Vi detalj en enkel metod för att producera högupplösta time-lapse filmer av Pseudomonas aeruginosa svärmar som svarar på bakteriofage (fag) och antibiotika stress med hjälp av en flatbed dokument scanner. Detta förfarande är en snabb och enkel metod för övervakning av svärmande dynamik och kan anpassas för att studera motilitet och tillväxt av andra bakteriearter.
Svärmang är en form av ytmotilitet observerats i många bakteriearter inklusive Pseudomonas aeruginosa och Escherichia coli. Här rör sig täta populationer av bakterier över stora avstånd i karakteristiska tendrilformade samhällen under flera timmar. Svärmande är känslig för flera faktorer, inklusive medelfukt, fuktighet och näringsinnehåll. Dessutom avvisar den kollektiva stressresponsen, som observeras i P. aeruginosa som är stressad av antibiotika eller bakteriofage (fag), svärmar från att närma sig det område som innehåller stressen. De metoder som beskrivs här tar upp hur man kontrollerar de kritiska faktorer som påverkar svärmande. Vi introducerar en enkel metod för att övervaka svärmande dynamik och den kollektiva stressresponsen med hög tidsmässig upplösning med hjälp av en flatbäddsdokumentskanner, och beskriver hur man sammanställer och utför en kvantitativ analys av svärmar. Denna enkla och kostnadseffektiva metod ger exakt och välkontrollerad kvantifiering av svärmande och kan utvidgas till andra typer av plattbaserade tillväxtanalyser och bakteriearter.
Swarming är en kollektiv form av samordnad bakteriell motilitet som ökar antibiotikaresistens och produktion av virulensfaktorer i värden1,2,3. Detta multicellulära beteende uppstår på halvfasta ytor som liknar de av slemhinnor som täcker epitelmembran i lungorna4,5. Biosurfactants produceras vanligen av svärmande populationer för att övervinna ytspänningen på ytor och produktionen av dessa regleras av komplexa cellcellssignaleringssystem, även känd som kvorumkännande6,,7,8. Många arter av bakterier kan svärma, inklusive Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, och Escherichia coli9,10,11,12. De svärmande mönster som skapas av bakterier är olika och påverkas av de fysiska och kemiska egenskaperna hos ytskiktet inklusive näringssammansättning, porositet och fukt13,14. Förutom ytegenskaper påverkar tillväxttemperatur och luftfuktighet flera aspekter av svärmande dynamik, inklusive svärmande hastighet och mönster12,,13,14,15. Tillväxtvariablerna som påverkar svärmanna skapar utmaningar som påverkar experimentell reproducerbarhet och förmåga att tolka resultat. Här beskriver vi en enkel standardiserad metod för att övervaka dynamiken i bakteriell svärmar genom time-lapse imaging. Metoden beskriver hur man kontrollerar kritiska tillväxtförhållanden som väsentligt påverkar utvecklingen av svärm. Jämfört med traditionella metoder för svärm analys, denna time-lapse imaging metod gör det möjligt att spåra motilitet av flera svärmar samtidigt under längre tidsperioder och med hög upplösning. Dessa aspekter förbättrar djupet av data som kan erhållas från övervakning svärmar och underlätta identifiering av faktorer som påverkar svärmande.
Svärmande i P. aeruginosa underlättas genom produktion och utsläpp av rhamnolipids och 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic syror i det omgivande området6,16. Införandet av stress från sub-dödliga koncentrationer av antibiotika eller infektion av fagvirus påverkar organisationen av svärmar. I synnerhet, dessa påfrestningar inducera P. aeruginosa att släppa kvorum avkänning molekylen 2-heptyl-3-hydroxy-4-kinolon, även känd som Pseudomonas kinolon signal (PQS)17,18. I svärm analyser som innehåller två populationer av svärmar, PQS produceras av stress-inducerad befolkningen stöter obehandlade svärmar från att komma in i området som innehåller stress (figur 1). Denna kollektiva stressrespons utgör en fara kommunikation signalering system som varnar P. aeruginosa om närliggande hot18,19. Effekterna av stress på P. aeruginosa, aktivering av den kollektiva stressrespons, och avsky av svärmar kan visualiseras med hjälp av time-lapse imaging metod som beskrivs här. Det protokoll som beskrivs här förklarar hur man: (1) förbereda agar plattor för svärmande, (2) kultur P. aeruginosa för två typer av analyser (traditionella svärmande analyser eller kollektiva stressrespons analyser) (Figur 1), (3) förvärva time-lapse bilder, och (4) använda ImageJ för att sammanställa och analysera bilderna.
Kort, P. aeruginosa från en övernattning kultur är fläckig i mitten av en svärmande agar platta medan P. aeruginosa som är infekterade med eller behandlas med antibiotika ses på satellitpositioner. Utvecklingen av P. aeruginosa svärmar övervakas på en konsument dokument flatbäddsskanner som placeras i en fuktreglerad 37 °C inkubator. Skannern styrs av en programvara som automatiskt skannar plattorna med jämna mellanrum under svärmtillväxtperioden, vanligtvis 16–20 timmar. Denna metod ger samtidiga time-lapse videor på upp till sex 10 cm svärma plattor. Bilderna sammanställs i filmer och avsky av svärmar av stress-inducerad populationer kvantifieras med hjälp av fritt tillgängliga ImageJ programvara. Särskild hänsyn tas till att säkerställa konsekvens och reproducerbarhet mellan olika svärma experiment.
Detta protokoll fokuserar på att minimera variationen i svärmande agar plattor och ger en enkel och billig metod för att förvärva time-lapse bilder av P. aeruginosa svärmar och svarar på stress. Detta förfarande kan utvidgas till att omfatta andra bakteriesystem genom att anpassa mediesammansättningen och tillväxtförhållandena. För P. aeruginosa, även om M9 eller FAB minimalt medium kan användas för att inducera svärmande16,21, …
The authors have nothing to disclose.
J.-L.B., A.S., och N.M.H-K. skrev och reviderade manuskriptet. Alla författare designade experimenten. J.-L.B. utförde experimenten och analysen. Detta arbete stöddes av NIH tilldelning K22AI112816 och R21AI139968 bidrag till A.S. och university of California. N.M.H-K. stöds av Lundbeckstipendium R220-2016-860 och R251-2017-1070. Finansiärerna hade ingen roll i beslutet att lämna in arbetet för publicering. Vi har inga konkurrerande intressen att deklarera.
Reagents | |||
Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O |
LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5X M8 media |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5X M8 media |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5X M8 media |
Strains | |||
Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
Supplies | |||
Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1000 mL |
8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 x 15 mm polystyrene plates |
Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
Equipment | |||
Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30-min internals imaging |
Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |