Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Renal Arter Darlığında Renin Regülasyonunun Modifiye İki Böbrek Bir Klipsli Fare Modeli

Published: October 26, 2020 doi: 10.3791/61058
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Medicine/Clinical Pharmacology Division, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Renal arter darlığını başlatmak için poliüretan tüp kullanılarak modifiye edilmiş 2 böbrek 1 klips (2K1C) Goldblatt fare modeli geliştirildi ve renin ekspresyonunda ve böbrek hasarında artışa neden oldu. Burada, tekrarlanabilir ve tutarlı bir 2K1C fare modeli oluşturmak için manşetin renal arter üzerine hazırlanması ve yerleştirilmesi için ayrıntılı bir prosedür açıklıyoruz.

Abstract

Renal arter darlığı, renin anjiyotensin aldosteron sisteminin (RAAS) aşırı aktive olduğu koroner veya periferik vasküler hastalığı olan hastalarda sık görülen bir durumdur. Bu bağlamda, RAAS'ta hız sınırlayıcı proteaz olan renin ekspresyonunda ve salınımında bir artışı uyaran renal arterlerde daralma vardır. Renin ekspresyonunda ortaya çıkan artış, sıklıkla böbrek hasarı ve son organ hasarı ile ilişkili olan renovasküler hipertansiyonun bilinen bir sürücüsüdür. Bu nedenle, bu durum için yeni tedaviler geliştirmeye büyük ilgi vardır. Renal arter darlığında renin kontrolünün moleküler ve hücresel mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır ve daha fazla araştırmayı gerektirmektedir. Farelerde renal arter darlığını indüklemek için, modifiye edilmiş 2 böbrek 1 klip (2K1C) Goldblatt fare modeli geliştirilmiştir. Sağ böbrek vahşi tip farelerde stenozlandı ve sahte ameliyat edilen fareler kontrol olarak kullanıldı. Renal arter darlığı sonrası renin ekspresyonu ve böbrek hasarı saptandı. Böbrekler toplandı ve reninin protein ve mRNA ekspresyonunu belirlemek için taze korteksler kullanıldı. Bu hayvan modeli tekrarlanabilir ve renovasküler hipertansiyon ve böbrek hasarında rol oynayan patofizyolojik yanıtları, moleküler ve hücresel yolları incelemek için kullanılabilir.

Introduction

Renal arter darlığı (RAStenosis), 65 yaş üstü kişilerin yaklaşık% 6'sını ve koroner veya periferik vasküler hastalığı olan kişilerin% 40'ına kadarını etkileyen inatçı bir sorundur 1,2. Hastalık için mevcut tedaviler sınırlıdır; Bu nedenle, renovasküler hipertansiyonu veya RAStenosis'in neden olduğu dirençli hipertansiyonu tedavi etmek için yeni tedavilerin geliştirilmesine kritik bir ihtiyaç vardır. Renin anjiyotensin aldosteron sistemi (RAAS), RAStenozise bağlı hipertansiyon veya renovasküler hipertansiyonun patogenezinde rol oynayan anahtar yoldur 3,4. ACE inhibitörleri veya anjiyotensin reseptör blokerleri gibi RAAS'ı hedef alan bilinen tedaviler hipertansiyonu hafifletir, ancak böbrek yetmezliği ve hiperkalemiiçin yakından incelenmelidir 5,6,7. Renin, RAAS'taki hız sınırlama adımını katalize eder; anjiyotensinojeni anjiyotensin I'e dönüştürür. Aterosklerozda plak oluşumu, renin sekresyonunu yönlendiren renal arterin daralmasına neden olarak renovasküler hipertansiyon ve böbrek hasarı ile sonuçlanır8. Bir dizi çalışma, insanlarda renovasküler hipertansiyon sırasında oksidatif stres düzeylerinin arttığını bildirmiştir; bunlar, iki böbrek bir klip (2K1C) fare modelinin yanı sıra diğer hipertansif hayvan modelleri 2,9,10,11,12,13,14,15,16 ile doğrulanmıştır. . RAStenozise bağlı renovasküler hipertansiyon sırasında renin ekspresyon kontrolünün moleküler mekanizması iyi anlaşılmamıştır ve daha fazla araştırma gerektirmektedir.

RAStenosis'i güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde özetleyen deneysel hayvan modelleri, yeni tedavilerin geliştirilmesi için renin ekspresyon kontrolünün hücresel ve moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasında önemlidir. 2K1C fare modeli, renovasküler hipertansiyonun patogenezini incelemek için iyi kurulmuş bir deneysel modeldir17,18,19,20. Bu model, 17,20,21 numaralı bir klips kullanılarak renal arterin daralmasıyla üretilir, bu nedenle renin ekspresyonunda ve hipertansiyonda 17,19,20,21'de bir artışa neden olan renal arter tıkanıklığı üretir. Bununla birlikte, hayvan modellerinde renal arter darlığı oluşturmak için adım adım bir prosedürü tanımlayan teknik raporlar mevcut değildir.

Geleneksel U-şekilli gümüş klipsler, poliüretan tüpler ve diğer klipsler, renal arter darlığını indüklemek için renal arteri daraltmak için kullanılmıştır. Bazı çalışmalar, klibin tasarımının ve malzemesinin, 2K1C hayvan modeli ile güvenilir ve tekrarlanabilir veriler elde etmek için kritik öneme sahip olduğunu göstermiştir. Lorenz ve ark.'ya göre, geleneksel U-tasarımlı gümüş klipslerin kullanımı, düşük bir hipertansiyon başarı oranına neden olur (%40-60)21. Klips tasarımı nedeniyle, renal arter lateral olarak bastırılır, birkaç daralmayı tetikler ve renal arterden çıkma olasılığı daha yüksektir. Gümüş dövülebilirliği ve sünekliği, klips genişliklerinde değişikliklere izin verebilir; bu nedenle, fareler arasında farklı hipertansiyon seviyelerine neden olur. Klips üzerindeki gümüş dioksitler perivasküler inflamasyona, intimal proliferasyona ve doku granülasyonuna neden olarak renal arter çapı22'yi değiştirebilir. Geleneksel U-design gümüş klips ile elde edilen hipertansiyon seviyelerindeki değişkenlik nedeniyle, Warner ve ark. ve Lorenz ve ark., farelerde renal arter darlığını başlatmak için yuvarlak tasarımlı bir poliüretan tüpü başarıyla kullanmış ve iki böbrek bir klips hayvan modeli 20,21'in daha güvenilir ve tutarlı bir indüksiyonunu sağlamıştır.

Bu yazıda, renal arteri daraltmak için poliüretan tüpü kullanarak, farelerde deneysel RAStenoz oluşturmak için cerrahi bir protokol tanımlanmıştır. Poliüretan yuvarlak tasarımlı manşet, farede darlık oluşturmak için daha tekrarlanabilir, güvenilir ve düşük maliyetli bir klipstir. Bu deneysel modelin amacı, renal arter darlığı sırasında renin ekspresyon kontrolünün moleküler ve hücresel mekanizmasını incelemek ve tanımlamaktır. RAStenosis fareleri modelinin başarısını, renin ekspresyonu ve böbrek hasarı belirteci nötrofil jelatinaz ile ilişkili lipokalini (N-GAL) ölçerek doğruladık.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Fareler, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) kılavuzlarını ve ABD Sağlık ve İnsan Hizmetleri Bakanlığı, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nu izleyerek Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi (VUMC) Hayvan Bakımı Bölümü'nde barındırıldı ve bakıldı. Tüm hayvan prosedürleri, deneylere başlamadan önce VUMC Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvan hazırlama ve diseksiyon

