Временное изображение бактериальных роев и коллективный стресс ответ
Summary
Мы подробно простой метод для производства высокого разрешения замедленного фильмов Pseudomonas aeruginosa стаи, которые реагируют на бактериофаг (фаг) и антибиотик стресс с помощью планшетного сканера документов. Эта процедура является быстрым и простым методом мониторинга динамики рояии и может быть адаптирована для изучения подвижности и роста других видов бактерий.
Abstract
Рой является одной из форм подвижности поверхности наблюдается во многих бактериальных видов, включая Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli. Здесь плотные популяции бактерий перемещаются на большие расстояния в характерных тендриловидных сообществах в течение нескольких часов. Рой чувствителен к нескольким факторам, включая среднюю влажность, влажность и содержание питательных веществ. Кроме того, коллективная реакция на стресс, которая наблюдается в P. aeruginosa, которые подчеркиваются антибиотиками или бактериофаг (фаг), отталкивает рои от приближения области, содержащей стресс. Описанные здесь методы касаются того, как контролировать критические факторы, влияющие на рой. Мы внедряем простой метод мониторинга динамики рояии и коллективного реагирования на стресс с высоким временным разрешением с помощью планшетного сканера документов, а также описываем, как компилировать и выполнять количественный анализ роев. Этот простой и экономичный метод обеспечивает точную и хорошо контролируемую количественную оценку рояии и может быть распространен на другие типы анализов роста на основе плит и бактериальных видов.
Introduction
Рой является коллективной формой скоординированной бактериальной подвижности, что повышает устойчивость к антибиотикам и производство факторов вирулентности в принимающей1,2,3. Это многоклеточное поведение происходит на полутвердых поверхностях, которые напоминают слизистые слои, покрывающие эпителиальные мембраны в легких4,,5. Biosurfactants обычно производятся роятся населения для преодоления поверхностного натяжения на поверхности и производство из них регулируется комплексных клеток ячейки сигнализации систем, также известный как кворум зондирования6,7,8. Многие виды бактерий способны роятся, в том числе Pseudomonas aeruginosa,Золотистый стафилококк,и Escherichia coli9,10,11,12. Узоры роятся, созданные бактериями, разнообразны и подвержены воздействию физических и химических свойств поверхностного слоя, включая состав питательных веществ, пористость и влажность13,14. В дополнение к поверхностным свойствам, температура роста и влажность окружающей среды влияют на некоторые аспекты динамики роя, в том числе скорость роения и модели12,,13,,14,15. Переменные роста, влияющие на рой, создают проблемы, влияющие на экспериментальное воспроизводимость и способность интерпретировать результаты. Здесь мы описываем простой стандартизированный метод мониторинга динамики бактериальных стай с помощью замедленной визуализации. Метод описывает, как контролировать критические условия роста, которые существенно влияют на прогрессирование роя. По сравнению с традиционными методами анализа роя, этот метод визуализации замедленного действия позволяет отслеживать подвижность нескольких роев одновременно в течение длительных периодов времени и с высоким разрешением. Эти аспекты улучшают глубину данных, которые могут быть получены в ходе мониторинга стай, и облегчают выявление факторов, влияющих на рой.
Рой в P. aeruginosa облегчается через производство и высвобождение rhamnolipids и 3-(3-гидроксиалканоилокси)алканоиновые кислоты в окружающую среду6,16. Введение стресса от сублетальных концентраций антибиотиков или инфекции фаговым вирусом влияет на организацию стай. В частности, эти стрессы побуждают P. aeruginosa выпустить молекулу кворума зондирования 2-гептил-3-гидрокси-4-хинолона, также известный как Псевдомонас хинолон сигнал (ПЗС)17,18. В рое анализы, которые содержат две популяции стаи, ПЗС производства стресс-индуцированной населения отталкивает необработанных стай от входа в область, содержащую стресс (Рисунок 1). Этот коллективный стресс ответ представляет собой опасность связи сигнализации системы, которая предупреждает P. aeruginosa о близлежащих угроз18,19. Влияние стресса на P. aeruginosa, активации коллективной реакции на стресс, и отвращение стаи могут быть визуализированы с помощью замедленного метода изображения описано здесь. Описанный здесь протокол объясняет, как: (1) подготовить агар пластины для роятся, (2) культуры P. aeruginosa для двух типов анализов (традиционные анализы рояилища или коллективные анализы реакции на стресс) ( Рисунок 1 ),(рисунок 1),(3) приобрести замедленного изображения, и (4) использовать ImageJ для компиляции и анализа изображений.
Кратко, P. aeruginosa от ночной культуры пятнистый в середине роятся агар пластины в то время как P. aeruginosa, которые инфицированы фагом или лечение антибиотиками заметили на спутниковых позиций. Прогрессирование P. aeruginosa роятся на потребительском документе планшетный сканер, который помещается в влажности регулируется 37 C инкубатор. Сканер управляется программным обеспечением, которое автоматически сканирует пластины через регулярные промежутки времени в течение периода роста роя, как правило, 16-20 ч. Этот метод дает одновременные видеозаписи до шести 10 см роящихся пластин. Изображения компилируются в кино, и отталкивание стай вызванными стрессом популяций количественно с помощью свободно доступного программного обеспечения ImageJ. Особое внимание уделяется обеспечению согласованности и воспроизводимости между различными экспериментами роятся.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол фокусируется на минимизации изменчивости в роятся агар пластин и предоставление простой и недорогой метод для получения замедленного изображения P. aeruginosa роятся и реагирования на стресс. Эта процедура может быть расширена до изображения других бактериальных систем…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Дж-Л.Б., А.С., и Н.М.Х-К. написал и пересмотрел рукопись. Все авторы разработали эксперименты. J.-L.B. провел эксперименты и анализ. Эта работа была поддержана NIH награду K22AI112816 и R21AI139968 грант a.S. и Калифорнийского университета. Н.М.Х-К. была поддержана Lundbeck стипендий R220-2016-860 и R251-2017-1070. Спонсоры не принимали никакого решения о представлении работы для публикации. У нас нет конкурирующих интересов, чтобы заявить.
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5X M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5X M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5X M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30-min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
References
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
- Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
- Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O’Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, 2005-2013 (2003).
- Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
- Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
- Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
- Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Ha, D. -. G., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, 67-72 (2014).
- Tremblay, J., Richardson, A. -. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
- Bru, J. -. L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
- van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
- Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
- Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
- Bernier, S. P., Ha, D. -. G., Khan, W., Merritt, J. H., O’Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).
