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Artículo de método

Imágenes de lapso de tiempo de enjambres bacterianos y la respuesta colectiva al estrés

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DOI:

10.3791/60915

⸱

23 de mayo de 2020

 ,  , 
1Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 2Department of Physics & Astronomy, University of California, Irvine, 3Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen

En este artículo

Resumen

Detallamos un método simple para producir películas de lapso de tiempo de alta resolución de enjambres Pseudomonas aeruginosa que responden al bacteriófago (fago) y estrés antibiótico utilizando un escáner de documentos de base plana. Este procedimiento es un método rápido y sencillo para monitorear la dinámica de enjambre y puede adaptarse para estudiar la motilidad y el crecimiento de otras especies bacterianas.

Resumen

El enjambre es una forma de motilidad superficial observada en muchas especies bacterianas incluyendo Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli. Aquí, las poblaciones densas de bacterias se mueven a grandes distancias en comunidades características en forma de zarcillo en el transcurso de horas. El enjambre es sensible a varios factores, incluyendo humedad media, humedad y contenido de nutrientes. Además, la respuesta al estrés colectivo, que se observa en P. aeruginosa que se estresa con antibióticos o bacteriófagos (fago), repele que los enjambres se acerquen a la zona que contiene el estrés. Los métodos descritos aquí abordan cómo controlar los factores críticos que afectan al enjambre. Presentamos un método sencillo para monitorear la dinámica de enjambre y la respuesta de tensión colectiva con alta resolución temporal usando un escáner de documentos de base plana, y describimos cómo compilar y realizar un análisis cuantitativo de enjambres. Este método simple y rentable proporciona una cuantificación precisa y bien controlada del enjambre y puede extenderse a otros tipos de ensayos de crecimiento a base de placas y especies bacterianas.

Introducción

El enjambre es una forma colectiva de motilidad bacteriana coordinada que aumenta la resistencia a los antibióticos y la producción de factores de virulencia en el huésped1,2,3. Este comportamiento multicelular ocurre en superficies semisólidas que se asemejan a las de las capas mucosas que cubren las membranas epiteliales en los pulmones4,5. Los biosurfactantes son comúnmente producidos por poblaciones enjambres para superar la tensión superficial en las superficies y la producción de estos está regulada por complejos sistemas de señalización de células celulares, también conocidos como cuórum de sensato6,7,8. Muchas especies de bacterias son capaces de enjambre, incluyendo Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,y Escherichia coli9,10,11,12. Los patrones de enjambre creados por las bacterias son diversos y se ven afectados por las propiedades físicas y químicas de la capa superficial, incluyendo la composición de nutrientes, porosidad y humedad13,14. Además de las propiedades de la superficie, la temperatura de crecimiento y la humedad ambiental afectan a varios aspectos de la dinámica de enjambre, incluyendo la tasa de enjambre y los patrones12,,13,,14,,15. Las variables de crecimiento que afectan al enjambre crean desafíos que afectan la reproducibilidad experimental y la capacidad de interpretar los resultados. Aquí, describimos un método estandarizado simple para monitorear la dinámica de los enjambres bacterianos a través de imágenes de lapso de tiempo. El método describe cómo controlar las condiciones críticas de crecimiento que afectan significativamente la progresión del enjambre. En comparación con los métodos tradicionales de análisis de enjambres, este método de imágenes de lapso de tiempo permite realizar un seguimiento de la motilidad de múltiples enjambres simultáneamente durante períodos prolongados de tiempo y con alta resolución. Estos aspectos mejoran la profundidad de los datos que se pueden obtener de la supervisión de enjambres y facilitan la identificación de los factores que afectan el enjambre.

El enjambre en P. aeruginosa se facilita a través de la producción y liberación de ácidos rhamnolipids y 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic en el área circundante6,16. La introducción del estrés a partir de concentraciones subletales de antibióticos o infección por el virus del fago afecta la organización de enjambres. En particular, estas tensiones inducen a P. aeruginosa a liberar la molécula de sensibilidad de quórum 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolona, también conocida como la señal de quinolona Pseudomonas (PQS)17,18. En los ensayos de enjambres que contienen dos poblaciones de enjambres, los PQS producidos por la población inducida por el estrés repele que los enjambres no tratados entren en el área que contiene la tensión (Figura 1). Esta respuesta de estrés colectivo constituye un sistema de señalización de comunicación de peligro que advierte a P. aeruginosa sobre amenazas cercanas18,,19. Los efectos del estrés en P. aeruginosa, la activación de la respuesta de estrés colectivo y la repulsión de enjambres se pueden visualizar utilizando el método de imagen de lapso de tiempo descrito aquí. El protocolo descrito aquí explica cómo: (1) preparar placas de agar para enjambre, (2) cultivo P. aeruginosa para dos tipos de ensayos (ensayos de enjambre tradicionales o ensayos de respuesta de estrés colectivo)(Figura 1), (3) adquirir imágenes de lapso de tiempo, y (4) utilizar ImageJ para compilar y analizar las imágenes.

Brevemente, P. aeruginosa de un cultivo nocturno se ve en medio de una placa de agar enjambre, mientras que P. aeruginosa que están infectados con fago o tratados con antibióticos son vistos en las posiciones del satélite. La progresión del enjambre de P. aeruginosa se supervisa en un escáner de cama plana de documentos de consumo que se coloca en una incubadora de 37 oC regulada por humedad. El escáner está controlado por un software que escanea automáticamente las placas a intervalos regulares durante el período de crecimiento del enjambre, normalmente de 16 a 20 h. Este método produce videos simultáneos de lapso de tiempo de hasta seis placas de enjambre de 10 cm. Las imágenes se compilan en películas y la repulsión de enjambres por poblaciones inducidas por el estrés se cuantifica mediante el uso de software ImageJ disponible libremente. Se presta especial atención a garantizar la coherencia y reproducibilidad entre los diferentes experimentos de enjambre.

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Protocolo

1. Preparación de placas de agar enjambre para P. aeruginosa Swarming Time-lapse Imaging

  1. Preparar 1 L de 5x M8 medios mínimos en una botella de vidrio añadiendo 64 g de Na2HPO4•7H2O, 15 g de KH2PO4y 2,5 g de NaCl en agua de doble destilación de 500 ml (ddH2O). Ajuste el volumen final a 1 L con ddH2O. Autoclave adicional para esterilizar y almacenar medios líquidos a temperatura ambiente.
  2. Preparar 100 ml de 1 M MgSO4 (sulfato de magnesio) en una botella de vidrio añadiendo 24,6 g de MgSO4•7H2O en 50 ml ddH2O. Ajuste el volumen final a 100 ml con ddH2O. Autoclave adicional para esterilizar. Conservar a temperatura ambiente.
  3. Preparar 100 ml de 20% de ácidos casamino en una botella de vidrio añadiendo 20 g de ácidos casamino en 50 ml ddH2O. Ajuste el volumen final a 100 ml con ddH2O. Autoclave adicional para esterilizar. Conservar a temperatura ambiente.
  4. Preparar 100 ml de 20% de glucosa en un frasco de vidrio añadiendo 20 g de glucosa en 50 ml de ddH2O. Ajuste el volumen final a 100 ml con ddH2O. Esterilizar por filtración con filtro de 0,22 m. Conservar a temperatura ambiente.
  5. Para hacer 10 placas de agar enjambre, añadir 1 g de agar en 100 ml de ddH2O y ajustar el volumen final a 160 ml con ddH2O adicional en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Esterilice mediante autoclave.
    1. Inmediatamente después del autoclave, coloque la solución de agar en un baño de agua de 55 oC durante 15 minutos.
    2. Retire la solución de agar del baño de agua y añada 40 ml de 5x M8 medios mínimos, 200 ml de 1 M MgSO4, 2 ml de 20% de glucosa y 5 ml de ácidos casamino al 20%15. Continúe con el paso 1.6 inmediatamente después de la mezcla.
      NOTA: Las concentraciones finales son 0,5% agar, 1 mM MgSO4, 0,2% glucosa y 0,5% ácidos casamino.
  6. Usando una pipeta de 25 ml para un volumen constante, agregue 20 ml de la solución de agar enjambre por plato Petri de 10 cm de diámetro.
    NOTA: Un volumen fijo de solución de agar es importante, ya que el volumen afecta al tiempo de secado y al contenido de humedad del agar. Evite las burbujas al hacer las placas de agar enjambre.
  7. Deje que el agar se solidifique colocando las placas de agar enjambre en una sola pila con tapas puestas durante 1 h en el banco a temperatura ambiente. Encienda el deshumidificador para disminuir la humedad relativa de la habitación a 40-50% 1 h antes del siguiente paso.
  8. Seque las placas de agar enjambre durante 30 minutos adicionales con las tapas en una campana de flujo laminar a 300 pies3/min con 40-50% de humedad relativa a temperatura ambiente. Seque el interior de las tapas colocándolas boca arriba en la campana de flujo laminar. Almacene las placas de agar enjambre a 4 oC durante un máximo de 24 h.
  9. Prepare tapas negras de 10 cm petri para la toma de imágenes alisando el interior de la tapa con papel de lija. Coloque las tapas dentro de una caja de embalaje y coloque la caja de embalaje debajo de una campana química. Rocíe dentro de las tapas con pintura en aerosol negra. Deje que las tapas se sequen.
    NOTA: Las tapas negras se pueden reutilizar para experimentos adicionales. Es importante que las tapas estén pintadas para que no reflejen la luz durante el escaneo.

2. Crecimiento de las condiciones de P. aeruginosa y Plating

  1. Preparar 400 ml de caldo de lisógenia (LB) añadiendo 10 g de mezcla en polvo LB-Miller en 400 ml ddH2O. Para platos de Petri de 2% LB-agar, agregue 8 g de agar adicional. Autoclave para esterilizar.
  2. Vierta 20 ml de medio de agar LB fundido en platos Petri de 10 cm de diámetro y deje que se solidifiquen a temperatura ambiente durante la noche. Almacene los medios líquidos a temperatura ambiente y a garares a 4oC.
  3. Streak P. aeruginosa en un plato de Petri LB-agar a partir de un caldo congelado almacenado a -80 oC utilizando lazos estériles o palos de madera. Incubar la placa Petri boca abajo durante la noche a 37oC. Almacene la placa de agar LB a 4 oC durante un máximo de 1 semana.
  4. Escoge una sola colonia de la placa Petri con un lazo estéril o palo de madera, inocularla en un medio LB de 2 ml e incubar el cultivo a la saturación durante la noche (16-18 h) a 37oC en un tambor de rodillos a 100 rpm.
  5. Pipeta de 5 l de cultivo nocturno del paso 2.4 utilizando un pipeta P20 y punto en el centro de la placa de agar enjambre acercándose a la punta del pipeta en un ángulo (10–45o) 2,5 cm por encima del área de manchado, pipeteando hasta la primera parada, y tocando el agar con sólo la gota de líquido(Figura 1B).
    1. Evite tocar el agar con la punta del pipeteo, ya que daña el agar. Utilice una plantilla para colocar el punto constantemente a través de diferentes placas de agar enjambre(Figura suplementaria S1).
    2. Para los ensayos de enjambre tradicionales, utilice solo el punto central y vaya al paso 2.8. Para los ensayos de respuesta al estrés colectivo, continúen con el paso 2.6 (para la infección por fagos) o el paso 2.7 (para el estrés antibiótico).
  6. Para la infección por fago, mezcle 30 ml de cultivo nocturno de P. aeruginosa a partir del paso 2.4 con 6 l de 1 x10 12 pfu/ml de fago DMS3vir20. Proceda inmediatamente al siguiente paso.
    1. Pipet a 6 l de la P. mezcla de aeruginosa-fago del paso 2.6 usando un pipeta P20 y punto en 6 posiciones de satélite equidistantes en un círculo concéntrico de radio de 2,8 cm que se centra en la placa Petri acercándose a la punta del pipeta en un ángulo (10 a 45o) 2,5 cm por encima del área de manchado, pipeteando hasta la primera parada, y tocando el agar con solo la caída de líquido(Figura 1).C
    2. Evite tocar el agar con la punta del pipeteo, ya que daña el agar. Utilice una plantilla de chapado para la coherencia (Figura suplementaria S1). Continúe con el paso 2.8.
  7. Para los tratamientos antibiótico, mezcle el cultivo nocturno de 30 ml P. aeruginosa del paso 2.4 con 6 ml de gentamicina de 3 mg/ml, 10 ml de kanamicina de 100 mg/ml o 7,5 ml de fosfomicina de 100 mg/ml. Proceda inmediatamente al siguiente paso.
    1. Pipet 6 l de antibiótico tratado P. aeruginosa del paso 2.7 usando una pipeta P20 y spot en 6 posiciones de satélite equidistantes en un círculo concéntrico de radio de 2,8 cm alrededor del centro de la antena acercándose a la punta del pipeteo en un ángulo (10 a 45o) 2,5 cm por encima del área de detección, pipeteando hasta la primera parada, y tocando el agar con solo la gota de líquido).D
    2. Evite tocar el agar con la punta del pipeteo, ya que daña el agar. Utilice una plantilla de chapado para la coherencia (Figura suplementaria S1). Continúe con el paso 2.8.
  8. Sustituya las tapas claras de la vajilla Petri por tapas negras hechas en el paso 1.9(Figura 2A).
  9. Coloque las placas de agar enjambre en un escáner en una incubadora a 37 oC con un baño de agua de 10 L para mantener la humedad al 75%(Figura 1E, Figura 2B).
    ADVERTENCIA: No moleste las células manchadas en las placas de agar enjambre. Mantenga las placas hacia arriba en todo momento.

3. Adquisición de imágenes con escáner

  1. Disminuya la iluminación ambiental de los platos Petri conectando tela mate negra a un estante de 40-60 cm por encima del escáner de documentos de base plana. Asegúrelo usando corbatas(Figura 2B).
  2. El escáner se controlará mediante un software de escaneo y un software de scripting automático.
    1. En el software de escaneado, seleccione Modo de inicio(figura 3A). Capture imágenes en color seleccionando Color en Tipo de imagen. Para establecer la calidad de imagen, seleccione Otro en Destino y ajuste la Resolución a 300 ppp. Mantenga el tamaño estándar de las imágenes seleccionando Original para Tamaño de destino. Deje todas las opciones en Ajustes de imagen desactivadas para obtener la calidad de imagen estándar.
      NOTA: Tamaño de destino se establece en Original de forma predeterminada. Para seleccionar otras opciones para Tamaño de destino, haga clic en Vista previa primero.
  3. Establezca la ruta de guardado de las imágenes haciendo clic en el icono de carpeta a la derecha de Escanear para abrir Configuración de guardado de archivos(Figura 3A).
    1. Seleccione el destino de la carpeta para guardar imágenes seleccionando Otro en Ubicación y haga clic en Examinar. Elija una carpeta para guardar las imágenes.
    2. Asigne un nombre a las imágenes en el cuadro de texto Prefijo. Establezca número de inicio 001 para comenzar la secuencia de nomenclatura de las imágenes. Establezca el formato de archivo en JPEG seleccionando JPEG (*.jpg) en Tipo en Formato de imagen y haga clic en Opciones para ajustar detalles. Establezca la calidad del formato de imagen ajustando El nivel de compresión a 16, Codificación a estándar y marque Incrustar perfil ICC. Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana(Figura 3B).
    3. Deje la primera opción desactivada ("Sobrescribir cualquier archivo con el mismo nombre") y marque las 3 opciones siguientes ("Mostrar este cuadro de diálogo antes del siguiente escaneo", "Abrir carpeta de imagen después de escanear" y "Mostrar cuadro de diálogo Agregar página después de escanear"). Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana
    4. Compruebe la calidad de la imagen haciendo clic en Vista previa. Aparece la ventana de vista previa y el icono Escanear se vuelve funcional(Figura 3C).
  4. Utilice el software de scripting para automatizar la adquisición de imágenes. El script proporcionado hace clic en Escanear en la ventana Escanear y en Aceptar en la ventana Configuración de guardado de archivos a intervalos de 30 minutos.
    1. Importe el script haciendo clic en Tarea ( Task) Importe y seleccione Single_scan.tsk y Idle_scanning.tsk (archivos TSK proporcionados como archivos suplementarios 1 y 2). Vea la figura 3D.
      NOTA: Single_scan.tsk hace clic en el botón Escanear en la ventana Escanear y en Aceptar en la ventana Configuración de guardado de archivos. Idle_scanning.tsk activa Single_scan.tsk cada 30 minutos. Uno puede cambiar la frecuencia de escaneo cambiando la activación de Idle_scanning.tsk.
    2. Habilite el análisis automático a intervalos de 30 minutos seleccionando Análisis inactivo (importado) y Análisis único (importado),haciendo clic con el botón derecho en Análisis inactivo (importado)y haciendo clic izquierdo en Habilitado (Figura 3D, Figura suplementaria S2).
      NOTA: El análisis automático se ejecuta hasta que el usuario detiene manualmente el script. Para detener el script, seleccione Análisis inactivo (importado),haga clic con el botón derecho en Análisis inactivo (importado)y haga clic con el botón izquierdo en Habilitado. Se eliminará la marca de verificación.

4. Compilación de imágenes de lapso de tiempo y repulsión del enjambre de medición

  1. Realice la edición de imágenes y el análisis de imágenes con ImageJ.
  2. Importe todas las imágenes escaneadas a ImageJ haciendo clic en Archivo . Importación de la lista de importaciones Secuencia de imágenes y seleccione las imágenes. En la ventana Opciones de secuencia, active Convertir a RGB para mantener las imágenes en color. El número de imágenes indica el número de imágenes seleccionadas.
  3. Mantenga Iniciar imagen en 1 para empezar desde la primera imagen de la carpeta y Escalar imágenes al 100% para conservar el tamaño original de las imágenes. Deje la opción Usar pila virtual desactivada. Haga clic en Aceptar y espere a que se carguen las imágenes(Figura 4A).
  4. Establezca el nivel de compresión de vídeo en 100 haciendo clic en Editar . Opciones de la página de opciones de la Entrada/Salida... y ajuste la calidad JPEG a 100.
  5. Guarde el archivo como un archivo .avi haciendo clic en Archivo . Guardar como ? AVI. Ajuste la compresión a JPEG y la velocidad de fotogramas a 5 fps(Figura 4B). Guarde el lapso de tiempo .avi en la carpeta deseada.
  6. Para cuantificar las distancias de repulsión del enjambre, abra una imagen cerca del final del período de enjambre en ImageJ. Haga clic en Archivo ? Abra y seleccione la imagen. Ajustar la escala haciendo clic en Analizar ( Analizar) Establezca Escala y ajuste Distancia en píxeles a 118, Distancia conocida en 1, Relación de aspecto de píxeles en 1,0 y Unidad de longitud a cm ( Figura4C). Deje Global sin marcar. Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana.
  7. Haga clic en el icono Recto y mida desde el centro de la colonia en la posición del satélite hasta el borde de la población enjambre. Seleccione Analizar (Analizar) Medida para hacer que aparezca una nueva ventana con las medidas (Longitud) (Figura 4D).
    NOTA: Utilice "+" para acercar el zoom y "-" para alejar.

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Resultados

Los pasos para cultivar P. aeruginosa, estresar las células e imaginar las placas de agar enjambre se representan en la Figura 1. Inoculamos una sola colonia de cepas de tipo salvaje P. aeruginosa UCBPP-PA14 a partir de una placa de agar LB en 2 ml de caldo LB durante la noche a 37 oC y nos detectamos 5 oC en el centro de la placa de agar enjambre. Las imágenes de lapso de tiempo de esta placa revelan el crecimiento inicial en forma de colonia en el centro y luego la propagación de zarc...

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Discusión

Este protocolo se centra en minimizar la variabilidad en las placas de agar enjambre y proporcionar un método simple y de bajo costo para adquirir imágenes de lapso de tiempo de P. aeruginosa enjambre y responder al estrés. Este procedimiento se puede extender a la imagen de otros sistemas bacterianos mediante la adaptación de la composición de los medios y las condiciones de crecimiento. Para P. aeruginosa,aunque M9 o FAB medio mínimo se puede utilizar para inducir enjambre16

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

J.-L.B., A.S., y N.M.H-K. escribió y revisó el manuscrito. Todos los autores diseñaron los experimentos. J.-L.B. realizó los experimentos y análisis. Este trabajo fue apoyado por el premio NIH K22AI112816 y la concesión R21AI139968 a A.S. y por la Universidad de California. N.M.H-K. fue apoyado por las Becas Lundbeck R220-2016-860 y R251-2017-1070. Los funderos no tuvieron ningún papel en la decisión de presentar la obra para su publicación. No tenemos intereses que declarar.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivos
enjambre
D-GlucosaFisher ChemicalD16500Dextrosa. Para medios de enjambre
Sal disódica de fosfomicina Industriaquímica de TokioF0889Concentración de existencias: 200 mg/mL. Disuelto en ddH2O
sulfato de gentamicinaSigma-AldrichG1914Concentración de stock: 3 mg/mL. Disuelto en ddH2O
Sulfato de kanamicinaSigma-Aldrich60615Concentración de existencias: 100 mg/mL. Disuelto en ddH2O
LB-MillerBD Difco244620Para caldo LB y placas de agar LB
Sulfato de magnesio heptahidratadoSigma-Aldrich230391Para enjambre de medios
Fosfato de potasio monobásicoSigma-AldrichP0662Para 5 medios M8
Cloruro de sodioSigma-AldrichS9888Para 5 medios
M8Fosfato de sodio dibásico heptahidratadoFisher ChemicalS373Para 5x M8 media
Cepas
Pseudomonas aeruginosaSiryaporn labAFS27E.118PA14 cepa
DMS3virO'Toole labDMS3vir20Bacteriófago
< strong>Supplies
Papel de lija de óxido de aluminio3M150 FinePara tapas negras Tela
negra JoannPRD7089Tela negra Pintura
aerosol negraKrylon5592 Negro matePara tapas negras
Matraz ErlenmeyerKimax26500250 mL
Botellas de vidrioPyrex13951L250 mL, 500 mL, 1,000 mL
Bridas de 8 pulgadasGardner BenderE173770tela mate negra
(100 mm x 15 mm)FisherFB0875712placas de poliestireno de 100 mm x 15 mm
Palos de maderaFisher23-400-102Para rayar e inocular bacterias
Equipo
Mercado de autoclavesForge IndustriesSTM-EPara reactivos esterilizantes
Pipeta de 25 mLUSA Scientific, Inc.1072-5410Para pipetear 20 mL para enjambre de placas de agar
DeshumidificadorFrigidaireFAD704DWD 70 pintasPara mantener la humedad relativa de la habitación en aproximadamente 45%
ImageJNIHv1.52aSoftware para el análisis de imágenes
IncubadoraVWR89032-092Para el crecimiento de bacterias a 37 ° C
Baño de agua IsotempFisher15-462-21QPara enfriar medios hasta 55 ° C
Campana de flujo laminarThe Baker CompanySG603APara placas de secado
Pipeta P-20GilsonF123601 Manchado en placas de agar de enjambre
Controlador de pipetasBrandTechaccu-jetPara pipetear 20 mL para enjambre de placas de agar
Tambor de rodilloNew BrunswickTC-7Para el crecimiento de bacterias a 100 rpm
EscánerEpsonEpson Perfection V370Photo Scanner para placas de imagen Software de
automatización de escánerRoboTask Litev7.0.1.932Para imágenes internas de 30 minutos Software de
adquisición de imágenes de escánerEpsonv9.9.2.5USSoftware para placas de imagen
Bacto agar, deshidratado BD Difco 214010 Para placa de agar LB y placa de agar enjambre Ácidos Casamino BD Difco 223050 Para medios de en Para colocar placas de Petri de

Referencias

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