  1. Ameliyata başlamadan yaklaşık 30 dakika önce ısıtma yastığının çimlendiricisini ve su pompasını açın.
  2. 0,5 mm uzunluğunda poliüretan boruları keskin bir neşterle kesin. Bir manşet yapmak için uzunlamasına bir kesim yaparak çevrenin 0,2 mm'sini çıkarın.
    NOT: Bu, renal arter darlığı prosedürünün aşırı hassasiyet, detaylara dikkat ve sabır gerektiren kritik bir parçasıdır. Bir seferde birkaç parça poliüretan boru kesmeye çalışın. Tüm bu prosedürü mikroskop altında gerçekleştirin.
  3. Daha fazla ilerlemeden önce, cerrahi steril eldivenler ve cerrahi maske takın.
  4. 6-8 haftalık C57BL/6 vahşi tip (WT) fareler kullanın. Herhangi bir cinsiyet önyargısından kaçınmak için eşit sayıda erkek ve dişi fare kullanın.
  5. Ameliyat yapmadan önce farelerin ağırlığını kaydedin. Poliüretan tüp ile renal arter darlığı yapmak için ideal ağırlık 18-22 g'dır. Fareleri nazikçe tutun ve anesteziyi enjekte ederken ajitasyon yapmayın. Ameliyat öncesi analjezi uygulayın (Ketofgen, 5 mg/kg vücut genişliği).
    NOT: Fareleri barınma odalarından ameliyat odasına aktarırken, ajitasyonu önlemek için onları büyük bir nezaket ve özenle taşıyın. Fare kafeslerinin bir araba yerine ellerde taşınması şiddetle tavsiye edilir.
  6. Fareleri intraperitoneal (I.P.) enjeksiyonlar yoluyla ketamin (100 mg / kg BW) ve ksilazin (10 mg / kg BW) karışımı ile anestezi altına alın.
  7. Tamamen anestezi uygulanana kadar fareyi kafesin içine geri yerleştirin. Farenin tamamen bilinçsiz hale gelmesi yaklaşık 4-5 dakika sürer. Farenin tamamen bilinçsiz ve ameliyat için hazır olup olmadığını kontrol etmek için kuyruğu veya ayak parmağını forseps ile sıkıştırın.
  8. Fareyi sırt üstü bir kağıt havlunun üzerine koyun. Saç büyümesinin ters yönünü takip eden elektrikli bir saç kesme makinesi kullanarak lateral karın kıllarını çıkarın. Cerrahi bölgeyi tıraş ettikten sonra, bölgeyi iyot (veya klorheksidin) içeren cerrahi bir ovma ile temizleyin ve ardından% 70 etanol (veya steril salin) ile durulayın.  3 kez tekrarlayın.
    NOT: Epilasyon prosedürü, ameliyat prosedürü sırasında herhangi bir saç parazitini ve saç kontaminasyonunu önlemek için belirli bir mesafede veya tercihen cerrahi prosedür tezgahından farklı bir tezgahta yapılmalıdır.
  9. Isıtma yastığını steril bir tabaka ile örtün. Fareyi cerrahi tezgaha getirin ve farenin sağ yan tarafına mikroskopa doğru bakacak şekilde steril tabakaya yerleştirin. Dolaşımdaki su ile 37 °C'lik sabit bir ped sıcaklığını koruyun.
  10. Tüm cerrahi ekipmanı içeren sterilize edilmiş torbayı açın. Diseksiyon yapan bir mikroskop ve steril keskin makas kullanarak, küçük bir yan kesi (13. torasik kaburgaya yakın, faredeki son kaburga) ve omurlardan yaklaşık 0,5 cm uzakta yapın. Bel omurları boyunca ilerleyin ve 1 inçlik bir kesi yapın.
  11. Böbreği açığa çıkarmak için cildi ve kası geri çekin.
  12. Renal arteri izole etmek için steril pamuklu çubuklar kullanarak çevredeki yağları temizleyin ve çıkarın. Kavisli forseps kullanarak renal siniri renal arterden izole edin.
  13. Sahte ameliyatı gerçekleştirirken, cildi kapatmak için dikişler uygulayın ve kapalı yaraya antibiyotik uygulayın, ardından ameliyat sonrası bakıma devam edin. Değilse, arteri stenose etmek için aşağıdaki bölüme devam edin.
    NOT: Her deney, cerrahi prosedürün kontrolleri olarak sahte hayvanlara sahip olmalıdır. Şam hayvanları, üzerine bir manşet yerleştirmeden renal arteri açığa çıkarmanın cerrahi prosedüründen geçen farelerden oluşur.

2. Sağ renal arter darlığı

  1. Sağ renal arterin altına iki naylon sütür yerleştirin, gevşek düğümler yapın ve ardından manşeti ana renal arterin etrafına böbrek ve aort bifurkasyonu arasında yaklaşık olarak eşit mesafeye yerleştirin.
  2. Naylon dikişleri kullanarak manşeti kapatın. Ameliyattan sonra dikişleri kaybetme olasılığını önlemek için her dikiş için dört düğüm yapın.
  3. Basit bir sürekli dikiş uygulayarak kastaki kesiyi kapatın.
  4. Cildi kapatmak için basit kesilmiş dikişler yapın.
  5. IACUC onaylı analjezikleri uygulayın.
    NOT: Her kullanımdan önce otoklav cerrahi aletleri. Aynı anda birden fazla ameliyat yapılıyorsa, kullanılan tüm aletleri steril bir alkol göstergesi ile silin ve her ameliyattan sonra 15-30 sn boyunca sıcak çimlendiriciye yerleştirin. Her fare için steril eldivenleri de değiştirin.

3. Ameliyat sonrası bakım

  1. Fareleri kafeslerine geri döndürün ve kafesi yarı açık, yarı kapalı, 2-3 saat boyunca dolaşımdaki bir su ısıtma yastığı olarak bırakın. Kafesin içine jel diyet kurtarma yiyecekleri ekleyin.
  2. Ağrı kesici (ketoprofen) ertesi gün intraperitoneal olarak (doz: 5 mg / kg BW) uygulayın.
  3. Fareleri önümüzdeki iki gün boyunca tartın; Bazı fareler ağırlıklarının% 20'sinden fazlasını kaybederse veterinere danışın ve uygun IACUC yetkili prosedürünü takiben hayvanın ötenazi yapılması gerekip gerekmediğine karar verin.
  4. Kızarıklık, şişlik, ağrı veya enfeksiyon açısından değerlendirmek için fareleri günlük olarak izleyin.
  5. Kurumsal IACUC politikalarına uygun olarak postoperatif komplikasyonlar için veteriner konsültasyonu isteyin.

4. Doku hasadı

  1. Cerrahi işlemden 3 hafta sonra doku hasadı. Her farenin ağırlığını kaydedin.
  2. IACUC onaylı bir prosedürle fareyi ötenazileştirin.
  3. Fareyi steril bir platforma diseksiyon yapmak için sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
  4. Hareketi sınırlamak için uzuvları sabitleyin ve uzatın.
  5. Farelere% 70 etanol ile iyice püskürtün.
  6. Keskin makas kullanarak karın ve göğüs bölgesini açmak için orta hat kesisi yapın.
  7. Cildi ve periton duvarını geri çekin.
  8. Kalbi dikkatlice ortaya çıkarın ve sağ ventrikülü delin ve fareyi exsanguinate edin.
  9. Forseps kullanarak her iki böbreği de çıkarın. Böbrekler farelerin arkasında bulunur.
    NOT: Her iki böbreği de karıştırmayın. Stelsezli, sahte ve kontralateral böbreklerin farkında olun.
  10. Böbrek kapsülünü çıkarın, herhangi bir yağdan temizleyin ve her böbreğin ağırlığını ayrı ayrı kaydedin.
  11. Her iki böbreğin uzunlamasına bir bölümünü kesin ve daha sonra parafin gömme için işlenmek, in situ hibridizasyon (ISH) ve immünohistokimya (IHC) gerçekleştirmek için 4 ° C'de bir gecede% 4 PFA'ya sabitlenir. ISH ve IHC protokollerini rapor edildiği gibi takip edin23,24.
  12. Kalan böbreğin korteksini izole edin ve batı lekesini gerçekleştirmek için sıvı azotta dondurun. Numuneleri analize kadar -80 °C'de saklayın.
  13. Renin ve N-GAL ifadelerini literatür23,24'te tanımlandığı gibi Batı lekesi ile sayısallaştırın.

5. İstatistik

  1. Üç veya daha fazla koşullu deneyler için tek yönlü veya iki yönlü ANOVA'yı kullanın, ardından bireysel gruplar arasındaki karşılaştırmalar için Bonferroni post-hoc testleri yapın. 0,05'e eşit veya daha küçük bir p değerinin önemli olduğunu düşünün. Tüm istatistiksel analizleri yapmak için yazılım kullanın (örneğin, GraphPad Prism 8.2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Renal arter daralması, stenozlu böbrekte renin ekspresyonunu arttırırken, kontralateral böbrekte ekspresyonu baskılar. İki böbrek bir klip (2K1C) veya Goldblatt stenoz modeli, artmış renin ekspresyonuna ve böbrek hasarına neden olur. Bu, insanlarda tek taraflı renal arter darlığının en iyi temsili modeli olarak kabul edilmektedir.

Renin ve prorenin ekspresyonu (renin öncüsü) immünoblotlama kullanılarak ölçüldü. Veriler, renin ve prorenin ekspresyonunun stenozlu böbrekte kontralateral ve sahte böbreklere kıyasla arttığını ve manşetin renal arteri daralttığını ve renal perfüzyonda değişikliklere neden olduğunu düşündürmektedir (Şekil 1). Renin ekspresyonunun lokalizasyonunu görselleştirmek için IHC gerçekleştirildi. IHC, kırpılmış böbrekte renin ekspresyonunun arttığını gösteren immünoblotlama verilerini doğruladı (Şekil 2). Ayrıca stenozlu böbrekte afferent arteriol boyunca jukstaglomerüler (JG) hücre alımı görüldü (Şekil 2). Renin mRNA ekspresyon düzeyleri üzerindeki etkisini araştırmak için ISH uygulandı. ISH verileri, kontralateral ve sahte böbreklere kıyasla stenozlu böbrekte artmış renin mRNA ve JG hücrelerinin işe alımını göstermektedir (Şekil 3).

Renal arter darlığının bir diğer özelliği de böbrek perfüzyonu, süperoksit üretimi ve hipertansiyondaki değişikliklere bağlı olarak böbrek hasarı belirteçlerinin upregülasyonudur 2,25,26. Nötrofil jelatinaz ile ilişkili lipokalin (NGAL) iyi karakterize bir akut yaralanma belirtecidir ve böbrek hasarı sırasında aşırı eksprese edilir27,28. Bu nedenle, akut böbrek hasarı belirteci NGAL, immünoblotlama kullanılarak ölçüldü. İmmünoblotlama verileri, N-GAL'in stenozlu böbrekte kontralateral ve sahte böbreklere kıyasla oldukça yukarı regüle olduğunu göstermiştir (Şekil 4).

Figure 1
Resim 1: Renin ifadesi. 15 ve 3 günlük renal arter darlığından sonra, fareler ötenazi yapıldı. Böbrekler toplandı ve renin ekspresyonu batı lekesi ile belirlendi. (A) 15 günlük stenozlu (sol panel) ve sahte farelerden (sağ panel) temsili batı lekeleri görüntüleri gösteriyor. (B) prorenin (sol panel) ve renin (sağ panel) protein bantlarının densitometrik analizini gösterir. Yükleme kontrolü olarak beta-aktin kullanıldı. (C) 3 günlük stenozlu (sol panel) ve sahte farelerden (sağ panel) temsili batı lekeleri görüntülerini gösteriyor. (D) prorenin (sol panel) ve renin (sağ panel) protein bantlarının densitometrik analizini göstermektedir. Yükleme kontrolü olarak beta-aktin kullanıldı. Veriler ortalama ± SD. P değeri iki yönlü ANOVA ile hesaplanmış ve ardından Tukey post-hoc testi ile sunulmuştur. *P<0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001, N=3-6. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Renal arter darlığı sonrası renin ekspresyonunun görüntülenmesi ve lokalizasyonu için immünohistokimya analizi. Böbrekler, fareleri 3 günlük renal arter darlığından ötenazi yaptıktan sonra izole edildi. Tüm böbreğin uzunlamasına kesiminden bir parça,% 4 nötr tamponlu formalin çözeltisi ile sabitlendi, bundan sonra dereceli bir etanol serisinde dehidre edildi ve parafine gömüldü. Yeşil boyama, renin protein ekspresyonunu temsil eder; mavi, çekirdekler. (A) Dartlı farelerden stenozlu böbrek (sol taraf), kontralateral böbrek (sağ taraf) temsili mikroskopi görüntüleri. (B) Sahte farelerden sahte böbrek (sol taraf) ve kontralateral böbrek (sağ taraf) temsili mikroskopi görüntüleri. Ölçek çubuğu 30 mikron. 90X büyütme. (C) Stenozlu farelerden stenozlu böbrek (sol taraf), kontralateral böbrek (sağ taraf) temsili mikroskopi görüntüleri. (D) Sahte farelerden sahte böbrek (sol taraf) ve kontralateral böbrek (sağ taraf) temsili mikroskopi görüntüleri. Bu görüntüler esas olarak korteks bölgesinden alınmıştır. Ölçek çubuğu 50 μm. 15x büyütme. Beyaz noktalı daireler glomerüllerin yerini gösterir. G: Glomerüller, AfAr: Afferent arteriol, N=4. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Renal arter darlığı sonrası renin mRNA ekspresyonunun in situ hibridizasyon analizi. 3 günlük renal arter darlığından sonra, fareler ötenazi yapıldı ve böbrekler% 4 nötr tamponlu formalin çözeltisi ile izole edildi ve perfüzyon sabitlendi, dereceli bir etanol serisinde dehidre edildi ve parafine gömüldü. In situ hibridizasyon, üreticinin talimatlarına uyarak gerçekleştirildi. Koyu kırmızı boyama mRNA renin ekspresyonunu temsil eder; mavi, çekirdekler. (A) . Stelseli farelerden stenozlu böbreklerin (sol taraf) ve kontralateral böbreğin (sağ taraf) temsili mikroskopi görüntüsü. (B) . Sahte farelerden sahte böbrek (sol taraf) ve kontralateral böbrek (sağ taraf) temsili mikroskopi görüntüsü. Ölçek çubuğu 50 μm. Beyaz noktalı daireler, renin'i ifade eden glomerülleri gösterir. G: Glomerüller, AfAr: Afferent arteriol, N=4. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Renal arter darlığı sonrası nötrofil jelatinaz ilişkili lipokalin (N-GAL) ekspresyonu. 3 günlük renal arter darlığından sonra, fareler ötenazi yapıldı ve böbrekler toplandı ve Western blot ile N-GAL ekspresyon ölçümü yapıldı. (A) 3 günlük stenozlu (sol panel) ve sahte farelerden (sağ panel) temsili Western leke görüntüleri. Yükleme kontrolü olarak beta-aktin kullanıldı. (B) N-GAL bantlarının densitometrik analizi. N-GAL'in protein yoğunluk değerleri β-aktin olarak normalleştirildi. Veriler ortalama ± SD. P değeri iki yönlü ANOVA ile hesaplanmış ve ardından Tukey post-hoc testi ile sunulmuştur. **P<0.01, ***P< 0.001, N=3-5. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Renal arter darlığı, sekonder veya dirençli hipertansiyonun ve böbrek hasarının 1,29'unun önemli bir nedenidir. İki böbrek bir klip (2K1C) Goldblatt modeli, RAStenozise bağlı renovasküler hipertansiyonu1,17,18,19 incelemek için kullanılmıştır. Çeşitli hayvan modellerini kullanan bir dizi önceki çalışma, renal arterdeki darlığın, renin aşırı ekspresyonu ve salınımının güçlü bir uyarıcısı olduğunu ve böbrek hasarının 18,30,31,32,33,34,35 olduğunu göstermiştir. Ayrıca, bu model bağışıklık hücresi infiltrasyonu, fibroz, inflamasyon ve akut ve kronik böbrek hasarı belirteçlerini incelemek için kullanılır29.

Burada, farelerde tekrarlanabilir, güvenilir ve tutarlı renal arter darlığı modeli oluşturmak için ayrıntılı ve adım adım bir prosedür tanımladık. Daha önce, renal arter darlığını başlatmak için metal klipsler kullanılmıştır36,37,38. Alternatif olarak, poliüretan yuvarlak boru kullandık (MRE 025; iç çap (ID) = 0.30 mm; dış çap (OD) = 0.63 mm; duvar kalınlığı, (WT) = 0.16 mm). Boru kullandık, çünkü bir poliüretan manşetin yerleştirilmesi, metal bir klipste olduğu gibi bir (düzleşme) yerine iki boyutta daralmaya (daralma) neden olacaktır. Ayrıca, poliüretan yuvarlak boru kullanmak, renal arterde düzgün daralma avantajı sağlar. Kritik adım ve zorluklar, mikroskop kullanılarak yapılması gereken ayrıntılara aşırı dikkat gerektiren poliüretan boruların doğru boyutunu kesmektir. Bir diğer kritik kriter, tüpü renal artere sığdırmak için fareleri 18-22 g arasında tutmaktır. Bu ağırlık aralığındaki fareler normalde sürekli olarak boru manşet çapı aralığında olan bir renal arter dış çapına (OD) sahiptir. Yöntemin bir sınırlaması, ağır (25 g'ın üstünde) veya küçük (16 g'ın altında) farelerin, içinde yapılan tüpün ve manşetin büyüklüğü nedeniyle ameliyat yapmanın zor olmasıdır. Bununla birlikte, gerektiğinde, poliüretan borudaki değişiklikler genç veya yaşlı fareleri barındıracak şekilde yapılabilir.

Yaklaşık %95 başarı oranına sahip farelerde renal arter darlığını başlatmak için 3 günlük ve 15 günlük çalışmalar yaptık. Deneyimlerimize göre, bu yöntemi kullanarak renal arter darlığının indüklenmesi, cinsiyetten bağımsız olarak fareler arasında güvenilir, tekrarlanabilir ve tutarlı sonuçlar vermiştir. Renal arterin daralmasını doğrulamak için renin ekspresyonu ve böbrek hasarını ölçtük. Verilerimiz stenozlu böbrekte renin ekspresyonunun anlamlı olarak arttığını göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar tarafından finansal veya başka türlü hiçbir çıkar çatışması beyan edilmez.

Acknowledgments

Araştırma, JAG'ye NHLBI Research Scientist Development Grant (1K01HL135461-01) tarafından desteklenmiştir. David Carmona-Berrio ve Isabel Adarve-Rengifo'ya teknik yardımları için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diet Gel Clear H2O Diet-Gel 76A Surgery recovery diet
EMC Heated Hard pad Hallowell 000A2788B Heating pads were used to keep mice warm
Ethilon Nylon Suture Ethicon 662G 4-0 (1.5 metric), This suture was used to close the peritoneum, and skin
Ethilon Nylon Suture Ethicon 2815 G 8-0 (0.4 metric), This suture was used to close cuff to tie and constrict the artery
Germinator 500 Braintree Scientific Inc. GER 5287 Sterilize surgical tools between surgeries
Ketoprofen Zoetis Ketofen Painkiller
Polyurethane Braintree Scientific Inc. MRE-025 This tube was used to initiate stenosis
Povidone-iodine antiseptic swabsticks Medline MDS093901 It was applied after hair removal and surgery on the skin
Reflex 7 Clip Applier Roboz Surgical Instrument Co 204-1000 This clip applier was used to apply clip in case one or more sutures went off
Sterile towel drapes Dynarex 4410 It was used as a bedsheet for mice during surgery
Triple antibiotic ointment Medi-First 22312
Water pump Stryker T/pump Professionals Used to warm and circulate water in the heating hard pad to keep mice warm during and post-surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kashyap, S., et al. Blockade of CCR2 reduces macrophage influx and development of chronic renal damage in murine renovascular hypertension. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 310 (5), 372-384 (2016).
  2. Wang, W., et al. Changes in inflammatory biomarkers after renal revascularization in atherosclerotic renal artery stenosis. Nephrology Dialysis Transplantation. 31 (9), 1437-1443 (2016).
  3. Yerram, P., Karuparthi, P. R., Chaudhary, K. Pathogenesis and management of renovascular hypertension and ischemic nephropathy. Minerva Urologica e Nefrologica. 64 (1), 63-72 (2012).
  4. Covic, A., Gusbeth-Tatomir, P. The role of the renin-angiotensin-aldosterone system in renal artery stenosis, renovascular hypertension, and ischemic nephropathy: diagnostic implications. Progress in Cardiovascular Diseases. 52 (3), 204-208 (2009).
  5. Barreras, A., Gurk-Turner, C. Angiotensin II receptor blockers. Proceedings. 16 (1), Baylor University. Medical Center. 123-126 (2003).
  6. Sica, D. A. Angiotensin-converting enzyme inhibitors side effects--physiologic and non-physiologic considerations. Journal of Clinical Hypertension. 6 (7), 410-416 (2004).
  7. Hill, R. D., Vaidya, P. N. Angiotensin II Receptor Blockers (ARB, ARb). StatPearls. , (2019).
  8. Durante, A., et al. Role of the renin-angiotensin-aldosterone system in the pathogenesis of atherosclerosis. Current Pharmaceutical Design. 18 (7), 981-1004 (2012).
  9. Chen, K., et al. Plasma reactive carbonyl species: Potential risk factor for hypertension. Free Radical Research. 45 (5), 568-574 (2011).
  10. Zhang, X., et al. Angiotensin receptor blockade has protective effects on the poststenotic porcine kidney. Kidney International. 84 (4), 767-775 (2013).
  11. Zou, X., et al. Renal scattered tubular-like cells confer protective effects in the stenotic murine kidney mediated by release of extracellular vesicles. Scientific Reports. 8 (1), 1263 (2018).
  12. Kinra, M., Mudgal, J., Arora, D., Nampoothiri, M. An insight into the role of cyclooxygenase and lipooxygenase pathway in renal ischemia. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 21 (21), 5017-5020 (2017).
  13. Cavalcanti, C. O., et al. Inhibition of PDE5 Restores Depressed Baroreflex Sensitivity in Renovascular Hypertensive Rats. Frontiers in Physiology. 7, 15 (2016).
  14. Dias, A. T., et al. Sildenafil ameliorates oxidative stress and DNA damage in the stenotic kidneys in mice with renovascular hypertension. Journal of Translational Medicine. 12, 35 (2014).
  15. Lerman, L. O., Chade, A. R., Sica, V., Napoli, C. Animal models of hypertension: an overview. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 146 (3), 160-173 (2005).
  16. Reckelhoff, J. F., Romero, D. G., Yanes Cardozo, L. L. Sex, Oxidative Stress, and Hypertension: Insights From Animal Models. Physiology (Bethesda). 34 (3), 178-188 (2019).
  17. Goldblatt, H., Lynch, J., Hanzal, R. F., Summerville, W. W. Studies on Experimental Hypertension : I. The Production of Persistent Elevation of Systolic Blood Pressure by Means of Renal Ischemia. Journal of Experimental Medicine. 59 (3), 347-379 (1934).
  18. Gollan, F., Richardson, E., Goldblatt, H. Hypertension in the systemic blood of animals with experimental renal hypertension. Journal of Experimental Medicine. 88 (4), 389-400 (1948).
  19. Lewis, H. A., Goldblatt, H. Studies on Experimental Hypertension: XVIII. Experimental Observations on the Humoral Mechanism of Hypertension. Bulletin of the New York Academy of Medicine. 18 (7), 459-487 (1942).
  20. Warner, G. M., et al. Genetic deficiency of Smad3 protects the kidneys from atrophy and interstitial fibrosis in 2K1C hypertension. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 302 (11), 1455-1464 (2012).
  21. Lorenz, J. N., et al. Renovascular hypertension using a modified two-kidney, one-clip approach in mice is not dependent on the alpha1 or alpha2 Na-K-ATPase ouabain-binding site. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 301 (3), 615-621 (2011).
  22. Ebina, K., Iwabuchi, T., Suzuki, S. Histological change in permanently clipped or ligated cerebral arterial wall. Part II: Autopsy cases of aneurysmal neck clipping. Acta Neurochirurgica. 66 (1-2), 23-42 (1982).
  23. Saleem, M., et al. Sox6: A new modulator of renin expression during physiological conditions. bioRxiv. , (2019).
  24. Saleem, M., et al. Sox6 as a new modulator of renin expression in the kidney. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2019).
  25. Chade, A. R., Williams, M. L., Engel, J., Guise, E., Harvey, T. W. A translational model of chronic kidney disease in swine. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (2), 364-373 (2018).
  26. Xue, Y., Xu, Z., Chen, H., Gan, W., Chong, T. Low-energy shock wave preconditioning reduces renal ischemic reperfusion injury caused by renal artery occlusion. Acta Cirúrgica Brasileira. 32 (7), 550-558 (2017).
  27. Lalanne, A., Beaudeux, J. L., Bernard, M. A. NGAL: a biomarker of acute and chronic renal dysfunction. Annales de Biologie Clinique. 69 (6), 629-636 (2011).
  28. Bolignano, D., et al. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as a marker of kidney damage. American Journal of Kidney Diseases. 52 (3), 595-605 (2008).
  29. Kashyap, S., et al. Development of renal atrophy in murine 2 kidney 1 clip hypertension is strain independent. Research in Veterinary Science. 107, 171-177 (2016).
  30. Anderson, W. P., Woods, R. L., Kline, R. L., Korner, P. I. Acute haemodynamic responses to unilateral renal artery stenosis in conscious dogs. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 12 (3), 305-309 (1985).
  31. Imanishi, M., et al. Critical degree of renal arterial stenosis that causes hypertension in dogs. Angiology. 43 (10), 833-842 (1992).
  32. Ziecina, R., Abramczyk, P., Lisiecka, A., Papierski, K., Przybylski, J. Adrenal-renal portal circulation contributes to decrease in renal blood flow after renal artery stenosis in rats. Journal of Physiology and Pharmacology. 49 (4), 553-560 (1998).
  33. Johnson, J. A., Ichikawa, S., Kurz, K. D., Fowler, W. L., Payne, C. G. Pressor responses to vasopressin in rabbits with 3-day renal artery stenosis. American Journal of Physiology. 240 (6), 862-867 (1981).
  34. Eirin, A., et al. Changes in glomerular filtration rate after renal revascularization correlate with microvascular hemodynamics and inflammation in Swine renal artery stenosis. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (5), 720-728 (2012).
  35. Ma, Z., Jin, X., He, L., Wang, Y. CXCL16 regulates renal injury and fibrosis in experimental renal artery stenosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory. 311 (3), 815-821 (2016).
  36. Cheng, J., et al. Temporal analysis of signaling pathways activated in a murine model of two-kidney, one-clip hypertension. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (4), 1055-1068 (2009).
  37. Wiesel, P., Mazzolai, L., Nussberger, J., Pedrazzini, T. Two-kidney, one clip and one-kidney, one clip hypertension in mice. Hypertension. 29 (4), 1025-1030 (1997).
  38. Johns, C., Gavras, I., Handy, D. E., Salomao, A., Gavras, H. Models of experimental hypertension in mice. Hypertension. 28 (6), 1064-1069 (1996).

Tags

Tıp Sayı 164 İki böbrek bir klip (2K1C) Renal arter darlığı Renin Anjiyotensin Aldosteron Sistemi renin ekspresyonu Böbrek hasarı fare modeli
Renal Arter Darlığında Renin Regülasyonunun Modifiye İki Böbrek Bir Klipsli Fare Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saleem, M., Barturen-Larrea, P.,… More

Saleem, M., Barturen-Larrea, P., Saavedra, L., Gomez, J. A. A Modified Two Kidney One Clip Mouse Model of Renin Regulation in Renal Artery Stenosis. J. Vis. Exp. (164), e61058, doi:10.3791/61058 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter