肾动脉狭窄肾素调节的改良双肾单夹小鼠模型

Summary

使用聚氨酯管开发改良的2肾1夹（2K1C）Goldblatt小鼠模型以启动肾动脉狭窄，诱导肾素表达增加和肾损伤。在这里，我们描述了准备袖带并将其置于肾动脉上以产生可重复且一致的2K1C小鼠模型的详细程序。

Abstract

肾动脉狭窄是冠状动脉或外周血管疾病患者的常见病症，其中肾素血管紧张素醛固酮系统（RAAS）过度活化。在这种情况下，肾动脉变窄，刺激肾素（RAAS中的限速蛋白酶）表达和释放的增加。由此产生的肾素表达升高是肾血管性高血压的已知驱动因素，通常与肾损伤和终末器官损伤有关。因此，人们对开发针对这种情况的新疗法非常感兴趣。肾动脉狭窄中肾素控制的分子和细胞机制尚不完全清楚，需要进一步研究。为了诱导小鼠肾动脉狭窄，开发了一种修饰的2肾1夹（2K1C）Goldblatt小鼠模型。野生型小鼠右肾被冷冻，假手术小鼠用作对照。肾动脉狭窄后，我们确定了肾素表达和肾损伤。收获肾脏，并使用新鲜皮质来确定肾素的蛋白质和mRNA表达。该动物模型是可重复的，可用于研究参与肾血管性高血压和肾损伤的病理生理学反应，分子和细胞途径。

Introduction

肾动脉狭窄（RAStenosis）是一种棘手的问题，影响约6%的65岁以上人群和高达40%的冠状动脉或外周血管疾病患者^1，2。目前对这种疾病的治疗是有限的;因此，迫切需要开发新的疗法来治疗肾血管性高血压或由RAStenosis诱导的抵抗性高血压。肾素血管紧张素醛固酮系统（RAAS）是参与RAS狭窄诱导的高血压或肾血管性高血压发病机制的关键途径^3，4。针对 RAAS 的已知疗法（如血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂）可缓解高血压，但需要仔细检查肾衰竭和高钾血症^5，6，7。肾素催化RAAS中的速率限制步骤;它将血管紧张素原转化为血管紧张素I。在动脉粥样硬化中，斑块形成导致肾动脉变窄，从而驱动肾素分泌，导致肾血管高血压和肾脏损伤⁸。许多研究报告了人类肾血管性高血压期间氧化应激水平升高，这与两个肾脏一夹（2K1C）小鼠模型以及其他高血压动物模型^2，9，10^{，11，12，13，14，15，16}证实。.RAS狭窄诱发的肾血管性高血压期间肾素表达控制的分子机制尚不清楚，需要进一步研究。

可靠且可重复地概括RAStenosis的实验动物模型对于阐明肾素表达控制的细胞和分子机制以开发新疗法非常重要。2K1C小鼠模型是研究肾血管性高血压发病机制的成熟实验模型^{17，18，19，20}。该模型通过使用夹子^17，20，21的肾动脉收缩而^{生成，因此}产生肾动脉阻塞，导致肾素表达增加和高血压^{17，19，20，21}。然而，没有可用的技术报告，其中描述了在动物模型中产生肾动脉狭窄的分步过程。

传统的U形银夹，聚氨酯管和其他夹子已被用于收缩肾动脉以诱导肾动脉狭窄。一些研究表明，夹子的设计和材料对于获得2K1C动物模型的可靠和可重复数据至关重要。根据Lorenz等人的说法，使用传统的U型设计银夹诱导高血压的成功率较低（40-60%）²¹。由于夹子设计，肾动脉被横向压压，引发一些收缩和更大的概率从肾动脉中移出。银的延展性和延展性可能允许夹子宽度的变化;因此，在小鼠中引起不同的高血压水平。夹子上的二氧化银可引起血管周围炎症、内膜增殖和组织肉芽形成，改变肾动脉^直径22。由于用常规U-design银夹获得的高血压水平的可变性，Warner等人和Lorenz等人已经成功地使用圆形设计的聚氨酯管来启动小鼠的肾动脉狭窄，从而产生更可靠和一致的诱导两肾一夹动物模型^20，21。

在这份报告中，我们描述了一种手术方案，以在小鼠中产生实验性RAStenosis，使用聚氨酯管来收缩肾动脉。聚氨酯圆形设计袖口是一种更具可重复性，可靠性和低成本的夹子，可在小鼠中产生狭窄。该实验模型的目标是研究和定义肾动脉狭窄期间肾素表达控制的分子和细胞机制。我们通过测量肾素表达和肾损伤标志物中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（N-GAL）来确认RAS狭窄小鼠模型的成功。

Protocol

根据美国国立卫生研究院（NIH）指南和美国卫生与公众服务部的范德比尔特大学医学中心（VUMC）动物护理部对小鼠进行饲养和护理。在开始实验之前，所有动物程序都得到了VUMC机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 动物准备和解剖

1. 在开始手术前约30分钟打开加热垫的发芽器和水泵。
2. 用锋利的手术刀切割0.5毫米长的聚氨酯管。取下 0.2 毫米的周长，纵向切开，做成袖口。
   注意：这是肾动脉狭窄手术的关键部分，需要极高的精确度，注重细节和耐心。尝试一次切割几块聚氨酯管。在显微镜下执行所有这些程序。
3. 在继续之前，戴上外科无菌手套和外科口罩。
4. 使用6-8周的C57BL / 6野生型（WT）小鼠。使用相同数量的雄性和雌性小鼠以避免任何性别偏见。
5. 在进行手术之前记录小鼠的体重。用聚氨酯管进行肾动脉狭窄的理想重量为18-22克。轻轻地处理小鼠，注射麻醉剂时不要搅拌。给予术前镇痛（酮促，5毫克/ kg身体重量）。
   注意：在将小鼠从其住房室转移到手术室时，请非常温和和小心地携带它们，以避免激动。强烈建议将小鼠笼子放在手中而不是手推车中。
6. 通过腹膜内（I.P.）注射用氯胺酮（100mg / kg BW）和甲苯噻嗪（10mg / kg BW）的混合物麻醉小鼠。
7. 将鼠标放回笼内，直到完全麻醉。鼠标完全失去知觉大约需要4-5分钟。用镊子捏住尾巴或脚趾，检查鼠标是否完全失去知觉并准备好进行手术。
8. 将鼠标仰面放在纸巾上。沿着毛发生长的相反方向，使用电动理发器去除外腹部的毛发。剃除手术部位后，用含有碘（或氯己定的）的手术磨砂膏清洁该区域，然后用70%乙醇（或无菌盐水）冲洗。 重复3次。
   注意：脱毛手术必须在一定距离上进行，或者最好在与手术手术台不同的工作台上进行，以避免手术过程中的任何头发干扰和头发污染。
9. 用无菌片盖住加热垫。将鼠标带到手术台上，放在无菌片上，面向小鼠的右侧侧向显微镜。用循环水保持37°C的恒定焊盘温度。
10. 打开装有所有手术设备的灭菌袋。使用解剖显微镜和无菌利器剪刀，做一个小的侧腹切口（靠近^第 13胸肋骨，小鼠的最后一根肋骨），距离椎骨约0.5厘米。沿着腰椎继续，做一个1英寸的切口。
11. 拉回皮肤和肌肉以暴露肾脏。
12. 使用无菌棉签清洁并去除周围的脂肪，以隔离肾动脉。使用弯曲的镊子将肾神经与肾动脉隔离开来。
13. 进行假手术时，应用缝合线以闭合皮肤并将抗生素应用于闭合的伤口，然后进行 术后护理。 如果没有，请继续执行以下部分以切断动脉狭窄。
    注意：每个实验都应该有假动物作为外科手术的对照。假动物由经过暴露肾动脉而不在其上放置袖带的外科手术的小鼠组成。

2. 右肾动脉狭窄

1. 在右肾动脉下方放置两条尼龙缝合线，打出松散的结，然后将袖带放在肾脏和主动脉分叉之间大致等距的肾主动脉周围
2. 使用尼龙缝合线关闭袖口。每个缝合线打四个结，以避免手术后失去缝合线的可能性。
3. 通过应用简单的连续缝合线来关闭肌肉中的切口。
4. 进行简单的断续缝合以闭合皮肤。
5. 使用IACUC批准的镇痛药。
   注意：每次使用前高压灭菌手术工具。如果一次进行多次手术，请用无菌酒精计擦拭所有使用过的工具，并在每次手术后将其放入热发芽器中15-30秒。也为每只老鼠更换无菌手套。

3. 术后护理

1. 将小鼠放回笼子里，让笼子一半打开，一半关闭，循环水加热垫2-3小时。在笼子内添加凝胶日粮恢复食品。
2. 第二天腹膜内注射止痛药（酮洛芬）（剂量：5毫克/千克体重）。
3. 称量接下来两天的小鼠;如果一些小鼠体重减轻超过20%，请咨询兽医，并决定动物是否需要按照适当的IACUC授权程序进行安乐死。
4. 每天监测小鼠以评估发红，肿胀，疼痛或感染。
5. 根据机构IACUC政策寻求兽医咨询术后并发症。

4. 组织采集

1. 手术后3周收获组织。记录每只鼠标的重量。
2. 用IACUC批准的程序对小鼠实施安乐死。
3. 将鼠标放在无菌平台上，以仰卧位解剖。
4. 固定并伸展四肢以限制运动。
5. 用70%乙醇彻底喷洒小鼠。
6. 做一个中线切口，用锋利的剪刀打开腹部和胸部区域。
7. 拉回皮肤和腹膜壁。
8. 小心地暴露心脏并穿刺右心室并释放小鼠。
9. 使用镊子取出两个肾脏。肾脏位于小鼠的背部。
   注意：不要混合两个肾脏。注意狭窄的肾脏、假肾和对侧肾脏。
10. 取出肾囊，从任何脂肪中清除它们，并分别记录每个肾脏的重量。
11. 切开两个肾脏的纵向切片，并在4°C下固定在4%PFA中过夜，以便随后处理石蜡包埋，以进行原位杂交（ISH）和免疫组织化学（IHC）。遵循^23，24 报告的 ISH 和 IHC 协议。
12. 分离剩余肾脏的皮质，并在液氮中快速冷冻以进行蛋白质印迹。将样品储存在-80°C直至分析。
13. 用蛋白质印迹量化肾素和N-GAL表达，如文献^23，24中所述。

5. 统计

1. 使用单向或双向方差分析进行具有三个或更多条件的实验，然后使用 Bonferroni 事后检验来比较各个组之间的比较。考虑 p 值等于或小于 0.05 的显著性。使用软件（例如，图形键盘棱镜 8.2）执行所有统计分析。

Representative Results

肾动脉收缩增加狭窄肾中的肾素表达，同时抑制对侧肾的表达。狭窄的两个肾一夹（2K1C）或Goldblatt模型诱导肾素表达增加和肾损伤。这被认为是人类单侧肾动脉狭窄的最佳代表性模型。

使用免疫印迹法测量肾素和原脯素（肾素的前体）的表达。数据显示，与对侧肾和假肾相比，狭窄肾中的肾素和原脯素表达增加，表明袖带收缩肾动脉，导致肾灌注改变（图1）。为了可视化肾素表达的定位，进行了IHC。IHC证实免疫印迹数据显示肾素在夹闭的肾脏中的表达增加（图2）。此外，在狭窄的肾脏中观察到沿传入小动脉的并列肾小动脉（JG）细胞募集（图2）。为了研究对肾素mRNA表达水平的影响，进行了ISH。ISH数据表明，与对侧肾和假肾相比，狭窄肾中的肾素mRNA和JG细胞募集增加（图3）。

肾动脉狭窄的另一个特征是由于肾脏灌注，超氧化物产生和高血压2^，25，²⁶的变化而导致的肾损伤标志物的上调。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）是一种特征明确的急性损伤标志物，在肾损伤期间过表达^27，28。因此，使用免疫印迹法测量急性肾损伤标志物NGAL。免疫印迹数据显示，与对侧肾和假肾相比，狭窄的肾脏中的N-GAL高度上调（图4）。

图1：肾素表情。 肾动脉狭窄15天和3天后，小鼠被安乐死。收获肾脏，通过蛋白质印迹测定肾素表达。（A）显示来自15天狭窄（左图）和假老鼠（右图）的代表性蛋白质印迹图像。（B）显示了原蛋白（左图）和肾素（右图）蛋白条带的密度分析。β-肌动蛋白被用作负荷对照。（C）是显示来自3天狭窄（左图）和假小鼠（右图）的代表性蛋白质印迹图像。（D）正在显示原蛋白（左图）和肾素（右图）蛋白条带的密度分析。β-肌动蛋白被用作负荷对照。数据以平均值±SD.P值表示，使用双向方差分析法计算，然后进行Tukey事后检验。*P<0.05，< 0.01， 0.01， 0.P<， N=3-6。 请点击此处查看此图的大图。

图2：免疫组织化学分析，用于肾动脉狭窄后肾素表达的可视化和定位。 从3天肾动脉狭窄中对小鼠实施安乐死后分离出肾脏。一块从纵向切口的整个肾脏用4%中性缓冲福尔马林溶液固定，之后在分级乙醇系列中脱水，并嵌入石蜡中。绿色染色代表肾素蛋白表达;蓝色，原子核。（A）狭窄的小鼠的狭窄肾脏（左侧），对侧肾脏（右侧）的代表性显微镜图像。（B）来自假老鼠的假肾（左侧）和对侧肾（右侧）的代表性显微镜图像。比例尺30微米。90倍放大倍率。（C）狭窄的肾脏（左侧），对侧肾脏（右侧）的代表性显微镜图像来自狭窄的小鼠。（D）来自假鼠的假肾（左侧）和对侧肾（右侧）的代表性显微镜图像。这些图像主要取自皮层区域。比例尺 50 μm. 15倍放大倍率。白色虚线圆圈表示肾小球的位置。G：肾小动脉，阿非：传入小动脉，N = 4。 请点击此处查看此图的大图。

图3：肾动脉狭窄后肾素mRNA表达的原位杂交分析。 肾动脉狭窄3天后，对小鼠实施安乐死，用4%中性缓冲福尔马林溶液分离肾脏灌注固定，脱水成分级乙醇系列，并包埋在石蜡中。根据制造商的说明进行原位杂交。深红色染色代表mRNA肾素表达;蓝色，原子核。（一）. 狭窄的肾脏（左侧）和对侧肾脏（右侧）的代表性显微镜图像来自狭窄的小鼠。（二）. 来自假鼠的假肾（左侧）和对侧肾（右侧）的代表性显微镜图像。比例尺 50 μm。白色虚线圆圈表示肾小球表达肾素。G：肾小动脉，阿非：传入小动脉，N = 4。 请点击此处查看此图的大图。

图4：肾动脉狭窄后的 中性粒细胞明胶酶相关脂质运价蛋白（N-GAL）表达。肾动脉狭窄3 d后，对小鼠实施安乐死，收获肾脏，用蛋白质印迹测定N-GAL表达。（A）来自3天狭窄（左图）和假老鼠（右图）的代表性蛋白质印迹图像。β-肌动蛋白被用作负荷对照。（B） N-GAL波段的密度分析。N-GAL的蛋白质密度值归一化为β肌动蛋白。数据以平均值±SD.P值表示，使用双向方差分析法计算，然后进行Tukey事后检验。P<0.01，< 0.001， N=3-5。请点击此处查看此图的大图。

Discussion

肾动脉狭窄是继发性或难治性高血压和肾损伤的重要病因^1，29.两个肾脏一夹（2K1C）Goldblatt模型已被用于研究RAS狭窄诱导的肾血管高血压^{1，17，18，19}。以前使用各种动物模型的一些研究表明，肾动脉狭窄是肾素过表达和释放的强大刺激因子，肾损伤^{为18，30，31，32，33，34，35}。此外，该模型用于研究免疫细胞浸润，纤维化，炎症以及急性和慢性肾损伤标志物²⁹。

在这里，我们描述了一个详细的和循序渐进的程序，以在小鼠中产生可重复，可靠和一致的肾动脉狭窄模型。早些时候，金属夹已被用于启动肾动脉狭窄^36，37，38。作为替代方案，我们使用聚氨酯圆管（MRE 025;内径（ID）= 0.30毫米;外径（外径）=0.63毫米;壁厚（重量）=0.16毫米）。我们使用管子，因为放置聚氨酯袖带会导致两个维度的收缩（收缩），而不是像金属夹那样的一个维度（扁平）。此外，使用聚氨酯圆管具有肾动脉均匀收缩的优点。关键步骤和挑战是切割合适尺寸的聚氨酯管，这需要对必须使用显微镜进行的细节给予极大的关注。另一个关键标准是将小鼠保持在18-22g之间，以使管子适合肾动脉。该体重范围内的小鼠通常具有肾动脉外径（OD），该外径始终在管袖带直径范围内。该方法的局限性在于，由于其中制成的管子和袖带的大小，重型（高于25g）或小型（低于16g）小鼠难以进行手术。然而，当需要时，可以改变聚氨酯管以适应年轻或年长的小鼠。

我们已经进行了3天和15天的研究，以启动小鼠的肾动脉狭窄，成功率约为95%。根据我们的经验，使用这种方法诱导肾动脉狭窄在小鼠中产生了可靠，可重复和一致的结果，无论性别如何。为了确认肾动脉的收缩，我们测量了肾素表达和肾损伤。我们的数据表明，肾素表达在狭窄的肾脏中显着增加。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diet Gel	Clear H2O	Diet-Gel 76A	Surgery recovery diet
EMC Heated Hard pad	Hallowell	000A2788B	Heating pads were used to keep mice warm
Ethilon Nylon Suture	Ethicon	662G	4-0 (1.5 metric), This suture was used to close the peritoneum, and skin
Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2815 G	8-0 (0.4 metric), This suture was used to close cuff to tie and constrict the artery
Germinator 500	Braintree Scientific Inc.	GER 5287	Sterilize surgical tools between surgeries
Ketoprofen	Zoetis	Ketofen	Painkiller
Polyurethane	Braintree Scientific Inc.	MRE-025	This tube was used to initiate stenosis
Povidone-iodine antiseptic swabsticks	Medline	MDS093901	It was applied after hair removal and surgery on the skin
Reflex 7 Clip Applier	Roboz Surgical Instrument Co	204-1000	This clip applier was used to apply clip in case one or more sutures went off
Sterile towel drapes	Dynarex	4410	It was used as a bedsheet for mice during surgery
Triple antibiotic ointment	Medi-First	22312
Water pump	Stryker	T/pump Professionals	Used to warm and circulate water in the heating hard pad to keep mice warm during and post-surgery