Summary
该协议的总体目标是指导如何从中枢神经系统中提取、维持和分离鼠星细胞和微胶质细胞，然后感染原生动物寄生虫。
Abstract
星细胞和微胶质是最丰富的胶质细胞。他们负责中枢神经系统（CNS）的生理支持和平衡维护。越来越多的证据表明，它们参与控制传染病，这证明人们越来越有兴趣改进分离原发星体和微胶质的方法，以评估它们对影响国家神经系统的感染的反应。考虑到锥虫瘤cruzi（T.cruzi）和弓形虫贡迪（T.贡迪）感染在CNS的影响，在这里我们提供一种方法，提取，维持，分离和感染鼠星细胞和微胶质细胞与原生动物寄生虫。从新生儿皮质中提取的细胞在体外保存14天，并定期更换差分介质。通过机械分离从相同的提取协议中获得星细胞和微胶质。通过流动细胞测定进行渗透后，细胞感染了原生动物寄生虫。感染率由不同时间点的荧光显微镜决定，从而能够评估胶质细胞控制原生动物入侵和复制的差分能力。这些技术代表了研究星细胞和微胶质对感染的反应的简单、廉价和有效的方法，为进一步的神经免疫学分析开辟了领域。
Introduction
中枢神经系统主要由神经元和胶质细胞11、2、32,3组成。微胶质和星形细胞是中枢神经系统中最丰富的胶质细胞。Microglia，即住院巨噬细胞，是CNS33、44中的免疫能力和噬菌体细胞，而星形细胞负责维持平衡和发挥支持作用5。
尽管胶质细胞通常被认为是负责神经元6、77的支撑和保护，但最近的文献中6已经描述了这些细胞的新兴功能，包括它们对感染的反应88、9、10、11。9,10,11因此，有一个推动开发方法，以隔离这些胶质细胞，以单独理解其功能。
有一些替代模型来研究胶质细胞，而不是原始培养，如不朽的细胞谱系和体内模型。然而，不朽的细胞更有可能经历遗传漂移和形态变化，而体内研究施加有限的操作条件。相反，原生培养物易于处理，最好类似于体内细胞，也允许我们控制实验因子12，13。12,在这里，我们描述了如何在同一协议中提取、维持和分离鼠星细胞和微胶质原细胞的指南。此外，我们还提供了在这些文化中如何处理原生动物感染的示例。
从新生儿小鼠（最多3天）中提取的CNS细胞在差异培养的培养物上14天，允许星细胞和微胶质细胞优先生长。由于微胶质位于附着的星细胞之上，细胞群在轨道培养箱中机械地分离。接下来，我们收集了所有含有微胶质的上清液，并添加了胰蛋白酶来分离星体细胞。通过流细胞测定和根据期望的实验进行表层化评估的分离胶质细胞。
我们还提供了如何将这些孤立的微胶质和星细胞感染原生动物寄生虫的例子。T. Gondii是一种高度神经性原生动物，负责弓形虫病14，而T.Cruzi负责恰加斯病，这可能导致神经紊乱的发展在CNS15，16。,16此外，据报道，感染T.gondii17，18,18或T.cruzi19，20，21是免疫功能低下患者可能死亡的原因。 T. cruzi19,20,21因此，从CNS阐明胶质细胞在控制原生动物感染中的作用具有十分重要的意义。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有涉及小鼠的实验程序都根据巴西国家法律（11.794/2008）进行，并经圣保罗联邦大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 胶质细胞提取、维护和分离
注：用于胶质细胞提取的小鼠数量取决于执行所需实验所需的细胞数量。在该协议中，从6只新生儿C57BL/6小鼠中总共获得了2.7 x 107个星囊和4 x 106微胶质。所有手术均在第二类生物安全柜无菌条件下进行。
- 第1天
- 制备纯汉克的平衡盐溶液（HBSS）和HBSS = 10%的热灭活胎儿牛血清（FBS）（参见材料表）。
- 制备补充的Dulbecco的改良鹰介质（DMEM）/F12（10%FBS = 0.08 mM青霉素+ 0.09 mM链霉素= 12.5 mM HEPES = 30 mM碳酸氢钠，pH 7.2），并过滤它与0.22μm过滤器（见材料表）。
注：所有培养介质应储存在4°C，但在开始实验前，必须在37°C下预热20分钟。 - 在高压灭菌器中消毒所有手术器械（剪刀、铲子和钳子），并在手术过程中使用70%乙醇。
- 将新生儿（最多3天）的小鼠放入密封的腔室中，里面装有浸着西罗兰的棉花5分钟，进行深度麻醉。
- 用70%乙醇喷洒老鼠，用剪刀把动物斩首。
