Summary

Caracterização de estruturas amilóides em Envelhecimento C. Elegans usando imagem de fluorescência ao longo da vida

Published: March 27, 2020
doi:

Summary

A fluorescência de imagens ao longo da vida monitora, quantifica e distingue as tendências de agregação de proteínas em modelos de doença susturais de C. elegans vivos, envelhecidos e estressados.

Abstract

Fibrilas amilóides estão associadas a uma série de doenças neurodegenerativas, como Huntington, Parkinson ou Doença de Alzheimer. Essas fibrilas amilóides podem sequestrar proteínas metastáveis endógenas, bem como componentes da rede de proteotase (PN) e, assim, exacerbar a proteína dobrável na célula. Há um número limitado de ferramentas disponíveis para avaliar o processo de agregação de proteínas amilóides dentro de um animal. Apresentamos um protocolo de microscopia vitalícia de fluorescência (FLIM) que permite o monitoramento, bem como a quantificação da fibrilização amiloide em células específicas, como neurônios, de forma não invasiva e com a progressão do envelhecimento e após perturbação de o PN. FLIM é independente dos níveis de expressão do flúor e permite uma análise do processo de agregação sem qualquer maior coloração ou branqueamento. Fluoróforos são extintos quando estão próximos de estruturas amilóides, o que resulta em uma diminuição da vida útil da fluorescência. A saciedade correlaciona-se diretamente com a agregação da proteína amilóide. FLIM é uma técnica versátil que pode ser aplicada para comparar o processo de fibrilização de diferentes proteínas amilóides, estímulos ambientais ou origens genéticas in vivo de forma não invasiva.

Introduction

A agregação proteica ocorre tanto no envelhecimento quanto na doença. Os caminhos que levam à formação e deposição de grandes amilóides ou inclusões amorfas são difíceis de seguir e seus cinéticos são igualmente desafiadores para desvendar. As proteínas podem se desdobrar devido a mutações intrínsecas dentro de suas sequências de codificação, como no caso de doenças genéticas. As proteínas também se desdobram porque a rede de proteota (PN) que as mantém solúveis e devidamente dobradas é prejudicada, como acontece durante o envelhecimento. A PN inclui acompanhantes moleculares e máquinas de degradação e é responsável pela biogênese, dobramento, tráfico e degradação de proteínas1.

C. elegans emergiu como um modelo para estudar o envelhecimento e a doença devido à sua curta vida útil, natureza isogênica e facilidade de manipulação genética. Várias cepas transgênicas C. elegans que expressam proteínas causadoras de doenças humanas em tecidos vulneráveis foram criadas. É importante ressaltar que muitas das cepas que contêm proteínas propensas à agregação recapitulam a marca registrada de distúrbios amilóides, a formação de grandes inclusões. Graças ao corpo transparente de C. elegans, esses agregados podem ser visualizados in vivo, não invasiva e não destrutivo2. Gerar qualquer proteína de interesse (POI) em fusão com um flúor permite investigar suas localizações, tráfico, rede de interação e destino geral.

Apresentamos um protocolo para monitorar a agregação de proteínas causadoras de doenças em vivos e envelhecimento s c. elegans via fluorescência de imagem ao longo da vida (FLIM). FLIM é uma técnica poderosa baseada na vida de um fluoróforo, em vez de seus espectros de emissão. A vida útil (tau, τ) é definida como o tempo médio exigido por um fóton para decair de seu estado animado de volta ao seu estado terrestre. A vida útil de uma determinada molécula é calculada com a técnica de domínio temporal da contagem de fótons únicos correlacionados com o tempo (TCSPC). No TCSPC-FLIM, a função de decaimento fluorescente é obtida por excitar o fluoróforo com pulsos laser curtos e de alta frequência e medir os tempos de chegada do fóton emitido a um detector em relação aos pulsos. Ao digitalizar uma amostra, um conjunto de dados tridimensional é criado para cada pixel: o array inclui informações sobre a distribuição dos fótons em suas coordenadas espaciais x,y e sua curva de decaimento temporal. Uma determinada amostra torna-se, portanto, um mapa de vidas revelando informações sobre a estrutura, a ligação e o ambiente da proteína3,4. Cada proteína fluorescente possui uma vida útil intrínseca e precisamente definida, geralmente de alguns nanossegundos (ns), dependendo de suas propriedades fisioquímicas. É importante ressaltar que a vida útil de um flofófono é independente de sua concentração, intensidade fluorescente e da metodologia de imagem. No entanto, dentro de um sistema biológico, pode ser afetado por fatores ambientais como pH, temperatura, concentrações de íons, saturação de oxigênio e seus parceiros de interação. As vidas também são sensíveis a mudanças estruturais internas e orientação. Fundir um florofófono a um POI resulta em uma mudança em sua vida útil e, consequentemente, informações sobre o comportamento da proteína fundida. Quando um fluoróforo é cercado ou encapsulado em um ambiente bem ligado, como as folhas beta antiparalelas de uma estrutura amilóide, ele perde energia não radiativamente, um processo conhecido como saciamento5. A saciedade do flúor resulta em um encurtamento de sua vida aparente. Quando solúvel, a vida útil de uma proteína permanecerá mais próxima de seu valor original e mais alto. Em contraste, quando uma proteína começa a se agregar, sua vida útil inevitavelmente mudará para um valor mais baixo6,7. Assim, torna-se possível monitorar a propensão de agregação de qualquer proteína formadora de amilóide em diferentes idades em c. elegansvivos .

