzünde bulunan bir membran proteindir. HYPE-APEX2 yapıları HEK-293T hücrelerinde aşırı ifade edildi. 90 nm incelikli kesitlerin TEM analizi, HYPE'nin çevresel ER'nin yanı sıra nükleer zarfta da mevcut olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 3A,B). Ayrıca, HYPE yoğunluğu lümenal ER membran(Şekil 3C, oklar) boyunca düzenli aralıklı foci içine çözülmüş başardı. HYPE dağılımı ve foci de geleneksel fiksasyon ve dehidratasyon ile hazırlanan bir örnek te görülebiliyordu; ancak geniş membran bozulması ve ekstraksiyonu mevcuttu ve bu da numunenin suboptimal olduğunu göstermektedir (Şekil 3D,E).

Bir dizi etiketli protein için kriyoAPEX yönteminin sağlam organeller özgüllüğünü ve uygulanabilirliğini göstermek için, üç hücresel belirteç kullanarak APEX2 etiketlemeuyguladık. Mitokondri mito-V5-APEX234kullanılarak etiketlenmiştir. Mitokondriyal matriksin bu belirteci sadece mitokondriye özgü boyama(Şekil 4A). Aynı şekilde, sadece plazma zarının farklı boyanmasına neden olan CAAX-APEX234kullanarak plazma membran etiketlemesini değerlendirdik (Şekil 4C). Hücre içi organellerde etiketleme gözlenmedi (Şekil 4C). Ayrıca, apex2 geni48ile α-mannosidaz fare izoform ilk 118 amino asitlerer eriterek Golgi lümen için bir belirteç olarak yeni bir yapı oluşturdu. Ortaya çıkan MannII-APEX2 geçici olarak daha sonra kriyoAPEX yöntemi ile hazırlanan hücrelere aktarıldı. Lekeli Golgi yığınları çevredeki organellerden açıkça ayırt edilebilirdi (Şekil 4B). Tek tek yığınlar, sarnıçlar ve bazı veziküller, Golgi boyama tipik olarak etiketlenmiştir (Şekil 4B). Bu belirteçler, kriyoAPEX yönteminin çeşitli organeller içindeki membran proteinlerinin çevredeki alt hücresel yapılardan ayırt etmek için yeterince yüksek çözünürlükte özel etiketleme sağladığını göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: CryoAPEX protokolündeki temel adımların şeması. (A) Hücreler büyütülür ve apex2 plazmid ile transfected. (B) Hücreler pelletli ve glutaraldehit ile sabit, ardından (C) DAB ve hidrojen peroksit ile inkübasyon peroksidaz reaksiyon ürün üretmek için. (D) Pelet HPF tarafından kriyosabitlenir, (E) ağır metaller ve aseton ile ikame donma, ve (F) resenin içine gömülü. İnce kesitler mikrotom üzerinde toplanır. (G) TEM görüntüleme yapılır ve boyama sonrası ek kontrast eklenebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Geleneksel kimyasal fiksasyon, kriyoAPEX ve HPF/FS kullanılarak OSER membran korumanın karşılaştırılması. Kimyasal olarak sabit yeniden düzenlenen ER morfolojisi, DAB geleneksel kimyasal fiksasyon ve alkol dehidratasyonu(A-D) veya cryoAPEX(E-H)ile işlenen ERM-APEX2 ifade hücreleri tepki verdi ERM-APEX2 canlı ve DAB reaksiyonu olmadan ifade hücreleri ile karşılaştırıldı(I-K). Canlı kriyofixed hücreler en iyi ulaşılabilir ultrayapısal