Summary
Hier stellen wir ein modifiziertes CLIP-seq-Protokoll namens FbioCLIP-seq mit FLAG-Biotin-Tandemreinigung vor, um die RNA-Ziele von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) in Säugetierzellen zu bestimmen.
Abstract
RNA- und RNA-bindende Proteine (RBPs) steuern mehrere biologische Prozesse. Die räumliche und zeitliche Anordnung von RNAs und RBPs liegt der heiklen Regulierung dieser Prozesse zugrunde. Eine Strategie namens CLIP-seq (Cross-Linking und Immunprecipitationung) wurde entwickelt, um endogene Protein-RNA-Wechselwirkungen mit UV-Vernetzung mit anschließender Immunpräzipation zu erfassen. Trotz des breiten Einsatzes der konventionellen CLIP-Seq-Methode in der RBP-Studie wird die CLIP-Methode durch die Verfügbarkeit hochwertiger Antikörper, potentieller Verunreinigungen aus den korifizierten RBPs, die Anforderung der Isotopenmanipulation und den potenziellen Informationsverlust während eines mühsamen experimentellen Verfahrens eingeschränkt. Hier beschreiben wir eine modifizierte CLIP-seq-Methode namens FbioCLIP-seq mit der FLAG-Biotin-Tag-Tandemreinigung. Durch Tandemreinigung und strenge Waschbedingungen werden fast alle interagierenden RNA-bindenden Proteine entfernt. Somit werden auch die RNAs, die indirekt durch diese korifizierten RBPs vermittelt werden, reduziert. Unsere FbioCLIP-seq-Methode ermöglicht einen effizienten Nachweis von direkten proteingebundenen RNAs ohne SDS-PAGE- und Membrantransferverfahren in isotop- und proteinspezifischer Antikörperfreiheit.
Introduction
RNAs und RNA-bindende Proteine (RBPs) steuern verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich Spleißen, Translation, Ribosomenbiogenese, epigenetische Regulation und Zellschicksalübergang1,2,3,4,5,6. Die empfindlichen Mechanismen dieser Prozesse hängen von der einzigartigen räumlichen und zeitlichen Anordnung von RNAs und RBPs ab. Daher besteht ein wichtiger Schritt zum Verständnis der RNA-Regulierung auf molekularer Ebene darin, die Positionsinformationen über die Bindungsstellen von RBPs aufzudecken.
Eine Strategie, die als Vernetzung und Immunpräzipation (CLIP-seq) bezeichnet wird, wurde entwickelt, um Protein-RNA-Wechselwirkungen mit UV-Vernetzung zu erfassen, gefolgt von Immunpräzipitation des von Interesse sindden Proteins7. Das Hauptmerkmal der Methodik ist die Induktion kovalenter Querverbindungen zwischen einem RNA-bindenden Protein und seinen direkt gebundenen RNA-Molekülen (innerhalb von 1 ° ) durch UV-Bestrahlung8. Die RBP-Footprints können durch CLIP-Tag-Clustering und Peak-Calling bestimmt werden, die in der Regel eine Auflösung von 30 bis 60 nt haben. Alternativ kann der umgekehrte Transkriptionsschritt von CLIP zu Indels (Einfügungen oder Deletionen) oder Substitutionen an den Vernetzungsstellen führen, was die Identifizierung von Proteinbindungsstellen auf den RNAs bei einer Einzigennukleotid-Auflösung ermöglicht. Für die Analyse der High-Throughput-Sequenzierungsergebnisse von CLIP-seq8wurden Pipelines wie Novoalign und CIMS entwickelt. Mehrere modifizierte CLIP-seq-Methoden wurden ebenfalls vorgeschlagen, darunter die Vernetzung der Individualnukleotid-Auflösung und die Immunpräzipation (iCLIP), verbesserte CLIP (eCLIP), irCLIP und photoaktivierbare ribonukleosidverstärkte Vernetzung und Immunpräzipation (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Trotz des breiten Einsatzes traditioneller CLIP-Seq-Methoden bei der Untersuchung von RBPs haben die CLIP-Methoden mehrere Nachteile. Erstens kann das mühsamde denaturierte Gelelektrophorese- und Membrantransferverfahren zu Informationsverlust führen und zu einer begrenzten Sequenzkomplexität führen. Zweitens kann die proteinspezifische CLIP-Methode einen Proteinkomplex anstelle eines einzelnen Zielproteins nach unten ziehen, was zu falsch positiven Protein-RNA-Wechselwirkungen aus den korifizierten RBPs führen kann. Drittens erfordert die Antikörper-basierte Strategie eine große Menge an hochwertigen Antikörpern, was die Anwendung dieser Methoden für die Untersuchung von RBPs ohne hochwertige Antikörper unzureichend macht. Viertens erfordert die traditionelle CLIP-Methode radioaktiv markierte ATP, um die proteingebundenen RNAs zu kennzeichnen.
Die hohe Affinität von Streptavidin zu biotinylierten Proteinen macht es zu einem sehr leistungsfähigen Ansatz, um bestimmte Proteine oder Proteinkomplexe zu reinigen. Die effiziente Biotinylierung von Proteinen, die eine künstliche Peptidsequenz durch ektopisch exprimierte bakterielle BirA-Biotinligase in Säugetierzellen tragen, macht es zu einer effizienten Strategie, Biotinreinigung in vivo13durchzuführen. Wir entwickelten eine modifizierte CLIP-seq-Methode namens FbioCLIP-seq (FLAG-Biotin-mediated Cross-linking and Immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing) using FLAG-biotin tag tandem purification14 (Abbildung 1). Durch Tandemreinigung und strenge Waschbedingungen werden fast alle interagierenden RBPs entfernt (Abbildung 2). Die strengen Waschbedingungen ermöglichen auch die Umgehung des arbeitsintensiven und technisch anspruchsvollen SDS-PAGE- und Membrantransfers. Und ähnlich wie eCLIP und irCLIP ist die FbioCLIP-seq Methode isotopfrei. Das Überspringen der Gellauf- und Übertragungsschritte vermeidet den Verlust von Informationen, hält authentische Protein-RNA-Interaktionen intakt und erhöht die Bibliothekskomplexität. Darüber hinaus ist es durch die hohe Effizienz des Kennzeichnungssystems eine gute Wahl für RBPs ohne hochwertige Antikörper.
Hier finden Sie eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung des FbioCLIP-seq Protokolls für Säugetierzellen. Kurz gesagt, die Zellen sind durch 254 nm UV vernetzt, gefolgt von Zelllyse und FLAG-Immunpräzipitation (FLAG-IP). Als nächstes werden die Protein-RNA-Komplexe durch Biotin-Affinitätserfassung weiter gereinigt und RNAs durch partielle Verdauung mit MNase fragmentiert. Dann wird die proteingebundene RNA dephosphoryliert und mit einem 3'-Linker ligiert. Ein 5'-RNA-Linker wird hinzugefügt, nachdem die RNA mit PNK phosphoryliert und durch Proteinase-K-Verdauung eluiert wurde. Nach umgekehrter Transkription werden die proteingebundenen RNA-Signale durch PCR verstärkt und durch Agarose-Gel-Reinigung gereinigt. Zwei RBPs wurden ausgewählt, um das FbioCLIP-seq-Ergebnis zu veranschaulichen. LIN28 ist ein gut charakterisiertes RNA-bindendes Protein, das an der mikroRNA-Reifung, Proteintranslation und Zellreprogrammierung beteiligt ist15,16,17. WDR43 ist ein WD40 domänenhaltiges Protein, das die Ribosomenbiogenese, die eukaryotische Transkription und die embryonale Stammzell-Pluripotenzkontrolle14,18koordiniert. In Übereinstimmung mit den zuvor berichteten Ergebnissen für LIN28 mit CLIP-seq zeigt FbioCLIP-seq Bindungsstellen von LIN28 auf "GGAG"-Motiven in den microRNA mir-let7g und mRNAs16,19 (Abbildung 3). WDR43 FbioCLIP-seq identifizierte auch die verbindliche Präferenz von WDR43 mit 5' externen transkribierten Abstandshaltern (5'-ETS) von Pre-rRNAs20 (Abbildung 4). Diese Ergebnisse bestätigen die Zuverlässigkeit der FbioCLIP-seq-Methode.
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Protocol
1. Zelllinienbau
- Klonen Sie das gen von Interesse in einem PiggyBac Vektor pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA von Interesse]-(Hygromycin-resistent) Plasmid, das ein FLAG-Biotin-Epitop13,21 trägt, um ein FLAG-Biotin-Tag geschmolzenes RBP (FBRBP) auszudrücken.
- Kotranssekte den FB-RBP-Exezierenden Vektor mit dem pBase-Vektor in eine Zelllinie, die das BirA-Enzym22exzisiert.
HINWEIS: In dieser Studie wurde das FB-RBP-Gen in embryonale Mundzellen (mESCs) transfiziert, die einen integrierten BirA-Expressionsvektor21tragen. Alternativ kann der FB-RBP-Extiervektor zusammen mit pBase und pPiggyBac-BirA-V5 in Zellen umgewandelt werden. - Die Zellen in mESC auf gelatinierten Gerichten anbauen und im mES-Kulturmedium (Materialtabelle) in 5%CO2 bei 37 °C halten. Wählen Sie die transfizierten Zellen mit Hygromycin b (100 g/ml) für 1 Woche aus.
- Nach der Arzneimittelauswahl ernten Zellen durch SDS-Ladepuffer (Tabelle 1) und verwenden einen Western Blot23, um die Kennzeichnung und Expression des Gens mit einem FLAG-Antikörper bzw. Streptavidin-HRP zu bestätigen.
2. Vernetzung
- Platte 3 x 106 mES-Zellen in einer 10 cm Platte 1 Tag vor dem Experiment, so dass die Zellen bei der Ernte zu 70 bis 90 % Zusammenfluss wachsen (5 bis 10 Millionen Zellen pro Probe).
- Entfernen Sie das Medium mit einem Vakuum. Behandeln Sie die Zellen mit 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA für 2 min bei Raumtemperatur (RT) und löschen Sie das Trypsin um 4 ml frisches mESC-Medium. Übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml Zentrifugenrohr. Drehen Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 3 min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand.
- Die Zellen mit 4 ml kaltem PBS aufhängen und die Zellen zur Vernetzung wieder auf die 10 cm Platte verkleben. Vernetzung der Zellen durch Strahlung mit 254 nm UV-Licht (stellen Sie den UV-Kreuzlinker mit einem Parameter von 400 mJ/cm2) ein).
HINWEIS: Bei Zellmonolayern können die Zellen vor der Trypsin-Behandlung direkt auf der Platte mit UV-Licht vernetzt werden. - Übertragen Sie die vernetzten Zellen in ein 15 ml-Rohr. Durch Zentrifugation bei 300 x g für 3 min bei 4 °C nach unten drehen und den Überstand entfernen.
HINWEIS: Das vernetzte Zellpellet kann bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert werden.
3. Zelllysat-Präparation
- Lyse die Zellen mit 500 l Waschpuffer A (Tabelle 1) frisch ergänzt mit 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 Protease-Hemmer-Cocktail und 400 U/ml RNase-Hemmer. Übertragen Sie die Zellen in ein RNase-freies 1,5 ml-Rohr. Inkubieren Sie die Zellen für 30-60 min auf einem Rotor mit sanfter Drehung bei 4 °C.
- Behandeln Sie das Lysat mit 30 l DNase I bei 37 °C für 10 min. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 4 l von 0,5 M EDTA hinzufügen. Drehen Sie das unlösliche Pellet um 12.000 x g für 20 min bei 4 °C und übertragen Sie den Überstand auf ein neues vorgekühltes 1,5 ml-Rohr.
HINWEIS: Für den sofortigen Gebrauch auf Eis bleiben. Wenn der Überstand nicht sofort verwendet wird, lagern Sie ihn bei -80 °C, bis er verwendet wird.
4. FLAG Perlen Vorbereitung
- Fügen Sie 40 L Gülle FLAG Perlen pro Probe zu einem frischen 1,5 ml Rohr hinzu.
- Die Perlen schnell mit 0,5 ml eiskaltem Waschpuffer A waschen und bei 4 °C 2 min um 3.000 x g drehen.
- Wiederholen Sie Schritt 4.2 einmal. Die Perlen mit 3.000 x g für 2 min bei 4 °C abdrehen. Entfernen Sie den Puffer vorsichtig mit einer schmalen Pipettenspitze. Vermeiden Sie das Entfernen der Perlen.
5. Immunitizipation
- Übertragen Sie das Zelllysat von Schritt 3.2 auf die vorausgeglichenen FLAG-Perlen. Drehen Sie alle Proben auf einem Walzenschüttler bei 4 °C vorsichtig. Inkubieren Sie die FLAG-Perlen mit Lysat für 2 x 4 h oder über Nacht.
- Zentrifugieren Sie die Perlen für 2 min bei 3.000 x g und entfernen Sie den Überstand.
- Die Perlen mit 0,5 ml vorgekühltem Waschpuffer A durch Inkubation für 5 min in einem Rotator bei 4 °C waschen, die Perlen mit 3.000 x g für 2 min abdrehen und den Überstand entfernen. Wiederholen Sie die Wäsche 1x.
- Wiederholen Sie die Wäsche 2x wie in Schritt 5.3 beschrieben mit 0,5 ml vorgekühltem Waschpuffer B (Tabelle 1).
6. Elution mit 3x FLAG Peptid
- Bereiten Sie 3x FLAG Elutionslösung durch Auflösen von 1 mg 3x FLAG Peptid mit 5 ml Waschpuffer A auf eine Endkonzentration von 200 ng/ml vor.
- Drehen Sie die FLAG-Perlen ab Schritt 5.4 mit 3.000 x g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand sorgfältig. Stellen Sie sicher, dass der größte Teil des Überstandes entfernt wird, indem Sie eine schmale Endpipettenspitze verwenden.
- Fügen Sie jeder Probe 200 L 3x FLAG-Elutionslösung hinzu. Inkubieren Sie die Proben mit sanfter Drehung für 30 min bei 4 °C. Drehen Sie die FLAG Perlen für 2 min bei 3.000 x g. Übertragen Sie die Überräube in frische Schläuche.
- Wiederholen Sie die Elution 2x wie in den Schritten 6.2 und 6.3 beschrieben und bündeln Sie die Eluenten zusammen. Sparen Sie 5% der Eluenten für Western Blot Analysis oder Silberfärbung, um die Effizienz von FLAG-IP zu überprüfen.
7. Streptavidin Perlen Vorbereitung
- Bereiten Sie für jede Probe 50 l einer Streptavidin-Perlenschlämme vor. Sammeln Sie die Perlen mit einem magnetischen Ständer für 30 s und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze.
- Waschen Sie die Perlen schnell mit 0,5 ml eiskaltem Waschpuffer A und sammeln Sie die Perlen mit einem Magnetständer für 30 s.
- Wiederholen Sie die Wäsche 1x. Entfernen Sie den Überstand nach dem Waschen.
8. Biotin Affinitätsreinigung
- Die gepoolten Eluenten von Schritt 6.4 auf die Streptavidinperlen ab Schritt 7.3 übertragen und die Proben vorsichtig bei 4 °C für 1 x 3 h oder über Nacht drehen.
- Sammeln Sie die Perlen mit einem magnetischen Ständer für 30 s und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Perlen 2x mit 500 l Waschpuffer C (Tabelle 1) durch sanfte Rotation bei RT für 5 min.
- Sammeln Sie die Perlen mit dem magnetischen Ständer und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Perlen 2x mit 500 l Waschpuffer D (Tabelle 1) durch Drehen bei RT für 5 min.
- Sammeln Sie die Perlen mit dem magnetischen Ständer und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Perlen schnell 2x mit 500 l eiskalten PNK-Puffer (Tabelle 1).
9. Partielle RNA-Verdauung
- Machen Sie eine 105-facheVerdünnung der MNase mit MNase-Reaktionspuffer (Tabelle 1). Fügen Sie jeder Probe 100 L MNase-Lösung hinzu. Die Perlen bei 37 °C mit einem Thermomischer bei 1.200 Rpm (5 s Lauf, 30 s Stopp) für 10 min, sammeln Sie die Perlen mit einem Magnetischen Ständer für 30 s und entfernen Sie den Überstand.
HINWEIS: Die MNase-Konzentration sollte für verschiedene RNA-bindende Proteine optimiert werden. Die MNase-Konzentration, die RNAs in 30 bis 50 nt Fragmente verdauen kann (bestimmt durch die Größe des Einfügens der endgültigen Bibliothek), ist optimal. - Waschen Sie die Perlen schnell 2x mit 500 l eiskalten PNK+EGTA Puffer (Tabelle 1). Sammeln Sie die Perlen mit einem magnetischen Ständer und entfernen Sie den Überstand zwischen jedem Waschschritt.
- Waschen Sie die Perlen 2x mit 500 l Waschpuffer C durch sanfte Rotation für 5 min bei RT. Dann waschen Sie die Perlen schnell 2x mit 500 l eiskalten PNK Puffer.
10. Dephosphorylierung der RNA
- Machen Sie eine Kalbsdarmphosphatase (CIP) Reaktionsmischung mit 8 l von 10x CIP-Puffer (Tabelle der Materialien), 3 l CIP-Enzym, und 69 l Wasser. Das Gesamtvolumen beträgt 80 l pro Reaktion.
- Sammeln Sie die Perlen mit einem magnetischen Ständer und entfernen Sie den Puffer. Fügen Sie den CIP-Reaktionsmix zu den Perlen hinzu. Wirbeln Sie die Perlen bei 37 °C mit einem Thermomischer auf 1.200 Rpm (5 s Lauf, 30 s Stopp) für 10 min.
- Waschen Sie die Perlen schnell 2x mit 500 l eiskalten PNK+EGTA Puffer. Waschen Sie die Perlen schnell 2x mit 500 l eiskalten PNK-Puffer.
11. 3' Linker ligation
- Machen Sie eine 3'-Linker-Mischung mit 4 l von 20 'M 3' Linker, 4 'L von 10x T4 RNA-Ligase-Puffer, 4 'L von 50% PEG8000, 2 'L T4 RNA Ligase 2 (abgeschnitten) und 26 'L Wasser. Das Gesamtvolumen beträgt 40 l pro Reaktion.
- Sammeln Sie die Perlen aus Schritt 10.3 mit einem magnetischen Ständer und entfernen Sie den Puffer. Fügen Sie 40 L der 3' Linker Ligation Mix zu den Perlen. Wirbeln Sie die Perlen bei 16 °C mit einem Thermomischer auf 1.200 Rpm (5 s Lauf, 30 s Stopp) für 3 h oder über Nacht.
- Waschen Sie die Perlen schnell 2x mit 500 l eiskalten PNK+EGTA Puffer. Waschen Sie die Perlen schnell 2x mit 500 l eiskalten PNK-Puffer.
12. PNK-Behandlung
- Machen Sie eine PNK-Mischung mit 4 l mit 10x PNK-Puffer, 2 l T4-PNK-Enzym, 1 l von 10 mM ATP und 33 l Wasser. Das Gesamtvolumen beträgt 40 l pro Reaktion.
- Sammeln Sie die Perlen mit einem magnetischen Ständer und entfernen Sie den Puffer. Fügen Sie den Perlen 40 L PNK-Mix hinzu. Vortex die Perlen sanft bei 37 °C mit einem thermischen Mischer auf 1.200 Rpm (5 s Lauf, 30 s Stopp) für 10 min eingestellt.
- Waschen Sie die Perlen schnell mit 500 l eiskalten PNK+EGTA Puffer.
- Waschen Sie die Perlen schnell mit 500 l eiskalten PNK-Puffer. Sparen Sie 5% der Perlen für westliche oder silberne Färbung Analyse, um die Effizienz der Immunpräzipitation zu bestätigen.
13. RNA-Isolation
- Sammeln Sie die Perlen aus Schritt 12.4 mit einem magnetischen Ständer und entfernen Sie den Puffer. Fügen Sie 200 L Proteinase K Verdauungspuffer hinzu (Tabelle 1). Wirbel die Perlen für 30 min bei 37 °C mit einem thermoMischer bei 1.200 Rpm (5 s Lauf, 30 s Stopp). Magnetisch isolieren Sie die Perlen und nehmen Sie den Überstand für das Experiment.
- 400 L RNA-Isolationsreagenz (Materialtabelle) ab Schritt 13.1 dem Überstand hinzufügen, gründlich mischen und 5 min auf Eis brüten. Fügen Sie 80 l Chloroform hinzu und mischen Sie sie gründlich und tauchen Sie dann 5 min auf Eis ein. Mit 12.000 x g für 10 min 4 °C nach unten drehen.
HINWEIS: Dieser Schritt sollte in einer chemischen Haube durchgeführt werden. - Nehmen Sie den Überstand (ca. 500 l) und fügen Sie zwei Volumina isopropanol:ethanol-Mix (1:1), 1/10 Volumen von 3 M Natriumacetat (pH = 5,5) und 1 l Glykogen hinzu. Bei -20 °C für 2 h einfrieren. Zentrifuge bei 4 °C mit 12.000 x g für 20 min.
- Waschen Sie das Pellet 2x mit eiskaltem 70% Ethanol. Drehen Sie das Pellet bei 4 °C mit 12.000 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet. Lösen Sie die RNAs in 5 l RNase-freiH2O auf.
14. 5' RNA-Linker-Ligation
- Machen Sie einen 5'-RNA-Ligationsmix mit 1 l 10x T4-RNA-Ligase-Puffer, 0,5 l BSA (1 g/l), 1 l von 10 mM ATP, 1 L RNase-Inhibitor und 0,5 l T4-RNA-Ligase. Das Gesamtvolumen beträgt 4 l pro Reaktion.
- Fügen Sie der RNA ab Schritt 13.4 1 l von 5' 20'M RNA-Linker hinzu, denaturieren Sie die RNA durch Erhitzen bei 70 °C für 2 min und kühlen Sie sofort auf Eis.
- Fügen Sie den 5' RNA-Ligationsmix ab Schritt 14.2 in die RNA ein. Bei 16 °C über Nacht inkubieren.
15. Umgekehrte Transkription
- Reinigen Sie die RNAs wie in Abschnitt 13 beschrieben und lösen Sie die RNA mit 11,5 l RNase-freiem Wasser auf.
- Fügen Sie der gereinigten RNA 1 l von 10 'M Reverse-Transkriptions-Primer hinzu, erhitzen Sie sie bei 70 °C für 2 min und kühlen Sie sofort auf Eis.
- Machen Sie eine umgekehrte Transkriptionsmischung mit 4 l 5x Reverse-Transkriptionspuffer, 1 l mit 10 mM dNTPs, 1 l 0,1 M DTT, 1 L RNase-Inhibitor und 0,5 l Reverse-Transkription-Puffer(Materialtabelle). Das Gesamtvolumen beträgt 7,5 l pro Reaktion.
- Fügen Sie der RNA 7,5 l Reverse-Transkriptionsmix hinzu, inkubieren Sie 30 min bei 50 °C und stoppen Sie die Reaktion durch Inkubation bei 70 °C für 10 min. Bei 4 °C lassen.
16. PCR-Verstärkung
- Machen Sie eine PCR-Verstärkungsmischung mit 15 l 2x PCR-Master-Mix (Tabelle der Materialien), 5 'L cDNA ab Schritt 15.4, 0.6 'L von 10 'M Vorwärtsprimer 1 ( Tabelle2), 0.6 'L von 10 'M Reverse Primer 1 (Tabelle 2) und 8.8 'L von H2O. Das Gesamtvolumen beträgt 30 l.
- Verstärken Sie die cDNA mit folgenden Einstellungen: 98 °C 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (Wiederholungsschritte 2 x 4 für 15 x 20 Zyklen), 72 °C 2 min und halten bei 4 °C. Führen Sie das PCR-Produkt auf einem 2-3% Agarose-Gel. Schneiden Sie die DNA von 100 bis 150 bp aus, extrahieren Sie DNA mit dem Gelextraktionskit (Table of Materials)und entkernen Sie die DNA mit 20 l Wasser.
- Nehmen Sie 3 l des gereinigten PCR-Produkts, verstärken Sie es mit Vorwärtsprimer 2 (Tabelle 2) und Reverse Primer 2 (Indexprimer; Tabelle 2) wie in Schritt 16.2 für fünf Zyklen beschrieben, um Indexsequenzen einzuführen. Reinigen Sie das PCR-Produkt wie in Schritt 16.2 beschrieben.
- Sequenzieren Sie die Bibliothek mit einer Sequenzierungsplattform mit hohem Durchsatz.
17. Bioinformatik-Analyse
- Führen Sie Datenanalysen mit kommerziellen Programmen wie zuvor beschrieben8durch.
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Representative Results
Die schematische Darstellung der FbioCLIP-seq-Prozedur ist in Abbildung 1dargestellt. Im Vergleich zur FLAG-vermittelten oder streptavidinvermittelten einstufigen Affinitätsreinigung entfernte die FLAG-Biotin-Tandemreinigung fast alle korifizierten Proteine, wodurch die Kontamination indirekter Protein-RNA-Wechselwirkungen vermieden wurde (Abbildung 2). Repräsentative Ergebnisse für FbioCLIP-seq für LIN28 und WDR43 sind in Abbildung 3 und Abbildung 4dargestellt. Wir führten LIN28 oder WDR43 FbioCLIP-seq mit mESCs auf. Abbildung 3A zeigt die Spuransicht von LIN28 und WDR43 FbioCLIP-seq in pre-let-7g. Das gemeldete GGAG-Motiv in Pre-let-7g und die von FbioCLIP-seq identifizierten vernetzten Seiten sind in Abbildung 3Bdargestellt. Die Klassifizierung der durch den CIMS-Algorithmus aufgerufenen Mutationsstellen zeigte, dass LIN28 es vorzieht, G-Nukleotid zu binden und zu vernetzen (Abbildung 3C). Die angereicherten RNA-Motive in LIN28 FbioCLIP-seq Bindungsstellen sind in Abbildung 3Ddargestellt. Weitere repräsentative Spuren von FbioCLIP-seq auf LIN28 und HNRNPU sind in Abbildung 3Edargestellt. Der Vergleich von WDR43 und LIN28 FbioCLIP-seq zeigte ihre unterschiedlichen Bindungsmuster in Rn45 pre-rRNA locus (Abbildung 4). Abbildung 5 zeigt die repräsentativen Ergebnisse der FLAG- und Biotin-Tag-Validierung nach zelllinienbaulichen. Abbildung 6 zeigt repräsentative Ergebnisse einer effizienten (Abbildung 6A) oder erfolglosen (Abbildung 6B) FLAG-IP und FLAG-Biotin-Tandemreinigung.
Abbildung 1: Schematische Darstellung von FbioCLIP. UV-vernetzte Zellen (Schritt 1) werden im Lysepuffer (Schritt 2) lysiert. Der FBRBP-RNA-Komplex wird mit Anti-FLAG-Harz immunpräzipiert (Schritte 3 x 4). Der eluierte Protein-RNA-Komplex wird mit Streptavidinperlen weiter gereinigt und strenge Waschbedingungen werden verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu entfernen (Schritte 5-6). RNAs werden teilweise von MNase verdaut und nicht proteingebundene RNA-Fragmente werden durch weitere Wäsche entfernt (Schritte 7-8). Die RNAs werden dann dephosphoryliert und mit 3' Linker (Schritt 9) gelinkt. Dann werden die RNAs phosphoryliert und durch Proteinase-K-Behandlung eluiert (Schritt 10). Gereinigte RNAs werden mit einem 5' RNA-Linker ligiert, der einen 6 nt zufälligen Barcode (Schritt 11) enthält. Nach der umgekehrten Transkription (Schritt 12) wird die cDNA-Bibliothek mit PCR verstärkt und eine Sequenzierung mit hohem Durchsatz durchgeführt (Schritte 13-15). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: FLAG-Biotin-Tandemreinigung entfernt korifizierte Proteine. Die Silberfärbung von FBWDR43 zeigte, dass fast alle interagierenden Proteine, die in FLAG- oder biotinvermittelter einstufiger Reinigung präsentiert wurden, nach strenger Reinigung bei der Tandemreinigung eliminiert wurden. FLAG: FLAG-vermittelte Affinitätsreinigung, SA: Streptavidin-vermittelte Biotinreinigung, Tandem: FLAG-Biotin-Tandemreinigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse von LIN28 FbioCLIP-seq. (A) Spuransicht von LIN28 FbioCLIP-seq Tags und Mutationslesungen, die von CIMS in pre-let-7g RNA aufgerufen werden. Die angezeigten Tags sind eindeutige Lesevorgänge von FbioCLIP-seq. Insgesamt wurden 7,7 Millionen US-Dollar für einzigartige Lesevorgänge für LIN28 FbioCLIP-seq und 2,2 Millionen US-Dollar für einzigartige Lesevorgänge für WDR43 FbioCLIP-seq abgerufen, nachdem redundante Lesevorgänge entfernt wurden. (B) Vernetzte Seiten auf dem GGAG-Motiv der pre-let7-g RNA von LIN28 FbioCLIP-seq. Die Pfeile zeigen die vernetzten Sites an. (C) Prozentsatz der mutierten Nukleotide in verschiedenen Arten von Mutationen. G ist das häufigste vernetzte und mutierte Nukleotid. Zufällige Verteilung der vier Nukleotide. (D) Vorhergesagte LIN28-Bindungsmotive von FbioCLIP-seq mit HOMER-Algorithmus. (E) Verfolgen Sie Ansichten von LIN28 FbioCLIP-seq auf LIN28 und HNRNPU mRNAs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse von WDR43 und LIN28 FbioCLIP-seq auf Rn45S locus. Spuransicht von WDR43 und LIN28 FbioCLIP-seq auf Rn45S locus. WDR43 und LIN28 zeigten unterschiedliche Bindungsmuster auf Pre-rRNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse der FLAG- und Biotin-Tag-Validierung. FLAG oder Biotin Western Blot validiert die Kennzeichnung der Zelllinien. Klone #1, #2 und #4 zeigten eine effiziente Expression und Biotinylierung des Tags, während #3 eine schlechte Expression des markierten Proteins zeigten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse der FLAG-Immunpräzipitation und der Validierung der Tandemreinigungseffizienz. (A) Beispiel für die effiziente Reinigung von markiertem Protein durch FLAG und Biotin-Affinitätsreinigung. (B) Beispiel für die ineffiziente Reinigung von markiertem Protein durch FLAG und Biotin-Affinitätsreinigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Puffer | Zusammensetzung |
| SDS-Ladepuffer | 50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 0,1% Bromphenolblau, 10% Glycerin, 100 mM DTT |
| Waschpuffer A | 1x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% Natriumdeoxycholat, 0,1% SDS |
| Waschpuffer B | 5x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% Natriumdeoxycholat, 0,1% SDS |
| Waschpuffer C | 50 mM Tris pH 7,4, 2% SDS |
| Waschpuffer D | 5x PBS, 0,5% NP-40, 0,5% SDS, 1 M Harnstoff |
| PNK-Puffer | 50 mM Tris pH 7,4, 0,5% NP-40, 10 mM MgCl2 |
| MNase-Reaktionspuffer | 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM CaCl2 |
| PNK+EGTA-Puffer | 50 mM Tris pH 7,4, 0,5% NP-40, 10 mM EGTA |
| Proteinase K Verdauungspuffer | 50 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,5% SDS, 20 g Proteinase K |
Tabelle 1: Zusammensetzung der in dieser Studie verwendeten Puffer.
| Oligo-Name | Sequenz | Notizen | ||||
| 3' Linker | rAppAGATCGGAAGAGCACACGTCT-NH2 | |||||
| 5' RNA-Linker | GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGUCNNNNN | |||||
| RT-Grundierung | AGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Vorwärtsgrundierung 1 | GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC | |||||
| Reverse Primer 1 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Vorwärtsgrundierung 2 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC | |||||
| Reverse Primer 2 | CAAGGAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGAGAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T | Die roten und unterstrichenen Sequenzen stellen die Illumina-Indexsequenz dar. | ||||
Tabelle 2: Oligonukleotide, die in dieser Studie verwendet werden.
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Discussion
Hier stellen wir eine modifizierte CLIP-seq-Methode namens FbioCLIP-seq vor, bei der das FLAG-Biotin-Doppel-Tagging-System für die Tandemreinigung von Protein-RNA-Komplexen genutzt wird. Das FLAG-Biotin-Doppel-Tagging-System hat sich als leistungsfähig bei der Identifizierung von Protein-Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen13,21erwiesen. Hier zeigen wir die hohe Spezifität und den Komfort dieses Systems bei der Identifizierung der RNAs, die mit Proteinen interagieren. Durch Tandemreinigung und strenge Waschbedingungen haben wir den anspruchsvollen SDS-PAGE- und Membrantransferschritt übersprungen, so dass mehr Protein-RNA-Wechselwirkungen erhalten blieben und kontaminierte RNA-Signale, die von RBPs im selben Komplex vermittelt wurden, vermieden wurden. Außerdem vermeidet die Umgehung dieser Schritte die Kennzeichnung der RNA mit radioaktiv markiertem ATP. Dies erleichtert das Verfahren erheblich. Beachten Sie, dass während der Vorbereitung unserer Veröffentlichung auch eine ähnliche Methode namens uvCLAP vorgeschlagen wurde24.
Mehrere Schritte sind wichtig für den Erfolg des Protokolls. Erstens sollte die Wirksamkeit der Biotinylierung des markierten Proteins vor dem Experiment durch Western Blot bestätigt werden (Abbildung 5). Zweitens ist die effiziente Elution von gereinigtem Protein durch 3 x FLAG-Peptid für die erfolgreiche Verstärkung der RNA-Signale erforderlich. Die Perlen aus Schritt 12.4 sollten mit Western Blot oder Silberfärbung analysiert werden, um zu gewährleisten, dass eine anständige Menge an Zielprotein abgerufen wird (Abbildung 6). Um die Effizienz zu erhöhen, entweder erhöhen Sie die 3 x FLAG Peptidkonzentration in Schritt 6 bis zu 500 ng/ml oder wiederholen Sie den Elutionsschritt mehrmals, um eine bessere Produktion zu erzielen. Drittens ist es optimal, die MNase-Konzentration für jedes Protein bei der ersten Studie zu tittieren. Überverdauung oder unzureichende Behandlung kann zu RNA-Fragmenten von unangemessener Größe führen. Schließlich enthält das Protokoll zwei Runden der Affinitätsreinigung und hochgradig strengen Wäsche. Es wird nur eine geringe Menge gereinigter RNAs abgerufen. Das Reagenz sollte RNase-frei sein und einen RNA-Abbau nach dem MNase-Behandlungsschritt vermeiden.
Trotz der Leichtigkeit dieser Methode gibt es noch einige Aspekte, die verbessert werden können. Beispielsweise kann die Ligation eines 5'-Adapters direkt an die RNA die Wiederherstellung der Signale einschränken, da ein erheblicher Teil der umgekehrten Transkription durch verbleibende vernetzte Peptide beendet wird. Unsere aktuelle Studie basiert hauptsächlich auf der ektopischen Expression von markierten Proteinen, was aufgrund der Proteinüberexpression zu einigen Artefakten führen kann. Es lohnt sich, die Methode zu verbessern, indem das Tag in den endogenen Lokus eingeführt wird. Das CRISPR/Cas9-System macht die Zelllinienkonstruktion viel einfacher und praktikabel. Einige Studien haben das eCLIP-seq-Experiment auf Mausgewebe angewendet25. Die Ableitung von Einschlagsmäusen mit dem Doppeltag ist auch eine potenzielle und vielversprechende Richtung bei der Verbesserung und Anwendung der FbioCLIP-seq Methode. Darüber hinaus kann ektopisch exprimierte bakterielle BirA-Ligase zu unerwarteten Biotinylierungsereignissen in vivo führen. Die Kennzeichnung des Proteins kann auch seine biologischen Funktionen beeinflussen.
Eine große Anzahl von Studien hat gezeigt, dass die Genexpression und das Epigenom von Zellen heterogen sind, anstatt vollständig homogen zu sein, was darauf hindeutet, dass es wertvoll ist, das Interaktionsnetzwerk auf einer einzelzelligen Ebene zu untersuchen. Mehrere Strategien wurden entwickelt, um das Transkriptom und Epigenom einzelner Zellen zu untersuchen. Es wurden jedoch keine Strategien zur Analyse des Protein-RNA-Interactoms auf einzelzelligem Niveau berichtet. Ohne die denaturierten Gellauf- und Membranübertragungsschritte kann FbioCLIP-seq mehr Signale konservieren, was es zu einer potenziellen Strategie macht, Protein-RNA-Wechselwirkungen auf einzelzelliger Ebene zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Stipendien werden vom National Basic Research Program of China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), der National Natural Science Foundation of China (31630095) und dem Center for Life Sciences der Tsinghua University unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
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