Aqui descrevemos um protocolo para analisar a agregação de uma proteína de fusão que compreende diferentes trechos de poliglutamina (CAG, Q) (Q40, Q44 e Q85). Ilustramos como a técnica pode ser aplicada igualmente a diferentes fluoróforos, como proteína fluorescente de ciano (PCP), proteína fluorescente amarela (FpS) e proteína fluorescente vermelha monórica (mRFP); e em todos os tecidos de C. elegans,incluindo os neurônios, músculos e o intestino. Além disso, no contexto da proteotase, a FLIM é uma ferramenta muito útil para observar mudanças no esgotamento das acompanhantes moleculares. Derrubar uma das principais acompanhantes moleculares, a proteína de choque térmico 1 (hsp-1), através da interferência do RNA produz o desdobramento prematuro das proteínas. O aumento da carga de agregação como resultado do envelhecimento, doença ou acompanhantes deficientes, é então medido como uma diminuição na vida útil da fluorescência.

Protocol

1. Sincronização de C. elegans Sincronize C. elegans através do tratamento da solução de hipoclorito alcalino ou através de um simples ovo por 4 h a 20 °C8. Cultivar e manter nematóides a 20 °C em placas médias de crescimento de nematóides (NGM) semeadas com OP50 E. coli de acordo com os procedimentos padrão9. Idade dos nematóides até o estágio ou dia de desenvolvimento desejado.NOTA: Neste protocolo, adultos…

Representative Results

O protocolo mostra como monitorar com precisão a formação de espécies agregadas em C. elegansvivos, tanto durante seu envelhecimento natural quanto quando submetidos ao estresse. Selecionamos quatro cepas diferentes de nematóides transgênicos que expressam proteínas de poliglutamina de repetições de 40T, 44T ou 85Q. Essas proteínas são sintetizadas em diferentes tecidos e foram fundidas a diferentes floróforos. As cepas C. elegans expressaram Q40-mRFP nos mú…

Discussion

O protocolo aqui apresentado descreve uma técnica baseada em microscopia para identificar espécies agregadas no sistema modelo C. elegans. FLIM pode caracterizar com precisão a presença de espécies agregadas e solúveis fundidas a um fluoróforo através da medição de suas decaidas ao longo da vida de fluorescência. Quando uma proteína de fusão começar a agregar sua vida média registrada passará de um valor mais alto para um valor mais baixo16. A propensão da agregação pod…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A cepa músculo-Q40-mRFP fornecida pelo CGC, que é financiada pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). O neuronal-Q40-CFP foi um presente gentil do Laboratório Morimoto. Reconhecemos o DFG (KI-1988/5-1 para JK, a bolsa de doutorado NeuroCure pelo Cluster de Excelência neurocure para MLP), a EMBO (bolsa de curto prazo para a MLP) e a Companhia de Biólogos (bolsas de viagem para CG e MLP) para financiamento. Também reconhecemos a instalação de imagens de microscopia avançada de luz no Centro Max Delbrück de Medicina Molecular, Berlim, por fornecer a configuração para a imagem que o YFP constrói.

Materials

Agar-Agar Kobe I Carl Roth GmbH + Co. KG 5210.2 NGM component
Ahringer Library hsp-1 siRNA Source BioScience UK Limited F26D10.3
Ampicillin Carl Roth GmbH + Co. KG K029.3 Antibiotic
B&H DCS-120 SPC-150 Becker & Hickl GmbH FLIM Aquisition software
B&H SPC830-SPC Image Becker & Hickl GmbH FLIM Aquisition software
BD Bacto Peptone BD-Bionsciences 211677 NGM component
C. elegans iQ44-YFP CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) OG412
C. elegans iQ85-YFP Kind gift from Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFP Kind gift from Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFP Kind gift from Morimoto Lab
Deckgläser-18x18mm Carl Roth GmbH + Co. KG 0657.2 Cover slips
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Carl Roth GmbH + Co. KG 2316.4
Leica M165 FC Leica Camera AG Mounting Stereomicroscope
Leica TCS SP5 Leica Camera AG Confocal Microscope
Levamisole Hydrochloride AppliChem GmbH A4341 Anesthetic
OP50 Escherichia coli CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) OP50
PicoQuant PicoHarp300 PicoQuant GmbH FLIM Aquisition software
Sodium Azide Carl Roth GmbH + Co. KG K305.1 Anesthetic
Sodium Chloride Carl Roth GmbH + Co. KG 3957.2 NGM component
Standard-Objektträger Carl Roth GmbH + Co. KG 0656.1 Glass slides
Universal Agarose Bio & Sell GmbH BS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1 Carl Zeiss AG Confocal Microscope
Zeiss LSM510-Meta NLO Carl Zeiss AG Confocal Microscope

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Cite This Article
Pigazzini, M. L., Gallrein, C., Iburg, M., Kaminski Schierle, G., Kirstein, J. Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging. J. Vis. Exp. (157), e61004, doi:10.3791/61004 (2020).

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