Summary
Denne protokollen presenterer en detaljert prosedyre for å forberede biologiske kryompler for synkrotronbaserte røntgenabsorpsjonsspektroskopieksperimenter. Vi beskriver alle trinnene som kreves for å optimalisere prøvepreparering og kryopreservering med eksempler på protokollen med kreft og planteplanktonceller. Denne metoden gir en universell standard for prøvekryo-forberedelse.
Abstract
Studiet av elementer med røntgenabsorpsjonsspektroskopi (XAS) er av spesiell interesse når man studerer metallenes rolle i biologiske systemer. Prøvepreparering er en viktig og ofte kompleks prosedyre, spesielt for biologiske prøver. Selv om røntgenspesifisieringsteknikker er mye brukt, er det ennå ikke formidlet noen detaljert protokoll for brukere av teknikken. Videre er kjemisk tilstandsmodifisering bekymringsfull, og kryobaserte teknikker anbefales å analysere de biologiske prøvene i deres nesten innfødte hydrerte tilstand for å gi maksimal bevaring av kjemisk integritet av cellene eller vevene. Her foreslår vi en cellulær forberedelsesprotokoll basert på kryo-bevarte prøver. Det er demonstrert i en høy energioppløsning fluorescens oppdaget røntgenabsorpsjon spektroskopi studie av selen i kreftceller og en studie av jern i planteplankton. Denne protokollen kan brukes med andre biologiske prøver og andre røntgenteknikker som kan bli skadet ved bestråling.
Introduction
Studien av cellulære biotransformasjoner av essensielle eller giftige elementer krever spesieringsteknikker med høy følsomhet og bør minimere prøveprepareringstrinn som ofte er utsatt for modifikasjon av kjemiske arter.
Fysiologiske elementer som selen og jern er kjent for å være spesielt vanskelig å spekulere på grunn av deres komplekse kjemi, ulike stabiliteter av selen eller jernarter, og deres lave konsentrasjon i ppm (mg / kg) eller til og med sub-ppm-serien. Dermed kan studiet av spesiering av disse elementene av XAS være ekstremt utfordrende. Synchrotron XAS og spesielt høy energioppløsning fluorescens oppdaget XAS (HERFD-XAS), som tillater et svært lavt signal-til-bakgrunn-forhold1, er tilgjengelige ved synkrotronkilder for å spekulere høyt fortynnede elementer i komplekse biologiske matriser 2,3. Konvensjonelle fluorescens-XAS-målinger kan utføres ved hjelp av en energiavklart SSD-detektor (solid state detektor) med energibåndbredde ~ 150-250 eV, på CRG-FAME-strålelinjen ved European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, mens HERFD-XAS-målinger trenger et krystallanalysatorspektrometer (CAS), med en energibåndbredde ~ 1-3 eV, på CRG-FAME-UHD-strålelinjen ved ESRF2 . Fluorescensfotoner diskrimineres med hensyn til deres energi med henholdsvis elektroniske eller optiske prosesser.
Prøven cryo-forberedelse er avgjørende for å bevare strukturer og opprettholde komposisjonell kjemisk integritet, og dermed tillate analyse nær den biologiske innfødte tilstand5. Videre tillater analyser utført ved kryogeniske temperaturer så lave som 10 K ved hjelp av flytende heliumkryogen kjøling (LN2), strålingsskader å bremse og bevare elementær spesiering for XAS. Selv om noen vurderinger av XAS-teknikker som brukes på biologiske prøver rapporterer nødvendigheten av å forberede og analysere prøver under kryogeniske forhold (f.eks. Sarret et al.6, Porcaro et al.7), beskriver ingen av dem tydelig den relaterte detaljerte protokollen. I denne publikasjonen er en metode for kryo-forberedelse av kreftceller og planktonmikroorganismer beskrevet for HERFD-XAS-spesiering avSe 8 og Fe9 ved kryogen temperatur.
God praksis for prøvepreparering og miljø under toppmoderne XAS-spektroskopimålinger krever 1) et oppsett; 2) en analyseprosedyre som begrenser effekten av strålingsskader så mye som mulig; og 3) en prøve (eller modellforbindelsesreferanse) så homogen som mulig med hensyn til røntgenfotonstrålestørrelsen. Det første elementet tas i betraktning ved å utføre oppkjøpet ved lav temperatur, ved hjelp av en flytende helium cryostat. Den andre gjenstanden håndteres ved å utføre hvert oppkjøp på et nytt område av prøven ved å flytte den med hensyn til bjelken. Til slutt, med tanke på den tredje tilstanden, er prøver (pellets) og referanser (pulver) betinget i presset bulkpellets for å begrense porøsiteter og inhomogeniteter så mye som mulig, og for å unngå grovhet med hensyn til strålestørrelsen på røntgensonden. Vi forklarer hvordan protokollen omhandler alle disse punktene.
Vi brukte human prostata celle linje PC-3 (høyt metastatisk potensial) og ovariecelle linje OVCAR-3 (som står for opptil 70% av alle ovariekreft tilfeller) for å undersøke antiproliferative egenskaper mot kreftceller av selen nanopartikler (Se-NPs), og Phaeodactylum tricornutum diatom som en modellart for å undersøke jern sequestration i phytoplankton.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av den menneskelige PC-3 og OVCAR-3 kreftcellepellets for selen spesiering
MERK: Følgende protokoll er tilpasset fra Weekley et al.10. Alle trinn må utføres under en cellekultur hette under biosikkerhet nivå 2 forhold og restriksjoner, ved hjelp av aseptiske teknikker.
- Tell cellene ved hjelp av et Malassez celletellingskammer. Frø 150 000–200 000 celler per kolbe for PC-3-cellelinjen og 300 000 celler for cellelinjen OVCAR-3.
- Frøceller i T-75-kolber (tre kolber per tilstand for å ha triplikater) i tilstrekkelige cellekulturmedier (tabell 1) under laminær strømningshette.
- La cellekulturene vokse i en inkubator ved 37 °C og en fuktig atmosfære med 5 % CO2 til de når 80 % samløp. Vanligvis dobler PC-3 prostatakreftcellelinjer etter 24 timer mens OVCAR-3 eggstokkkreftcellelinjer tar 72 timer. Kolbene må stå i inkubatoren.
- I mellomtiden fortynner se-NPs som brukes til behandling til en endelig konsentrasjon som tilsvarer IC20 (hemmende konsentrasjon for å oppnå 20% celledød) som har blitt forhåndsbestemt av MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) analyse for cytoksisitetsvurdering. Disse konsentrasjonene er spesifikke for hver Se-NPs type, men også spesifikk for den studerte cellelinjen.
- Plasser nanopartikkelbestandsløsningen (2 mg/ml bovint serumalbumin [BSA] eller chitosanbelagte Se-NPs) i et ultralydvannbad i 30 minutter ved romtemperatur (RT).
- Fortynn Se-NPs-løsningen ved serielle fortynninger i komplett cellekulturmedium for å nå arbeidskonsentrasjoner. Mellom hver fortynning, virvel i 1 min.
- Forbered en selen positiv kontroll med fortynnet selen salt til behandling.
- Forbered en vandig natrium selenitt lagerløsning (1 mg / ml) i et 15 ml polypropylenrør. Bland 1 mg natriumselenittpulver med 1 ml ultrarent vann.
- Virvel lagerløsningen i 1 min.
- Fortynn natriumselenittbestandsløsningen ved serielle fortynninger i komplett cellekulturmedium for å nå arbeidskonsentrasjoner.
MERK: Ikke glem å pipet flere ganger før hver fortynning for å homogenisere løsningen.
- Utsett kreftcellene for selenbehandlinger.
MERK: Denne delen av protokollen må gjentas for hver nanopartikkel (NP) som testes. Her er NPs av to typer, BSA og chitosan belagte Se-NPs, pluss kontrollene. Natriumselenittoppløsningen er den positive kontrollen, og ingen behandling er den negative kontrollen.- Åpne de tre T-75-kolbeene som inneholder cellene i laminær strømningshette.
- Fjern mediet og vask cellene forsiktig 2x med 5 ml oppvarmet (37 °C) fosfatbufret saltvann (PBS).
- Forsiktig, på undersiden av kolben og ikke direkte på cellelaget, tilsett 15 ml av behandlingen i hver kolbe ved hjelp av en automatisk pipette utstyrt med 25 ml sterile plastpipetter. Sett lokkene på kolbeene. Ikke lukk dekslene godt.
MERK: Som beskrevet i trinn 1.3 og 1.4, må behandlingsløsninger ha blitt resuspendert på forhånd for å bli homogenisert. - La de tre kolbeene ligge horisontalt i en inkubator ved 37 °C og en atmosfære fuktet med 5 % CO2 i 24 timer.
- Forberedelse av cellepellets
- Vask cellene forsiktig 2x med 5 ml oppvarmet PBS (37 °C) direkte i T75-kolbe.
- Tilsett 6 ml oppvarmet cellekulturmedium (37 °C) på cellelaget i T-75-kolben ved hjelp av en pipettegutt utstyrt med 10 ml sterile plastpipetter.
- Samle cellene ved forsiktig skraping ved hjelp av en celleskraper. Bruk en celleskraper per kolbe.
- Bruk en pipettegutt og en 10 ml pipette til å aspirere væsken og skylle tilbake cellen/mediet på kolbeoverflaten for å samle alle cellene. Gjenta dette trinnet flere ganger for å fjerne og individualisere cellene. Samle mediet som inneholder cellene i et 15 ml polypropylenrør.
- Spinn ned på 250 x g i 5 min på RT. Aspirer supernatanten.
- Skyll cellene ved å bruke dem på nytt i 5 ml PBS.
- Spinn ned på 250 x g i 5 min på RT. Aspirer supernatanten og gjenta trinn 1.6.5 og 1.6.6 2x for å kvitte seg med alle gjenværende spor av behandlingen.
- Resuspend cellene i 1 ml PBS og overfør dem til et 1,5 ml polypropylenrør. Til slutt spinner du dem ned på 250 x g i 5 minutter ved RT. Figur 1 representerer cellepelleten som er oppnådd etter sentrifugering og kasting av supernatanten.
- Fjern forsiktig alle PBS supernatant ved hjelp av en 200 μL pipette.
MERK: Pass på at du ikke berører og skader cellepelleten. Ideelt sett bør pelletsen være 2-3 mm høy eller tykk, med en diameter på 3-6 mm. For PC-3-cellelinjen kreves 9 x 106–10 x 106 celler for analysen. For cellelinjen OVCAR-3 kreves det 8 x 106–9 x 106 celler (figur 1). Noen celler vil sannsynligvis gå tapt under de påfølgende buffer skylletrinnene. Jo høyere cellenummeret er, jo bedre blir pelletsen.
- Flash-frysing av cellepellets
- Dypp den nederste delen av 1,5 ml-røret som inneholder pelletsen i flytende nitrogen (LN2) til nivået på cellepelleten.
- I en hanskeboks som er fullstendig renset med en inert atmosfære som nitrogengass, samler du cellepelleten ved å banke forsiktig på 1,5 ml-røret på den flate overflaten av en LN2-avkjølt kobberblokk (figur 2). Pelletsen samles deretter uten celletap.
MERK: Bruk kryobeskyttelsesutstyr, labfrakk, lukkede sko, kryohansker og ansiktsskjerm eller vernebriller for LN2-håndtering . - Om nødvendig kan en LN2 avkjølt nål brukes til å hjelpe til med å ta ut pelletsen.
MERK: Den resulterende frosne cellepelleten kan fragmenteres. Disse trinnene må utføres i løpet av noen få minutter og stole på forskerens fingerferdighet og hastighet. - De frosne pelletsdimensjonene må passe til kryostatprøveholderen. Ved hjelp av det beskrevne utstyret, hvis cellepellet er større enn 2 mm i høyden og litt mindre enn hullet på prøveholderen som brukes til XAS, kan prøven brukes direkte. Hvis ikke, eller hvis en flat overflate for analysen er ønsket, må en bulk sylindrisk pellet fremstilles, og fortsatt holde pellet i frossen tilstand. Hvis cellepellet er fragmentert, kan følgende trinn brukes ideelt i en hanskeboks helt renset med en inert atmosfære.
- Forberedelse av bulk frosne sylindriske pellets
- Senk alle delene av en manuell hydraulisk trykk som kommer i kontakt med prøven i LN2 (figur 3A; pellets med 3 eller 5 mm diameter dør, mugg, stempel/trådtrekking).
- Overfør de raskt frosne pelletsfragmentene inn i formen lastet med passende pellets dør (figur 3B).
- Rask pelletize med hydraulisk trykk. Bruk av 1,5 tonn for en pellets med en diameter på 5 mm eller 0,5 tonn for en pellets med 3 mm diameter er tilstrekkelig (figur 3C).
MERK: Etter hvert pelletspreparat med hydraulikkpressen må alle materialene tines og tørkes riktig ved hjelp av nitrogengass for å unngå problemer med gjenværende frost og fuktighet. - Samle bulkpellet av frosne celler raskt og legg den i en tilstrekkelig kryotube for lagring.
- Oppbevar den tilbake i LN2-tanken for langtidslagring.
- Overfør og monter kryopellets for analyse. Pelletsen som er lagret i en LN2 avkjølt kryotube overføres til en 77 K ferdigkjølt kryostatprøveholder i flytende N2 (figur 4, som brukes til en CRG-FAME-UHD-strålelinje). Dette trinnet bør utføres så raskt som mulig, men kan ta noen minutter. Overfør deretter prøveholderen til kryostaten og vedlikehold den ved 10 K under hele XAS-analysen.
MERK: Trinn 1.9.3 og 1.9.6 er vanskelige fordi de må gjøres raskt for å unngå frostdannelse som vil blokkere stempelet og formen. Et alternativ er å utføre disse trinnene under et plasttelt som er fullstendig renset med nitrogengass. LN2-kjøle kobbermassen gjør at pelletsen kan holdes frosset.
2. Forberedelse av planktoncellene for jernspesiering
MERK: Syntetisk sjøvann som brukes til denne protokollen ble tilberedt ved å tilsette ultrarent vann havsalter, morpholino propansulfonsyre, ammoniumnitrat, natriumnitrat, natriummetasiicat pentahydrat, natriumfosfatmonobasic, vitaminbestand, spormetallbestand, antibiotikabestand og HEPES-buffer ved pH = 7,9. Konsentrasjonene av hver komponent er angitt i materialtabellen. Detaljer om kulturen finner du i Sutak et al.11
- Sentrifuger en P. tricornutum diatomkultur i et 50 ml polypropylenrør på 1100 x g i 6 minutter og overfør pellet til en kolbe med friskt medium.
- La kulturen vokse i syntetisk sjøvann i et vekstkammer i 24 timer.
- Sentrifuger planktonkulturen i 6 min ved 1100 x g og overfør pelletsen til friskt medium som inneholder Fe-citrate (1 μM i den endelige kulturen). Inkuber i 72 timer.
- Forbered planktoncellene
- Sentrifuger cellene i 3 min ved 1100 x g og skyll med medium uten jern.
- Overfør pelletsen til et 1,5 ml polypropylenrør, vask med ultrarent vann og sentrifuger 2x i 3 min ved 1100 x g. Fjern supernatanten.
- Dypp den nederste delen av 1,5 ml polypropylenrøret som inneholder pelletsen i LN2 , som beskrevet i trinn 1.8.
- Overfør de frosne cellene i en LN2 frossen molder og trykk raskt med en XRF pelletspresse (figur 3 og figur 7) som beskrevet i trinn 1.9.
- Fjern pelletsen og oppbevar den i en LN2-tank for langvarig lagring.
- Følg trinn 1.9.6 (se figur 4 for overføringen til kryostatprøveholderen).
3. Referanse sammensatt forberedelse og måling
MERK: Referanseforbindelser (faste eller flytende) representanter for arten og forventes å bli funnet i det biologiske systemet må utarbeides og analyseres av XAS for sammenligning med eksperimentelle biologiske prøver. Referansespektra finnes også i databaser 12,13,14 og kan brukes forutsatt at måleforholdene (f.eks. spektraloppløsning) var lik de eksperimentelle prøvene.
- For referanser i vandig løsning, veie innledende forbindelser i pulver eller flytende form under anaerob tilstand eller inert atmosfære. Forbered redoksensitive referanser i en inert atmosfære (dvs. i en anaerob hanskeboks eller i en Schlenk-linje, se figur 5 og figur 6) for å unngå oksido-reduktive reaksjoner og for å bevare forbindelsens kjemiske integritet, som kan være svært reaktiv og ustabil i omgivelsesluften). Her ble alle selenhenvisningene utarbeidet ved hjelp av en Schlenk-linje og avfettet ultrarent vann (figur 6). Flytende FeIII-malate og ferritin ble tilberedt ved omgivelsesluft.
- Bland med passende løsning for å nå en 1% wt endelig konsentrasjon av det studerte elementet (dvs. selen eller jern) for innsamling i fluorescensmodus.
MERK: Ultrapure vann er den mest brukte løsningen for å tilberede XAS-referanser. Tilsetning av glyserol (15%-20%) er nødvendig for væsker målt ved hjelp av standard XAS fluorescens for å forhindre gjenstander som oppstår fra røntgendiffraksjon av iskrystaller og bevart kvalitet på XAS-signalet samlet inn med faststoffdetektoren. For HERFD-XAS er glyserol imidlertid ikke obligatorisk. Ved hjelp av et krystallanalysatorspektrometer i stedet for en solid state-detektor, velges energien med en ekstremt høy oppløsning, og diffraksjonen indusert av iskrystaller påvirker ikke datainnsamlingen til det studerte elementet1. - Konserver og oppbevar den tilberedte oppløsningen i en forseglet Schlenk-ballong (figur 5) eller i et 1,5 ml polypropylenrør til måling under samme forhold som prøvene.
- For faste referanser, vei selen eller jernmodell sammensatte pulver i omgivelsesluft eller i en hanskeboks hvis arten er redoksensitiv. Her ble solide FeII-referanser (Fe II-acetat og vivianite) tilberedt i en gassformig N2 hanskeboks mens FeIII (Fe(OH)3 og FeIII-fosfat) ble tilberedt ved omgivelsesluft.
- Vei bornitrittpulver med høy renhet og bland med modellforbindelsene pulver for å nå en 1% wt endelig konsentrasjon av det studerte elementet (figur 7A).
- Grind til et fint pulver ved hjelp av en mørtel i minst 15 min.
- Plasser pulverblandingen i molderen for å klargjøre pellets med hydraulikkpressen (figur 7B, lik figur 3A for prøvepelleten).
- Lukk molderen med stempelet (figur 7C, lik figur 3B for prøvepellet).
- Trykk for å få bulkpellet (figur 7D, lik figur 3C for prøvepelleten).
- Oppbevar de tilberedte bulkpellets i hanskerommet til de analyseres under samme forhold som prøvene.
MERK: Bulkpellet holder seg noen ganger til stemplene, avhengig av for eksempel pulverkompensiteten. Å fjerne det mykt uten å bryte det da kan være vanskelig. I så fall må følgende prosedyre ved hjelp av polyimiddisker (f.eks. Kapton) brukes. - Sett en dråpe etanol på hver side av stemplene som vil være i kontakt med pulveret (figur 8A).
- Forbered to polyimidskiver med en diameter som er litt mindre enn stemplene. Polyimidtykkelsen må være 10-25 μm (tynnere vil være vanskelig å manipulere, tykkere vil absorbere for mye av røntgenfotonene under analyse).
- Sett diskene på stemplene. De vil holde seg ved kapillær virkning (figur 8B).
- Monter molderen med stempelet, tilsett pulveret og legg det i det andre stempelet (figur 8C).
- Trykk (se trinn 3.11) og fjern den komprimerte bulkpellet fra stemplene.
MERK: De faste referansene kan monteres på den kryostatspesifikke prøveholderen som prøvene (se trinn 1.8.6). Væskereferansene kan monteres på den kryostatspesifikke prøveholderen. Se figur 9A for en CRG-FAME cryostat prøveholder. Den samme prosedyren kan brukes ved hjelp av en CRG-FAME-UHD prøveholder, vist i figur 4D, ved hjelp av følgende prosedyre. - Montering av væskereferanse på kryostatprøveholderen.
- Still inn polyimidbåndet (f.eks. kapton) (25 μm tykt) for å forsegle den ene siden av hullet på prøveholderen ved RT (figur 9B).
- Bruk en sprøyte, fyll hulrommet sakte med løsningen til den når toppen. Unngå bobler. Reservoaret må fylles (figur 9C, venstre).
- Forsegle den andre siden av hulrommet med båndet (figur 9C, høyre).
- Dypp den forseglede prøveholderen i LN2 (figur 9D, T0–T3).
- Entermisk reaksjon induserer LN2 boblende. Vent til boblen stopper, og signaliser enden av reaksjonen (figur 9D, T3–T5).
- Overfør prøveholderen ved 77 K til kryostaten på strålelinjen før du starter datainnsamlingen (figur 9D, T6) eller oppbevar den i LN2 Dewar.
MERK: Den frosne oppløsningen er godt spredt i hulrommet og danner en jevn og homogen pellets (figur 9D, T7).
4. HERFD-XAS: måleprosedyre
- Optimaliser alle krystallene fra CAS i Bragg-forhold med hensyn til fluorescenslinjens energi av interesse. Denne prosedyren kan gjøres med en konsentrert referanseforbindelse.
- Kalibrer hendelsen monokromatisk stråleenergi ved hjelp av en referanse som energiposisjonen til absorpsjonskanten er kjent for (vanligvis en ren metallisk folie). Denne referansen kan plasseres i et annet trinn etter prøven, i dobbel overføringsmodus, for å kunne kontrollere kalibreringen for hvert oppnådde spektra og til slutt justere dem etter behandling.
- Plasser prøven i en flytende heliumkryostat for biologiske prøver etter den aktuelle prosedyren som er beskrevet i trinn 1.9.6.
- Lukk den eksperimentelle hutch etter synkrotronsikkerhetsregler.
- Utfør XAS-oppkjøpet på et energiområde som dekker den valgte absorpsjonskanten.
- Etter hvert spektraloppkjøp flytter du prøven minst dobbelt så stor som bjelkestørrelsen i bevegelsesretningen før du starter et nytt oppkjøp.
MERK: I dette tilfellet ble det utført målinger ved hjelp av Ge(440)-krystaller for å velge Fe Ka1-linjen og bruke Ge(844)-krystaller for å velge Se Ka1-linjen. Bjelkestørrelsen på prøven var 200 x 100 μm² (H x V full bredde halv maksimum). Prøvebevegelsen mellom hvert oppkjøp var 500 μm i begge retninger, for å undersøke strukturell homogenitet og for å analysere et nytt område uten tidligere mulig strålingsskade hver gang. Individuelle spektra sammenlignes og slås sammen hvis de er overliggende i støyen. Målingen stoppes for en gitt prøve når kvaliteten på det sammenslåtte spekteret er riktig. Deretter kan dataanalyse utføres ved hjelp av programvare dedikert til XAS-analyse, spesielt de som tillater en lineær kombinasjonsmontering av normalisert spektra, for eksempel Athena og Artemis (Demeter-programvaregruppe)15, SixPack16 eller Viper17. Fullstendige og detaljerte forklaringer på XAS-analyse faller utenfor omfanget av denne protokollen og finnes i nyere papirer 18,19, noen av dem mer spesifikt viet til biologiske prøver20. Selen XANES referansespektra er allerede samlet i SSHADE spektra database21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hovedmålene med disse preparatene var å undersøke samspillet mellom selen nanopartikler (Se-NPs) og kreftceller, og jernbinding og beslagleggelse i planteplankton.
HERFD-XANES-spektra av selen i opprinnelig tilstand (BSA Se-NPs) og i celler inkubert i næringsmiddelmedium (BSA Se-NPs etter 24 h inkubasjon) er vist i figur 10. Resultatene viste at selen i de første Se-NPs var til stede som både Se(0) og selenittlignende former, mens selen i cellene etter interaksjoner med PC-3-celler hovedsakelig var til stede som Se(0), og dermed demonstrerte en endring av selenarter i celler. For jern viste HERFD-XANES spektra av referanser distinkte kantposisjoner avhengig av jernoksidasjonstilstanden, med reduserte jernarter skiftet til lave energiverdier (figur 11). To påfølgende spektra samlet på samme posisjon av en diatompellet var like, noe som indikerer at stråleskade var begrenset mellom to oppkjøp ved bruk av en He-cryostat ved 10 K. Videre var spektra fra forskjellige posisjoner i diatompellet (her tre posisjoner) identiske, noe som viste at prøvepellet var homogen, og at spektraet kunne beregnes for å oppnå et bedre signal-til-støy-forholdsspekter (gjennomsnittlig spektrum). Det gjennomsnittlige spekteret for diatomer viser kantfunksjoner som hovedsakelig tilsvarer Fe (III). Lineær kombinasjonsmontering av referansespektraet ble deretter utført for å kvantifisere andelen jernarter som beskrevet i Sarret et al.6.
Figur 1: Typiske cellepellets. De 1,5 ml polypropylenrørene (OVCAR-3 celler venstre, PC-3 celler høyre) som inneholder henholdsvis 8 x 106 celler og 1 x 107 celler. Kreditering: Caroline Bissardon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Klargjøring i anaerob hanskeboks. (A) Anaerob hanskeboks som inneholder en (B) 1,5 ml polypropylenrørstativ (blå) helt nedsenket i flytende LN2. Væsken LN2 presenteres ikke på bildet for klarhet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjema for cellepelleting. (A) Prøvepellet i pressen før lasting. (B) Prøve under lasting. (C) Prøve bulkpellet etter lasting. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Montering av kryoprøven(e). Montering i prøveholderen som er spesifikk for BM16 XAS bjelkelinje ved ESRF. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Anoksisk fremstilling av referanseløsning. Eksempler på selen referansepreparater lagret i Schlenk ballonger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Oppsett for anoksisk fremstilling av referanseløsninger. Oppsett av Schlenk rampen med degasifisert ultrapure vann i flasken til høyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Tilberedning i fast referansepellet. Tilberedning av pressede sylindriske pellets for pulverforbindelser enten i omgivelsesluft eller under hanskeboksen. (A) Vekten av referansepulveret. (B) Pulveret i det sylindriske hullet i pressestøtten. (C) Lukket pressestøtte. (D) Trykk på. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Fremstilling av en solid referansepellet ved hjelp av polyimidskiver. Tilberedning av presset sylindrisk pellet for klissete eller sprø pulverforbindelser. (A) En dråpe etanol på hver side av stemplene som vil være i kontakt med pulveret, vil tillate polyimidskivene på stemplene å holde seg til dem (B). Molderen er montert med stempelet. Deretter kan pulveret deponeres, og molderen kan lukkes med det andre stempelet (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Klargjøringstrinn for kryostatprøveholderen for en væskereferanse eller prøve. For bildeklarhet ble bilder tatt utenfor hanskerommet og uten farlige stoffer. Her brukte vi ddH2O vann. Om nødvendig kan dette preparatet gjøres under en hanskeboks eller inert atmosfære (N2) plasttelt. (A) Prøveholder. (B) Plasser polyimidtape på den buede overflaten for å forsegle hullet. (C) Injiser referanseløsningene langsomt ved å slippe ved hjelp av en sprøyte til hulrommet er fylt. Ingen luftbobler må forbli. Forsegle det andre hullet med polyimidbånd. (D) Stupe i LN2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Se K-edge typisk HERFD-XANES-analyse. Se K-edge HERFD-XANES av BSA-belagte Se-NPs, som mottatt og forlatt 24 h i cellekultur medium, og PC-3 celle utsatt for BSA-belagte Se-NPs. Spectra er forskjøvet for klarhet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Fe K-edge typisk HERFD-XANES-analyse. Eksempel på spektra samlet under vårt eksperiment på jernspesiering i plankton. De seks øvre spektraene tilsvarer referansene/standardene. Den overliggende spektra (i rødt og svart) tilsvarer to spektra samlet på samme posisjon av pellet. Spektra merket pos # 1, pos # 2 og pos # 3 ble samlet på tre forskjellige posisjoner av prøvepelleten. Spekteret kalt Diatoms Average tilsvarer det gjennomsnittlige spektraet samlet på ulike stillinger av pellets og er prøven som spesieringen må bestemmes for. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Produkter | PC3-cellelinje | OVCAR3-cellelinje |
| ATCC modifisert RPMI 1640 medium | 445 ml | 394,5 ml |
| Føtal bovint serum | 50 ml | 100 ml |
| Penicillin-Streptomycin | 5 ml | 5 ml |
| Bovint insulin | - | 500 μL |
Tabell 1. Forberedelse av cellekulturmedier. Cellene er dyrket i American Type Culture Collection (ATCC) modifisert RPMI 1640 medium supplert med 10% av foster bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (PS) for PC-3 prostatakreftceller og med 20% fbs og 1% penicillin-streptomycin og 0,01 mg / ml storfeinsulin for OVCAR-3 eggstokkkreftceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen ble brukt til å studere den kjemiske formen for selen og jern i biologiske prøver ved røntgenabsorpsjonsspektroskopi. Den fokuserer på kryo-forberedelse og lagring av biologiske prøver og referanser forbindelser, samt på HERFD-XAS målinger.
Kryo-forberedelse og lagring
Kryo-preparatet av de store biologiske prøvepellets tillater bevaring av den kjemiske integriteten til artene som er tilstede i prøvene. Dette er avgjørende, fordi det er observert spesieringsendringer ved bruk av frysetørking eller lufttørking for tilberedning6. Denne protokollen bør brukes så snart strålelinjen som er valgt for målinger er utstyrt med en helium cryostat.
For referanseforbindelser er det nødvendig å jobbe i en anoksisk atmosfære når du bruker redoksensitive elementer for å bevare oksidasjonstilstanden. Dette kan deretter kontrolleres med variasjoner i spektral kantposisjon som vist for jernholdige og jernholdige referanseforbindelser (figur 11).
Denne prøveprepareringen kan utføres før synkrotron- eller laboratorieanalysen. I dette tilfellet skal den frosne pelletsen eller referansen overføres til en kryotube og lagres i en LN2-tank . Denne LN2-lagringen er obligatorisk for å gi et beskyttende inert miljø og unngå endringer i den kjemiske arten, spesielt for reaktivt jern eller selen. Fortrinnsvis bør prøver utarbeides like før måling eller lagres noen dager før analyse. Det er best å ikke lagre prøver over lengre tid (dvs. måneder).
Kryo-analyse
Analyse ved lave temperaturer, ideelt ved 10 K, er sterkt forfektet for å redusere skade forårsaket av den intense røntgenstrålen, spesielt dannelsen av frie radikaler fra hydrolyse av vann, noe som kan skade proteinmatrisen og skape fotoreduksjon av overgangsmetallioner eller fotoreduksjon av elementer som svovel22. Det er best å ta hensyn til disse mulige endringene i den kjemiske arten gjennom rask oppkjøp av XAS-spekteret. Prøven bør også skannes for å eksponere et ikke-utstrålet område for hvert spektrum. Som demonstrert av spektra samlet på de tre forskjellige posisjonene til planteplanktonpellet (figur 11), avslører en slik strategi kraftig spektra, som deretter kan beregnes for å oppnå et bedre signal-til-støy-forhold.
Fremtidige programmer
I vårt arbeid brukte vi en strålelinje dedikert til HERFD-XAS-målinger (FAME-UHD, ESRF, Frankrike), men denne protokollen for biologisk prøvepreparering kan brukes på en hvilken som helst standard XAS-strålelinje utstyrt med en kryostat mens du bruker andre typer detektorer som multielement Ge Solid-State-Detector eller Silicon-Drift Detector. Den foreslåtte arbeidsflyten kan også brukes på andre kjemiske elementer eller noe biologisk materiale som forventes å bli studert ved røntgenabsorpsjonsspektroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for økonomiske bidrag til beamline-utviklingen av CEMHTI (Orleans, Frankrike, ANR-13-BS08-0012-01) og Labex OSUG@2020 (Grenoble, Frankrike, ANR-10-LABX-0056). FAME-UHD-prosjektet støttes økonomisk av den franske "grand emprunt" EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), CEA-CNRS CRG-konsortiet og INSU CNRS-instituttet. Vi er takknemlige for alle bidragene under eksperimentene, spesielt alle personene som jobber med BM30B og BM16. Forfatterne anerkjenner det europeiske synkrotronstrålingsanlegget for levering av synkrotronstrålingstråletid. Vi anerkjenner også PHYTOMET ANR-prosjekt for økonomisk støtte (ANR-16-CE01-0008) og SEDMAC-prosjekt for økonomisk støtte (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
References
- Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).
- Proux, O., et al. High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences. Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Proux, O., et al. FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests. Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).
- Sarret, G., et al. Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
- Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).
- Bissardon, C., et al. Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China. , Available from: https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7 (2018).
- Isaure, M. P. Metals in microorganisms: new insights from nano-scale imaging and X-ray absorption spectroscopy. 102nd Canadian Chemistry Conference and Exhibition Environmental Chemistry. Quebec, Canada. , Available from: http://www.ccce2019.ca/environmental-chemistry (2019).
- Weekley, C. M., et al. Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
- Sutak, R., et al. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step. Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).
- Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. The challenge of constructing an international XAFS database. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).
- Schmitt, B., et al. SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure. , Available from: https://www.sshade.eu/ (2018).
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Ravel, B., Newville, M. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).
- Webb, S. M. SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica Scripta. 115, 1011 (2005).
- Klementiev, K. V.
- Newville, M.
- Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).
- Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).
- Bissardon, C., Bohic, S., Proux, O. Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME. , Available from: https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001 (2019).
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).