- 沿颅骨用剪刀进行下垂切割（前身）以打开它并露出大脑。用钳子将头骨与大脑分开。使用微刮刀取出大脑，以保持大脑的完整性。
- 将大脑放在干式培养皿中（直径为 6 厘米）。使用微刮刀取出嗅觉灯泡和小脑。将皮层移到另一个包含 HBSS = 10% FBS（2 mL/Petri 盘）的培养皿（直径为 6 厘米）。
- 用无菌剪刀将脑组织切成小块，并使用p1000微移液器将每个脑组织与HBSS + 10% FBS转移到不同的15 mL锥形管。确保最终体积为 2 mL/管。如果没有，则使用 HBSS = 10% FBS 完成。
注： 协议可以在这里暂停。如果是这样，带有CNS组织的锥形管必须放置在冰上长达1小时。 - 用 3 mL 的 HBSS = 10% FBS（每管）和发量后清洗切切的脑组织。小心地取出上清液。重复此步骤 3 次。
注：此步骤旨在清除碎片并恢复提取的组织。 - 用3 mL纯HBSS（每管）清洗切切的脑组织，在切碎后，小心地去除上清液。重复此步骤 3 次。
注：此步骤旨在从以前的洗注中去除剩余的血清，因为细胞将在下一步中尝试。 - 每管加入3 mL的胰蛋白酶，在37°C的水浴中放置30分钟，每5分钟轻轻摇动管子。通过倒置或突然混合管子，避免气泡。
注：此步骤旨在消化收集的组织。 - 要停用胰蛋白酶，请每管HBSS +10%FBS用3 mL清洗组织，并在组织切除后小心去除上清液。重复此步骤 3 次。
- 用每管纯HBSS3 mL清洗组织，并小心地去除上清液。重复此步骤 2 次。
- 每管纯HBSS加入7 mL，通过移液器的连续通道使组织均质化：首先使用10 mL血清移液器，然后是5 mL，最后使用p1000微移液器。
- 均质后，在 4°C 下以 450 x g的离心机管 5 分钟。
- 丢弃上清液，用4 mL的HBSS重新悬浮颗粒= 每管10%的FBS。
- 将细胞转移到预处理的T-75烧瓶中，以获得最佳的细胞培养附着力（参见材料表）。
注：每瓶每只动物的加工组织。 - 将烧瓶放在培养箱中37°C和5%CO2，30分钟进行粘附。
- 每瓶加入10 mL补充DMEM/F12，在37°C和5%CO2孵育。
注：最终体积为每瓶14 mL。
- 第3天
- 从 T-75 烧瓶中取出 7 mL 培养介质，加入 7 mL 的新鲜补充 DMEM/F12。
注：烧瓶将包含大量的细胞碎片和多云的外观。
- 从 T-75 烧瓶中取出 7 mL 培养介质，加入 7 mL 的新鲜补充 DMEM/F12。
- 第5天
- 从 T-75 烧瓶中取出所有介质，加入 14 mL 新鲜补充的 DMEM/F12。
注：从烧瓶中更换介质，以去除碎屑和非粘附细胞。 - 每48小时后，去除6 mL的上清液，并添加7 mL的新鲜补充DMEM/F12介质，直到第14天的培养。
- 从 T-75 烧瓶中取出所有介质，加入 14 mL 新鲜补充的 DMEM/F12。
- 第14天
- 去除6 mL的上清液，加入7 mL的新鲜补充DMEM/F12介质后，紧紧关闭T-75烧瓶。
- 将它们以200 rpm和37°C在地面轨道振动器中过夜，以机械方式与星形细胞分离微胶质。
- 第15天
- 从摇床取瓶，用自己的介质大力清洗，以优化细胞分离，收获最大数量的微胶质。然后，收集上清液（含有微胶质），并转移到50mL锥形管。
- 接下来，在每个烧瓶中加入4 mL的胰蛋白酶，并在37°C下孵育5分钟，以便分离星体细胞。
- 每瓶加5 mL补充DMEM/F12，使胰蛋白酶失效。用自己的介质清洗烧瓶，将内容物转移到50mL锥形管。
- 在4°C下，将所有含有分离微胶质和星形细胞的管在450 x g下离心5分钟。
- 丢弃上清剂。将微胶质颗粒重新悬浮在 1 mL 中，在补充 DMEM/F12 的 10 mL 中重新悬挂星形细胞。
- 继续在Neubauer室或自动细胞计数器中计数。在适当的扁平底细胞培养板中，以所需的密度将补充DMEM/F12的细胞镀板（为最佳细胞附件进行预处理;参见材料表）。在37°C和5%CO2孵育细胞24小时，使其得以连接。
注：保留每个细胞群的1.5 x 106，通过流动细胞测定确认其纯度。 - 执行流细胞测量分析，以验证细胞群的纯度。
注：我们考虑微胶质CD11b+/CD45+/GFAP-和天体囊状体 CD11b-/CD45-/GFAP+。Iba1和TMEM119染色可以考虑，以充分表征微胶质22。 - 为每个细胞群（星细胞和微胶体）添加FMO（荧光减一）23和未染色样本，作为流细胞测定的控制。
- 对于每个细胞群，为每个染色和未染色的样本保留 5 x 105 个细胞。对于FMO，保留另外两个含有2.5 x 105细胞的微胶质管，并保留另一管5 x 105星形细胞。
注：由于微胶质数可能是一个限制因素，因此使用更少的细胞进行未染色和 FMO 控制。 - 在4°C下将所有微管在 450 x g 下离心 5 分钟。丢弃上清液，用500μL/微管的FACS缓冲液（磷酸盐缓冲盐水（PBS）+0.5%牛血清白蛋白（BSA）=2 mM EDTA，pH 7.2重新悬浮颗粒。
- 在4°C下将所有微管在450 x g下离心5分钟。在FACS缓冲液中稀释100μL/microtubes，将超清液弃置，重新悬浮颗粒。在室温下孵育10分钟。
- 在4°C下以450 x g的速度将所有微管和离心机中加入500μL/微管，5分钟。丢弃上清液。重新悬浮星形细胞和微胶质染色管以及具有50 μL/微管表面标记混合的星细胞FMO管：抗CD45（PE，克隆30-F11）和反CD11b（eFluor 450，克隆M1/70）（在FACS缓冲液中1：100稀释）。
- 对于未染色的单元格，使用相同交易量的 FACS 缓冲重新挂起。对于微胶质FMO，用抗CD45或抗CD11b孵育每个微胶质管。在黑暗中以4°C孵育所有样品20分钟。
- 每微管加入500 μL的FACS缓冲液。在4°C下在450 x g下离心5分钟。在零热的室温下，丢弃上清液，用100μL/微管重新悬浮颗粒（参见材料表），在室温下20分钟。
- 加入500 μL/微管渗透缓冲液1倍（参见材料表），在黑暗中在4°C孵育5分钟。
- 在4°C下将所有微管在450 x g下离心5分钟。丢弃上清液。在1倍渗透缓冲液中，在1：100稀释液中，重新悬浮星斑细胞和微胶质染色管，以及具有50μL/微管细胞内抗体抗体GFAP（APC，克隆GA5）的微胶质FMO管。对于未染色的细胞和星形细胞 FMO，使用相同体积的 FACS 缓冲液重新悬浮细胞。在黑暗中以4°C孵育所有样品30分钟。
- 通过添加 500 μL/微管的 1x 渗透缓冲液来清洗所有管。将所有微管在450 x g下离心，在4°C下5分钟。在FACS缓冲液的200μL中重新悬浮每个微管。在流量细胞仪上获取 1 x 105事件/样本。
- 为了进行分析，细胞必须首先在CD11b x CD45上封闭，然后用GFAP直方图进行封闭。
注： 未染色和 FMO 控制可用于确定门。
2. 感染率与评价
- 胶质细胞感染T.贡迪
- 板 3 x 104微胶质或星形细胞，在 37 °C 时补充 DMEM/F12，在预处理的 96 孔平板中为 24 小时提供 5% CO2（参见材料表）。
- 感染每个细胞群与T的塔奇佐特。 贡迪RH 菌株表达黄色荧光蛋白 （YFP） 在多种感染 （MOI） 1：1 （寄生虫：细胞） 稀释在 200 μL/孔的补充 RPMI （3% FBS = 0.16 mM 青霉素 = 0.18 mM 链霉素 = 12.5 mM HEPES = 30 mM 碳酸钠， pH 7.2） （见表材料）.在37°C和5%CO2孵育48小时。
- 然后，在4°C下加入100μL/1%的甲醛（PFA），在24小时内加入在PBS中稀释的100μL/井，从而丢弃上清液并固定细胞。
- 在 pH 7.2 处将 PFA 替换为 100 μL/well PBS。
- 在黑暗中室温下，通过移液在PBS pH 7.2（1：1，000）中稀释的50μL/0L（5mg/mL），小心地去除上清和染色细胞核， 1分钟。
- 用 100 μL/cwell PBS （pH 7.2） 替换 DAPI 染色溶液，并通过荧光显微镜进行分析。
- 胶质细胞感染T.cruzi
- 板 3 x 104微胶质或星形细胞，在 37 °C 时补充 DMEM/F12，在预处理的 96 孔平板中为 24 小时提供 5% CO2（参见材料表）。
注：对于每个感染点，使用不同的板。 - 感染胶质细胞与从T.cruzi Y菌株的锥体细胞在MOI5：1（寄生虫：细胞）稀释在200μL/孔的补充RPMI和孵育在37 °C和5%CO2 2小时。
注：此步骤对于寄生虫的细胞入侵非常重要。 - 通过添加200μL/well补充的RPMI来去除所有超清剂并洗井，以去除所有细胞外寄生虫。去除上清液，加入200 μL/well新鲜补充的RPMI。
注：此步骤旨在清除所有未侵入粘附细胞的寄生虫。 - 孵育受感染细胞为2小时、48小时和96小时，以评估胶质细胞11中的T.cruzi复制。
- 每次点后，取出上清液，用100μL/well的甲醇在室温下固定15分钟，然后用100μL/00PBS（pH 7.2）的液位代替甲醇。
- 固定后，准备细胞进行免疫荧光测定，如下所示。
- 为避免自荧光，将100 μL/well的50 mM NH4Cl稀释在PBS（pH 8.0）中的细胞进行15分钟处理。
- 接下来，通过在PBS中加入100 μL/well 0.5% 的Triton稀释15分钟来渗透细胞。 洗涤细胞，加入100μL/well的PBS并立即去除它（重复此步骤3次）。
- 然后，在室温下用100μL/孔的阻断溶液（5%非脂牛奶+2%BSA稀释在PBS[pH 7.2]）孵育细胞培养液。通过加入 100 μL/well PBS 来清洗细胞并立即将其移除（重复此步骤 3 次）。
- 为了染色乳腺，在室温下用30μL/well的非商业单克隆抗体（mAb）2C2抗Ssp-4蛋白（1：200）在阻滞溶液中稀释1小时孵育。
- 通过加入 100 μL/well PBS 来清洗细胞并立即将其移除（重复此步骤 3 次）。在室温下，用在PBS中稀释的30μL/well二级抗鼠抗体（1：500）孵育板1小时。
注：非商业性mAb 2C2抗Ssp-4蛋白是圣保罗联邦大学微生物学、免疫学和寄生虫学系的雷纳托·莫尔塔拉教授赠送的一份礼物。 - 在黑暗中室温下，在PBS pH 7.2（1：1，000）中加入50μL/well DAPI（5mg/mL），小心地去除上清和染色核1分钟。
- 将 DAPI 染色溶液替换为 100 μL/well 的 PBS pH 7.2，并通过荧光显微镜进行分析。
- 板 3 x 104微胶质或星形细胞，在 37 °C 时补充 DMEM/F12，在预处理的 96 孔平板中为 24 小时提供 5% CO2（参见材料表）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在14日当天，胶质细胞培养（图1A）接受了机械分离。根据CD11b、CD45和GFAP标记，通过流细胞测定对分离细胞群进行了分析。我们可以观察到占星细胞种群的纯度为89.5%，微胶质种群的纯度为96.6%（图1B）。分离后，细胞被镀在96孔平板中，24小时后，根据各自的感染协议，它们准备被T.cruzi或T.gondii感染。在这里，我们提供了T.cruzi的时间过程感染作为这些胶质细胞感染率评估的例子。
Astrocytes和微胶质（3 x 104细胞/井）在MOI= 5：1（寄生虫：细胞）感染了T.cruzi，时间为2~96小时（图2）。通过计算细胞数量和沾有DNA分热器（DAPI）的寄生虫数，通过免疫荧光来评估感染率。简单地说，我们可以观察到，T.cruzi能够以类似的速率入侵微胶质和星形细胞。此外，T. cruzi在两种细胞类型中均复制，感染后 96 h 达到最高感染率（p.i.）。有趣的是，在96小时p.i.感染率在星形细胞比在微胶质更明显，这表明微胶质细胞能够更有效地控制寄生虫复制比星细胞，正如我们之前描述的11。
需要注意的是，使用转基因寄生虫表达荧光报告器或标有特定荧光抗体的寄生虫可以改善免疫荧光显微镜，因为它们与细胞核更好地区分（图3）。此外，荧光寄生虫的感染率可以通过其他技术（如流细胞测定）来确定。在这里，我们提供了T.贡迪RH菌株构成表达YFP（图3A）和T.cruzi Y菌株染色非商业mAb 2C2抗Ssp-4蛋白的例子（图3B）。
总之，该协议描述了如何提取、维持、分离和感染鼠状微胶质和星细胞原细胞，这可能是研究胶质细胞对原生动物感染的免疫反应的有力工具，例如，简要阐明的胶质细胞对原生动物感染的免疫反应这里。
图1：原发星体和微胶质细胞。（A） 培养第14天的C57BL/6鼠胶质细胞的图像是通过倒置显微镜（400x）获得的。红色箭头表示星形细胞层，黑色箭头表示微胶质。（B） 机械分离后，星形细胞和微胶质被染色（5 x 105细胞）与荧光抗CD111b、抗CD45和抗GFAP，并通过流细胞学（1 x 105细胞采集）进行评估。星形细胞被视为CD11b-/CD45-和GFAP+细胞，而微胶质是CD11b+/CD45+和GFAP-细胞。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：胶质细胞中T.cruzi感染的时间过程。来自C57BL/6小鼠的星细胞和微胶质感染了T.cruzi Y（MOI = 5：1）。在2小时、48小时和96小时后，腔室用甲醇固定，并沾染细胞核标记DAPI（蓝色）和反GFAP（红色）。图像通过倒置荧光显微镜（400x）获得。荧光显微镜软件对细胞内的乳腺数量和受感染细胞的频率进行了评估（参见材料表）。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：星细胞和微胶质感染荧光原生动物寄生虫。（A） 3 x 104来自 C57BL/6 小鼠的微状细胞和微胶质被感染 （MOI = 1：1） 与T. gondii RH YFP （绿色） 48 小时， 室被固定与 1% PFA 和染色 DAPI （蓝色）.（B） 3 x 104来自 C57BL/6 小鼠的微状细胞和微胶质被感染 （MOI = 5：1） 与T. cruzi Y 为 96 h，并且腔室用纯甲醇固定，并沾染 DAPI（绿色）和 mAb 2C2 抗 Ssp-4（橙色）。图像是使用倒置荧光显微镜获得的。请点击此处查看此图形的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
研究分离的胶质细胞在不同生物背景下的作用的重要性在过去二十年中一直在扩大。了解神经元以外的中枢神经系统仍然是细胞生物学中一个不断增长的领域，特别是在感染或炎症条件下88，9，24。9,24胶质细胞不仅对神经元的体力支持至关重要（如以前所知），而且在许多其他生理情况下，如神经元能量供应、神经代谢、免疫监测、突触修剪、组织整形和调制等，包括,253、25、26、27、28、29。,26,27,28,29
由于星形细胞和微胶质可以在感染或无菌炎症期间进行差分调节，因此了解这些胶质细胞的个体和相对作用非常重要。虽然微胶体已知代表中枢神经系统的单核邻形细胞系统（MPS），但星形细胞也被描述为中枢神经系统免疫反应8中的关键角色。为了比较每个胶质子集在感染和/或炎症中的作用，必须从相同的提取和条件获得它们。关于微胶质和星形细胞对控制感染的反应，特别是原生动物寄生虫，几乎没有报道。从这个意义上说，我们最近证明了NLRP3的炎黄体对控制微胶质中的T.cruzi复制的要求，而不是通过一氧化氮（NO）分泌11的机制在星体细胞中。
该协议描述了一种方法，重点是同时从产后（最多3天）小鼠中提取两个最丰富的胶质细胞种群，即星细胞和微胶质。可以使用超过3天的新生小鼠，但我们发现，随着时间的推移，两个细胞的产量略有下降（数据未显示）。我们的方法不同于先前描述的星形细胞或微胶体分离协议，因为我们专注于在相同的条件下，在相同的提取中获取和分离两种细胞类型，从而优化实验动物的使用，并改进这些细胞在免疫环境中的相对作用的研究。此外，我们的协议还优化了两种细胞类型的产量。产量通常为3×5 x 106 6天体囊和3×5×105微胶质每瓶。将此与其他协议进行比较，这些协议导致每个T-75瓶使用更多动物的细胞较少（有些协议每瓶使用2~3只动物）30，31。,31
该协议的另一个优点是获得孤立的星细胞和微胶质所需的时间。在14天内，有可能获得成熟的微胶质。事实上，必须强调，正如Flode和Combs所证明的，超过14天的微胶质目前分泌细胞因子的能力减弱;在神经免疫学背景30中考虑这一点是非常重要的。尽管尚未完全理解成熟的天体细胞制造者，但GFAP主要用于描述反应灵敏和活跃的星形细胞。某些协议仅在培养 21 或 28 天后达到 90% GFAP 阳性细胞的水平。因此，我们提出了一种方法，提供，细胞是免疫反应，大多在7-14天内成熟。虽然这种纯度可以低于其他方法的天体细胞31和微胶质30，主要的重点是获得更多的微胶质和星细胞在伴随提取。我们理解，细胞群可以通过柱分离进一步分类或分离，以提高它们的纯度。为此，可能包括额外的细胞标记，如用于微胶质的Iba1或TMEM119;Aquaporin-4 或 S100B 用于星形细胞，CC1 或 O4 用于寡核细胞，NeuN 表示神经元22、31、32、3331,32,33。22但是，应考虑协议末尾的重要细胞丢失。
因此，我们提供了一种改进的方法，以高效和廉价的协议同时获得微胶质和星形细胞。此外，该协议提供了一个伟大的产量的优势，允许比较研究在神经免疫背景的胶质子集，如这里在T.cruzi和T.贡迪感染期间说明。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢圣保罗联邦大学（UNIFESP）的雷纳托·莫尔塔拉教授对mAb 2C2反Ssp-4。这项工作得到了圣保罗埃斯塔多-佩斯基萨基金会（FAPESP，2017/25942-0向K.R.B.）提供赠款的支持， 向K.R.B.提供402100/2016-6，国家文博研究所（INCTV/CNPq）和南威高级国家研究所（CAPES，财务代码001）。M.P.A.从CNPq获得研究金，A.L.O.P.从CAPES获得研究金，国际基金会和L.Z.M.F.B.从FAPESP获得研究金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 μmm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat - anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS - Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10x) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60 mm x 15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 °C with trypsin |
References
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
- Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
- Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
- Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
- Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
- Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
- Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
- Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
- Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
- Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
- Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
- Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
- Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
- Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
- Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
- Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
- Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
- Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
- Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).