koruma temsil eder ve burada iki APEX tabanlı algılama protokolleri(A-H)ile elde edilen membran korunması değerlendirmek için metrik olarak hizmet vermektedir. KriyoAPEX (G ve Hpanellerinde örneklenen) tarafından elde edilen ER türetilmiş membranların eşit aralıklı paralel lamellar istifleme, geleneksel yöntemlerle elde edilen kabarık membranlar aksine (Paneller C ve D),kriyoAPEX tarafından elde edilen üstün membran koruma vurgulamaktadır. Bu rakam Sengupta ve ark. 201948'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: APEX2 etiketli ER membran proteininin protein lokalizasyonu periyodik odak lara dönüştürülebilir. (A) HYPE-APEX2 ifade eden ve kriyoAPEX tarafından işlenen bir HEK-293T hücresinin ince bir bölümünün bir görüntü iyi korunmuş (yoğun) sitoplazmik arka plan(B,C)er boyama ortaya koymaktadır. Periferik ER küçük bir bölümünün yüksek büyütme görüntüleri (A sarı kutu ile çizilmiş ve Bgösterilir , Cgösterilen B kırmızı kutu daha fazla büyütme ile ) APEX2 oluşturulan yoğunluk periyodik odak sergiler (B, kırmızı kutu ve C, beyaz ok başları HYPE foci arasında periyodik gösteren). (D) Hype-APEX2 ifade eden ve geleneksel kimyasal fiksasyon ve dehidratasyon tarafından hazırlanan bir hücrenin ince bir bölümünün görüntü kortikal ER ve nükleer zarf (kırmızı oklar) belirli boyama gösterir. (E) Daha yüksek bir büyütme de, periyodik HYPE özgü odak ER (sarı kutu ve inset beyaz ok kafaları) uzanır içinde belirgin, geniş membran bozulmasına rağmen, kırmızı oklar ile gösterilir. NE = nükleer zarf. Bu rakam Sengupta ve ark. 201948'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Organel belirteçleri APEX2 etiketli proteinlerden elde edilen sinyalin özgüllüğünü gösterir. Apex2 etiketli protein yapıları mitokondriyal matrislokalize etmek için tasarlanmış (mito-V5-APEX2; Agösterilir), veya Golgi lümen (α-mannII-APEX2; Bgösterilir), veya plazma membranı (CAAX-APEX2; Cgösterilir) geçici OLARAK HEK293 hücrelerinde ifade edildi ve örnekler krioAPEX tarafından işlendi. Her yapı organel özgü yoğunluklar verdi. α-mannIIAPEX2 (panel B)veya CAAX-APEX2 (panel C)ifade eden hücrelerden iki bölümün (sarı veya kırmızı kutular) büyütülmüş görünümleri gösterilir. Bu rakam Sengupta ve ark. 201948'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada sunulan kriyoAPEX protokolü, hücreli ortamda membran proteinlerinin lokalizasyonunu karakterize etmek için sağlam bir yöntem sağlar. Genetik olarak kodlanmış APEX2 etiketinin kullanımı sadece ilgi çekici bir proteinin kesin lokalizasyonunu sağlamakla kalmıyor, cryofixation ve düşük sıcaklıklı dehidratasyon kullanımı çevredeki hücresel ultrayapının mükemmel korunmasını ve boyanması sağlar. Bu yaklaşımlar, hücre altı bağlamında yüksek hassasiyetle bir proteini yerelleştirmek için güçlü bir araçtır.

Bu yöntemin ilerlemesinin püf noktası, geleneksel TEM yöntemleri ile hazırlandıktan sonra yaşanan ultrayapı kaybının, fiksasyon adımı40'tançok dehidratasyon adımından kaynaklanmasıdır. Daha önce peroksidaz bazlı yöntemlerin HPF/FS ile uyumsuz olduğuna inanıldı çünkü peroksidaz reaksiyonu öncesinde kimyasal fiksasyon alameti gerekiyorlardı. Bu sorunu aşmak için, CryoCHEM adlı bir protokol son zamanlarda hangi örnekler başlangıçta kriyofixed, rehidrasyon ve peroksidaz reaksiyonu takip geliştirilmiştir49. Bu yaklaşım, numune boyama ve koruma da önemli iyileştirmeler ile mükemmel hedef lokalizasyon sağlar. Doku örneklerinde ve korgöreceli floresan ve elektron mikroskobu istenilen durumlarda yararlı olduğu gösterilmiştir. CryoCHEM'e paralel olarak yöntemimiz glutaraldehit fiksasyonunu HPF ve FS ile birleştirir. CryoAPEX, küçük hücresel numuneler için bile etkili bir şekilde çalışan kolaylaştırılmış bir protokol sunar.

Yüksek basınç dondurma ve dondurma ikame cihazlarına erişim kriyoAPEX yöntemi için çok önemlidir. Bu aletler ve beceriler EM tesislerinde giderek daha yaygındır. HPF ve FS ekipmanları hazır olmasa bile, kimyasal olarak sabit numune mütevazımesafeler40taşınacak kadar kısa bir süre için kararlıdır. Numunelerin DAB reaksiyonundan sonra 4 °C'de HPF'den en az 48 saat önce önemli bir kalite kaybı olmaksızın depolanabildiği bulunmuştur. CryoAPEX protokolünün bir diğer kritik yönü, sağlam bir deney ve ikna edici sonuçlar için gerekli olan kontrollerin dahil edilmesidir. %100'den daha az verimlilikle geçici transfeksiyon tarafından hazırlanan numuneler negatif kontrol hücrelerinin yanı sıra aynı numune içindeki etiketli hücreleri de içerecektir. APEX2 kararlı ifadesi ile hücre hatları kullanıyorsanız, ayrı bir negatif kontrol ilgi apex2 etiketli protein ile hücrelerin transfeksiyon tarafından hazırlanmalıdır. Organeller kontroller olarak hizmet verebilir çeşitli yapılar Addgene üzerinden mevcuttur, ve yayınlanan görüntüler doğrulama için kullanılabilir bu ve diğer yayınlarmevcuttur 33,34,36,48. Yeni APEX2 füzyon yapılarının deneysel tasarımı ve doğrulanması hakkında derinlemesine tartışma Martell ve ark.36 tarafından sağlanmıştır.

cryoAPEX membran proteinlerinin tespiti için genel olarak yararlı olmakla birlikte, bazı sınırlamalar mevcuttur. APEX2 küçük bir 28 kDa protein olmasına rağmen, bazı proteinler etiketi dahil etmek mümkün olmayabilir33,34. APEX2, diffüz reaksiyon ürünü33,36nedeniyle, sitosol çözünür proteinlerin etiketlanması için yararlı olarak kabul edilmez. Ayrıca, protein küçük miktarlarda tespiti çevreleyen hücrede boyama varlığı nedeniyle bir sorun teşkil etmektedir. HPF ve FS tarafından hazırlanması geleneksel fiksasyon ve dehidratasyon ile elde edilen hücresel bileşenleri korur. Bu hücrede genel koyu boyama yol açar, potansiyel APEX2 etiketleme düşük seviyeleri ile rekabet.

CryoAPEX tekniği birçok protein için yaygın olarak uygulanabilir ve optimizasyon gerektiren sınırlı sayıda adım vardır. İlk olarak, proteinler arasındaki bireysel değişkenlik nedeniyle, sinyalin hücrenin arka plan boyama sının üzerinde görüntülenebilmesi için protein ekspresyonu düzeyi ve/veya DAB reaksiyon süresinin ayarlanması gerekebilir. Yeni APEX2 füzyon yapılarının doğrulanması ve ifadenin ve DAB boyamanın optimizasyonu için yararlı bilgiler ve protokoller Martell ve ark.36 Hücresel boyama perspektifinden, FS protokolü ve/veya kimyasalların farklı hücre tipleri, dokular veya organizmalar50, 51,52,53,54olmak üzere farklı organel zarlarının optimal görselleştirilmesi için ayarlanması gerekebilir. Deneyimlerimize göre, burada sunulan FS koşulları çeşitli memeli hücre hatları için iyi çalıştı.

CryoAPEX'in hibrit yaklaşımı diğer birçok genetik etiketleme tekniğine uygulanma potansiyeline sahiptir. HpF / FS ile geleneksel alkol dehidratasyon yerine büyük ölçüde ultrastrüktasyon koruma ve protein lokalizasyon bilgileri geliştirmek bekleniyor. Bir monolayer olarak hücreleri düzeltmek için bir hücre substrat olarak safir diskler kullanarak sitoiskelet ve hücre hücre temasları da dahil olmak üzere hücre çevre, korunması nı artırır. Protokolde küçük değişiklikler safir diskler kullanmak için gerekli olacaktır. APEX teknolojisi gfp bağlayıcı peptid35ile yeşil floresan protein (GFP) etiketli proteinleri tespit etmek için kullanılabilir. Bu dolaylı algılama yöntemi, zaten GFP ile etiketlenmiş sayısız protein için APEX teknolojisini kullanma potansiyelini ortaya çıkarmaktadır. Son zamanlarda tanıtılan bölünmüş APEX2 yakınlık ve etkileşim çalışmaları için avantajlı olacak55. Ayrıca, mevcut HRP tabanlı yöntemler hücresel korumayı geliştirmek için HPF/FS ile kombine edilebilir. Bir örnek fluorescent indicator ve peroksidaz efride precipitation için E M resolution (FLIPPER), hangi bireysel hücre belirteçleri hem floresan etiketi ve HRP ile erimiş olan, Golgi veya ER56için lümenal belirteçleri sağlayan . RNA etiketleme 57için optimize edilmiş substratlar da dahil olmak üzere, DAB yerine geliştirilmiş peroksidaz yüzeylerin kullanımı da mümkündür. CryoAPEX ayrıca elektron tomografisi yoluyla protein dağılımının üç boyutlu analizi için gerekli hücre içi etiketleme ve ultrayapısal koruma sağlar ve potansiyel olarak Yüksek hacimlerde SBF-SEM veya FIB-SEM48,58.

Genel olarak, CryoAPEX geniş uygulanabilirliği ile sağlam bir yöntemdir. Prensip olarak, herhangi bir membran proteinuygulanabilir, bir organel lümenal uzay içinde olsun, sitoplazmik yüz üzerinde, veziküller içinde, hücreplazma zarında ve hatta hücre dışı uzayda. Bu geniş membran protein yelpazesi için kriyoAPEX yöntemi, bir proteinin hücre altı bağlamında doğru bir şekilde lokalizasyonunu ve dağılımını görme potansiyeli sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmezler.

Acknowledgments

Burada açıklanan protokol Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48tarafından yayınlanan bir yayın kaynaklanmaktadır. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden R01GM10092 (S.M.'ye) ve AI081077 (R.V.S.) hibeleri ile desteklenir. Ctsi-106564 (S.M.) Indiana Klinik ve Çeviri Bilimleri Enstitüsü ve PI4D-209263 (S.M.) Purdue Üniversitesi Enstitüsü Inflamasyon, İmmünoloji ve Bulaşıcı Hastalık için.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate Sigma-Aldrich D5637-1G
Acetone (Glass Distilled) Electron Microscopy Sciences 10016
Beakers; Plastic, Disposable 120 cc Electron Microscopy Sciences 60952
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G
Cryogenic Storage Vials, 2 mL VWR 82050-168
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Corning 10-017-CV
Durcupan ACM Fluka, single component A, M epoxy resin Sigma-Aldrich 44611-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component B, hardener 964 Sigma-Aldrich 44612-500ML
Durcupan ACM Fluka, single component C, accelerator 960 (DY 060) Sigma-Aldrich 44613-100ML
Durcupan ACM Fluka,single component D Sigma-Aldrich 44614-100ML
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 6 mm Electron Microscopy Sciences 70901
Embedding mold, standard flat, 14 mm x 5 mm x 4 mm Electron Microscopy Sciences 70900
Fetal Bovine Serum; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement Corning 355104
Glass Knife Boats, 6.4 mm Electron Microscopy Sciences 71008
Glass Knifemaker Leica Microsystems EM KMR3
Glutaraldehyde 10% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 16120
HEK 293 Cells ATCC CRL-1573
High Pressure Freezer with Rapid Transfer System Leica Microsystems EM PACT2 Archived Product Replaced by Leica EM ICE
Hydrogen Peroxide 30% Solution Fisher Scientific 50-266-27
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific L3000015
Membrane carrier for EM PACT2, 1.5 mm x 0.1 mm Mager Scientific 16707898
Osmium Tetroxide, crystalline Electron Microscopy Sciences 19110
Phosphate Buffered Saline (PBS) 20X, Ultra Pure Grade VWR 97062-950
Plastic Capsules for AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm Mager Scientific 16702738
Slot grids, 2 x 1 mm copper with Formvar support film Electron Microscopy Sciences FF2010-Cu
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2 M, pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 102090-962
Sodium Hydroxide, Pellet 500 G (ACS) Avantor Macron Fine Chemicals 7708-10
Tannic Acid Electron Microscopy Sciences 21710
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile, Corning, 100 mm VWR 25382-166
Ultra Glass Knife Strips Electron Microscopy Sciences 71012
Ultramicrotome Leica Microsystems EM UC7
Uranyl Acetate Dihydrate Electron Microscopy Sciences 22400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  2. Sydor, A. M., Czymmek, K. J., Puchner, E. M., Mennella, V. Super-Resolution Microscopy From Single Molecules to Supramolecular Assemblies. Trends in Cell Biology. 25, 730-748 (2015).
  3. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6, 022003 (2018).
  4. De Mey, J., Moeremans, M., Geuens, G., Nuydens, R., De Brabander, M. High resolution light and electron microscopic localization of tubulin with the IGS (Immuno Gold Staining) method. Cell Biology International Reports. 5, 889-899 (1981).
  5. Faulk, W., Taylor, G. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Brown, W. J., Constantinescu, E., Farquhar, M. G. Redistribution of Mannose-6-Phosphate Receptors Induced by Tunicamycin and Chloroquine. The Journal of Cell Biology. 99, 320-326 (1984).
  7. Brown, W. J., Farquhar, M. G. The Mannose-6-phosphate Enzymes Is Concentrated Receptor for Lysosomal in Cis Golgi Cisternae. Cell. 36, 295-307 (1984).
  8. Sternberger, L. A., Hardy, P. H., Cuculis, J. J., Meyer, H. G. The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 18, 315-333 (1970).
  9. Oliver, C. Pre-embedding Labeling Methods. Immunocytochemical Methods and Protocols. Oliver, C., Jamur, M. C. 588, Humana Press. 381-386 (2010).
  10. Polishchuk, E. V., Polishchuk, R. S. Pre-embedding labeling for subcellular detection of molecules with electron microscopy. Tissue and Cell. 57, 103-110 (2019).
  11. Polishchuk, R. S., Polishchuk, E. V., Luini, A. Visualizing Live Dynamics and Ultrastructure of Intracellular Organelles with Preembedding Correlative Light-Electron Microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy. Mueller-Reichert, T., Verkade, P. 111, Elsevier. 21-35 (2012).
  12. Humbel, B. M., De Jong, M. D. M., Müller, W. H., Verkleij, A. J. Pre-embedding immunolabeling for electron microscopy: An evaluation of permeabilization methods and markers. Microscopy Research and Technique. 42, 43-58 (1998).
  13. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9, 152-158 (2012).
  14. Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New Frontiers in Gold Labeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 471-480 (2000).
  15. Hainfeld, J. F., Furuya, F. R. A 1.4-nm Gold Cluster Covalently Attached to Antibodies Improves Immunolabeling. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40, 177-184 (1992).
  16. Baschong, W., Stierhof, Y. Preparation, Use, and Enlargement of Ultrasmall Gold Particles in Immunoelectron Microscopy. Microscopy Research and Technique. 42, 66-79 (1998).
  17. Roth, J., Bendayan, M., Orci, L. Ultrastructural loclaization of intracellular antigens by the use of Protein A-gold complex. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 26, 1074-1081 (1978).
  18. Armbruster, B. L., et al. Specimen preparation for electron microscopy using low temperature embedding resins. Journal of Microscopy. 126, 77-85 (1982).
  19. Fowler, C. B., Leary, T. J. O., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Laboratory Investigation. 88, 785-791 (2008).
  20. Newman, G. R., Hobot, J. A. Modern Acrylics for Post-embedding Immunostaining Techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35, 971-981 (1987).
  21. Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. The Journal of Cell Biology. 57, 551-565 (1973).
  22. Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143, 139-149 (1986).
  23. Möbius, W., Posthuma, G. Sugar and ice Immunoelectron microscopy using cryosections according to the Tokuyasu method. Tissue and Cell. 57, 90-102 (2019).
  24. Gaietta, G., et al. Multicolor and Electron Microscopic Imaging of Connexin Trafficking. Science. 296, 503-508 (2002).
  25. Uttamapinant, C., et al. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 10914-10919 (2010).
  26. Porstmann, B., Porstmann, T., Nugel, E., Evers, U. Which of the Commonly Used Marker Enzymes Gives the Best Results in Colorimetric and Fluorimetric Enzyme Immunoassays: Horseradish Peroxidase, Alkaline Phosphatase or Beta-Galactosidase. Journal of Immunological Methods. 79, 27-37 (1985).
  27. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biology. 9, 1001041 (2011).
  28. Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 160, 70-82 (2007).
  29. Wang, Q., Mercogliano, C. P., Löwe, J. A ferritin-based label for cellular electron cryotomography. Structure. 19, 147-154 (2011).
  30. Risco, C., et al. Specific, sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy. Structure. 20, 759-766 (2012).
  31. Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. E. Chimeric Molecules Employing Horseradish Peroxidase as Reporter Enzyme for Protein Localization in the Electron Microscope. Methods in Enzymology. Thorner, J., Emr, S. D., Abelson, J. N. 327, 35-45 (2000).
  32. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetrcysteine-tagged proteins in intact cells. Nature Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  33. Martell, J. D., et al. Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy. Nature Biotechnology. 30, 1143-1150 (2012).
  34. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12, (2015).
  35. Ariotti, N., et al. Modular Detection of GFP-Labeled Proteins for Rapid Screening by Electron Microscopy in Cells and Organisms. Developmental Cell. 35, 513-525 (2015).
  36. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12, 1792-1816 (2017).
  37. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130, 877-889 (2008).
  38. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure Freezing for the Preservation of Biological Structure: Theory and Practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  39. McDonald, K. L. High-Pressure Freezing for Preservation of High Resolution Fine Structure and Antigenicity for Immunolabeling. Electron Microscopy Methods and Protocols. Hajibagheri, N. 117, Humana Press. 77-97 (1999).
  40. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  41. Korn, E. D., Weisman, R. A. Loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 116, 309-316 (1966).
  42. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. Journal of Cell Biology. 163, 257-269 (2003).
  43. Sandig, G., et al. Regulation of endoplasmic reticulum biogenesis in response to cytochrome P450 overproduction. Drug Metabolism Reviews. 31, 393-410 (1999).
  44. Faber, P. W., et al. Huntingtin interacts with a family of WW domain proteins. Human Molecular Genetics. 7, 1463-1474 (1998).
  45. Worby, C. A., et al. Article The Fic Domain Regulation of Cell Signaling by Adenylylation. Molecular Cell. 34, 93-103 (2009).
  46. Sanyal, A., et al. A Novel Link between Fic (Filamentation Induced by cAMP) - mediated Adenylylation / AMPylation and the Unfolded Protein Response. The Journal of Biological Chemistry. 290, 8482-8499 (2015).
  47. Mattoo, S., et al. Comparative Analysis of Histophilus somni Immunoglobulin-binding Protein A (IbpA) with Other Fic Domain-containing Enzymes Reveals Differences in Substrate and Nucleotide Specificities. The Journal of Biological Chemistry. 286, 32834-32842 (2011).
  48. Sengupta, R., Poderycki, M. J., Mattoo, S. CryoAPEX - an electron tomography tool for subcellular localization of membrane proteins. Journal of Cell Science. 132, 222315 (2019).
  49. Tsang, T. K., et al. High-quality ultrastructural preservation using cryofixation for 3D electron microscopy of genetically labeled tissues. eLife. 7, 1-23 (2018).
  50. Giddings, T. H. Freeze-substitution protocols for improved visualization of membranes in high-pressure frozen samples. Journal of Microscopy. 212, 53-61 (2003).
  51. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  52. McDonald, K. Cryopreparation methods for electron microscopy of selected model systems. Methods in Cell Biology. 79, 23-56 (2007).
  53. Buser, C., Walther, P. Freeze-substitution: the addition of water to polar solvents enhances the retention of structure and acts at temperatures around -60 degrees C. Journal of Microscopy. 230, 268-277 (2008).
  54. Jiménez, N., et al. Tannic acid-mediated osmium impregnation after freeze-substitution A strategy to enhance membrane contrast for electron tomography. Journal of Structural Biology. 166, 103-106 (2009).
  55. Han, Y., et al. Directed Evolution of Split APEX2 Peroxidase. ACS chemical biology. 14, 619-635 (2019).
  56. Kuipers, J., Van Ham, T. J., Kalicharan, R. D., Schnell, U., Giepmans, B. N. G. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Research. 360, 61-70 (2015).
  57. Zhou, Y., et al. Expanding APEX2 Substrates for Spatial-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins in Living Cells. Angewandte Chemie. , International ed. in English (2019).
  58. Joesch, M., et al. Reconstruction of genetically identified neurons imaged by serial-section electron microscopy. eLife. 5, 1-13 (2016).

Tags

Biyoloji Sayı 156 CryoAPEX membran protein APEX2 iletim elektron mikroskobu cryofixation yüksek basınç dondurma dondurma ikamesi
Ultrayapısal Olarak Korunmuş Hücrelerde Membran Protein Lokalizasyonunun Elektron Mikroskobu Analizi için CryoAPEX Yöntemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin,… More

Mihelc, E. M., Angel, S., Stahelin, R. V., Mattoo, S. The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells. J. Vis. Exp. (156), e60677, doi:10.3791/60677 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter