세균성 떼의 시간 경과 이미징 및 집단 스트레스 반응
Summary
우리는 평판 문서 스캐너를 사용하여 박테리오파지 (phage) 및 항생제 스트레스에 반응하는 슈도모나스 aeruginosa 떼의 고해상도 타임 랩스 영화를 생산하는 간단한 방법을 자세히 설명합니다. 이 절차는 무리 역학을 감시하기 위한 빠르고 간단한 방법이고 그밖 세균성 종의 운동성과 성장을 공부하기 위하여 적응될 수 있습니다.
Abstract
떼는 녹농균과 대장균을포함한 많은 Pseudomonas aeruginosa 세균종에서 관찰되는 표면 운동성의 한 형태이다. 여기에서, 박테리아의 조밀한 인구는 시간의 과정을 통해 특징적인 tendril 모양 지역 사회에 있는 먼 거리에 이동합니다. 떼는 중간 수분, 습도 및 영양소 함량을 포함한 여러 가지 요인에 민감합니다. 또한, 항생제 또는 박테리오파지 (파지)에 의해 스트레스를 받는 P. aeruginosa에서 관찰되는 집단 스트레스 반응은 스트레스가 함유 된 영역에 접근하는 무리를 격퇴합니다. 여기에 설명된 방법은 떼에 영향을 미치는 중요한 요소를 제어하는 방법을 설명합니다. 평판 문서 스캐너를 사용하여 높은 시간적 해상도로 군단역학 및 집단 응력 반응을 모니터링하는 간단한 방법을 소개하고 군단의 정량적 분석을 컴파일하고 수행하는 방법을 설명합니다. 이 간단하고 비용 효율적인 방법은 무리의 정확하고 잘 제어 된 정량화를 제공하고 플레이트 기반 성장 측정 및 세균 종의 다른 유형으로 확장 될 수있다.
Introduction
떼는 숙주1,,2,,3에서항생제 내성 및 독성 인자의 생산을 증가시키는 조정된 세균 운동성의 집단 형태이다. 이 다세포 행동은 폐에 있는 상피 막을 덮는 점액 층의 그것과 유사한 반 고체 표면에서 생깁니다4,,5. 생체 계면 활성제는 일반적으로 표면의 표면 장력을 극복하기 위해 무리를 지어 생성되며 이들의 생산은 복잡한 세포 세포 신호 시스템, 일컬어 쿼럼 센싱6,,7,,8에의해 조절된다. 많은 종의 박테리아는 녹농균, 황색포도상구균, 대장균9,,10,,11,,12를포함하여 무리를 지을 수 있다. 세균에 의해 생성된 무리 패턴은 다양하고 영양 성분, 다공성 및 수분13,,14를포함하는 표면층의 물리적 및 화학적 특성에 의해 영향을 받습니다. 표면 특성 이외에, 성장 온도 및 주변 습도는 떼지어 속도 및 패턴12,,13,,14,,15를포함하여 무리 역학의 몇몇 양상에 영향을 미칩니다. 무리에 영향을 미치는 성장 변수는 실험 재현성과 결과를 해석하는 능력에 영향을 미치는 문제를 만듭니다. 여기에서는 시간 경과 이미징을 통해 세균 군단의 역학을 모니터링하는 간단한 표준화 방법을 설명합니다. 이 방법은 떼의 진행에 큰 영향을 미치는 중요한 성장 조건을 제어하는 방법을 설명합니다. 전통적인 군단 분석 방법에 비해 이 타임랩스 이미징 방법을 사용하면 오랜 시간 동안 고해상도로 동시에 여러 군단의 운동성을 추적할 수 있습니다. 이러한 측면은 군단 모니터링을 통해 얻을 수 있는 데이터의 깊이를 향상시키고 떼에 영향을 미치는 요인을 쉽게 식별할 수 있습니다.
P. aeruginosa에서 떼이는 주변 지역으로 의 rhamnolipids 및 3-(3-hydroxyalkanoyloxy) 알카노산의 생산 및 방출을 통해 촉진된다6,,16. 파지 바이러스에 의한 항생제 또는 감염의 하위 치명적인 농도에서 스트레스의 도입은 무리의 조직에 영향을 미칩니다. 특히, 이러한 응력은 P. aeruginosa가 쿼럼 감지 분자 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone을 방출하도록 유도하며, 또한 슈도모나스 퀴놀론 신호(PQS)로 알려져있다 17,,18. 두 마리의 무리 집단을 포함하는 군단 의 에서, 응력 유도 인구에 의해 생성된 PQS는 응력포함 지역을 입력하는 처리되지 않은 떼를 격퇴합니다(그림 1). 이 집단 스트레스 대응은 주변 위협에 대해 P. aeruginosa에게 경고하는 위험 통신 신호 시스템을구성18,,19. P. aeruginosa에대한 스트레스의 영향, 집단 스트레스 반응의 활성화 및 군단의 반발은 여기에 설명된 시간 경과 이미징 방법을 사용하여 시각화 할 수 있습니다. 여기서 설명된 프로토콜은 (1) 무리를 위한 한천 플레이트를 준비하고, (2) 배양 P. aeruginosa 두 가지 유형의 분석(전통적인 무리 분석 또는 집단 스트레스 반응 분석)에대해(그림 1), (그림 1),(3) 시간 경과 이미지를 획득하고, (4) ImageJ를 사용하여 이미지를 컴파일하고 분석하는 방법을 설명합니다.
간략하게, P. aeruginosa 하룻밤 문화에서 파지에 감염 되거나 항생제로 치료 하는 P. aeruginosa 위성 위치에서 발견 하는 동안 무리 한천 접시의 중간에 발견 된다. P. aeruginosa 떼의 진행은 습도 조절 37°C 인큐베이터에 배치되는 소비자 문서 평판 스캐너상에서 모니터링됩니다. 스캐너는 일반적으로 16-20 시간 동안 정기적으로 플레이트를 자동으로 스캔하는 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 이 방법은 최대 6 개의 10cm 떼지어 플레이트의 동시 타임 랩스 비디오를 생성합니다. 이미지는 영화로 컴파일되고 스트레스로 인한 모집단에 의한 무리의 반발은 자유롭게 사용할 수 있는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화됩니다. 서로 다른 무리 실험 간의 일관성과 재현성을 보장하기 위해 특별한 고려 사항이 주어집니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 한천 판의 가변성을 최소화하고 P. aeruginosa 떼지어 스트레스에 대응하는 시간 경과 이미지를 획득하는 간단하고 저렴한 방법을 제공하는 데 중점을 둡니다. 이 절차는 매체 조성 및 성장 조건을 적응시킴으로써 다른 세균 시스템을 이미지화할 수 있다. P. aeruginosa의경우, M9 또는 FAB 최소 배지가 떼지어16,21을유도하는데 사용될 수?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.-L.B., A.S., 그리고 N.M.H-K. 원고를 작성하고 수정했습니다. 모든 저자는 실험을 설계했다. J.-L.B.는 실험 및 분석을 수행하였다. 이 작품은 NIH 상 K22AI112816 및 R21AI139968 A.S. 및 캘리포니아 대학에 의해 지원되었다. N.M.H-K. Lundbeck 펠로우십 R220-2016-860 및 R251-2017-1070의 지원을 받았습니다. 기금 모금자는 출판을 위해 작품을 제출하기로 결정하는 데 아무런 역할이 없었습니다. 우리는 선언할 경쟁적인 이해관계가 없습니다.
Materials
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5X M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5X M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5X M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30-min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
References
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
- Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
- Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O’Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, 2005-2013 (2003).
- Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
- Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
- Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
- Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Ha, D. -. G., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, 67-72 (2014).
- Tremblay, J., Richardson, A. -. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
- Bru, J. -. L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
- van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
- Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
- Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
- Bernier, S. P., Ha, D. -. G., Khan, W., Merritt, J. H., O’Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).
