Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מודל שונה של שתי כליות קליפ אחד של ויסות רנין בהיצרות עורק הכליה

Published: October 26, 2020 doi: 10.3791/61058
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Medicine/Clinical Pharmacology Division, Vanderbilt University Medical Center

Summary

מודל שונה של 2 כליות 1 קליפ (2K1C) עכבר גולדבלט פותח תוך שימוש בצינורות פוליאוריתן כדי ליזום היצרות של עורק הכליה, מה שגרם לעלייה בביטוי הרנין ובפגיעה בכליות. כאן אנו מתארים הליך מפורט של הכנה והנחת השרוול על עורק הכליה כדי ליצור מודל עכבר 2K1C הניתן לשחזור ועקבי.

Abstract

היצרות עורק הכליה היא מצב שכיח בחולים עם מחלת כלי דם כליליים או היקפיים שבה מערכת רנין אנגיוטנסין אלדוסטרון (RAAS) מופעלת יתר על המידה. בהקשר זה, יש היצרות של עורקי הכליה המעוררים עלייה בביטוי ושחרור של רנין, הפרוטאז המגביל את קצב ב- RAAS. העלייה בביטוי הרנין כתוצאה מכך היא גורם ידוע ליתר לחץ דם רנובסקולרי, הקשור לעתים קרובות לפגיעה בכליות ולפגיעה באיברי הקצה. לכן, יש עניין רב בפיתוח טיפולים חדשניים למצב זה. המנגנון המולקולרי והתאי של בקרת רנין בהיצרות עורק הכליה אינו מובן במלואו ומצדיק חקירה נוספת. כדי לגרום להיצרות עורק הכליה בעכברים, פותח מודל שונה של 2 כליות 1 קליפ (2K1C) עכבר גולדבלט. הכליה הימנית התקבעה בעכברים מסוג בר, ועכברים שהופעלו על ידי שומה שימשו כבקרה. לאחר היצרות עורק הכליה, קבענו ביטוי רנין ופגיעה בכליות. הכליות נקטפו, וקורטיקס טרי שימש לקביעת ביטוי חלבון ו-mRNA של רנין. מודל חייתי זה ניתן לשחזור וניתן להשתמש בו כדי לחקור תגובות פתופיזיולוגיות, מסלולים מולקולריים ותאיים המעורבים ביתר לחץ דם רנובסקולרי ופגיעה בכליות.

Introduction

היצרות עורק הכליה (RAStenosis) היא בעיה בלתי פתירה המשפיעה על כ -6% מהאנשים מעל גיל 65 ועל עד 40% מהאנשים עם מחלת כלי דם כליליים או היקפיים 1,2. הטיפולים הקיימים כיום במחלה מוגבלים; לכן, קיים צורך קריטי לפתח טיפולים חדשים לטיפול ביתר לחץ דם רנובסקולרי או יתר לחץ דם עמיד המושרה על ידי RAStenosis. מערכת רנין אנגיוטנסין אלדוסטרון (RAAS) היא מסלול המפתח המעורב בפתוגנזה של יתר לחץ דם המושרה על ידי RAStenosis או יתר לחץ דם רנובסקולרי 3,4. טיפולים ידועים המכוונים ל-RAAS, כגון מעכבי ACE או חוסמי קולטן אנגיוטנסין, מקלים על יתר לחץ דם, אך זקוקים לבדיקה מדוקדקת של אי ספיקת כליות והיפרקלמיה 5,6,7. רנין מזרז את השלב המגביל את הקצב ב-RAAS; הוא ממיר אנגיוטנסינוגן לאנגיוטנסין I. בטרשת עורקים, היווצרות פלאק גורמת להיצרות של עורק הכליה המניע את הפרשת רנין, וכתוצאה מכך יתר לחץ דם רנובסקולרי ונזק לכליות8. מספר מחקרים דיווחו על רמות מוגברות של עקה חמצונית במהלך יתר לחץ דם רנובסקולרי בבני אדם, אשר אומתו עם מודל שני עכברי קליפ כליה אחת (2K1C) וכן מודלים אחרים של בעלי חיים עם יתר לחץ דם 2,9,10,11,12,13,14,15,16 . המנגנון המולקולרי של בקרת ביטוי רנין במהלך RAStenosis המושרה יתר לחץ דם renovascular אינו מובן היטב ומצדיק חקירה נוספת.

מודלים ניסיוניים של בעלי חיים המשחזרים באופן אמין ומשכפל RAStenosis חשובים בהבהרת המנגנונים התאיים והמולקולריים של בקרת ביטוי רנין לפיתוח טיפולים חדשניים. מודל העכבר 2K1C הוא מודל ניסיוני מבוסס היטב לחקר הפתוגנזה של יתר לחץ דם רנובסקולרי17,18,19,20. מודל זה נוצר על ידי התכווצות עורק הכליה באמצעות קליפ 17,20,21, ולכן מייצר חסימה של עורק הכליה שמביאה לעלייה בביטוי רנין ויתר לחץ דם 17,19,20,21. עם זאת, אין דוחות טכניים זמינים, המתארים הליך צעד אחר צעד כדי ליצור היצרות עורק הכליה במודלים של בעלי חיים.

קליפסים כסופים קונבנציונליים בצורת U, צינורות פוליאוריתן ותופסנים אחרים שימשו כדי לכווץ את עורק הכליה כדי לגרום להיצרות עורק הכליה. מחקרים מסוימים הראו כי העיצוב והחומר של הקליפ הם קריטיים להשגת נתונים אמינים וניתנים לשחזור עם מודל החיות 2K1C. על פי Lorenz et al., השימוש בקליפסים כסופים קונבנציונליים בעיצוב U גורם לשיעור הצלחה נמוך של יתר לחץ דם (40-60%)21. בשל עיצוב הקליפ, עורק הכליה נלחץ לרוחב, מה שמפעיל כמה כיווצים והסתברות גדולה יותר להיעקר מעורק הכליה. גמישות כסף ומשיכות עשויות לאפשר שינויים ברוחב הקליפס; לכן, גרימת רמות שונות של יתר לחץ דם בקרב עכברים. דו תחמוצת הכסף על התפס עלולה לגרום לדלקת פריווסקולרית, התפשטות אינטימית וגרגירי רקמות, מה שמשנה את קוטר עורק הכליה22. בשל השונות ברמות יתר לחץ הדם המתקבלות עם קליפס הכסף הקונבנציונלי של U-design, Warner et al. ו- Lorenz et al. השתמשו בהצלחה בצינורות פוליאוריתן בעיצוב עגול יותר כדי ליזום היצרות עורק הכליה בעכברים, ויצרו אינדוקציה אמינה ועקבית יותר של שתי הכליות מודל20,21.

בדו"ח זה אנו מתארים פרוטוקול כירורגי ליצירת RAStenosis ניסיוני בעכברים, תוך שימוש בצינורות הפוליאוריתן כדי לכווץ את עורק הכליה. השרוול בעל העיצוב העגול מפוליאוריתן הוא קליפס שניתן לשחזור, אמין ובעלות נמוכה יותר ליצירת היצרות בעכבר. מטרתו של מודל ניסיוני זה היא לחקור ולהגדיר את המנגנון המולקולרי והתאי של בקרת ביטוי רנין במהלך היצרות עורק הכליה. אישרנו את ההצלחה של מודל עכברי RAStenosis על ידי מדידת ביטוי רנין וסמן פגיעה בכליות נויטרופילים הקשורים לג'לטינאז (N-GAL).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עכברים שוכנו וטופלו במחלקה לטיפול בבעלי חיים במרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט (VUMC) בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) והמדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, משרד הבריאות ושירותי האנוש של ארה"ב. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של VUMC לפני תחילת הניסויים.

1. הכנת בעלי חיים ודיסקציה

  1. הפעל את הנבט ואת משאבת המים של כרית החימום כ -30 דקות לפני תחילת הניתוח.
  2. חותכים צינורות פוליאוריתן באורך 0.5 מ"מ עם אזמל חד. הסר 0.2 מ"מ מההיקף על ידי ביצוע חתך לאורך כדי ליצור שרוול.
    הערה: זהו חלק קריטי בהליך היצרות עורק הכליה הדורש דיוק רב, תשומת לב לפרטים וסבלנות. נסו לחתוך כמה חתיכות של צינורות פוליאוריתן בכל פעם. בצע את כל ההליך הזה תחת מיקרוסקופ.
  3. לפני שתמשיך הלאה, לבש כפפות סטריליות כירורגיות ומסכה כירורגית.
  4. השתמש בעכברי C57BL/6 מסוג בר (WT) במשך 6-8 שבועות. השתמש במספר שווה של עכברים זכרים ונקבות כדי למנוע הטיה מינית.
  5. רשום את משקל העכברים לפני ביצוע הניתוח. המשקל האידיאלי לביצוע היצרות עורק הכליה עם צינור פוליאוריתן הוא 18-22 גרם. טפלו בעכברים בעדינות ואל תתסיסו בזמן הזרקת ההרדמה. יש לתת משכך כאבים טרום ניתוחי (קטופגן, 5 מ"ג/ק"ג גוף).
    הערה: בעת העברת העכברים מחדר המגורים שלהם לחדר הניתוח, נשא אותם בעדינות רבה ובזהירות רבה כדי למנוע תסיסה. מומלץ מאוד לשאת כלובי עכברים בידיים במקום בעגלה.
  6. הרדימו את העכברים בתערובת של קטמין (100 מ"ג/ק"ג BW) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג BW) באמצעות זריקות תוך-צפקיות (I.P.).
  7. החזירו את העכבר לתוך הכלוב עד להרדמה מלאה. זה לוקח בערך 4-5 דקות לפני העכבר הוא מחוסר הכרה מלאה. צבוט את הזנב או הבוהן עם מלקחיים כדי לבדוק אם העכבר מחוסר הכרה לחלוטין ומוכן לניתוח.
  8. הניחו את העכבר על גבו על מגבת נייר. הסר את שיער הבטן הצדדית באמצעות קוצץ שיער חשמלי בעקבות הכיוון ההפוך של צמיחת השיער. לאחר גילוח האתר הכירורגי, נקו את האזור עם קרצוף כירורגי המכיל יוד (או כלורהקסידין) ואחריו שטיפה עם 70% אתנול (או מלח סטרילי).  חזור על 3 פעמים.
    הערה: יש לבצע את הליך הסרת השיער במרחק מה או עדיף בספסל שונה מספסל הניתוח כדי למנוע הפרעות שיער וזיהום שיער במהלך הליך הניתוח.
  9. מכסים את כרית החימום בסדין סטרילי. מביאים את העכבר לספסל הניתוח ומניחים על היריעה הסטרילית, הפונה לצד הימני הצדדי של העכבר לכיוון המיקרוסקופ. לשמור על טמפרטורת כרית קבועה של 37 מעלות צלזיוס עם מים במחזור.
  10. פתח את השקית המעוקרת המכילה את כל הציוד הכירורגי. באמצעות מיקרוסקופ מנתח ומספריים חדים סטריליים, מבצעים חתך קטן באגף (קרוב לצלע החזהה-13 , הצלע האחרונה בעכבר) ובמרחק של כ-0.5 ס"מ מהחוליות. ממשיכים לאורך החוליות המותניות ומבצעים חתך של 1 אינץ '.
  11. למשוך בחזרה את העור ואת השרירים כדי לחשוף את הכליה.
  12. נקו והסירו את השומן שמסביב באמצעות צמר גפן סטרילי כדי לבודד את עורק הכליה. לבודד את עצב הכליה מעורק הכליה באמצעות מלקחיים מעוקלים.
  13. בעת ביצוע ניתוח הבושה, החל תפרים כדי לסגור את העור ולהחיל אנטיביוטיקה על הפצע הסגור, ולאחר מכן להמשיך לטיפול לאחר הניתוח. אם לא, המשך עם הקטע הבא כדי stenose את העורק.
    הערה: כל ניסוי צריך לכלול חיות בושה כבקרה על ההליך הכירורגי. חיות שאם מורכבות מעכברים שעברו את ההליך הכירורגי של חשיפת עורק הכליה מבלי להניח עליו שרוול.

2. היצרות עורק הכליה הימני

  1. מניחים שני תפרים מניילון מתחת לעורק הכליה הימני, יוצרים קשרים רופפים, ואז מניחים את השרוול סביב עורק הכליה הראשי בערך שווה בין הכליה לאבי העורקים
  2. סגרו את השרוול באמצעות תפרים מניילון. הכינו ארבעה קשרים לכל תפר כדי למנוע את ההסתברות לאבד את התפרים לאחר הניתוח.
  3. סגור את החתך בשריר על ידי החלת תפר רציף פשוט.
  4. הכינו תפרים פשוטים שנקטעים כדי לסגור את העור.
  5. מתן משככי כאבים מאושרים על ידי IACUC.
    הערה: כלי ניתוח אוטוקלאב לפני כל שימוש. אם מבוצע יותר מניתוח אחד בבת אחת, נגבו את כל הכלים המשומשים עם מד אלכוהול סטרילי והכניסו אותם לנביטה חמה למשך 15-30 שניות לאחר כל ניתוח. החלף כפפות סטריליות גם עבור כל עכבר.

3. טיפול לאחר הניתוח

  1. החזירו עכברים לכלוב שלהם והשאירו את הכלוב חצי דולק, חצי כבוי, כרית חימום מים במחזור למשך 2 - 3 שעות. הוסיפו מזון ג'ל להתאוששות דיאטת בתוך הכלוב.
  2. יש לתת משכך כאבים (קטופרופן) דרך הצפק (מינון: 5 מ"ג/ק"ג BW) למחרת.
  3. שקלו את העכברים ביומיים הקרובים; אם חלק מהעכברים מאבדים יותר מ-20% ממשקלם, התייעצו עם הווטרינר והחליטו אם יש צורך להרדים את בעל החיים לאחר ההליך המתאים המאושר על ידי IACUC.
  4. עקוב אחר העכברים מדי יום כדי להעריך אדמומיות, נפיחות, כאב או זיהום.
  5. יש לפנות לייעוץ וטרינרי לסיבוכים לאחר הניתוח בהתאם למדיניות IACUC המוסדית..

4. קציר רקמות

  1. קציר רקמות 3 שבועות לאחר הליך כירורגי. רשום את המשקל של כל עכבר.
  2. להרדים את העכבר בהליך שאושר על ידי IACUC.
  3. הנח את העכבר על פלטפורמה סטרילית במצב שכיבה כדי לנתח.
  4. אבטח והרחב את הגפיים כדי להגביל את התנועה.
  5. רססו היטב את העכברים ב-70% אתנול.
  6. בצע חתך בקו האמצע כדי לפתוח את אזור הבטן והחזה באמצעות מספריים חדים.
  7. משכו לאחור את העור ואת דופן הצפק.
  8. בזהירות לחשוף את הלב ולנקב את החדר הימני exsanguinate העכבר.
  9. הסר את שתי הכליות באמצעות מלקחיים. הכליות ממוקמות על גב העכברים.
    הערה: אין לערבב את שתי הכליות. היו מודעים לכליות היצרניות, הבושה והקונטרלטרליות.
  10. הסר את כמוסת הכליות, נקה אותם מכל שומן ורשום את המשקל של כל כליה בנפרד.
  11. חותכים חתך אורך של שתי הכליות ומקובעים ב-4% PFA למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס כדי שיעובדו מאוחר יותר להטמעת פרפין, כדי לבצע הכלאה באתרה (ISH) ואימונוהיסטוכימיה (IHC). עקוב אחר פרוטוקולי ISH ו- IHC כפי שדווחו23,24.
  12. לבודד את קליפת המוח של הכליה הנותרת ולהקפיא הבזק בחנקן נוזלי כדי לבצע כתם מערבי. יש לאחסן דגימות בטמפרטורה של -80°C עד לניתוח.
  13. כימות ביטויי רנין, ו-N-GAL עם כתם מערבי כמתואר בספרות23,24.

5. סטטיסטיקה

  1. השתמש ב- ANOVA חד-כיווני או דו-כיווני לניסויים עם שלושה תנאים או יותר ולאחר מכן מבחני בונפרוני לאחר הוק לצורך השוואה בין קבוצות בודדות. שקול ערך p שווה או קטן מ- 0.05 משמעותי. השתמש בתוכנה (לדוגמה, GraphPad Prism 8.2) כדי לבצע את כל הניתוחים הסטטיסטיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התכווצות עורק הכליה מגבירה את ביטוי הרנין בכליה היציבה תוך דיכוי הביטוי בכליה הנגדית. הקטיף של שתי הכליות (2K1C) או מודל ההיצרות של גולדבלט גורם לביטוי מוגבר של רנין ולפגיעה בכליות. זה מוכר כמודל הייצוגי הטוב ביותר של היצרות עורק הכליה חד צדדית בבני אדם.

ביטוי של רנין ופרורנין (מבשר של רנין) נמדדו באמצעות אימונובלוטציה. הנתונים מראים כי ביטוי הרנין והפרורנין עלה בכליה היציבה בהשוואה לכליות קונטרלטרליות ומרופטות, מה שמרמז על כך שהשרוול כיווץ את עורק הכליה וגרם לשינויים בזליגת הכליות (איור 1). כדי לדמיין את הלוקליזציה של ביטוי רנין, IHC בוצע. IHC אימת נתונים של אימונובלוטינג שהראו ביטוי מוגבר של רנין בכליה החתוכה (איור 2). יתר על כן, תאי ג'וקסטגלומרולריים (JG) שגיוס תאים לאורך העורק האפרנטי נצפה בכליה היציבה (איור 2). כדי לחקור את ההשפעה על רמות ביטוי ה-mRNA של רנין, בוצע ISH. נתוני ה-ISH מצביעים על גיוס מוגבר של תאי רנין mRNA ו-JG בכליה היציבה בהשוואה לכליות קונטרלטרליות ודמה (איור 3).

מאפיין נוסף של היצרות עורק הכליה הוא upregulation של סמני פגיעה בכליות עקב שינויים בזליגת כליות, ייצור superoxide ויתר לחץ דם 2,25,26. ליפוקלין הקשור לג'לטינאז נויטרופילים (NGAL) הוא סמן פציעה חריפה מאופיין היטב והוא מתבטא יתר על המידה במהלך פגיעה בכליות27,28. לכן, סמן פגיעה חריפה בכליות NGAL נמדד באמצעות immunoblotting. נתונים של Immunoblotting הראו כי N-GAL היה מווסת מאוד בכליה היציבה בהשוואה לכליות הקונטרלטרליות והבושה (איור 4).

Figure 1
איור 1: ביטוי רנין. לאחר 15 ו -3 ימים של היצרות עורק הכליה, עכברים הומתו. הכליות נקטפו, וביטוי הרנין נקבע על ידי כתם מערבי. (A) מציג תמונות מייצגות של כתמים מערביים מ-15 יום סטנוס (פאנל שמאלי) ועכברי בושה (פאנל ימני). (B) מציג את הניתוח הדנסיטומטרי של רצועות חלבון פרורנין (פאנל שמאלי) ורנין (פאנל ימני). בטא-אקטין שימש כבקרת טעינה. (C) מציג את תמונות הכתמים המערביים המייצגים מסטנוס בן 3 ימים (פאנל שמאלי) ועכברי בושה (פאנל ימני). (D) מציג אנליזה דנסיטומטרית של רצועות חלבון פרורנין (פאנל שמאלי) ורנין (פאנל ימני). בטא-אקטין שימש כבקרת טעינה. הנתונים מוצגים כממוצע ± ערך SD. P מחושב עם ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן טוקי לאחר הוק. *P<0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001, N=3-6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח אימונוהיסטוכימיה להדמיה ולוקליזציה של ביטוי רנין לאחר היצרות עורק הכליה. הכליות בודדו לאחר שהרדימו עכברים מהיצרות עורק הכליה למשך 3 ימים. חתיכה אחת מחתך אורכי של הכליה כולה תוקנה בתמיסת פורמלין נטויה ניטרלית ב-4%, לאחר מכן התייבשה בסדרת אתנול מדורגת, והוטמעה בפרפין. צביעה ירוקה מייצגת ביטוי של חלבון רנין; כחול, גרעינים. (A) תמונות מיקרוסקופיה מייצגות של כליה מקובעת (צד שמאל), כליה קונטרלטרלית (צד ימין) מעכברים מיותדים. (B) תמונות מיקרוסקופיה מייצגות של כליות בושה (צד שמאל), וכליות קונטרלטרליות (צד ימין) מעכברי בושה. סרגל קנה מידה של 30 מיקרון. הגדלה של 90X. (C) תמונות מיקרוסקופיה מייצגות של כליה במצב יציב (צד שמאל), כליה קונטרלטרלית (צד ימין) מעכברים יציבים. (D) תמונות מיקרוסקופיה מייצגות של כליות בושה (צד שמאל), וכליות קונטרלטרליות (צד ימין) מעכברי בושה. תמונות אלה נלקחו בעיקר מאזור קליפת המוח. סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר. הגדלה של פי 15. עיגולים מנוקדים לבנים מציינים את מיקומו של גלומרולי. G: Glomeruli, AfAr: עורק אפרנט, N=4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח הכלאה באתרו של ביטוי mRNA של רנין לאחר היצרות עורק הכליה. לאחר 3 ימים של היצרות עורק הכליה, עכברים הומתו והכליות בודדו והתקבעו בזלוף עם תמיסת פורמלין נטויה ניטרלית ב-4%, התייבשו בסדרת אתנול מדורגת והוטמעו בפרפין. הכלאה באתרה בוצעה בהתאם להוראות היצרן. כתמים אדומים כהים מייצגים ביטוי mRNA רנין; כחול, גרעינים. (א) . תמונת מיקרוסקופיה מייצגת של כליות מיותקות (צד שמאל), וכליות קונטרלטרליות (צד ימין) מעכברים יציבים. (ב) . תמונת מיקרוסקופיה מייצגת של כליות בושה (צד שמאל), וכליות קונטרלטרליות (צד ימין) מעכברי בושה. סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר. עיגולים לבנים מנוקדים מציינים גלומרולי המבטא רנין. G: Glomeruli, AfAr: עורק אפרנט, N=4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: ביטוי ליפוקלין הקשור לג'לטינאז נויטרופילי (N-GAL) לאחר היצרות עורק הכליה. לאחר היצרות עורק הכליה במשך 3 ימים, העכברים הומתו ונקטפו הכליות, והבעת N-GAL נמדדה על ידי כתם מערבי. (A) תמונות כתמים מערביים מייצגים מסטנוס בן 3 ימים (פאנל שמאלי) ועכברי בושה (פאנל ימני). בטא-אקטין שימש כבקרת טעינה. (B) ניתוח דנסיטומטרי של רצועות N-GAL. ערכי צפיפות החלבון של N-GAL נורמלו ל-β-אקטין. הנתונים מוצגים כממוצע ± ערך SD. P מחושב עם ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן טוקי לאחר הוק. **P<0.01, ***P< 0.001, N=3-5. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היצרות עורק הכליה היא גורם חשוב ליתר לחץ דם משני או עמיד, ולפגיעה בכליות 1,29. מודל גולדבלט בעל שתי הכליות (2K1C) שימש לחקר יתר לחץ דם רנובסקולרי המושרה על ידי RAStenosis 1,17,18,19. מספר מחקרים קודמים שהשתמשו במודלים שונים של בעלי חיים הראו כי היצרות בעורק הכליה היא ממריץ חזק של ביטוי יתר ושחרור רנין, ופגיעה בכליות 18,30,31,32,33,34,35. יתר על כן, מודל זה משמש לחקר חדירת תאי מערכת החיסון, פיברוזיס, דלקת וסמני פגיעה חריפה וכרונית בכליות29.

כאן תיארנו הליך מפורט וצעד אחר צעד ליצירת מודל היצרות עורק הכליה הניתן לשחזור, אמין ועקבי בעכברים. מוקדם יותר, קליפסים מתכת שימשו כדי ליזום היצרות עורק הכליה36,37,38. כחלופה, השתמשנו בצינורות עגולים מפוליאוריתן (MRE 025; קוטר פנימי (ID) = 0.30 מ"מ; קוטר חיצוני (OD) = 0.63 מ"מ; עובי דופן, (WT) = 0.16 מ"מ). השתמשנו בצינורות, מכיוון שמיקום של חפת פוליאוריתן יגרום להתכווצות בשני ממדים (כיווץ) ולא באחד (שיטוח), כמו בתפס מתכת. כמו כן, באמצעות צינורות עגולים פוליאוריתן מספק יתרון של התכווצות אחידה בעורק הכליה. השלב הקריטי והאתגרים הם לחתוך את הגודל הנכון של צינורות פוליאוריתן, מה שדורש תשומת לב רבה לפרטים שיש לבצע באמצעות מיקרוסקופ. קריטריון קריטי נוסף הוא לשמור על עכברים בין 18-22 גרם כדי להתאים את הצינורות על עורק הכליה. לעכברים בטווח משקל זה יש בדרך כלל קוטר חיצוני של עורק הכליה (OD) שנמצא באופן עקבי בטווח של קוטר שרוול הצינור. מגבלה של השיטה היא שעכברים כבדים (מעל 25 גרם) או קטנים (מתחת ל-16 גרם) קשים לביצוע ניתוח בגלל גודל הצינור והשרוול המיוצרים בו. עם זאת, בעת הצורך, ניתן לבצע שינויים בצינורות הפוליאוריתן כדי להתאים לעכברים צעירים או מבוגרים יותר.

ערכנו מחקרים בני 3 ימים ו-15 יום כדי ליזום היצרות של עורקי הכליה בעכברים עם כ-95% אחוזי הצלחה. מניסיוננו, אינדוקציה של היצרות עורק הכליה בשיטה זו הניבה תוצאות אמינות, ניתנות לשחזור ועקביות בקרב העכברים ללא קשר למין. כדי לאשר את התכווצות עורק הכליה, מדדנו את ביטוי הרנין ואת הפגיעה בכליות. הנתונים שלנו מצביעים על כך שביטוי הרנין עלה באופן משמעותי בכליה היציבה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא מוצהרים ניגודי עניינים, כספיים או אחרים, על ידי המחברים.

Acknowledgments

המחקר נתמך על ידי מענק פיתוח מדעני מחקר של NHLBI (1K01HL135461-01) לפצ"ר. תודה לדוד קרמונה-בריו, ואיזבל אדרבה-רנגיפו על עזרתם הטכנית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diet Gel Clear H2O Diet-Gel 76A Surgery recovery diet
EMC Heated Hard pad Hallowell 000A2788B Heating pads were used to keep mice warm
Ethilon Nylon Suture Ethicon 662G 4-0 (1.5 metric), This suture was used to close the peritoneum, and skin
Ethilon Nylon Suture Ethicon 2815 G 8-0 (0.4 metric), This suture was used to close cuff to tie and constrict the artery
Germinator 500 Braintree Scientific Inc. GER 5287 Sterilize surgical tools between surgeries
Ketoprofen Zoetis Ketofen Painkiller
Polyurethane Braintree Scientific Inc. MRE-025 This tube was used to initiate stenosis
Povidone-iodine antiseptic swabsticks Medline MDS093901 It was applied after hair removal and surgery on the skin
Reflex 7 Clip Applier Roboz Surgical Instrument Co 204-1000 This clip applier was used to apply clip in case one or more sutures went off
Sterile towel drapes Dynarex 4410 It was used as a bedsheet for mice during surgery
Triple antibiotic ointment Medi-First 22312
Water pump Stryker T/pump Professionals Used to warm and circulate water in the heating hard pad to keep mice warm during and post-surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kashyap, S., et al. Blockade of CCR2 reduces macrophage influx and development of chronic renal damage in murine renovascular hypertension. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 310 (5), 372-384 (2016).
  2. Wang, W., et al. Changes in inflammatory biomarkers after renal revascularization in atherosclerotic renal artery stenosis. Nephrology Dialysis Transplantation. 31 (9), 1437-1443 (2016).
  3. Yerram, P., Karuparthi, P. R., Chaudhary, K. Pathogenesis and management of renovascular hypertension and ischemic nephropathy. Minerva Urologica e Nefrologica. 64 (1), 63-72 (2012).
  4. Covic, A., Gusbeth-Tatomir, P. The role of the renin-angiotensin-aldosterone system in renal artery stenosis, renovascular hypertension, and ischemic nephropathy: diagnostic implications. Progress in Cardiovascular Diseases. 52 (3), 204-208 (2009).
  5. Barreras, A., Gurk-Turner, C. Angiotensin II receptor blockers. Proceedings. 16 (1), Baylor University. Medical Center. 123-126 (2003).
  6. Sica, D. A. Angiotensin-converting enzyme inhibitors side effects--physiologic and non-physiologic considerations. Journal of Clinical Hypertension. 6 (7), 410-416 (2004).
  7. Hill, R. D., Vaidya, P. N. Angiotensin II Receptor Blockers (ARB, ARb). StatPearls. , (2019).
  8. Durante, A., et al. Role of the renin-angiotensin-aldosterone system in the pathogenesis of atherosclerosis. Current Pharmaceutical Design. 18 (7), 981-1004 (2012).
  9. Chen, K., et al. Plasma reactive carbonyl species: Potential risk factor for hypertension. Free Radical Research. 45 (5), 568-574 (2011).
  10. Zhang, X., et al. Angiotensin receptor blockade has protective effects on the poststenotic porcine kidney. Kidney International. 84 (4), 767-775 (2013).
  11. Zou, X., et al. Renal scattered tubular-like cells confer protective effects in the stenotic murine kidney mediated by release of extracellular vesicles. Scientific Reports. 8 (1), 1263 (2018).
  12. Kinra, M., Mudgal, J., Arora, D., Nampoothiri, M. An insight into the role of cyclooxygenase and lipooxygenase pathway in renal ischemia. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 21 (21), 5017-5020 (2017).
  13. Cavalcanti, C. O., et al. Inhibition of PDE5 Restores Depressed Baroreflex Sensitivity in Renovascular Hypertensive Rats. Frontiers in Physiology. 7, 15 (2016).
  14. Dias, A. T., et al. Sildenafil ameliorates oxidative stress and DNA damage in the stenotic kidneys in mice with renovascular hypertension. Journal of Translational Medicine. 12, 35 (2014).
  15. Lerman, L. O., Chade, A. R., Sica, V., Napoli, C. Animal models of hypertension: an overview. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 146 (3), 160-173 (2005).
  16. Reckelhoff, J. F., Romero, D. G., Yanes Cardozo, L. L. Sex, Oxidative Stress, and Hypertension: Insights From Animal Models. Physiology (Bethesda). 34 (3), 178-188 (2019).
  17. Goldblatt, H., Lynch, J., Hanzal, R. F., Summerville, W. W. Studies on Experimental Hypertension : I. The Production of Persistent Elevation of Systolic Blood Pressure by Means of Renal Ischemia. Journal of Experimental Medicine. 59 (3), 347-379 (1934).
  18. Gollan, F., Richardson, E., Goldblatt, H. Hypertension in the systemic blood of animals with experimental renal hypertension. Journal of Experimental Medicine. 88 (4), 389-400 (1948).
  19. Lewis, H. A., Goldblatt, H. Studies on Experimental Hypertension: XVIII. Experimental Observations on the Humoral Mechanism of Hypertension. Bulletin of the New York Academy of Medicine. 18 (7), 459-487 (1942).
  20. Warner, G. M., et al. Genetic deficiency of Smad3 protects the kidneys from atrophy and interstitial fibrosis in 2K1C hypertension. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 302 (11), 1455-1464 (2012).
  21. Lorenz, J. N., et al. Renovascular hypertension using a modified two-kidney, one-clip approach in mice is not dependent on the alpha1 or alpha2 Na-K-ATPase ouabain-binding site. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 301 (3), 615-621 (2011).
  22. Ebina, K., Iwabuchi, T., Suzuki, S. Histological change in permanently clipped or ligated cerebral arterial wall. Part II: Autopsy cases of aneurysmal neck clipping. Acta Neurochirurgica. 66 (1-2), 23-42 (1982).
  23. Saleem, M., et al. Sox6: A new modulator of renin expression during physiological conditions. bioRxiv. , (2019).
  24. Saleem, M., et al. Sox6 as a new modulator of renin expression in the kidney. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2019).
  25. Chade, A. R., Williams, M. L., Engel, J., Guise, E., Harvey, T. W. A translational model of chronic kidney disease in swine. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (2), 364-373 (2018).
  26. Xue, Y., Xu, Z., Chen, H., Gan, W., Chong, T. Low-energy shock wave preconditioning reduces renal ischemic reperfusion injury caused by renal artery occlusion. Acta Cirúrgica Brasileira. 32 (7), 550-558 (2017).
  27. Lalanne, A., Beaudeux, J. L., Bernard, M. A. NGAL: a biomarker of acute and chronic renal dysfunction. Annales de Biologie Clinique. 69 (6), 629-636 (2011).
  28. Bolignano, D., et al. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as a marker of kidney damage. American Journal of Kidney Diseases. 52 (3), 595-605 (2008).
  29. Kashyap, S., et al. Development of renal atrophy in murine 2 kidney 1 clip hypertension is strain independent. Research in Veterinary Science. 107, 171-177 (2016).
  30. Anderson, W. P., Woods, R. L., Kline, R. L., Korner, P. I. Acute haemodynamic responses to unilateral renal artery stenosis in conscious dogs. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 12 (3), 305-309 (1985).
  31. Imanishi, M., et al. Critical degree of renal arterial stenosis that causes hypertension in dogs. Angiology. 43 (10), 833-842 (1992).
  32. Ziecina, R., Abramczyk, P., Lisiecka, A., Papierski, K., Przybylski, J. Adrenal-renal portal circulation contributes to decrease in renal blood flow after renal artery stenosis in rats. Journal of Physiology and Pharmacology. 49 (4), 553-560 (1998).
  33. Johnson, J. A., Ichikawa, S., Kurz, K. D., Fowler, W. L., Payne, C. G. Pressor responses to vasopressin in rabbits with 3-day renal artery stenosis. American Journal of Physiology. 240 (6), 862-867 (1981).
  34. Eirin, A., et al. Changes in glomerular filtration rate after renal revascularization correlate with microvascular hemodynamics and inflammation in Swine renal artery stenosis. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (5), 720-728 (2012).
  35. Ma, Z., Jin, X., He, L., Wang, Y. CXCL16 regulates renal injury and fibrosis in experimental renal artery stenosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory. 311 (3), 815-821 (2016).
  36. Cheng, J., et al. Temporal analysis of signaling pathways activated in a murine model of two-kidney, one-clip hypertension. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (4), 1055-1068 (2009).
  37. Wiesel, P., Mazzolai, L., Nussberger, J., Pedrazzini, T. Two-kidney, one clip and one-kidney, one clip hypertension in mice. Hypertension. 29 (4), 1025-1030 (1997).
  38. Johns, C., Gavras, I., Handy, D. E., Salomao, A., Gavras, H. Models of experimental hypertension in mice. Hypertension. 28 (6), 1064-1069 (1996).

Tags

רפואה גיליון 164 שתי כליות קליפ אחד (2K1C) היצרות עורק הכליה מערכת רנין אנגיוטנסין אלדוסטרון ביטוי רנין פגיעה בכליות מודל עכבר
מודל שונה של שתי כליות קליפ אחד של ויסות רנין בהיצרות עורק הכליה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saleem, M., Barturen-Larrea, P.,… More

Saleem, M., Barturen-Larrea, P., Saavedra, L., Gomez, J. A. A Modified Two Kidney One Clip Mouse Model of Renin Regulation in Renal Artery Stenosis. J. Vis. Exp. (164), e61058, doi:10.3791/61058 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter